Nghiên cứu chế tạo chip sợi nano vàng ứng dụng trong định lượng hàm lượng cholesterol tự do trong dung dịch

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình I.1: Cấu trúc hóa học của cholesterol Hình I.2: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học Hình I.3: nguyên lý hoạt động chung của một cảm biến sinh học Hình I.4: Sơ

PHẠM XUÂN THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHIP SỢI NANO VÀNG

ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG HÀM LƯỢNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO

PHẠM XUÂN THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHIP SỢI NANO VÀNG

ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG HÀM LƯỢNG

Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí điểm)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO

LỜI CAM ĐOAN iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cholesterol và cảm biến sinh học 2

1.1.1 Tổng quan về cholesterol 2

1.1.2 Tổng quan về cảm biến sinh học 5

1.2 Công nghệ nano và cảm biến sinh học sợi nano vàng 11

1.2.1 Công nghệ nano 11

1.2.2 Cảm biến sợi nano vàng dùng cho phát hiện cholesterol 14

1.3 Phương pháp đơn lớp tự lắm ghép 16

1.3.1 Cố định enzyme 16

1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme 17

1.3.3 Phương pháp đơn lớp tự lắp ghép (self assembly monolayer – SAM) 19

1.4 Kỹ thuật quét thế vòng tuần hoàn 22

1.4.1 Nguyên lý 22

1.4.2 Đồ thị quét thế vòng 24

1.5 Các nội dung nghiên cứu chính của luận văn 25

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 26

2.1 Chế tạo sợi nano vàng bằng kỹ thuật DEA 26

2.1.1 Cấu trúc sợi nano vàng trên đế silic chế tạo 26

2.1.2 Quy trình công nghệ chế tạo sợi nano vàng trên đế silic 26

2.2 Hoạt hóa bề mặt và cố định enzyme lên sợi nano vàng 38

2.2.1 Các hóa chất và thiết bị 38

2.2.2 Quy trình hoạt hóa bề mặt sợi nano vàng và cố định enzyme 39

2.2.2.2 Hoạt hóa bề mặt sợi nano vàng bằng DTSP 40

2.2.3 Xác định nồng độ cholesterol tự do trong dung dịch 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Đánh giá kết quả chế tạo sợi nano vàng bằng ký thuật DEA 42

3.1.1 Kết quả chế tạo sợi nano vàng 42

3.1.2 Kết quả đo điện trở sợi nano vàng 44

3.1.3 Kết quả chụp kính hiển vi điện lực nguyên tử (AFM) 48

3.2 Kết quả kiểm tra tính chất của chip sợi nano vàng trong quá trình hoạt hóa bề mặt 49

3.3 Xác định cholesterol 52

3.3.1 Xác định cholesterol bằng chip hoạt hóa bởi cysteamine 52

3.3.2 Xác định cholesterol bằng chip hoạt hóa bề mặt bởi DTSP 54

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN 57

• Kết luận 57

• Hướng phát triển 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan nội dung đề tài này do tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện Kết quả trình bày trung thực, chính xác Đề tài này chưa được công bố trên bất kỳ phương tiện nào Kết quả thực nghiệm do tác giả và nhóm nghiên cứu thực hiện Mọi bảng biểu đồ thị, hình ảnh có được do chúng tôi xử lý kết quả thí nghiệm

Xin cam đoan mọi thông tin là đúng sự thật, nếu có bất kỳ vấn đề gì tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

TP HCM ngày 22 tháng 09 năm 2014

Học viên cao học Cán bộ hướng dẫn

Phạm Xuân Thanh Tùng TS Tống Duy Hiển

Xin chân thành cảm ơn anh Phạm Văn Bình, chị Đặng Ngọc Thùy Dương, anh Phan Thanh Nhật Khoa, chị Lê Thị Thanh Tuyền là thành viên của nhóm nghiên cứu Biosensor thuộc PTN CNNN đã giúp đỡ tôi trong những vấn đề về chuyên môn cũng như quá trình làm thí nghiệm

Xin chân thành cảm ơn các anh chị em trong PTN CNNN đã giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn cũng như chia sẻ với tôi niềm vui khi thành công

Để hoàn thành luận văn này, không thể thiếu được sự giúp đỡ động viên từ cha mẹ và các thành viên trong gia đình tôi cũng như họ hàng đang sinh sống tại TP HCM Tôi xin dành tình cảm sâu sắc nhất cảm ơn mọi thành viên trong gia đình

Xin chân thành cám ơn!

