Đồ án công nghệ thực phẩm tổng quan về membrane bioreactor và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vận hành membrane bioreactor

Hệ thống MBRs với membrane nằm bên trong thiết bị lên men.... Mô hình hai bình lên men với một membrane nằm trong..... Trong vận hành, hỗn hợp sau lên men hoặc canh trườ

Trang 1

MỤC LỤC

Trang

LỜI NÓI ĐẦU iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

Chương 1: TỔNG QUAN MBRs 1

A- Giới thiệu chung 1

B- Membrane bioreactors trong công nghệ thực phẩm 3

B.1- Sơ lược bioreactor và membrane 3

1 Thiết bị lên men 3

2 Membrane 4

B.2- Ứng dụng thiết bị membrane vào hệ thống MBRs 6

1 Con đường hình thành 6

2 Các loại mô hình membrane trong MBRs 7

B.3- Cấu tạo và phương thức hoạt động của MBRs 10

1 Hệ thống MBRs với membrane nằm ngoài thiết bị lên men 10

a Mô hình hồi lưu đơn giản 10

b Mô hình hồi lưu mắc nối tiếp 11

c Mô hình hồi lưu nhiều bậc có 1 module membrane ở bậc cuối 12

2 Hệ thống MBRs với membrane nằm bên trong thiết bị lên men 13

a Trường hợp có sự vận chuyển môi trường qua membrane 14

b Trường hợp môi trường không khuếch tán qua membrane 15

3 Hệ thống MBRs với hai thiết bị lên men 16

a Mô hình hai bình lên men với một membrane nằm trong 16

b Mô hình hai bình lên men với hai thiết bị membrane nằm ngoài 17

B.4- Một số hiện tượng phát sinh trong quá trình vận hành MBRs 18

1 Hiện tượng tắc nghẽn màng 18

2 Hiện tượng sinh học 19

3 Các hiện tượng khác 19

Chương 2: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH VẬN HÀNH MBRs 21

Trang 2

A- Quá trình lên men 21

1 Giống vi sinh vật 21

2 Môi trường lên men 22

a Thành phần môi trường 23

b Vấn đề tiệt trùng môi trường 28

3 Điều kiện lên men 28

a Tốc độ pha loãng 28

b Cung cấp oxy 31

c Tốc độ dòng nhập liệu 32

B- Quá trình phân riêng bằng membrane 33

1 Bản chất của membrane 34

a Cấu trúc 34

b Vật liệu 35

c Đường kính 36

2 Tính chất dòng canh trường sau lên men 37

3 Các thông số kỹ thuật 38

a Tốc độ dòng vào và sự chảy rối 38

Một số phương hướng cải thiện tốc độ dòng permeate 39

b Áp lực qua màng 40

C- Ảnh hưởng của cấu hình thiết bị MBRs 42

Chương 3: ỨNG DỤNG MBRs TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 45

A- Acid lactic 45

1 Mô hình MCRB 46

2 Mô hình internal MBR 49

3 Hệ thống MBR-ED 51

4 Mô hình MBR-NF 57

5 Kết luận 60

B- Xylitol 60

1 Mô hình MBR với Candida guilliermondii 61

2 Mô hình SMRB với Candida tropicalis 63

3 Mô hình MBR với Sacharomyces cerevisiae 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

Trang 3

LỜI NÓI ĐẦU

Trong các quá trình sinh học, bản thân mỗi thiết bị phản ứng phải được liên kết với một bộ phận phân tách để thu nhận sinh khối, sản phẩm từ canh trường, hay để thực hiện chuyển hóa những hợp chất có lợi cho con người trong vấn đề xử

lý môi trường Rất nhiều phương thức phân tách khác nhau được sử dụng như: lắng (lóng cặn hoặc kết tủa), ly tâm, lọc dead-end Tất nhiên các phương pháp này phụ thuộc vào tuần tự vận hành, nghĩa là các bước khác nhau trong toàn bộ quy trình phải được thực hiện có trật tự và phải có sự thống nhất, như vậy sẽ rất khó điều khiển Việc đề xuất mô hình membrane bioreactor từ những năm 1980 đã trở nên khá thiết thực và hiệu quả để khắc phục những nhược điểm so với bioreactor truyền thống.

Trong khuôn khổ đồ án, tôi xin giới thiệu tổng quan về membrane bioreactor, cũng như khảo sát sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố có liên quan đến quá trình, đặc biệt là nhấn mạnh mô hình thiết bị này trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm.

Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Lê Văn Việt Mẫn – đã hết sức tận tình trong công việc hướng dẫn đồ án môn học này.

SVTH Nguyễn Vương Anh.

Trang 4

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CRR: cell recycle reactor

CSTR: continuous stirred tank reactor

D: dillution rate

DCW: dry cell weight

DO: dissolved oxygen

ED: electrodialysis

MBR: membrane bioreactor

MCMGR: multi – capillary membrane gradostat reactor

MCRB: membrane cell-recycle bioreactor

MF: microfiltration

MGR: membrane gradostat reactor

MRB: membrane recycle bioreactor

MSLC: membrane – surface liquid culture

MWCO: molecular weight cut off

NF: nanofiltration

NMBR: nanomembrane bioreactor

OTR: oxygen transfer rate

RO: reverse osmosis

SCMGR: single capillary membrane gradostat reactor

SMBR: submerged membrane bioreactor

TBR: tubular bioreactor

UF: ultrafiltration

YE: yeast extract

Trang 5

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Thiết bị lên men sử dụng quy mô công nghiệp 3

Hình 1.2 Cấu trúc membrane vi xốp đẳng hướng 4

Hình 1.3 Cấu trúc membrane vi xốp bất đẳng hướng 5

Hình 1.4 Thiết bị membrane – mô hình ống 7

Hình 1.5 Thiết bị membrane – mô hình ống 7

Hình 1.6 Thiết bị membrane – mô hình sợi 8

Hình 1.7 Thiết bị membrane – mô hình cuộn xoắn 9

Hình 1.8 Mô hình MBR đơn giản 10

Hình 1.9 Mô hình MRB mắc nối tiếp 11

Hình 1.10 Mô hình MBR nhiều bậc với 1 module membrane 12

Hình 1.11 Mô hình MBR với membrane bên trong 13

Hình 1.12 Mô hình MBR có sự vận chuyển môi trường qua membrane 14

Hình 1.13 Mô hình hồi lưu 15

Hình 1.14 Mô hình MBR không có sự vận chuyển môi trường qua membrane 15

Hình 1.15 Mô hình MBR với 1 membrane nằm trong bình 16

Hình 1.16 Mô hình MBR với 2 membrane ngoài 2 bình 17

Hình 1.17 Ba hiện tượng gây tắc nghẽn membrane 18

Hình 2.1 Ảnh hưởng việc sử dụng nguồn nitơ trong vận hành MSLC 24

Hình 2.2 Ảnh hưởng nguồn YE và glucose trong môi trường 25

Hình 2.3 Ảnh hưởng việc bổ sung chitin đến chất lượng sản phẩm 26

Hình 2.4 Ảnh hưởng tốc độ bổ sung cơ chất đến hiệu quả quá trình lên men ethanol 27

Hình 2.5 Ảnh hưởng dòng chảy trong MBRs trước và sau tiệt trùng 28

Hình 2.6 Ảnh hưởng tốc độ pha loãng đến nồng độ tế bào 29

Hình 2.7 Ảnh hưởng tốc độ pha loãng đến sinh khối và hoạt tính sản phẩm 30

Hình 2.8 Đánh giá hiệu quả quá trình lên men ethanol theo tốc độ pha loãng 31

Hình 2.9 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy đến giá trị KLa 32

Hình 2.10 Ảnh hưởng tốc độ dòng glucose và dòng cơ chất bổ sung trong hệ thống MBR-ED 33

Hình 2.11 Sự khác nhau về Fi ở 2 loại membrane đẳng hướng và bất đẳng hướng 34

Hình 2.12 Cơ chế tắc nghẽn khác nhau đối với tế bào vi sinh vật và phân tử lớn 35

Trang 6

Hình 2.13 Ảnh hưởng nồng độ tế bào trong canh trường sau lên men đến lưu lượng

dòng chảy 37

Hình 2.14 Lưu lượng dòng chảy theo thời gian ở các giá trị nồng độ tế bào khác nhau 38 Hình 2.15 Ảnh hưởng lớp trở lực tế bào lên quá trình lọc ở 2 trạng thái dòng chảy khác nhau 39

Hình 2.16 Ảnh hưởng việc làm sạch định kỳ bằng khí đến lưu lượng dòng permeate trong quá trình vi lọc nấm men bánh mì 40

Hình 2.17 Ảnh hưởng TMP đến tỷ lệ % lactose và lactate trong canh trường 41

Hình 2.18 Ảnh hưởng mật độ tế bào trong canh trường đến giá trị áp suất dòng vào membrane, với tốc độ tiếp tuyến luôn giữ không đổi là 0.75 m/s 42

Hình 2.19 Ảnh hưởng cấu hình thiết bị đến sinh khối tế bào 43

Hình 2.20 Ảnh hưởng cấu tạo thiết bị đến hoạt tính sản phẩm enzyme 44

Hình 3.1 Sơ đồ MCRB liên tục trong sản xuất acid lactic 46

Hình 3.2 Đánh giá hàm lượng acid lactic sinh ra, sinh khối tế bào và hiệu suất quá trình khi thực hiện quá trình ở MCRB trong 155.5h 47

Hình 3.3 MBR với 2 membrane đồng trục nằm bên trong 49

Hình 3.4 Sơ đồ vận hành hệ thống MBR 50

Hình 3.5 Đánh giá hiệu quả quá trình sản xuất acid lactic trong hệ thống 51

Hình 3.6 Lên men và tinh sạch acid lactic trong hệ thống MBR-ED (Jurag Separation A/S) 52

Hình 3.7 Quá trình vận hành trên hệ thống MBR-ED 52

Hình 3.8 Mô hình membrane điện thẩm tích và điều khiển sự di chuyển các ion trong sản xuất acid lactic 53

Hình 3.9 Hiệu quả quá trình trong sản xuất acid lactic bằng MBR-ED 54

Hình 3.10 Khuynh hướng sử dụng các nguồn nitơ bổ sung trong MBR-ED 55

Hình 3.11 Sơ đồ thiết bị MBR với membrane NF 58

Hình 3.12 Biểu diễn những thành phần bị giữ lại trên NF trong sản xuất bán liên tục acid lactic từ whey permeate trong mô hình NMBR 59

Hình 3.13 Sơ đồ vận hành hệ thống MBRs trong sản xuất xylitol 61

Hình 3.14 Động học quá trình chuyển hóa sinh học liên tục từ xylose thành xylitol bởi Candida guilliermondii trong hệ thống MBR 62

Hình 3.15 Mô hình SMBR trong sản xuất xylitol bởi Candida tropicalis 64

Hình 3.16 Mô hình MBR sản xuất xylitol từ S cerevisiae BJ3505/δXR 66

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Sự khác nhau trong quá trình lên men xylitol 22

Bảng 2.2 So sánh lưu lượng dòng canh trường trong quá trình làm sạch membrane thủy tinh ứng với các giống vi sinh vật khác nhau 22

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ glucose và casein trong môi trường 23

Bảng 2.4 Thành phần môi trường ở 3 giai đoạn 27

Bảng 2.5 Ảnh hưởng kích thước lỗ membrane lên mật độ tế bào trong dòng lọc 36

Bảng 2.6 Ảnh hưởng TMP lên lưu lượng dòng permeate 41

Bảng 3.1 So sánh giữa các mô hình lên men trong sản xuất acid lactic 45

Bảng 3.2 So sánh kết quả giữa 3 hệ thống MCRB 48

Bảng 3.3 Các thông số biểu diễn quá trình sinh trưởng L casei và sản xuất acid lactic trong mô hình MRB với hệ số bổ sung nguồn nitơ khác nhau 56

Bảng 3.4 Đánh giá hiệu quả lên men acid lactic trong hệ thống MBR-ED bởi giống Bacillus stearothermophilus BS119 56

Bảng 3.5 Thống kê các giá trị thu được trong quá trình lên men liên tục ở các tốc độ pha loãng khác nhau trong vận hành MBR 62

Bảng 3.6 Tóm tắt các thông số trong sản xuất xylitol 65

Bảng 3.7 Tóm tắt kết quả trong sản xuất xylitol bằng S cerevisiae BJ3505/δXR 67

Ch

A- Giới thiệu chung:

1 Định nghĩa chung về membrane bioreactors

Membrane bioreactor là một hệ thống kết hợp giữa thiết bị lên men và thiết bị membrane với hai chức năng chính:

− Thực hiện quá trình sinh học tạo sinh khối và các chất trao đổi

− Thực hiện quá trình phân tách vi sinh vật từ canh trường lên men, từ đó thu nhận sản phẩm con người mong muốn

2 Hiệu quả của MBRs:

− Quá trình được thực hiện trong điều kiện ôn hòa, kỹ thuật thân thiện với môi trường

− Hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm cao Sản phẩm thấm qua membrane một cách có chọn lọc, sản phẩm phụ được hạn chế

− Việc cố định vi sinh vật trên membrane khá tương đồng với vi sinh vật cố định trong tự nhiên, nên chúng dễ dàng phát huy tối đa hoạt tính trong vai trò chuyển hóa

cơ chất thành sản phẩm

Trang 8

− Trong MBRs xuất hiện dòng đối lưu, giúp tăng tốc độ chuyển khối cũng như tốc độ phản ứng sinh học.

− Quá trình tối ưu hóa, cơ giới hóa, tự động hóa cao

− Tiết kiệm lao động, chi phí năng lượng thấp, thời gian rút ngắn

− Năng suất hoạt động của thiết bị được nâng cao

− Các quá trình thu nhận và tinh sạch sản phẩm được tiến hành dễ dàng, độ tinh sạch

và chất lượng sản phẩm được cải thiện

− Tránh tổn thất xúc tác sinh học và ổn định lưu lượng trong quá trình, nên làm giảm đáng kể tổng chi phí vận hành thiết bị

3 Nhược điểm MBRs:

Bên cạnh những ưu điểm thì MBRs có một số nhược điểm như sau:

− Hệ thống khá phức tạp, chi phí đầu tư thiết bị cao

− Tốn kém trong việc khắc phục các hiện tượng về màng: sự tắc nghẽn và tập trung nồng độ, cũng như các hiện tượng khác trong quá trình vận hành

 Rios et al (2000) đã áp dụng MBR hoạt động liên tục có hồi lưu để thủy phân tinh bột sản xuất syrup đường với hàm lượng dextrose cao

 M A Mehaia và M Cheryan (1990) đã đề xuất mô hình membrane bioreactor lên men tĩnh có hồi lưu, với module sợi rỗng làm từ polysulfone để sản xuất ethanol từ

whey permeate bằng Saccharomyces cerevisiae.

 Một số ứng dụng khác như: Sản xuất acetone-buthanol-ethanol (ABE) bằng

Clostridium acetobutylicum (Minier et al 1984; Pierrot et al 1986), chuyển hóa sorbitol thành L-sorbose bởi Gluconobacter oxydans và chuyển hóa glucose thành 2-ketogluconic acid bởi Serratia marcescens (Bull và Young 1981), sản phẩm acid citric từ glucose bằng nấm men Candida (Enziminger và Asenjo 1986; Rane và

D-Sims 1995)…

b Trong ngành dược phẩm và y sinh :

- MBRs đã đem lại hiệu quả cao trong sản xuất penicillin, một loại thuốc khánh sinh

có giá trị, hữu ích cho con người Rất nhiều nghiên cứu đã đề cập đến vấn đề này

 Yaun et al (1990) đã thiết kế mô hình MBR mới có cố định tế bào để sản xuất amino-pencillanic acid (6-APA), với membrane sợi rỗng bằng polysulfone hay

Trang 9

6-membrane phẳng – có tỷ lệ thể tích vùng bề mặt lớn, kết quả là làm tăng hàm lượng

và độ tinh khiết của sản phẩm so với quá trình truyền thống

 Giordano et al (2002) đã tính toán thiết bị MBR ceramic để nuôi cấy

Penicillium chrysogenum cố định vùng bề mặt phía trên membrane sợi rỗng Để

tăng hiệu suất quá trình lên men, môi trường nuôi cấy được pha loãng ở giai đoạn sinh tổng hợp penicillin (trophophase) Việc thống nhất điều kiện ban đầu là quan trọng để xử lý hệ thống phương trình vi phân đại số, hữu ích cho việc đánh giá bioreactor, cũng như có thể xem xét trên phạm vi lớn, từ đó thiết kế được những kiểu bioreactor mới để ngày càng phát triển và hoàn thiện sản phẩm

- Ngoài ra, MBR còn được sử dụng thành công trong sản xuất những loại hợp chất y học khác (như là cyclodextrins, microbial alginate, glycerol, monoglycerides, formaldehyde…)

- Không những vậy, trong lĩnh vực y sinh, MBR cũng đóng vai trò khá quan trọng Điển hình là Yazaki và cộng sự (2001) đã tạo ra kháng nguyên anti-carcinoembryonic diabody và minibody trên lâm sàng bằng cách sử dụng bioreactor membrane sợi rỗng

c Đối với môi trường :

MBR được ứng dụng rất sớm và rất thành công, trong xử lý khí thải và nước thải công nghiệp

 Lu et al (1999) đã dùng đĩa xoay module UF kết hợp với bioreactor hiếu khí lên men cường độ mạnh để xử lý nước thải MBR có thể làm việc liên tục suốt 130 ngày

 Peretti et al (1999) đã báo cáo việc xử lý dòng khí thải có chứa VOCs, hệ thống MBR sử dụng có thể chịu được sự biến đổi không rõ ràng của nồng độ chất ô nhiễm VOC trong dòng khí thải được tách bởi pha dung môi oleic bằng việc sử dụng membrane xốp bó sợi rỗng kỵ nước tạo điều kiện tiếp xúc giữa pha khí và pha dung môi Chất ô nhiễm và bùn sinh học sẽ được phân tách với pha nước và oleic,

từ đó dòng khí sạch được thải ra ngoài

Trang 10

B- Membrane bioreactors trong công nghệ thực phẩm:

Cấu tạo thiết bị MBRs khá đa dạng, do bản chất của nó là hệ thống hoạt động dựa trên nhiều chức năng của nhiều thiết bị trong hệ thống đó, cụ thể ở đây là sự kết hợp giữa thiết

bị lên men và membrane

B.1/ Sơ lược bioreactor và membrane:

1 Thiết bị lên men:

Thiết bị lên men là thiết bị dùng nuôi cấy vi sinh vật nhằm thu nhận sản phẩm trao đổi chất hay thực hiện chuyển hóa có lợi cho con người

Trong sản xuất công nghiệp hiện nay, thiết bị lên men thường hình trụ gồm các bộ phận chính:

− Hệ thống đường ống dẫn khí bên trong (có thể là oxy, không khí, nitơ…)

− Lớp vỏ áo bao quanh thân hay hệ thống đường ống bên trong thiết bị để điều nhiệt

Trang 11

Thiết bị lên men rất đa dạng Dựa vào hoạt động của cánh khuấy trong bình lên men, ta có thể phân ra làm 3 loại chính: khuấy cơ học, khuấy bằng khí nén và không có cánh khuấy.

− Thiết bị khuấy bằng cơ học có thể là thùng quay, xoáy vi lọc, hay cánh khuấy thông gió

− Thiết bị khuấy bằng khí nén có thể là dựa vào hơi nước hay áp lực khí Thiết bị này thường gồm có bình chứa đựng chất lỏng, có gắn những lỗ thông cho hơi nước đi qua, làm sao để cung cấp đủ lượng oxy hòa tan cho sinh khối

Nhờ có cánh khuấy và dưới tác dụng sức đẩy của cánh quạt hay mái chèo, sinh khối và môi trường được hòa trộn đều, không cục bộ, nhờ đó hiệu suất của quá trình lên men cao Tuy nhiên, nếu cánh khuấy hoạt động quá mạnh hay lực trộn và cào mạnh có thể làm hư canh trường, ảnh hưởng đến hoạt tính vi sinh vật Ví dụ như trong trường hợp sử dụng nấm mốc, cánh khuấy có thể làm gãy sợi nấm

2 Membrane:

Membrane là màng đóng vai trò vật ngăn để phân riêng các cấu tử Động lực trong kỹ thuật phân riêng bằng membrane là áp suất Kết quả của quá trình phân riêng bằng membrane sẽ cho ta hai dòng sản phầm:

− Dòng sản phẩm qua membrane được gọi là permeate

− Dòng sản phẩm không qua membrane được gọi là retentate

 Cấu trúc membrane:

Membrane thường có độ dày rất nhỏ, tối đa chỉ lên đến vài trăm μm Đường kính các lỗ mao dẫn trên membrane cũng rất nhỏ, từ 10-4 đến10 μm

Membrane có cấu trúc vi xốp Theo cấu trúc, người ta chia membrane thành 2 nhóm:

− Cấu trúc đẳng hướng: gồm 1 lớp màng duy nhất với độ dày trung bình 0.05 – 0.2 μm Các ống mao dẫn trên membrane có đường kính không đổi, được bố trí song song với nhau và cùng vuông góc với bề mặt membrane Membrane vi xốp được chế tạo từ nhiều loại vật liệu khác nhau như ceramic, graphite, kim loại, oxit kim loại hoặc các loại polymer Membrane vi xốp thường được chế tạo bằng một số kỹ thuật như: nung kết, kéo căng, đảo pha…

Hình 1.2 Cấu trúc membrane vi xốp đẳng hướng

− Cấu trúc bất đẳng hướng: được cấu tạo từ hai lớp màng kết dính nhau Lớp trên gọi là lớp bề mặt có độ dày từ 0.1-0.5 μm Đường kính các mao dẫn của lớp bề mặt thường rất nhỏ Lớp bên dưới có độ dày dao động trong khoảng 100-200

μm với chứ năng làm tăng độ bền cơ học cho membrane Đường kính các lỗ

Trang 12

mao dẫn của lớp này khá lớn Lớp bên dưới có chức năng làm tăng độ bền cơ học cho membrane, nên loại này thường đóng vai trò là khung đỡ.

Hình 1.3 Cấu trúc membrane vi xốp bất đẳng hướng

Theo W Zhang và cộng sự 1998, cấu trúc membrane ảnh hưởng rất lớn đến quá trình hoạt động MBRs Qua khảo sát, ông đã kết luận rằng membrane bất đẳng hướng gây ra hiện tượng tắc nghẽn màng nghiêm trọng hơn so với membrane đẳng hướng

 Cấu tạo membrane

Membrane có thể được cấu tạo từ nhiều loại vật liệu khác nhau Trong lĩnh vực thực phẩm, người ta thường sử dụng membrane được làm từ cellulose acetat, các polyamide, polysulfone, ceramic và một số loại polymer khác

 Membrane được sản xuất từ cellulose acetate có ưu điểm là ưa nước, đường kính lỗ mao dẫn có thể dao động một khoảng rất lớn và giá thành thấp Tuy nhiên, chúng có một số nhược điểm như khoảng nhiệt độ và pH hoạt động khá hẹp (Tmax ≤ 35-400C; pH = 3-8), kém bền với các chất tẩy rửa công nghiệp như chlorine và dễ bị phân hủy sinh học

 Membrane polyamide nhìn chung có khoảng nhiệt độ và pH hoạt động rộng hơn các membrane cellulose triacetat (Tmax ≤ 500C; pH = 3-11) nhưng lại kém bền hơn với chlorine và trong quá trình vận hành, dòng permeate dễ bị tắc nghẽn hơn

 Membrane polysulfone có khoảng nhiệt độ và pH hoạt động khá rộng (Tmax

≤750C; pH = 1-13) và bền với chlorine Tuy nhiên, các vật liệu PS và PES chịu áp lực kém và do có tính kỵ nước nên trong vận hành, dòng permeate dễ bị tắc nghẽn

 Các membrane ceramic được chế tạo theo từng module riêng biệt Các module thường có hình trụ, bên trong gồm nhiều kênh dạng ống được xếp song song theo suốt chiều cao thân trụ của module Người ta sử dụng ceramic làm membrane và một số vật liệu khác làm chất mang để tạo nên các kênh cho dòng vào, dòng ra retentate, và dòng permeat trong module Các thông số kỹ thuật như chiều cao của module, độ dày lớp màng ceramic, kích thước lỗ mao dẫn… sẽ được tính toán theo yêu cầu người sử dụng

Membrane ceramic có rất nhiều ưu điểm như trơ với các hóa chất như acid, kiềm, chlorine… Khoảng nhiệt độ và pH hoạt động rất rộng (Tmax≤3500C;

pH = 0.5-13), do đó ta có thể sử dụng hơi để vô trùng thiết bị Tuy nhiên, chúng

Trang 13

khá dễ vỡ bởi những va chạm cơ học, giá thành cao và đường kính lỗ mao dẫn các membrane ceramic hiện nay không thể nhỏ hơn 10-2 μm.