HDL: High density lipoprotein

LDL: Low density lipoprotein

VLDL: very low density lipoprotein

SAM: Self assembly monolayer

EIS: electrochemical impedance spectroscopy

PECVD: plasma enhance chemical vapour deposition

LPCVD: low pressure chemical vapour deposition

RIE: reactive ion etching

PVD: physical vapour deposition

SEM: Scanning electron microscopy

WE: working electrode

CE: counter electrode

RE: reference electrode

PBS: phosphate buffer saline

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng I.1: Giới hạn hàm lượng cholesterol trong máu của người trưởng thành

Bảng I.2: Enthanpi của một số phản ứng có enzyme xúc tác

Bảng II.1: Thông số của quá trình quang khắc và chất lượng của cấu trúc tạo thành tương ứng

Bảng II.2: Tốc độ bốc bay theo dòng diện đốt

Bảng III.1: Kết quả đo điện trở từ khảo sát đặc trưng I-V của các sợi nano Au chế tạo Điện thế quét 1 Volt, với bước quét 50 mV, chiều dài sợi thay đổi từ 5-1000 µm Chiều ngang sợi la 50 nm, chiều dày 25 nm

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Hình I.7: Đồ thị quét thế theo thời gian trong phép đo CV

Hình I.8: Quan hệ dòng-điện thế trong quét thế vòng thuận nghịch

Hình I.10: Đồ thị CV của quá trình oxi hóa bất thuận nghịch (A), giả thuận nghịch (B)

và thuận nghịch (C)

Hình III.4: Đặc trưng tính chất điện I-V của sợi nano Au có chiều rộng 50 nm, độ dày

25 nm, và chiều dài thay đổi từ 5 đến 500 µm Điện thế một chiều được quét trong giá trị từ -1 volt đến + 1 volt, với bước quét 50 mV

Hình III.7: Đường quét CV của chip sợi nano vàng trong dung dịch H2SO4 10 mM Hình III.8: Đường CV của chip sợi nano vàng trong dung dịch K3Fe(CN)6 5mM trong PBS pH 4 trước và sau khi được hoạt hóa bởi cysteamine

Hình III.9: đồ thị sự phụ thuộc của cường độ peak oxi hóa khử theo thời gian của chip Au/CA với các nồng độ cysteamine khác nhau khi quét trong dung dịch K3Fe(CN)6trong PBS pH 4

Hình III.10: Đường CV của chip sợi nano vàng sau mỗi bước hoạt hóa bề mặt trong dung dịch K3Fe(CN)6 trong PBS pH 4 đối với chất hoạt hóa là cysteamine (A) và DTSP (B)

Hình III.11: đường CV của chip sợi nano vàng được hoạt hóa bởi cysteamine trong dung dịch cholesterol/PBS + 5%triton X-100 pH=7 ở các nồng độ cholesterol khác nhau từ 1 đến 7 mM (A) và đường chuẩn nồng độ - cường độ peak thu được từ đường

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình I.1: Cấu trúc hóa học của cholesterol

Hình I.2: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học

Hình I.3: nguyên lý hoạt động chung của một cảm biến sinh học

Hình I.4: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến áp điện

Hình I.5: Sợi nano chế tạo bởi nhiều phương pháp khác nhau (A); Đơn sợi nano với kích thước 40-50 nm (B); Sợi nano với hai điện cực nối ra mạch điều khiển bên ngoài (C)

Hình I.6: sự hình thành SAM từ sulfur hữu cơ

Hình I.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm quét thế vòng tuần hoàn

Hình II.1: Cấu trúc sợi nano Au trên đế silic chế tạo

Hình II.2: Quy trình chế tạo sợi nano vàng bằng kỹ thuật lắng đọng và ăn mòn dưới góc nghiêng

Hình II.3: Thiết bị PECVD Plasmalab 80Plus, Oxford Instruments tại PTN CN Nano Hình II.4: Giao diện màn hình phần mềm PC 2000 dùng điều khiển thiết bị PECVD Hình II.5: Thiết bị đo độ dày FilmTek 1000 tại PTN Công Nghệ Nano

Hình II.6: Hệ chiếu sáng dùng cho quá trình quang khắc quang học (optical lithography)

Hình II.7: Hình SEM bề mặt các màng Au chế tạo bằng phương pháp bốc bay (A) Màng có kích thước hạt nhỏ cỡ 10 nm (B) Màng có kích thước hạt lớn cỡ 30 nm Hình II.8: Hệ ăn mòn ion beam etching (Ionfab 300Plus Oxford Instruments)