B.2/ Ứng dụng thiết bị membrane vào hệ thống MBRs:

1 Con đường hình thành:

Theo phương pháp lên men truyền thống, quá trình lên men thường được thực hiện trong bồn lên men tĩnh (batch fermentors), tuy đơn giản nhưng sự ức chế sản phẩm sinh ra đối với hoạt tính của giống vi sinh vật rất mãnh liệt, kết quả là làm cho nồng độ sản phẩm rất thấp Chẳng hạn như trong sản xuất ethanol bởi nấm men, tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm cồn tại mức 6% ethanol sinh ra chỉ đạt ½ so với mức chưa có ethanol sinh ra, còn ở mức 12% thì chỉ bằng 1% so với lúc ethanol chưa sinh ra, kết quả là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm lên men thấp trong thiết bị lên men tĩnh truyền thống (tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm được đo bởi tổng khối lượng sản phẩm trên 1 đơn vị thể tích trong 1 đơn vị thời gian - g/L.h) Vì thế, người ta đề

ra những biện pháp nhằm cải thiện hệ thống lên men, cụ thể là đưa ra mô hình CSTR (continuous stirred tank reactors – thiết bị lên men liên tục có cánh khuấy):

− Sử dụng quá trình liên tục thay vì thực hiện lên men tĩnh

− Vận hành ở tốc độ pha loãng cao

− Mật độ tế bào cao tại mọi thời điểm

− Liên tục tháo sản phẩm cuối cùng để tránh ức chế

Nhờ đó, việc điều khiển quá trình sẽ tốt hơn, cải thiện được hiệu suất lên men.Tuy nhiên, mô hình này vẫn có nhược điểm chính là tốc độ pha loãng không thể lớn hơn tốc độ sinh trưởng cực đại của tế bào, nếu không tế bào sẽ bị rửa trôi Hồi lưu tế bào giúp tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm cao hơn Và mặc dù ly tâm là hiệu quả cho quá trình phân tách vi sinh vật, nhưng chi phí đầu tư, vận hành và bảo trì rất cao

Sử dụng membrane bán thấm ra đời từ rất sớm vào năm 1896, khi Metchnikoff

et al nỗ lực chỉ ra sự tồn tại độc tố cholera trong canh trường nuôi cấy Cholera vibrios trong collodion sac Gerhardt và cộng sự đã thực hiện một vài thí nghiệm

đầu tiên trên hệ thống thẩm tách cho nhiều ứng dụng khác nhau Họ chỉ ra việc tháo bỏ liên tục sản phẩm trao đổi chất sẽ cho kết quả tốt hơn trong quá trình lên men Tuy nhiên sự thẩm tách không khả thi ở quy mô công nghiệp, vì tốc độ phản ứng bị giới hạn bởi tốc độ cơ chất và sản phẩm có thể khuếch tán qua màng Sử dụng động lực áp suất bằng MF hay UF hiệu quả hơn (Michaels 1968) Budd và Okey 1969 lần đầu tiên ứng dụng mô hình hồi lưu tế bào với membrane để xử lý nước thải Và nó cũng được chú ý trong sản xuất ethanol và acid lactic Trường hợp sản xuất ethanol

bởi nấm men Kluyveromyces fragilis, nồng độ tế bào đạt 90g/L là tối ưu Sản xuất acid lactic bằng Lactobacillus sp yêu cầu khoảng 60 g/L Nhiều nghiên cứu đã cho

thấy được hiệu quả của sự phối hợp membrane vào quá trình lên men, như trong sản

xuất acid acetic từ glucose bởi vi khuẩn Clostridium thermoaceticum trong điều

kiện kỵ khí (Parekh và Cheryan 1994), kết quả là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm gấp 10 lần so với quá trình lên men tĩnh Sản xuất giấm trong điều kiện hiếu khí từ

ethanol bằng Acetobacter aceti, một trường hợp đạt tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm

là 8g/L.h (Reed và Bogdam 1986), trường hợp khác hiệu suất đạt 12.6 g/L.h – gấp 4.6 lần so với lên men tĩnh (Park et al 1989)

Tóm lại, hệ thống MBRs là kết quả tốt nhất để làm tăng nồng độ sinh khối và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm trong các quá trình lên men

Trang 14

2 Các loại mô hình membrane trong MBRs:

Vì mục đích sử dụng membrane là phân tách vi sinh vật thu nhận sản phẩm nên trong MBRs, thường người ta sử dụng membrane vi lọc (microfiltration – MF), cũng có một số trường hợp sử dụng membrane loại siêu lọc (ultrafiltration – UF).Thiết bị membrane trong hệ thống MBRs phổ biến với 4 mô hình sau: thiết bị dạng ống, dạng bảng, dạng sợi và dạng cuốn xoắn

a Mô hình ống

Thiết bị membrane có dạng hình trụ, bên trong chứa nhiều ống trụ nhỏ đặt song song Mỗi ống trụ nhỏ thường được cấu tạo bằng thép không rỉ, có đường kính dao động từ 12.5-75mm, chiều dài khoảng 0.6-6.4m và được đục các lỗ nhỏ trên thân Các membrane cũng có dạnghình trụ được lồng ép sát thành trong của các ống trụ nhỏ trên

Hỗn hợp sau lên men hoặc canh trường sẽ được bơm vào từ một đầu của thiết bị và được phân phối vào bên trong các ống trụ nhỏ Dòng retentate sẽ tiếp tục đi hết theo chiều dài các ống trụ nhỏ và thoát ra ở đầu bên kia của thiết bị rồi hồi lưu về thiết bị lên men (nếu có) Dòng permeate sẽ chui qua các mao dẫn của membrane và thoát ra bên ngoài các ống trụ nhỏ, sau đó được tập trung theo cửa ra chung nằm phía trên thân thiết bị

Hình 1.4 Thiết bị membrane – mô hình ống

Bên trong thiết bị membrane có thể được chia thành nhiều khoang, mỗi khoang gồm một số ống trụ nhỏ song song nằm cạnh nhau Đầu tiên hỗn hợp sau lên men (canh trường) sẽ được bơm vào một khoang trong thiết bị Dòng retentate thoát ra khỏi khoang này và đi tiếp vào khoang thứ hai, còn dòng retentate thoát ra từ khoang thứ hai sẽ đi tiếp vào khoang thứ ba và cứ tiếp tục… Như vậy dòng retentate thoát ra từ khoang cuối sẽ có nồng độ đạt giá trị yêu cầu

Hình 1.5 Thiết bị membrane – mô hình ống

Trang 15

Mô hình ống có ưu điểm là tạo ra dòng chảy rối trong quá trình vận hành; đơn giản khi vệ sinh, thay thế membrane sử dụng và bảo trì thiết bị Tuy nhiên, thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều không gian nhà xưởng và tốn nhiều năng lượng sử dụng do có sự tụt áp của dòng nguyên liệu trong các ống hình trụ nhỏ.

b Mô hình sợi

Mô hình sợi có cấu tạo như mô hình ống Thiết bị membrane được chế tạo bằng thép không rỉ có dạng hình trụ với đường kính thường dao động trong khoảng 2.5-17cm, chiều dài 18-120cm Bên trong thiết bị chứa bó sợi membrane Mỗi module chứa từ 50-3000 sợi Đường kính sợi thay đổi từ 0.2-3mm Thông thường chiều dày membrane từ 100-400μm

Trong vận hành, hỗn hợp sau lên men hoặc canh trường được bơm vào bên trong thiết bị và chui vào trong các sợi membrane Dòng retentate sẽ đi hết theo chiều dài sợi và tập trung thoát ra ở đầu còn lại của thiết bị Dòng permeate sẽ chui qua các lỗ mao dẫn, thoát ra ngoài sợi rồi được tập trung về cửa ra nằm trên thân thiết bị Riêng hãng Dupont thiết kế một số thiết bị sử dụng trong kỹ thuật thẩm thấu ngược đã cho dòng hỗn hợp sau lên men đi vào khoảng không gian trống giữa các sợi membrane, khi đó, một số cấu tử sẽ chui qua mao dẫn membrane để vào bên trong sợi tạo nên dòng permeate

Hình 1.6 Thiết bị membrane – mô hình sợi

Ưu điểm của mô hình sợi là dễ chế tạo, thiết bị ít chiếm diện tích nhà xưởng dù diện tích membrane sử dụng rất lớn, điều này rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật trên màng, hay trong trường hợp cố định tế bào vi sinh vật, membrane này ít tốn năng lượng cho quá trình Tuy nhiên, trong vận hành, một số sợi membrane dễ bị tổn thương và việc thay thế chúng khá tốn kém và phức tạp Hơn nữa, do đường kính sợi membrane khá nhỏ, những nguyên liệu dạng keo dễ gây tắc nghẽn membrane

c Mô hình bảng/ tấm

Trang 16

Mỗi đơn vị cấu tạo nên mô hình bảng bao gồm một tấm đỡ, hai miếng đệm và hai membrane ép sát vào nhau Các tấm đỡ có dạng hình hộp chữ nhật với độ dày rất mỏng, diện tích bề mặt từ 0.11-0.35 m2 Các miếng đệm có cấu trúc vi xốp được ép sát và phủ kín bề mặt tấm đỡ Các membrane dạng tấm có diện tích bề mặt bằng đúng với diện tích bề mặt tấm đỡ và được đặt sát lên các miếng đệm

Trong thiết bị membrane, các đơn vị trên được đặt song song với nhau Tùy thuộc vào số đơn vị được lắp ráp nhiều hay ít mà tổng diện tích membrane sử dụng trong thiết bị có thể dao động trong một khoảng rất lớn, từ 0.1-100 m2 Khoảng cách giữa các đơn vị là cửa vào cho dòng nhập liệu và cửa ra cho dòng retentate Một số cấu tử trong dòng nhập liệu sẽ chui qua mao dẫn membrane, theo các lỗ vi xốp của tấm đệm rồi tập trung thoát ra ngoài tạo nên dòng permeate

Ưu điểm lớn nhất của mô hình bảng là việc tháo lắp vệ sinh thiết bị đơn giản Ngoài ra mô hình này còn có tính linh động cao

d Mô hình cuộn xoắn

Thiết bị gồm hai ống hình trụ cùng trục, cùng chiều cao nhưng có đường kính khác nhau và được đặt lồng vào nhau Cả hai được chế tạo bằng thép không rỉ Ống hình trụ nhỏ được đục lỗ trên thân và là nơi tập trung các cấu tử của dòng permeate Khoảng không gian được giới hạn bởi mặt ngoài thân trụ nhỏ và mặt trong thân trụ lớn là hai tấm membrane hình chữ nhật cuộn lại theo hình xoắn ốc (bề mặt hoạt động của hai membrane được quay ngược nhau), cách nhau bởi một tấm đệm với vật liệu phổ biến là polypropylene

Hình 1.7 Thiết bị membrane – mô hình cuộn xoắn

Trang 17

Dòng nhập liệu được bơm vào một đầu thân trụ và di chuyển dọc theo thân trụ bởi một kênh có cơ cấu tiết diện hình xoắn ốc Dòng sản phẩm retentate sẽ được tập trung và thoát ra ở đầu kia của thiết bị hình trụ Các cấu tử permeate sẽ chui qua mao dẫn của hai membrane để vào kênh dẫn dành riêng cho chúng Kênh này cũng có tiết diện hình xoắn ốc và được liên thông với ống hình trụ trung tâm Từ ống hình trụ trung tâm, dòng permeate sẽ được tập trung thoát ra ngoài thiết bị.