Hình II.9: Hệ đo Autolab được sử dụng để khảo sát khả năng phát hiện cholesterol của sợi nano vàng chế tạo được tại PTN CNNN

Hình II.10: Quy trình hoạt hóa bề mặt và gắn kết enzyme

Hình III.1: Hình SEM độ phân giải thấp của chíp silicon có sợi nano vàng, các đơn sợi được chế tạo cùng với điện cực nối riêng biệt nối ra mạch điều khiển ngoài (mạch điện tử, hệ đo)

Hình III.2: Đơn sợi nano cùng các điện cực riêng biệt

Hình III.3: Chip sợi nano vàng dùng cho định lượng cholesterol

Hình III.5: Cấu trúc 4 điện cực dùng xác định điện trở tiếp xúc của sợi nano

Hình III.6: Hình ảnh AFM 2 chiều (A) và 3 chiều (B) của sợi nano Au

MỞ ĐẦU

Cholesterol là một chất béo steroid, mềm, màu vàng nhạt, có ở màng tế bào của tất

cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật Nó được sản xuất hàng ngày trong gan, mỗi ngày từ 1,5g – 2g

Trong máu người, lượng cholesterol thường dao động trong khoảng từ 3.6 mM đến 7.8 mM, và trong cơ thể người khoẻ mạnh, tổng lượng cholesterol xấp xỉ 5.2mM Tuy nhiên, đôi khi cơ thể lại sản sinh ra lượng cholesterol nhiều hơn mức cần thiết, tạo ra một lượng cholesterol dư thừa luân chuyển trong dòng máu và là tác nhân liên quan chặt chẽ với rất nhiều bệnh hiểm nghèo như: bệnh tim mạch vành, xơ cứng động mạch, nhồi máu cơ tim, bệnh nghẽn mạch máu não, rối loạn chuyển hóa lipid, tăng huyết áp,… Do đó xác định chính xác và khống chế nồng độ cholesterol trong máu ở mức cho phép là việc rất cần thiết và phải được thực hiện thường xuyên

Trong đề tài này, công nghệ chế tạo linh kiện nano (nanofabrication) sẽ được dùng

để chế tạo sợi nano vàng trên đế silic có lớp cách điện SiO2/SiN Sau đó, trên bề mặt của các sợi vàng này, enzyme cholesterol oxidase được cố định thông qua những nhóm chức năng như –SH, –CHO và –NH2 để tạo nên hệ kết hợp sợi nano vàng – enzyme , và tạo thành cảm biến sinh học, sử dụng cho việc định lượng cholesterol

Với hệ cảm biến nano sinh học này, cholesterol bị oxi hoá bởi cholesterol oxidase (ChOx) để thu được đồng thời hai sản phẩm là ketone và hydrogen peroxide (H2O2) Nồng độ H2O2 tạo ra sẽ được đo bởi phép đo điện hóa quét thế vòng tuần hoàn (CV–cyclic voltammetry), từ đó cho phép xác định được hàm lượng cholesterol tương ứng trong dung dịch, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu chế tạo một bộ cảm biến hoàn chỉnh

để xác định nồng độ cholesterol toàn phần trong máu người

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 T ổng quan về cholesterol và cảm biến sinh học

Cholesterol có nhiều loại khác nhau, thường gặp là ba loại có tác động tới sức khỏe đó là cholesterol HDL (High-density lipoprotein), cholesterol LDL (Low-density lipoprotein) và chất béo triglyceride Trong khi cholesterol HDL được xem là tốt vì giảm được lượng chất béo dư thừa trong cơ thể bằng cách chuyển chúng từ hệ thống động mạch tới gan để xử lý và thải ra ngoài, thì cholesterol LDL bị xem là xấu do tích

tụ nhiều ở động mạch khiến động mạch ngày càng hẹp đi, cản trở tuần hoàn máu, dễ dẫn đến các bệnh tim mạch cũng như nhiều sự cố khác

Lượng cholesterol trong máu cao hay thấp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như di truyền, chế độ dinh dưỡng, béo phì, tuổi tác, giới tính, thói quen sinh hoạt… Lượng cholesterol trong máu cao sẽ dẫn đến tình trạng các chất béo dư thừa bám vào thành mạch máu, lâu ngày khiến chúng bị chai (bệnh xơ cứng động mạch) hoặc thu nhỏ lại, gây cản trở tuần hoàn máu, dẫn đến nguy cơ đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não