Ưu điểm của mô hình này là giá thành thấp hơn so với các mô hình khác Tuy nhiên, tính linh động của màng không cao

Mỗi loại membrane có những ưu nhược điểm khác nhau Tùy vào điều kiện thực tế mà các nhà sản xuất chọn mô hình membrane phù hợp cho hệ thống MBRs Chẳng hạn như

- Khi khảo sát quá trình vận hành dài liên tục của Saccharomyces cerevisiae sinh

tổng hợp ethanol trên hệ thống MBRs, người ta sử dụng thiết bị membrane là 13 ống ceramic hình trụ song song cách đều và đặt bên trong bình lên men, mỗi ống hình trụ có đường kính trong 8mm, đường kính ngoài 11mm, chiều cao 80mm (B.G.Park và cộng sự 1998)

- Membrane có cố định xúc tác sinh học thường được sử dụng trong mô hình sợi vì mô hình này có ưu điểm là diện tích bề mặt lớn Ví dụ như trong quá trình lên men chuyển hóa đường saccharose thành đường palatinose bằng cách cố định tế bào

Serratia plymuthica trên membrane sợi rỗng được làm từ những sợi polysulfone dày

200μm, đường kính trong 8μm (A Krastanov và cộng sự 2007)

B.3/ Cấu tạo và phương thức hoạt động của MBRs:

Đối với nhà sản xuất, việc lựa chọn phù hợp cấu tạo và phương thức hoạt động cho

mô hình MBRs là rất quan trọng, làm sao để đạt được hiệu quả trong quá trình sinh học đồng thời quá trình phân tách sản phẩm được dễ dàng, hạn chế tối đa những sự cố về thiết bị lên men cũng như về màng

1 Hệ thống MBRs với membrane nằm ngoài thiết bị lên men (external membrane bioreactor)

a Mô hình hồi lưu đơn giản

Hình 1.8 Mô hình MBR đơn giản

Trang 18

Mô hình gồm có hệ thống thiết bị lên men, một thiết bị membrane và một bơm Bình lên men có cánh khuấy, có thể hoạt động theo chu trình kín hay bán kín, có hồi lưu (membrane recycle bioreactor – MRB) Thể tích sử dụng của thiết bị membrane nhỏ hơn nhiều so với thiết bị lên men chính Ban đầu, bình lên men được châm cơ chất và tạo điều kiện thích hợp cho quá trình lên men, vi sinh vật được bổ sung vào môi trường và thực hiện quá trình chuyển hóa sinh học Sau đó, hỗn hợp trong bình sau khi lên men được bơm qua membrane (phổ biến là MF), tại đây thực hiện quá trình phân tách, vi sinh vật bị giữ lại trên màng, còn sản phẩm và những chất tan có phân tử lượng nhỏ thấm qua màng tạo dòng permeate và thoát ra khỏi hệ thống Dòng retentate gồm sinh khối và cơ chất chưa sử dụng được hồi lưu trở về bình lên men để tiếp tục thực hiện quá trình.

Tổng thể tích của hệ thống luôn giữ không đổi, tức luôn cân bằng lưu lượng dòng cơ chất vào và dòng sản phẩm ra (dòng permeate)

Nếu cơ chất có phân tử lượng lớn, những phần chưa bị thủy phân hay chỉ mới thủy phân một phần có kích thước đủ lớn để không lọt qua membrane, mà nó sẽ được hồi lưu về bình lên men Nhưng nếu cơ chất có phân tử lượng nhỏ (glucose chẳng hạn), thì cơ chất không sử dụng cũng sẽ chui qua membrane để thoát ra cùng dòng permeate Vì thế, dù nói là MRB có thể áp dụng với mọi loại cơ chất, nhưng thực tế, MRB chỉ thích hợp với những kiểu lên men từ cơ chất có phân tử lượng lớn (như protein, tinh bột, cellulose )

Nhờ có sự hồi lưu về thiết bị lên men nên MRB hạn chế đáng kể sự ức chế do sản phẩm sinh ra Ngoài ra, MRB còn có một số ưu điểm khác như nồng độ sinh khối cao, tế bào được tái sử dụng liên tục, nhờ đó mà chi phí nhân giống và bảo quản giống giảm đáng kể

Tuy nhiên, sự khuấy trộn hoàn toàn trong thiết bị lên men làm ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa sinh học của vi sinh vật, do nồng độ cơ chất có giới hạn Cụ thể là trong

trường hợp sản xuất acid acetic từ dịch chiết trái cây, ethanol sinh ra bởi Sacchromyces cerevisiae từ đường trong dịch chiết trái cây được bơm qua membrane, nên còn lại không nhiều trong bình lên men để Acetobacter aceti chuyển hóa ra acid acetic, từ đó, việc sinh

tổng hợp acid acetic sẽ giảm Để khắc phục nhược điểm này, người ta đề xuất ra dạng MRB khác

b Mô hình hồi lưu mắc nối tiếp

Hình 1.9 Mô hình MRB mắc nối tiếp

Cơ chất S với tốc độ dòng chảy F và nồng độ S0 được đưa vào bậc thứ nhất có thể tích

V1 và nồng độ xúc tác là C1 Dòng permeate từ bậc thứ nhất có chứa sản phẩm nồng độ P1

Trang 19

tiếp tục đưa qua bậc thứ hai có nồng độ xúc tác là C2 với thể tích V2 Quá trình cứ tiếp tục đến bậc thứ n là nơi đòi hỏi mức độ chuyển hóa phải đạt, sản phẩm cuối cùng rời khỏi hệ thống có nồng độ Pn tại tốc độ dòng chảy F

Tổng thể tích của hệ thống này được giảm thiểu so với mô hình hồi lưu không mắc nối tiếp, nhờ đó tốc độ phản ứng ở các bậc được cải thiện đáng kể (ngoại trừ bậc cuối cùng) Tuy nhiên, hệ thống phức tạp, chi phí membrane và bơm là khá cao, kết hợp với phần cứng và hệ thống điều khiển phức tạp, nên không có hiệu quả kinh tế khi sử dụng quá ba bậc

Áp dụng hệ thống MRB mắc nối tiếp này là hiệu quả trong quá trình sản xuất ethanol từ tinh bột (Lee at el 1982) hay sản xuất acid acetic từ dịch chiết trái cây như đã đề cập ở trên, với bậc thứ nhất diễn ra quá trình sinh tổng hợp ethanol bởi nấm men, chuyển

ethanol đó qua bậc thứ hai, Acetobacter dùng ethanol này chuyển hóa thành acid acetic.

Loại MRB này khá nhạy khi thay đổi tốc độ pha loãng hay thời gian lưu Nếu tốc độ pha loãng quá cao trong bậc thứ nhất, nấm men sẽ ngừng trao đổi fructose Còn ở bậc thứ

hai, tốc độ pha loãng cao sẽ làm giảm việc sử dụng ethanol của Acetobacter và giảm luôn

hàm lượng acid acetic sinh ra

c Mô hình hồi lưu nhiều bậc nhưng chỉ có 1 module membrane ở bậc cuối

Hình 1.10 Mô hình MBR nhiều bậc với 1 module membrane

Hoạt động hệ thống cũng tương tự như trên Cơ chất S với tốc độ dòng chảy F và nồng độ S0 được đưa vào bậc thứ nhất có thể tích V1 và nồng độ xúc tác là C1 Toàn bộ hỗn hợp sau lên men từ bậc thứ nhất sẽ được chuyển vào bậc thứ hai có nồng độ xúc tác là C2 với thể tích V2, và cứ như vậy cho tới bậc thứ n Tại bậc thứ n này, hỗn hợp sau lên men được đưa qua thiết bị membrane Dòng permeate chứa sản phẩm được tháo ra ngoài có nồng độ Pn tại tốc độ dòng chảy F

Mô hình này có hiệu quả kinh tế cao hơn so với mô hình hồi lưu mắc nối tiếp vì giảm đáng kể chi phí membrane, chi phí vận hành, đặc biệt nó khả thi hơn nếu cơ chất và sản phẩm dễ thấm qua membrane Trong hệ thống này, toàn bộ quá trình được đánh giá qua tỷ số hồi lưu R/F Với tỷ số cao nghĩa là vi sinh vật phân phối đều trong các bậc, trong khi nếu tỷ số này thấp, thì việc chuyển hóa hầu như thực hiện ở bậc cuối cùng Điều này được thể hiện rất rõ trong quá trình chuyển hóa N-acetyl- D,L-methionine thành L-methionine bởi enzyme acylase (Wandrey và Flaschel 1979)

Trang 20

Hệ thống này được ứng dụng trong lên men ethanol liên tục từ glucose bằng Z mobilis, sử dụng mô hình hai bậc, với V1=1.65L, V2=0.83L, sinh khối trong bậc thứ hai cao hơn gấp 10 lần so với bậc đầu tiên, nồng độ ethanol sinh ra rất cao và cơ chất được sử dụng hiệu quả (Charley et al 1983) Hoặc trường hợp khác, đối với lên men sodium

acetate từ glucose bởi Clostridium thermoacetium, sử dụng hệ thống MRB hai bậc, kết

quả là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tăng 11%, nồng độ sản phẩm cao hơn so với MRB một bậc Tỷ số hồi lưu R/F là 0.25, cơ chất và nguồn dinh dưỡng được cung cấp ở bậc 1 Nồng độ tế bào trong bậc thứ hai cao gấp 3 lần so với bậc đầu Hệ thống MRB hoạt động ổn định và có thể kéo dài thời gian vận hành (Shah và Cheryan 1995)

2 Hệ thống MBRs với membrane nằm bên trong (internal membrane bioreactor)

Membrane nằm bên trong thiết bị lên men, hay nói cách khác, membrane được sử dụng như một bioreactor, tức ở trường hợp này, membrane thực hiện cả hai chức năng: vừa đóng vai trò là chất mang để vi sinh vật thực hiện chuyển hóa trao đổi chất, vừa thực hiện quá trình phân tách ngay sau khi vi sinh vật sinh tổng hợp sản phẩm

Hình 1.11 Mô hình MBRs với membrane bên trong

Cố định tế bào trên membrane được thử nghiệm khá thành công (Belfort và Heath 1993), và ứng dụng hiệu quả trong vấn đề tăng mật độ sinh khối Tế bào được đổ lên khắp màng với dòng chảy của môi trường ổn định liên tục, nguồn dinh dưỡng và oxy được cung cấp, vi sinh vật sẽ thực hiện quá trình sinh tổng hợp tạo sản phẩm ở bề mặt màng, sau đó sản phẩm ta cần được tháo ra, còn tế bào thì bị giữ lại trên membrane Rất nhiều loại hình membrane được nghiên cứu (như mô hình tấm hay cuộn xoắn…), mặc dù là dạng sợi rỗng luôn đặc biệt chú ý Tế bào vi sinh vật có thể sinh trưởng cùng với môi trường trên khắp các sợi trong khoảng không gian phía ngoài mao dẫn, hoặc là sinh trưởng bên trong các sợi, lúc này dòng môi trường ở phía ngoài hoặc từ ngoài khuếch tán vào các sợi Hiện tượng này ít xảy ra do sự truyền khối bị hạn chế (Heath và Belfort 1988) Một số hình dạng khác được nghiên cứu như vi sinh vật được phát triển trên các vành giữa 2 sợi (Custer 1988) Việc lựa chọn đường kính trong và đường kính ngoài thích hợp có thể hạn chế khoảng cách cần khuếch tán của các thành phần trong môi trường (oxy, glucose, glutamine, và các chất dinh dưỡng khác…), những tế bào xa nhất khoảng 50μm So với thiết bị truyền thống thì hệ thống này thu được nồng độ tế bào cao hơn, hiệu suất riêng và mật độ tế bào cũng lớn hơn

Loại MBR này được sử dụng sinh tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất, chẳng hạn như sản xuất amino acids, thuốc kháng sinh, kháng viêm, vitamin… còn trong sản xuất thực phẩm đa phần là thu nhận sinh khối, nên việc thu nhận sản phẩm là khó khăn