Hình I.1: Cấu trúc hóa học của cholesterol

Cholesterol được tổng hợp chủ yếu từ acetyl CoA theo đường HMG-CoAreductase ở nhiều tế bào/mô Khoảng 20–25% lượng cholesterol tổng hợp mỗi ngày (~1 g/ngày) xảy ra ở gan, các vị trí khác có tỉ lệ tổng hợp cao gồm ruột, tuyến thượng thận và cơ quan sinh sản Với một người khoảng 68 kg, tổng lượng cholesterol trung bình trong cơ thể khoảng 35g (35.000 mg) Trong một ngày lượng nội sinh trung bình khoảng 1000 mg và từ thức ăn trung bình khoảng 200 đến 300 mg Sự di chuyển cholesterol trong cơ thể có tính chất tuần hoàn, nó được bài tiết ở gan qua mật đến cơ quan tiêu hóa Khoảng 50% lượng cholesterol bài tiết được tái hấp thu ở ruột non vào

hệ tuần hoàn Phytosterols có thể cạnh tranh với cholesterol trong công tác tái hập thu của ruột vì vậy làm suy giảm độ tái hấp thu của cholesterol vào máu [1-3]

Một số thông tin cơ bản:

- Công thức phân tử: C27H46O

- Tên IUPAC: (3β)-cholest-5-en-3-ol

- Tên khoa học: 2,15-dimethyl-14-(1,5-dimethylhexyl)tetracyclo

- Nhiệt độ sôi: 360 ºC (phân hủy)

- Độ tan trong nước: 0.095mg/L

- Tan trong các dung môi: acetone, benzene, chloroform, ethanol, ether, hexan,

methanol, isopropyl myristate

1.1.1.2 Vai trò c ủa cholesterol trong cơ thể

Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholic acid tại gan, cholic acid sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muối mật có tác dụng xác tác trong quá trình tiêu hóa và hấp thụ các chất béo

- Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường:

+ Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormone vỏ tuyến thượng thận,

+ Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng,

+ Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone,

+ Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào,

+ Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì da, cùng với các chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng:

 Kháng lại việc hấp thu các chất hòa tan trong nước

 Kháng tác động của nhiều hóa chất

 Ngăn cản quá trình bốc hơi nước từ da

Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể con người khi hàm lượng của nó ở mức phù hợp Ở người trưởng thành, cholesterol toàn phần ở mức bình thường vào khoảng 4 – 5.6 mmol/L Những gười có mức cholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau

1.1.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng cholesterol tới sức khỏe

Cholesterol tồn tại trong mọi tế bào của cơ thể và rất cần thiết trong việc xây dựng các tế bào khỏe mạnh và kích thích tố Tuy nhiên, cholesterol cũng là nguyên nhân gây nên các bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não Vấn đề về tim nghiêm trọng có thể là kết quả của hàm lượng cholesterol trong cơ thể quá cao Cholesterol cao không phải là kết quả của việc ăn các loại thực phẩm chứa nhiều chất béo trong một vài ngày, vài tuần hoặc thậm chí một vài tháng, nhưng nếu sau nhiều năm ăn uống như vậy thì hàm lượng cholesterol cao là điều khó tránh Có hai loại cholesterol là cholesterol tốt và xấu Cholesterol xấu (LDL), là sự tích tụ của cholesterol có thể gây ra tắc nghẽn động mạch Cholesterol tốt (HDL), giúp ngăn ngừa sự tích tụ cholesterol trong động mạch trở về gan

Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về tim mạch ngày càng gia tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước Ở Mỹ, hàng năm có khoảng 6 triệu người bị bệnh tim, trong số này có khoảng 1,5 triệu người bị đau tim và một phần ba

số này chết Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đau tim không hề có triệu chứng hay dấu hiệu cảnh báo trước Tần số đàn ông Mỹ bị chết vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số, còn ở Anh, tỷ suất này là khoảng 250/100.000 dân số [4-5]

Cholesterol toàn phần trong máu (mmol/L [mg/dL])

Bảng I.1: Giới hạn hàm lượng cholesterol trong máu của người trưởng thành

1.1.1.4 Bi ện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu

Để giảm cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhau như sử dụng các loại thuốc có chứa chất simvastatine và chất ezetimibe hay các loại thuốc có chứa statin, nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh cholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý

Do sở thích ăn uống và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực phẩm có hàm lượng cholesterol cao như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất béo (thịt gà, heo, cá) và đặc biệt là trứng Có một số người ăn một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quả mà nó sẽ gây ra Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể, tuy nhiên chúng ta chỉ nên ăn với một lượng hợp lý để góp phần đề phòng

và giảm lượng cholesterol trong máu nhằm tránh các bệnh về tim mạch

1.1.2 T ổng quan về cảm biến sinh học

1.1.2.1 Khái ni ệm cảm biến sinh học

Cảm biến sinh học (Biosensor) thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện Đầu tiên, Cảm biến sinh học sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng Trong cảm biến sinh học, hiện tượng được nhận dạng bởi một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học (bioreceptor) Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích

gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho cảm biến sinh học Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích

Hình I.2: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến sinh học

1.1.2.2 Đặc điểm, yêu cầu của cảm biến sinh học

Để định lượng, cảm biến sinh học phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt

Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng cảm biến sinh học trong cùng một mẫu phân tích

Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai

Tính chọn lọc của cảm biến sinh học thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ biến năng Một cảm biến sinh học có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp

Tính nhạy cảm của cảm biến sinh học thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra

sự thay đổi về tín hiệu trả lời:

Da = sDmTrong đó Da: Độ dao động về biên độ của dòng ra

Dm: Độ dao động về biên độ của dòng vào

s: Độ nhạy cảm của cảm biến sinh học, đặc trưng cho mức độ phù hợp của cảm biến sinh học trong một ứng dụng cụ thể

Đối với Cảm biến sinh học đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với logarite của nồng độ chất phân tích Theo định luật Nernst: Da = sD(logc) Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời với nồng độ khác nhau của chất phân tích Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian

Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ

1.1.2.3 Nguyên lý ho ạt động của cảm biến sinh học

Các chất cần phân tích trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực, màng ngoài (external membrane) của cảm biến sinh học sẽ cho các chất cần phân tích thấm qua Các thành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, cơ quan) sẽ phản ứng với chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà các bộ biến năng (transducer) có thể phát hiện được Các thành phần sinh học ở đây thực hiện các hoạt động sau:

 Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hóa học khác thông qua các phản ứng sinh hóa (biểu diễn bằng vòng tròn rỗng trong sơ đồ)

 Giải phóng ra các sản phẩm hóa học rồi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích

 Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học

 Tạo ra một số các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được

Hình I.3: nguyên lý hoạt động chung của một cảm biến sinh học

Chất cần phân tích

Tác nhân kích thích (chất tạo ra tín hiệu)

Còn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có các đặc tính thấm khác nhau so với màng bên ngoài Tín hiệu ra của điện cực thường phụ thuộc vào loại biến năng mà nó sử dụng.[6-8]

1.1.2.4 Phân lo ại cảm biến sinh học

a Cảm biến sinh học điện hóa

C ảm biến đo điện thế

Điện cực đo điện thế hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode) (là điện cực có điện thế không đổi) Sự khác nhau về điện thế giữa hai điện cực là hàm của hoạt độ các ion trong dung dịch điện phân nơi đặt điện cực (điều kiện hoạt động của điện cực đo điện thế là không có dòng điện trong mạch đo, vì thế người ta gọi nó

là điện cực có dòng điện bằng không) Điện thế này được xác định theo phương trình Nerst:

𝐸 = 𝐸0+𝑅𝑇

𝑛𝐹 × ln

𝑎1

𝑎2Trong đó: Eo: Điện thế oxy hóa-khử tiêu chuẩn;

R: Hằng số khí;

T: Nhiệt độ tuyệt đối;

F: hằng số Faraday;

N: số điện tử trao đổi của cơ chất;

a1, a2: Hoạt độ trong dung dịch và trong lớp màng điện cực

C ảm biến đo dòng điện

Cảm biến đo dòng điện hoạt động dựa vào dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế giữa hai điện cực (điện cực đo và điện cực so sánh) Mật độ của các hạt tích điện tỷ lệ thuận với cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực

Cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực là hàm của mật độ các hạt tích điện trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực Trong đa số trường hợp, người ta thường tiến hành oxy hóa hoặc khử một loại hạt tích điện trên cực đo

Nếu đặt vào điện cực đo một điện thế E biến thiên so với điện cực so sánh và vẽ đường cong I= f(E), chiều cao I của bậc giới hạn khuếch tán sẽ tỷ lệ với nồng độ của hạt bị oxy hóa hoặc bị khử trên điện cực đo