Trang 21

Có 2 trường hợp:

a Trường hợp có sự vận chuyển môi trường qua membrane

Hình 1.12 Mô hình MBRs có sự vận chuyển môi trường qua membrane

Trong quá trình vận hành, dưới áp suất, membrane cho phép khuếch tán các chất dinh dưỡng đi qua bề mặt của nó Không khí được cung cấp một bên bề mặt membrane (nơi cố định vi sinh vật) tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển Bên trong membrane vi sinh vật không thể phát triển hiếu khí được, mà chỉ có sự di chuyển của cơ chất và sản phẩm Sản phẩm vi sinh vật sinh tổng hợp sẽ được tháo ra ngoài theo định kỳ

Điển hình là membrane ceramic nung kết, nó có ưu điểm là không thấm nước nên đảm bảo điều kiện vận chuyển cơ chất dưới áp suất và khuếch tán sản phẩm Hay membrane dạng sợi rỗng có lớp màng sinh học ở phía ngoài, tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa vi sinh vật và cơ chất

Tuy nhiên, hệ thống này có nhược điểm là việc vận chuyển qua màng đòi hỏi phải có áp suất, nếu áp suất qua màng mà không ổn định sẽ ảnh hưởng đến tính chất và hoạt tính của màng, màng dễ bị nứt vỡ, tổng các lỗ xốp thấp làm hoạt tính màng thấp, nguồn dinh dưỡng giảm làm hạn chế sự phát triển sinh khối vi sinh vật, từ đó hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm không cao

Để khắc phục nhược điểm này, yêu cầu nguồn dinh dưỡng phân bố đều khắp màng để tránh bị hư hỏng dưới áp suất

Hơn nữa, hệ thống này đòi hỏi kết cấu khá phức tạp, giá mang sẽ gây ảnh hưởng đến lớp màng sinh học, làm giảm tốc độ khuếch tán oxy và chất dinh dưỡng qua màng

Ở hệ thống này, có thể có hoặc không có hồi lưu Dưới đây là một minh họa về mô hình hồi lưu:

Trang 22

Hình 1.13 Mô hình hồi lưu

Đầu tiên, chất dinh dưỡng đưa vào theo hệ thống dòng vào, sau đó khuếch tán qua membrane Membrane dạng tấm phẳng thẳng đứng, gồm 2 membrane đi liền với nhau thành từng cặp, mỗi membrane có một lớp màng sinh học cố định trên đó, lớp màng này chứa vi sinh vật, không khí được thổi vào khắp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển hiếu khí trên màng Bộ phận cào giúp việc lưu thông khí tốt hơn Sản phẩm sinh ra được khuếch tán qua màng theo dòng ra cùng với nguồn cơ chất không khuếch tán Sau đó sản phẩm sẽ được phân tách, còn lại sẽ được hồi lưu về tiếp tục quá trình

b Trường hợp môi trường không khuếch tán qua membrane

Hình 1.14 Mô hình MBR không có sự vận chuyển môi trường qua membrane

Trang 23

Vi sinh vật ban đầu ở bên trong pha lỏng Khí oxy được bơm vào ở một phía khác của membrane Vi sinh vật muốn phát triển hiếu khí phải bám lên membrane để lấy oxy Từ bề mặt này, quá trình trao đổi chất sinh tổng hợp sản phẩm hình thành Sản phẩm sẽ được tháo ra ngoài theo định kỳ.

Mô hình này có nhược điểm là khí đi vào phải cung cấp dưới áp suất, membrane phải chịu được áp lực khí cao, làm chi phí thiết bị tăng, điều khiển phức tạp

3 Hệ thống MBRs với hai thiết bị lên men có sự trao đổi cơ chất lẫn nhau:

Nghiên cứu về tương tác vi sinh vật thường đòi hỏi phương pháp phân tích phức tạp và đắt tiền Trong quá trình lên men, một trong các thông số quan trọng cần phải xác định là sinh khối Tuy nhiên, việc xác định sinh khối cực kỳ khó khăn nếu có 1 hệ vi sinh vật cùng phát triển chung, đặc biệt là những vi sinh vật cùng loài, dù rằng xác định sinh khối tổng là không khó

Hơn nữa, mỗi loại vi sinh vật có điều kiện sinh trưởng và phát triển khác nhau, lượng oxy đòi hỏi cũng khác nhau Nếu vi sinh vật cùng tồn tại chung trong một môi trường, sẽ rất khó điều chỉnh nhu cầu lượng oxy cho chúng

Vì vậy, người ta đưa ra phương pháp là để mỗi vi sinh vật phát triển riêng trong mỗi bình lên men, và nguyên tắc cơ bản là cần có sự hòa trộn đều giữa hai canh trường, sao cho tại bất kỳ thời điểm nào, thành phần cơ chất của môi trường trong cả hai bình luôn giống nhau, ngoại trừ điều kiện oxy trong 2 bình là khác nhau để tương ứng với sự sinh trưởng của mỗi loài vi sinh vật trong mỗi bình lên men

Trường hợp này, membrane có thể nằm trong hay nằm ngoài thiết bị lên men, số lượng membrane có thể chỉ là một, cũng có thể tương ứng với số lượng bình lên men

Dưới đây là hai mô hình điển hình:

a Mô hình hai bình lên men với 1 membrane nằm trong (Sebastien Pommier và cộng sự 2002)

Hình 1.15 Mô hình MBRs với membrane trong bình

Hai bình lên men được nối với nhau bởi module membrane sợi rỗng, chìm vào chất lỏng của một trong hai bình Các sợi có dạng chữ U được nối với nhau tại phần trên với các hạt nhựa tổng hợp Chùm này được chứa trong túi thép không rỉ Kích thước lỗ sợi membrane khoảng 0.1μm cho phép sản phẩm trao đổi chất và cơ chất đi qua, trong khi các

Trang 24

tế bào vi sinh vật bị giữ lại Sử dụng áp suất gây ra dòng chảy giữa hai bình, cũng như vấn đề hòa trộn Hiệu quả hơn trong trường hợp có điều khiển việc súc rửa định kỳ để hạn chế hiện tượng tắc nghẽn màng

b Mô hình hai bình lên men với hai thiết bị membrane nằm ngoài (Masayuki Taniguchi và cộng sự 1997)

Đối với môi trường là hỗn hợp nhiều chất, chẳng hạn như môi trường là hỗn hợp hai loại đường: xylose và glucose, người ta muốn sản xuất ethanol từ việc nuôi cấy hỗn hợp

vi sinh vật gồm hai loại là Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis Theo phương

pháp truyền thống, người ta cùng cho hỗn hợp giống cấy này vào chung một bình lên men, và kết quả thu được là hiệu suất sinh tổng hợp ethanol rất thấp, thấp hơn cả việc chỉ

nuôi cấy riêng Pichia stipitis, do không thể điều chỉnh phù hợp lượng oxy tối ưu cho mỗi

loại vi sinh vật phát triển Hiện tượng sinh trưởng kép (diauxic) xuất hiện trong trường hợp này, tức là glucose phải được tiêu thụ gần hết rồi mới tới việc tiêu thụ xylose trong canh trường Vì vậy, người ta đã đề ra giải pháp là: cũng hỗn hợp giống đó nhưng nuôi cấy riêng từng loài trong từng bình lên men, và điều chỉnh các thông số kỹ thuật tối ưu cho mỗi loài phát triển

Hình 1.16 Mô hình MBRs với 2 membrane ngoài 2 bình Trong trường hợp này, Pichia stipitis cho vào bình lên men A, Saccharomyces cerevisiae cho vào bình lên men B, nuôi cấy riêng ở điều kiện thích hợp cho mỗi loài (A

và B – TBR2, Sakura Seiki Co.,Tokyo) Tại bình A, người ta cung cấp khí với lưu lượng

khí thích hợp, tối ưu cho sự phát triển của Pichia stipitis Canh trường sau lên men ở bình

A được đưa qua bơm E rồi vào membrane C (C và D – Microza MF, EMP 13, Asahi Kasei Kogyo Co., Tokyo) Ở đây, quá trình lọc thực hiện tách bỏ sinh khối Dòng permeate chủ yếu là ethanol tiếp tục đưa qua bộ phận điều chỉnh lọc G rồi vào bình lên men B Có sự hòa trộn đồng đều giữa hai canh trường trong hai bình lên men nhằm ổn

định quá trình lên men Tại bình lên men B, S cerevisiae phát triển trong điều kiện kỵ khí

(bằng cách cung cấp khí nitơ) Canh trường sau lên men ở bình này được đưa qua bơm F vào thiết bị membrane Dòng permeate trở về lại A qua bộ phận điều chỉnh lọc H Quá trình cứ tiếp tục cho đến khi hiệu suất ethanol đạt yêu cầu

Trang 25

B.4- Một số hiện tượng xảy ra trong quá trình hoạt động MBRs:

Trong quá trình hoạt động của MBRs, nồng độ sinh khối cao có thể ảnh hưởng không tốt đến tính chất của chất lỏng (có thể là sự chuyển khối, hay hiện tượng tắc nghẽn…), cũng như ảnh hưởng xấu đến khả năng xúc tác sinh học của tế bào vi sinh vật (hình thái cấu tạo, hoạt tính…) Trong quá trình phân riêng, trên bề mặt membrane có thể có đến

106CFU/cm2, bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men (Baker và Dudley 1998) Hơn nữa, việc vận hành cánh khuấy, bơm hay các tác động cơ học khác cũng có thể làm ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi sinh vật và phân tách sản phẩm

1 Hiện tượng tắc nghẽn membrane:

a Nguyên nhân

Hiện tượng tắc nghẽn membrane có thể do những cấu tử rắn lơ lửng, cơ chất hay sản phẩm sinh ra… từ quá trình lên men Các phần tử này bám trên membrane hay các bề mặt lỗ, hấp phụ vào các lỗ membrane gây tắc màng, và cũng có khi các phần tử này lắng xuống tạo nên lớp bánh quanh màng

Hình 1.17 Ba hiện tượng gây ra tắc nghẽn membrane

A Sự hấp thụ (Adsorption)

B Tắc lỗ (Pore clogging)

C Lớp bánh (Cake formation)

• Hấp thụ

Việc hấp thụ các phần tử lên membrane phụ thuộc vào thành phần môi trường và những sự biến đổi của chúng trong suốt quá trình trao đổi chất Ví dụ khi môi trường nuôi cấy nấm men mới được thay trong giai đoạn MF (Carbosep M14, Techsep France) đã làm giảm độ thấm nước lên tới 40% Sự hấp thụ các phần tử lên bề mặt membrane là khác nhau khi các vật liệu làm membrane khác nhau Ví dụ, acid humic và các vật liệu hữu cơ tự nhiên có tác động mạnh hơn lên sự giảm lưu lượng dòng so với các hạt keo

vô cơ khác, thậm chí ngay cả ở nồng độ thấp

Tính chất của các vật liệu hữu cơ có mối liên quan đến sự tắc nghẽn membrane bao gồm: sự tương đồng của chúng với membrane, khối lượng phân tử, các nhóm chức và hình dạng Sự tắc nghẽn membrane cũng liên quan chặt chẽ với tương tác kỵ nước của các vật liệu làm membrane Theo đó, membrane chế tạo từ các vật liệu có tính ưa nước thì thường ít gây tắc membrane hơn so với các membrane được chế tạo từ các vật liệu

Trang 26

Trở lực do lớp bánh tạo ra sẽ tăng khi các phần tử cấu thành lên các bánh đó giảm kích thước Các lớp gel của nguyên liệu có thành phần là các phân tử lớn sinh ra trở lực đáng kể Các lớp bánh và các lớp gel đóng vai trò như là một vật ngăn hay là một membrane thứ hai loại đi những phân tử chất tan trong dòng lưu chất.

b Hệ quả

Hiện tượng tắc nghẽn membrane dẫn đến hai hệ quả chính:

− Thứ nhất là tính chọn lọc của membrane bị thay đổi, làm cho những sản phẩm

ta mong muốn thu nhận trong dòng permeate bị giữ lại trên membrane

− Thứ hai là tốc độ dòng permeate giảm đáng kể do trở lực gây ra trong tắc nghẽn màng rất lớn Tốc độ giảm này tỉ lệ thuận với khối lượng của các chất tích tụ trong quá trình lên men Trong một thời gian ngắn, dòng permeate giảm đến khi sự dịch chuyển các phân tử tới tích tụ trên màng cân bằng sự thoát ra của các phân tử tích tụ trên màng ra khỏi màng, và khi đó lưu lượng dòng permeate giữ ở một giá trị ổn định

Trong suốt quá trình nuôi cấy S cerevisiae, tốc độ dòng permeate giảm rất nhanh

cùng lúc với việc tăng sinh khối, cho đến khi trạng thái cân bằng được thiết lập, nói chung là thấp hơn từ 5-10 lần so với dòng permeate hình thành ban đầu Việc giảm dòng chảy sẽ dẫn đến tốc độ pha loãng giảm, nguồn dinh dưỡng giảm làm hoạt tính riêng của vi sinh vật cũng sẽ giảm, kết quả là làm giảm hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm tính theo thể tích

Hiện tượng tắc nghẽn màng là một tính chất quan trọng được coi là làm thay đổi dòng chảy rất khó tránh khỏi Tùy từng hệ thống, sự thay đổi có thể diễn ra trong một hay nhiều giai đoạn, thường diễn ra ở tốc độ nhanh trong một vài phút đầu, sau đó sự thay đổi giảm dần Các phương pháp khắc phục có thể chỉ làm tăng dòng chảy một cách tạm thời hay đó chỉ là loại bỏ sự ảnh hưởng trong một giai đoạn ngắn mà thôi, chứ không hoàn toàn loại bỏ được hiện tượng này Việc ta có thể làm được là tối ưu hoá hệ thống để dòng chảy không giảm mạnh trong thời gian vận hành

2 Một số hiện tượng sinh học

Hoạt tính riêng của tế bào vi sinh vật giảm cùng lúc với nồng độ sinh khối tăng Tại mức tế bào đạt giá trị tới hạn thì tốc độ phát triển của vi sinh vật gần như là 0 Hoạt tính

vi sinh vật giảm còn do sự tích tụ độc tố ở dòng retentate, vì vậy, cần lựa chọn membrane phù hợp để tránh điều này Cũng có thể giải quyết bằng cách tăng tốc độ pha loãng, tuy nhiên, vấn đề về tốc độ pha loãng lại có liên quan đến hiện tượng tắc nghẽn membrane

Không chỉ ảnh hưởng đến hoạt tính mà sự vận hành của hệ thống MBRs còn ảnh hưởng đến tính toàn vẹn (hình dạng, cấu trúc vi sinh vật) do áp lực cơ học tác động lên các tế bào, từ đó ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng quá trình, nhất là trong các mô hình có hồi lưu sinh khối

Tóm lại, sự vận hành hệ thống MBRs cần được tối ưu hóa Muốn hiệu suất tăng nhanh, cần điều chỉnh giá trị tốc độ pha loãng, cũng như các yếu tố đầu vào phải phù hợp Hơn nữa, cần chú ý điều kiện vận hành không quá mãnh liệt dễ gây tắc nghẽn, kéo đến vô số hệ quả không tốt trong quá trình hoạt động của hệ thống

3 Một số hiện tượng khác

Trang 27

− Hiện tượng lưu biến của canh trường, cụ thể là khi sinh khối tăng, chất lỏng chuyển từ trạng thái Newton sang phi Newton, làm cho việc hòa trộn là khó khăn, cũng như quá trình truyền khối bị ảnh hưởng đáng kể.

− Khả năng chuyển hóa oxy ở những mô hình hiếu khí cũng là một vấn đề cần lưu tâm, vì đôi khi, oxy cung cấp không đủ để vi sinh vật thực hiện chuyển hóa sinh học, làm giảm hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm Hơn nữa, độ nhớt tăng, do sinh khối tăng, làm độ phân bố khí giảm

− Tương tác sinh học của quần thể vi sinh vật trong hệ thống

− Các vấn đề cần xử lý trong hệ thống đường dẫn, do bản chất của hỗn hợp sau lên men có độ nhớt tăng, nên hiện tượng nghẹt đường ống, nghẹt bơm rất dễ xảy ra, từ đó, lưu lượng dòng chảy giảm đáng kể ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình

Chương 2: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH VẬN HÀNH

MEMBRANE BIOREACTOR

Quá trình vận hành MBR khá phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn nên việc xét các yếu tố ảnh hưởng của nó đến chất lượng sản phẩm không phải là điều dễ dàng, cần phải tối ưu hóa bài toán đa biến

Khá nhiều nghiên cứu đã trực tiếp khảo sát các điều kiện vận hành cũng như tối ưu hóa những thông số công nghệ khác nhau trong MBRs Theo Giorno et al (2003), các thông số cần tối ưu hóa gồm có các yếu tố thuộc quá trình chuyển hóa sinh học (chủng loại vi sinh vật, hoạt tính giống, động học phản ứng, nguồn cơ chất, độ nhớt dòng vào và dòng ra…), các thông số hình học của membrane (hình dạng, cấu tạo, trạng thái, kích thước lỗ…) và các thông số thủy động lực học (áp suất qua màng, tốc độ dòng chảy…)

A Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Quá trình lên men trong MBR cũng giống như quá trình lên men trong các CSTR, thường đối với sản xuất công nghiệp, quá trình này được tóm tắt theo sơ đồ cân bằng vật chất như sau:

Môi trường trước lên men Canh trường sau lên men

Cơ chất + giống vi sinh vật  Cơ chất sót + Sinh khối vi sinh vật + các sản phẩm

trao đổi chất ngoại bào do vi sinh vật tổng hợp nên.Trong MBRs ứng dụng công nghiệp thực phẩm, canh trường sau lên men được đưa qua thiết bị membrane để tiếp tục lọc tách vi sinh vật, vì vậy thường dòng permeate của hệ thống này là những sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh vật, như dung môi hữu cơ (ethanol, butanol, acetone…), acid hữu cơ (acid lactic, citric…), acid amin (lysine, acid glutamic…), hoặc các enzyme do vi sinh vật tiết ra (protease, amilase, pectate lyase, glucosidase…) Do đó, các nhà sản xuất luôn đặt mục tiêu hàng đầu là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm phải càng cao càng tốt Thực tế, một giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp rất nhiều sản phẩm trao đổi chất, vấn đề đặt ra là ta muốn thu nhận sản phẩm nào, điều đó tùy thuộc vào sự kết hợp đồng thời của 3 yếu tố:

- Giống vi sinh vật

- Môi trường lên men

- Điều kiện lên men: lượng giống cấy, nhiệt độ, thời gian lên men, việc cung cấp oxy, tốc độ khuấy trộn…

Trang 28

Ngoài ra, các nhà sản xuất cũng rất quan tâm đến các tính chất vật lý của dòng canh trường ra khỏi bình lên men, làm sao để quá trình phân riêng trên membrane được hiệu quả trong quá trình vận hành hệ thống MBRs này.

1 Giống vi sinh vật

Việc chọn giống vi sinh vật phù hợp là yếu tố quan trọng trong quá trình lên men Giống vi sinh vật này phải thỏa mãn các điều kiện như khả năng sinh tổng hợp độc tố là thấp nhất, khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính phải cao nhất

Sự ổn định các hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật trong lên men với hệ thống MBRs cũng cần được chú ý, vì đối với hệ thống này có sự cố định hay hồi lưu tế bào, do đó đặc tính môi trường và điều kiện vận hành luôn chuyển biến, đòi hỏi vi sinh vật phải có khả năng thích nghi cao và chống chịu tốt, để làm sao các tính chất ưu việt của giống vi sinh vật được đảm bảo trong thời gian vận hành dài

Ngoài ra, yếu tố môi trường và điều kiện vận hành cũng ảnh hưởng đến việc chọn giống

vi sinh vật Trong sản xuất quy mô công nghiệp, các nhà sản xuất luôn muốn tìm ra được nguồn nguyên liệu phổ biến, rẻ tiền, điều kiện lên men không quá phức tạp, dễ điều khiển,

do đó đòi hỏi giống vi sinh vật lên men cũng phải thích hợp với những nguồn nguyên liệu đó, điều kiện đó, như vậy hiệu suất quá trình mới có thể được nâng cao Chẳng hạn như: theo H Danner et al (1998) trong sản xuất acid lactic, ông muốn thực hiện quá trình lên men ở nhiệt độ cao 600C, để có thể lên men trong điều kiện không cần vô trùng với xác suất

nhiễm là thấp nhất, vì vậy, ông đã chọn ra giống vi khuẩn Bacillus sterothermophilus BS

119 – giống này có khả năng lên men hexose và pentose, sản xuất chủ yếu acid lactic với độ tinh sạch 98%, có thể phù hợp với điều kiện đã đưa ra

− Ngoài ra, theo Soun-Gyu Kwon (2005), các chủng nấm men Candida tropicals khác

nhau cũng sẽ cho kết quả lên men khác nhau trong mô hình có hồi lưu tế bào

Bảng 2.1 Sự khác nhau trong quá trình lên men xylitol giữa các chủng nấm men C

tropicals

(g/L)

Xylitol (g/L)

189110182

4.945.4212

0.820.810.85

382015

11410

− Giống vi sinh vật cũng gây ảnh hưởng đến dòng chảy của canh trường sau lên men trong cùng điều kiện làm sạch bằng khí, dưới áp suất 288 Torr Kết quả thể hiện ở bảng 2.2 (T Asakura và K Toda 1991)

Bảng 2.2 So sánh lưu lượng dòng canh trường trong quá trình làm sạch membrane

thủy tinh ứng với các giống vi sinh vật khác nhau

Vi sinh vật Lưu lượng dòng chảy (m3/m2.h)

Z mobilis

S carlsbergensis

Nấm men bánh mì

0.0740.0290.023Với nồng độ sinh khối là 200 kg/m3.Qua đó, các nhà sản xuất có thể chọn giống vi sinh vật phù hợp nhằm mục đích đem lại hiệu quả kinh tế cao trong suốt quá trình

Trang 29

2 Môi trường lên men

Về lý thuyết môi trường là nguồn carbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh trưởng…, tuy nhiên, khi tỷ lệ các nguồn cơ chất này thay đổi thì hướng sản phẩm cũng sẽ thay đổi theo Chẳng hạn như đối với sản phẩm là enzyme amilase thì nguồn cơ chất chủ yếu là tinh bột, còn đối với sản phẩm là protease, protein sẽ đóng vai trò chủ lực

Không những thế, các thành phần trong môi trường lên men còn tạo nên giá trị pH và áp suất thẩm thấu Hai yếu tố này ảnh hưởng khá đáng kể đến sự sinh trưởng và hoạt tính sinh tổng hợp sản phẩm của vi sinh vật

Một môi trường với thành phần cơ chất đầy đủ, theo tỷ lệ tối ưu sẽ giúp cho quá trình lên men diễn ra nhanh và sản phẩm sau lên men đạt được yêu cầu do các nhà sản xuất đề ra Rất nhiều bài báo đã nghiên cứu về vấn đề này

a Các thành phần trong môi trường và việc bổ sung thêm nguồn cơ chất

Akinori Ogawa et al (1995) đã khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nguồn carbon và nitơ đến hàm lượng sản phẩm trong sản xuất enzyme protease bằng mô hình MSLC lên

men tĩnh có lặp lại trong thời gian dài, sử dụng loài vi sinh vật Aspergillus oryzae IAM

2704 Kết quả thể hiện như bảng 2.2

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ glucose và casein trong môi trường

Nồng độ glucose (%w/v)

Nồng độ casein (%w/v)

Hàm lượng protease(đơn vị hoạt độ/L)0.05

0.20.50.50.511.5

0.40.40.10.410.40.4

900155013501500125012001100Hàm lượng sản phẩm protease phụ thuộc vào nồng độ cả 2 chất Đối với trường hợp 0.5% glucose, protease sản sinh là cao nhất khi nồng độ casein là 0.4% Còn trong trường hợp nồng độ casein là 0.4% thì hàm lượng protease cực đại khi nồng độ glucose là 0.2% Hàm lượng protease giảm khi tăng glucose lên 1 hay 1.5%, có thể vì glucose là lượng sử dụng chủ yếu để vi sinh vật sinh trưởng, chứ không phải sinh tổng hợp sản phẩm Với 0.05% glucose và 0.4% casein, protease là thấp nhất do không đủ cơ chất cho nấm mốc sử dụng

Có thể kết luận rằng nồng độ glucose ở mức thấp sẽ hiệu quả cho việc sinh tổng hợp enzyme, không những vậy, ở mức glucose thấp tương đối, nấm mốc có thể sử dụng nguồn năng lượng do trao đổi chất từ casein, từ đó có thể sản sinh ra lượng lớn enzyme

− Cũng với loài Aspergillus oryzae nuôi cấy trong hệ thống MSLC, Masakazu Morita et

al (2004) đã nghiên cứu vấn đề sử dụng nguồn nitơ trong sản xuất enzyme α-glucosidae

Trang 30

Hình 2.1 Ảnh hưởng của việc sử dụng nguồn nitơ trong quá trình vận hành MSLC

Trong cả 2 trường hợp, việc sử dụng maltose và glucose cũng gần giống nhau Nồng độ maltose giảm nhanh trong giai đoạn đầu và bằng 0 sau 5 ngày nuôi cấy Nồng độ glucose tăng trong 2 hoặc 3 ngày đầu, và sau đó được vi sinh vật sử dụng đến cạn kiệt

Nguồn YE làm pH giảm, nhưng khoảng dao động này là nhỏ, không đáng kể Còn đối với nguồn NaNO3, pH tăng nhanh đến 8 sau 5 ngày nuôi cấy và vẫn có xu hướng tiếp tục tăng Sự thay đổi này có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật

Sự phát triển tế bào khi sử dụng YE hay NaNO3 có khuynh hướng giống nhau, dù sau 5 ngày, hàm lượng chất khô tế bào có giảm nhiều hơn trong trường hợp sử dụng NaNO3 Tuy nhiên, lượng enzyme sản sinh sau 5 ngày nuôi cấy khi dùng NaNO3 chỉ đạt khoảng ½ so với khi sử dụng YE

Vì vậy có thể kết luận được thành phần môi trường ảnh hưởng khá đáng kể đến sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp sản phẩm

− Không chỉ vậy, trong vận hành MBRs, lưu lượng dòng chảy qua membrane cũng bị ảnh hưởng bởi các thành phần trong môi trường

Lưu lượng dòng chảy qua membrane trong nghiên cứu này được W Zhang (1998) mô tả qua hệ số dòng chảy Fi, được xác định là tỷ số giữa dòng chảy canh trường qua membrane trong suốt thời gian vận hành và dòng chảy ban đầu của nước sạch

Sự ảnh hưởng của thành phần môi trường là glucose và YE đến hệ số Fi được biểu thị qua hình 2.2

Trang 31

Hình 2.2 Ảnh hưởng của YE và glucose trong môi trường

Trong trường hợp không có glucose, dòng chảy giảm không đáng kể từ giá trị YE 8.5 g/L trở đi Trong khi đó, dòng chảy giảm đi 40% so với ban đầu ở giá trị glucose 100g/L và không có sự hiện diện của YE Tuy nhiên, có thể quan sát được dòng chảy giảm gần 80% khi 100g/L glucose và 8.5g/L YE cùng tồn tại trong môi trường Kết quả cho thấy có sự tác động qua lại giữa glucose và YE Hiện tượng tắc nghẽn nghiêm trọng hơn khi các phân tử lớn hình thành do sự tác động của nguồn cơ chất này Nagata et al (1989) cũng đã nghiên cứu sự ảnh hưởng lẫn nhau của các thành phần trong môi trường, và có sự hình thành kết tủa kali amoni phosphate trong suốt quá trình tiệt trùng Kết tủa này là chất gây tắc nghẽn

chủ yếu trong việc thu nhận tế bào B polymyxa bằng vi lọc Sự ảnh hưởng và tác động qua

lại giữa các thành phần môi trường gây ra việc tắc nghẽn được chú ý nhiều hơn trong các hệ thống nuôi cấy tế bào cố định trên membrane

Việc thêm glucose trong lên men có hồi lưu ở hệ thống SMBR được quan tâm vì glucose làm tăng tốc độ sinh tổng hợp xylitol trong lên men tĩnh và fed batch Khi glucose thêm vào, nồng độ sinh khối tăng đến 71g/L trong 3 chu kỳ hồi lưu Tuy nhiên, sản phẩm

xylitol do Candida tropicalis sản sinh chậm hơn trong pha đầu tiên ở mỗi chu kỳ, và tốc độ

sinh tổng hợp xylitol cũng thấp hơn so với việc không sử dụng glucose

Rất nhiều nghiên cứu đề cập đến việc bổ sung glucose vào môi trường trong phương pháp lên men có hồi lưu Glucose là nguồn cơ chất khá phổ biến trong nhiều quá trình lên men Nhìn chung, glucose có khuynh hướng gây tắc nghẽn membrane nghiêm trọng và ít được sử dụng quá trình vận hành MBRs (W Zhang et al.1998)

− Trong sản xuất enzyme chitinase, chitin là nguồn cơ chất cảm ứng kích thích vi sinh vật

Paenibacillus sp CHE-N1 sinh tổng hợp enzyme cảm ứng Po-Min Kao et al (2007) đã

khảo sát việc bổ sung chitin tại thời điểm 96h và 168h, liệu có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme chitinase hay không, kết quả thể hiện trên hình 2.3

Trang 32

Hình 2.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung chitin đến chất lượng sản phẩm

Khi hoạt tính chitinase giảm dưới 13 mU/mL, người ta tiến hành bổ sung chitin Bằng cách thay thế 500 mL canh trường với 500mL chitin (55.4g/L), hoạt tính chitinase trong canh trường giữ ổn định ở mức 13-15 mU/mL hơn 10 ngày Điều này cho thấy khi chitin thêm vào, hoạt tính enzyem tăng tức thì Sau đó, hoạt tính có thể thay đổi từ 15 xuống còn

13 mU/mL trong 3-4 ngày Điều này có nghĩa rằng việc thêm chitin là cung cấp cho tế bào

vi sinh vật một lượng môi trường mới để phát triển liên tục và sinh tổng hợp sản phẩm

− Một vài nghiên cứu đã cho rằng nồng độ lactate ở mức độ thấp ngoài việc có thể gây ức chế sự sinh tổng hợp sản phẩm ethanol, còn ức chế luôn cả sự sinh trưởng của

Sacharomyces cerevisiae Hình 2.4 đã chỉ ra được ảnh hưởng của việc bổ sung acetate

trong quá trình vận hành MRB (M A Mehia và M Cheryan 1990)

Trang 33

Hình 2.4 Ảnh hưởng của tốc độ bổ sung cơ chất đến hiệu quả quá trình lên men ethanol.

Bảng 2.4 Thành phần trong môi trường ở 3 giai đoạn

Giai đoạn S4 (không bổ sung acetate) 66.5 71.5 3.7

Giai đoạn S5 (bổ sung acetate 5.8kg/m3) 77.1 81.5 5.3

Giai đoạn S6(bổ sung acetate 2.9 kg/m3) 74.4 78.2 4.9

(đơn vị: kg/m3)Để giảm thiểu hiện tượng tắc nghẽn, sự phân cực trên màng và các vấn đề về bơm, tế bào được rút và giữ ổn định ở khoảng 160±25 kg/m3 Trạng thái cân bằng đầu tiên được thiết lập (ngoại trừ sự sinh trưởng của tế bào) và sử dụng nguồn cơ chất không có acetate (giai đoạn S4), kết quả thu được nồng độ ethanol là 63kg/m3 và hiệu suất là 15.1 kg/m3.h Khi sử dụng nguồn cơ chất trong giai đoạn S5 có bổ sung 5.8kg/m3 acetate, sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật ngưng lại tức thời Tuy nhiên, trong khi acetate không tác động đến việc sử dụng glucose nhưng lại có sự giảm mãnh liệt trong vấn đề sử dụng nguồn galactose, kết quả là lượng galactose sót giữ ở mức 40kg/m3 Sau đó, loại bỏ acetate từ nguồn cơ chất để trở về giống với trạng thái ban đầu, thời gian vận hành giai đoạn này từ giờ thứ 76 đến giờ thứ 136

Trong giai đoạn S6, cơ chất chứa ½ lượng acetate so với giai đoạn S5 Tốc độ phát triển của vi sinh vật giảm đáng kể Lượng đường tiêu thụ quan sát được là: sử dụng hoàn toàn lượng glucose nhưng không sử dụng hoàn toàn lượng galactose

Như vậy, thấy được rằng việc bổ sung acetate ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát

triển của nấm men S cerevisiae Sự phát triển tế bào vi sinh vật giảm khi có mặt acetate

0.05M, và nó không ảnh hưởng đến việc sử dụng glucose sản sinh cồn Tuy nhiên, acetate ảnh hưởng đến việc sử dụng galactose, và đây là điều không mong đợi trong hiện tượng sinh trưởng kép Vẫn chưa có sự tối ưu hóa nào trong việc phối hợp giữa nồng độ acetate, tổng lượng đường và tốc độ pha loãng Tuy nhiên, ở nghiên cứu này cũng đã cho thấy rằng nồng độ sản phẩm và hiệu suất thu được là thấp so với việc sử dụng nguồn nguyên liệu không có acetate

Trang 34

Các ảnh hưởng đã nêu trên cho thấy tầm quan trọng trong việc sử dụng thành phần cơ chất như thế nào, với tỷ lệ là bao nhiêu để hợp lý Rõ ràng thấy được rằng không phải cứ bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng vào là có lợi cho sự phát triển và sinh tổng hợp sản phẩm của

vi sinh vật Cần xem xét tối ưu hóa lại nguồn nguyên liệu trước khi thực hiện quá trình MBRs

b Vấn đề tiệt trùng môi trường

Môi trường trước lên men thường được tiệt trùng với mục đích tiêu diệt toàn bộ hệ vi sinh vật có trong nguyên liệu Môi trường đã được tiệt trùng tác động hiệu quả hơn đến dòng chảy trong hệ thống MBRs Hình 2.5 là ví dụ cụ thể

Hình 2.5 Ảnh hưởng của dòng chảy trong MBRs trước và sau tiệt trùng

Môi trường lên men trong nghiên cứu này gồm có: 100g/L glucose, 8.5g/L YE, 1.3g/L

NH4Cl, 0.12g/L MgSO4.7H2O, 0.06g/L CaCl2 Khảo sát được thực hiện trên membrane bất đẳng hướng Điều kiện tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút

Nhận ra rằng dòng chảy của môi trường có qua tiệt trùng luôn cao hơn so với lúc chưa tiệt trùng, lưu lượng dòng gấp 1.8 lần ở trạng thái cân bằng Điều này có thể do các phân tử nhỏ kết tụ lại thành nhưng phân tử lớn sau quá trình tiệt trùng làm membrane ít bị tắc nghẽn hơn, nên tốc độ dòng chảy qua màng sẽ cao hơn

3 Điều kiện lên men

a Ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến quá trình vận hành MBRs

 Khái niệm về tốc độ pha loãng (dilution rate – D)

Tốc độ pha loãng là một trong những thông số quan trọng trong quá trình Nó quyết định đến sự tăng trưởng và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm, không những thế, D còn làm ảnh hưởng đến sự tắc nghẽn trong membrane trong quá trình vận hành hệ thống

D=F/V, với F là lưu lượng bơm cơ chất hay tháo sản phẩm (m3/h), V là thể tích sử dụng bình lên men (m3)

Trang 35

 Vận hành MBRs liên tục thường ứng dụng phương pháp chemostat, tức là các nhà sản xuất mong muốn lưu lượng dòng vào bằng với lưu lượng dòng ra, nghĩa là cố định

F, như vậy, hệ thống sẽ đơn giản và dễ điều khiển Hơn thế nữa, hệ thống MBRs luôn đạt được giá trị nồng độ sinh khối cao, nên họ chỉ cần cố định giá trị D luôn nhỏ hơn tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật ở giai đoạn logarite

Tốc độ pha loãng càng lớn thì năng suất hoạt động bình lên men càng cao Tuy nhiên, D càng lớn sẽ gây ra hiện tượng tắc nghẽn membrane càng nghiêm trọng Vì vậy, đối với hệ thống MBRs này, các nhà sản xuất cần phải tối ưu lại giá trị D

− Mối quan hệ giữa D và nồng độ tế bào trong sản xuất vang khô từ glucose bằng hệ

thống MBR hiệu năng cao bởi Sacharomyces cerevisiae WH-4 (Masamitsu Takaya et al

2002) thể hiện trong hình 2.6

Hình 2.6 Ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến nồng độ tế bào

Mối quan hệ này gần như tuyến tính, nghĩa là tốc độ pha loãng càng lớn thì nồng độ tế bào càng cao Kết quả này chỉ ra rằng nồng độ tế bào liên quan mật thiết đến hiệu suất quá trình, và như vậy, muốn quá trình đạt hiệu quả, có thể điều chỉnh giá trị D phù hợp Vì vậy có thể nói đặc tính của MBR rất hữu dụng để đạt được mật độ tế bào như mong muốn

− S Denis và P Boyaval (1991) đã khảo sát quá trình vận hành dài trong MBR với membrane UF ở những giá trị tốc độ pha loãng khác nhau

Trang 36

Hình 2.7 Sinh khối và hoạt tính sản phẩm enzyme trong dòng permeate khi thay đổi tốc độ

pha loãng

Với D1=0.023h-1, D2=0.074h-1, D3=0.1h-1, D4=0.135 h-1, D5=0.09h-1

Sinh khối đạt đến 4.4 g/L sau 210h vận hành với số tế bào vi khuẩn sống khá cao Ở mô hình này không thể đạt được trạng thái cân bằng thật sự Sinh khối liên tục tăng, hơn nữa số tế bào chết được tập trung lại Vì vậy, quan trọng là cần đưa các tế bào yếu ra ngoài, khi mà số tế bào sống giảm Điều này cũng đã thể hiện trong Prigent et al (1988) Quá trình liên tục được bắt đầu tại mức D=0.023h-1, sau khi kết thúc 26h lên men tĩnh Tại thời điểm này, hoạt tính enzyme pectate lyase bắt đầu giảm, trong khi hoạt tính protease có phần tăng nhẹ Sinh khối tăng 0.6g/L trong khi hoạt tính pectate lyase cứ tiếp tục giảm Ta chú ý rằng việc tăng sản phẩm protease tại D=0.074h-1, nhưng mức độ chung sau giá trị tốc độ pha loãng này vẫn thấp, trong khoảng 0.1 đơn vị hoạt độ/mL

Khảo sát trên bơm và điều kiện lên men kỵ khí cho phép ta hạn chế được việc giảm hoạt tính sinh học bởi mối nguy gãy vỡ Hơn nữa, những thí nghiệm khác cũng chỉ ra rằng việc hấp thụ pectate lyase trên membrane không đáng kể trong suốt quá trình Hiệu quả sinh tổng hợp protease là 0.09 đơn vị/mL.h trong lên men tĩnh và 0.18 đơn vị/mL.h tại thời điểm D=0.1h-1 Việc thay đổi D từ 0.1h-1 không thích hợp cho hiệu quả sinh tổng hợp protease Tắc nghẽn trên membrane giảm cho phép các thành phần khối lượng phân tử lớn được giữ lại trong bioreactor Phân tử khối của pectate lyase dao động trong khoảng 30-45kDa, trong khi của protease ngoại bào dao động trong khoảng 50-55kDa Các proteases này bị giữ lại ở lớp phân cực trên bề mặt membrane có thể gây nguy hiểm cho pectate lyases khi chúng đi qua màng

− Tổng quát hơn, Munir Cheryan và Mohamed A Mehaia (1983) đã khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến hiệu quả quá trình trong sản xuất liên tục cồn từ đường

lactose bởi loài vi sinh vật Kluyveromyces fragillis NRRL 2415 trong mô hình MRB hiệu

năng cao, với module membrane dạng sợi rỗng Kết quả thu được như hình 2.8

Trang 37

Hình 2.8 Đánh giá hiệu quả quá trình lên men ethanol trong MRB theo tốc độ pha loãng

Kết quả đạt được tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao, giá trị tối ưu là 65g/L.h tại giá trị tốc độ pha loãng là 7h-1 Tuy nhiên, kết quả này còn phụ thuộc vào nồng độ lactose cũng như hàm lượng sinh khối Cụ thể cũng trong nghiên cứu này, khi nồng độ tế bào ban đầu đạt 90g/L thì tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm đạt cực đại ở giá trị 118g/L.h tại D=6h-1 Vì vậy, sự kết hợp của hàm lượng cơ chất và tốc độ pha loãng có thể phản ánh được hiệu quả quá trình vận hành MRB

b Cung cấp oxy cho nhóm vi sinh vật hiếu khí

Đối với môi trường lỏng, hàm lượng oxy cần cung cấp cho vi sinh vật trong quá trình lên men được xác định thông qua việc chọn áp lực của dòng khí vô trùng nén vào hệ thống sục khí và tốc độ cánh khuấy của thiết bị lên men

B Hammarberg et al (1991) đã khảo sát ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy cũng như

lưu lượng khí vào bình lên men trong việc thu nhận protein từ vi khuẩn Eschericha coli

trong mô hình MBR dạng ống có phun tia từ đỉnh bình lên men Kết quả thể hiện trong hình 2.9

Hình 2.9 Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến giá trị K L a

Trong sản xuất quy mô công nghiệp, đôi khi các thông số lên men đã được tối ưu hóa ở quy mô phòng thí nghiệm không còn thích hợp nữa, điều này thể hiện rõ qua vấn đề cung cấp oxy vào bình lên men Chẳng hạn như đối với bình lên men 1 lít, lượng oxy hòa tan (DO) trong canh trường được đánh giá là phù hợp nhất trong điều kiện tốc độ khuấy là 500 rpm và không cần sục khí, nhưng áp dụng giá trị 500 rpm đó vào bồn lên men CSTR 500m3

thì sẽ không thu được hàm lượng oxy tương đương

Lúc này, người ta xét đến hệ số KLa – là đại lượng đặc trưng cho sự truyền khối trên một đơn vị diện tích bề mặt trong bình lên men, tức là giá trị KLa đặc trưng cho mức độ tiêu thụ oxy của vi sinh vật Giá trị này tăng khi tăng tốc độ cánh khuấy, tăng mức độ sục khí Điều này thể hiện rõ trong hình 2.9

Theo đó, ta thấy việc phun tia từ phía trên đỉnh CSTR có thể làm tăng tốc độ chuyển hóa oxy (OTR), và được định lượng bằng giá trị kLa nhờ phần mềm máy tính có nối đầu dò DO

Trang 38

Trong suốt quá trình, tốc độ cánh khuấy được giữ ở khoảng 400-500 min-1 Cánh khuấy

này có thể ngăn ngừa hiện tượng thoát các tế bào E.coli qua những mối hàn so với cánh

khuấy truyền thống Lưu lượng dòng khí từ 1-2 vvm, cũng có lúc hơn

Tóm lại, khi E coli nuôi cấy với mật độ cao, chúng tiêu thụ một lượng lớn oxy, do đó

nếu không cung cấp đủ khí oxy sẽ làm hạn chế sự sinh trưởng và làm giảm khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của vi sinh vật

Tăng OTR có thể làm tăng giá trị DO, bằng cách dùng oxy tinh khiết thay cho không khí, hoặc tăng lượng oxy hòa tan trong pha lỏng, tuy nhiên phải lưu ý là dù có tăng OTR cũng cần có mức giới hạn, vì sự sinh trưởng của tế bào thường được dừng trước khi đạt cực đại, do sự ức chế sản phẩm gây ra

c Tốc độ dòng nhập liệu

Hình 2.10 Ảnh hưởng của tốc độ dòng glucose và dòng cơ chất bổ sung trong hệ thống

MBR-ED

Khi tốc độ bổ sung đường cao 500-1000g/h, nồng độ lactate ổn định ở mức thấp hơn Dừng hoàn toàn việc bổ sung nguồn nitơ dẫn đến sự giảm rõ rệt nồng độ và tốc độ sinh tổng hợp acid lactic, đồng thời cũng làm tăng lượng glucose sót Điều này thể hiện rất rõ trong hình 2.10, trong khoảng 856-1052h lên men Hơn nữa, cũng chẳng có dấu hiệu tăng đáng kể tốc độ sinh tổng hợp acid lactic khi tốc độ cung cấp nguồn nitơ tăng từ 100-200g/h, không có sản phẩm phụ hay chất trao đổi khác trong quá trình lên men này

Tăng tốc độ bổ sung nguồn nitơ vượt quá 150g/h cũng không làm tăng hàm lượng sản phẩm lactate Trong khi đó, việc ngừng cung cấp trong khoảng 832-883h, và giữa 900-1052h lại dẫn đến hiện tượng giảm acid lactic đáng kể Trong điều kiện có nitơ sẽ thuận lợi hơn cho việc phát triển của vi sinh vật và hình thành sản phẩm Khi giữ ở mức độ châm yếu tố sinh trưởng là 100g/h thì nồng độ acid lactic thu được nói chung là cao (50g/L) Trong

lên men bởi giống Bacillus strains BS119 (H Danner 2002) dưới điều kiện nhiệt độ cao,

cần phải liên tục bổ sung nguồn nitơ để tránh giảm acid lactic, cũng như giảm thiểu được sự hao hụt nguồn dinh dưỡng Tuy nhiên, tốc độ này chỉ dao động trong khoảng 50-150g/h

Trang 39

B Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình phân riêng bằng membrane

Quá trình phân riêng nói chung hay quá trình lọc tách vi sinh vật nói riêng được đánh giá là đạt hiệu quả cao khi dòng permeate được dịch chuyển qua membrane với tốc độ nhanh và độ phân riêng đạt giá trị cao

Trong vận hành MBRs, tốc độ dòng permeate giảm dần là điều không thể tránh khỏi Tuy nhiên, các nhà sản xuất vẫn có thể hạn chế vấn đề này, sao cho lưu lượng dòng permeate giảm càng ít càng tốt, bằng cách chọn loại membrane phù hợp, tối ưu hóa các tính chất dòng canh trường sau lên men, hay điều khiển các thông số kỹ thuật của quá trình phân riêng như nhiệt độ, áp suất…

1 Bản chất của membrane

Thông thường, mức độ tắc nghẽn membrane có liên quan đến đặc tính membrane nhiều hơn các đặc tính khác, cụ thể là ảnh hưởng của những yếu tố sau:

a Cấu trúc membrane

Đối với membrane có bề mặt nhẵn bóng đồng nhất, những ống mao dẫn của chúng ít bị tắc nghẽn trong quá trình sử dụng Ngược lại, nếu membrane có bề mặt gồ ghề, lồi lõm, tế bào vi sinh vật hay các thành phần khác trong canh trường dễ bị hấp phụ lên bề mặt membrane, từ đó làm giảm tốc độ dòng permeate và kéo dài thời gian quá trình phân riêng.Cấu trúc membrane đẳng hướng hay bất đẳng hướng cũng có ảnh hưởng đến quá trình phân riêng bằng membrane, W Zhang (1998) đã khảo sát vấn đề này đối với membrane

ceramic bên trong hệ thống MBR trong lên men cồn bởi Sacharomyces cerevisiae Kết quả

được thể hiện qua các hình 2.11, ông đã so sánh 2 loại membrane dựa trên chỉ số Fi – là đại lượng đặc trưng cho lưu lượng dòng chảy qua membrane

Hình 2.11 Sự khác nhau về Fi của 2 loại membrane đẳng hướng và bất đẳng hướng

Quan sát hình 2.11a thấy được việc giảm đáng kể lưu lượng dòng chảy ở cả 2 loại membrane khi tăng nồng độ glucose Giá trị Fi không rõ ràng nhưng nhìn chung thì giá trị

Định dạng
Số trang	78
Dung lượng	2,22 MB