Phương pháp đo dòng điện này có những đặc điểm sau:

 Phản ứng Enzym sẽ phụ thuộc vào vận tốc khuếch tán của cơ chất qua màng

 Khi phản ứng oxy hóa – khử xảy ra, gradient nồng độ của cơ chất giảm dần, do

đó vận tốc chuyển khối chậm và có thể dòng điện bị khử, để duy trì dòng điện không đổi cần phải giữ những vùng tiếp xúc càng nhỏ càng tốt (tức là cần điều chế các vi điện cực có đường kính rất nhỏ, đến vài mm)

 Vận tốc phản ứng oxy hóa – khử phụ thuộc vào nồng độ Oxy hòa tan (cảm biến thế hệ 1) Để hạn chế ảnh hưởng của nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch

đến kết quả phân tích thì người ta không sử dụng oxy làm chất nhận điện tử mà

sử dụng các chất trung gian để vận chuyển điện tử đến bề mặt điện cực (cảm biến thế hệ 2) Các chất vận chuyển điện tửtrung gian có thể là ion Fe3+, N-methylphenazinium (NMP) hoặc tetracyanoquinodimethane (TCNQ), hexacyanoferate

b Cảm biến nhiệt (calorimetric biosensor)

Các phản ứng giữa cơ chất và chất xúc tác sinh học thường giải phóng ra nhiệt năng và người ta có thể đo lượng nhiệt giải phóng ra đó bằng một thiết bị đo nhiệt (điện cực đo nhiệt), từ đó sẽ tính được lượng cơ chất ban đầu Khi nhiệt lượng tỏa ra càng lớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn Do đó để tăng nhiệt lượng tỏa ra, có thể cố định đồng thời 2 hoặc 3 enzym (cũng có thể lên tới 4-5 enzym)

Bảng I.2: Enthanpi của một số phản ứng có enzyme xúc tác

c Cảm biến đo quang (Optical biosensor)

Cảm biến đo quang được chế tạo dựa vào các tính chất vật lý của ánh sáng để phát hiện ra sự biến đổi nhỏ trong mẫu phân tích

Nguyên tắc hoạt động: Dung dịch phân tích được tiếp xúc với màng và khi phản ứng enzym xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc phát ra ánh sáng màu Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của mẫu phân tích thông qua việc

đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của các chất tạo thành do phản ứng xúc tác bởi enzym

Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc phổ quang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang Nó có khả năng chỉ báo những thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợi dẫn Những thiết bị này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng được đo

d Cảm biến áp điện (Piezoelectric biosensor)

Nguyên lý của loại cảm biến này dựa vào sự dao động của các tinh thể Các chất điện môi tự nhiên như thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như liti sulfat, thạch anh tổng hợp…dao động khi chịu tác động của từ trường Tần số dao động của tinh thể phụ thuộc vào độ dày và sự biến dạng của tinh thể, mỗi tinh thể có một tần số dao động đặc trưng Tần số dao động này thay đổi theo sự hấp thụ hay giải hấp từ bề mặt tinh thể, thông thường nó sẽ tăng khi có tạp chất hấp thu lên trên bề mặt của tinh thể

Đo tần số dao động sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo

Tần sốdao động được tính theo công thức:

Ưu điểm: Cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền

Nhược điểm: Không dùng phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không khí

Hình I.4: Sơ đồ cấu tạo của cảm biến áp điện

e Cảm biến miễn dịch (Immunobiosensor)

Cảm biến miễn dịch hoạt động dựa trên tính chất kháng nguyên – kháng thể, tức là các kháng thể phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên sinh ra nó

Mỗi kháng thể là một protein hình chữ Y, gồm 4 chuỗi polypeptide, trong đó có hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ liên kết với nhau bởi các cầu disulfite Một phần cấu trúc của các chuỗi là cố định, nhưng các phần đầu mút của hai nhánh chữ Y lại biến đổi và tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng với các chất hóa học khác gọi

là kháng nguyên Kháng nguyên là các “chất lạ” có bản chất protein hay hydrat cacbon

Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định bằng nhiều cách, trong đó có

kỹ thuật ELISA (enzym linked immunosorben assay: kỹ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn enzym)

Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA như sau:

Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được cố định trên bề mặt của một ống Một hỗn hợp gồm một lượng đã biết phức kết enzym-kháng nguyên và một lượng chưa biết kháng nguyên của mẫu được đặt vào ống Sau một thời gian thích hợp kháng thể, phức enzyme kháng nguyên và kháng nguyên tự do có thể gắn kết hoặc vẫn ở trạng thái tự do, phụthuộc vào nồng độ của chúng Các kháng nguyên tự do được rửa trôi và loại bỏ Lượng phức kết enzym-kháng nguyên gắn với kháng thể được xác định bằng

vận tốc phản ứng enzym

ELISA được sử dụng để phát hiện và khuếch đại một phản ứng kháng nguyên kháng thể Lượng kháng nguyên liên kết với enzym gắn với kháng thể cố định được xác định bằng nồng độ tương đối giữa kháng nguyên liên kết và kháng nguyên tự do

và được định lượng bằng tỷ lệ của phản ứng enzym Để có thể đáp ứng nhanh chóng, người ta sử dụng các enzym có khả năng sử dụng lại nhiều lần Độ nhạy của phương pháp này cũng có thể tăng lên bằng cách sử dụng các phản ứng có xúc tác enzym Các phản ứng này cho đáp ứng nhanh hơn: chẳng hạn tạo ra các sản phẩm phát quang, hoặc huỳnh quang, hoặc có màu đậm hơn Kỹthuật này hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các phòng phân tích thí nghiệm.[9-10]

1.2 Công ngh ệ nano và cảm biến sinh học sợi nano vàng

1.2.1 Công ngh ệ nano

1.2.1.1 T ổng quan về công nghệ nano

Công nghệ nano là ngành khoa học nghiên cứu khả năng tác động đến vật chất ở mức nguyên tử và phân tử Nói đến công nghệ nano thường hàm ý nói đến các cấu trúc có kích thước từ 1 đến 100 nm Kích thước và cấu trúc siêu nhỏ dẫn đến các thay đổi lớn về bản chất và tính chất của vật liệu và linh kiện Những thay đổi và tính chất mới này khi được khai thác và sử dụng thích hợp sẽ mang lại những ứng dụng mới, với khả năng mạnh mẽ mà vật liệu và linh kiện truyền thống không có được

Có hàng loạt ví dụ về các vật liệu và linh kiện nano đang mang lại những ích lợi to lớn cho xã hội Các cấu trúc nano như thanh (cantilevers), dầm (beams), tạo ra các linh kiện dao động ở tần số siêu cao tần (GHz), mở ra các ứng dụng mới trong viễn thông Vật liệu dạng hạt nano (nanoparticles) ngoài việc đang được nghiên cứu làm hạt dẫn thuốc chữa bệnh, còn được hòa trộn vào các vật liệu khác, giúp tạo nên các siêu vật liệu về cơ tính, lý tính và hóa tính Ví dụ như việc sử dụng hạt nano TiO2 góp phần tạo nên sơn nano với tính chất tự diệt khuẩn mà sơn truyền thống không có được Các dạng vật liệu nano đang được nghiên cứu rộng rãi trong lĩnh vực năng lượng nhằm tạo ra các sản phẩm năng lượng thay thế cho năng lượng hóa thạch như pin mặt trời, tế bào nhiên liệu (fuel cells), vật liệu chứa hydro nhằm tạo ra các pin điện cho xe điện

1.2.1.2 V ật liệu nano

Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước nanomet Về trạng thái của vật liệu, người ta phân chia thành ba trạng thái, rắn, lỏng và khí Vật liệu nano được tập trung nghiên cứu hiện nay, chủ yếu là vật liệu rắn, sau đó mới đến chất lỏng và khí Về hình dáng vật liệu, người ta phân ra thành các loại sau:

 Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano, không còn chiều tự do nào cho điện tử), ví dụ: đám nano, hạt nano

 Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, điện

tử được tự do trên một chiều (hai chiều cầm tù), ví dụ: dây nano, ống nano

 Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, hai chiều tự do, ví dụ: màng mỏng

 Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau

1.2.1.3 Ch ế tạo vật liệu nano

Vật liệu nano được chế tạo bằng hai phương pháp: phương pháp từ trên xuống (top-down) và phương pháp từ dưới lên (bottom-up) Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo hạt kích thước nano từ các hạt có kích thước lớn hơn; phương pháp

từ dưới lên là phương pháp hình thành hạt nano từ các nguyên tử

Phương pháp từ trên xuống

Nguyên lý: dùng kỹ thuật nghiền và biến dạng để biến vật liệu thể khối với tổ chức hạt thô thành cỡ hạt kích thước nano Đây là các phương pháp đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả, có thể tiến hành cho nhiều loại vật liệu với kích thước khá lớn (ứng dụng làm vật liệu kết cấu) Trong phương pháp nghiền, vật liệu ở dạng bột được trộn lẫn với những viên bi được làm từ các vật liệu rất cứng và đặt trong một cái cối Máy

nghiền có thể là nghiền lắc, nghiền rung hoặc nghiền quay (còn gọi là nghiền kiểu hành tinh) Các viên bi cứng va chạm vào nhau và phá vỡ bột đến kích thước nano Kết quả thu được là vật liệu nano không chiều (các hạt nano) Phương pháp biến dạng được sử dụng với các kỹ thuật đặc biệt nhằm tạo ra sự biến dạng cực lớn(có thể >10)

mà không làm phá huỷ vật liệu, đó là các phương pháp SPD điển hình Nhiệt độ có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể Nếu nhiệt độ gia công lớn hơn nhiệt độ kết tinh lại thì được gọi là biến dạng nóng, còn ngược lại thì được gọi là biến dạng nguội Kết quả thu được là các vật liệu nano một chiều (dây nano) hoặc hai chiều (lớp có chiều dày nm) Ngoài ra, hiện nay người ta thường dùng các phương pháp quang khắc để tạo ra các cấu trúc nano

Phương pháp từ dưới lên

Nguyên lý: hình thành vật liệu nano từ các nguyên tử hoặc ion Phương pháp từ dưới lên được phát triển rất mạnh mẽ vì tính linh động và chất lượng của sản phẩm cuối cùng Phần lớn các vật liệu nano mà chúng ta dùng hiện nay được chế tạo từ phương pháp này Phương pháp từ dưới lên có thể là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học hoặc kết hợp cả hai

Phương pháp vật lý: là phương pháp tạo vật liệu nano từ nguyên tử hoặc chuyển pha Nguyên tử để hình thành vật liệu nano được tạo ra từ phương pháp vật lý: bốc bay nhiệt (đốt, phún xạ, phóng điện hồ quang) Phương pháp chuyển pha: vật liệu được nung nóng rồi cho nguội với tốc độ nhanh để thu được trạng thái vô định hình,

xử lý nhiệt để xảy ra chuyển pha vô định hình - tinh thể (kết tinh) (phương pháp nguội nhanh) Phương pháp vật lý thường được dùng để tạo các hạt nano, màng nano, ví dụ:

ổ cứng máy tính

Phương pháp hóa học: là phương pháp tạo vật liệu nano từ các ion Phương pháp hóa học có đặc điểm là rất đa dạng vì tùy thuộc vào vật liệu cụ thể mà người ta phải thay đổi kỹ thuật chế tạo cho phù hợp Tuy nhiên, chúng ta vẫn có thể phân loại các phương pháp hóa học thành hai loại: hình thành vật liệu nano từ pha lỏng (phương pháp kết tủa, sol-gel, ) và từ pha khí (nhiệt phân, ) Phương pháp này có thể tạo các hạt nano, dây nano, ống nano, màng nano, bột nano,

Phương pháp kết hợp: là phương pháp tạo vật liệu nano dựa trên các nguyên tắc

vật lý và hóa học như: điện phân, ngưng tụ từ pha khí, Phương pháp này có thể tạo các hạt nano, dây nano, ống nano, màng nano, bột nano,

1.2.1.4 Ứng dụng của công nghệ nano

Trong ngành công nghiệp hiện nay, các tập đoàn sản xuất điện tử đã bắt đầu đưa công nghệ nano vào ứng dụng, tạo ra các sản phẩm có tính cạnh tranh từ chiếc máy nghe nhạc iPod nano đến các con chip có dung lượng lớn với tốc độ xử lý cực nhanh

… Trong y học, để chữa bệnh ung thư người ta tìm cách đưa các phân tử thuốc đến

đúng các tế bào ung thư qua các hạt nano đóng vai trò là “ xe tải kéo”, tránh được hiệu ứng phụ gây ra cho các tế bào lành Y tế nano ngày nay đang nhằm vào những mục tiêu bức xúc nhất đối với sức khỏe con người, đó là các bệnh do di truyền có nguyên nhân từ gien, các bệnh hiện nay như: HIV/AIDS, ung thư, tim mạch, các bệnh đang lan rộng hiện nay như béo phì, tiểu đường, liệt rung (Parkison), mất trí nhớ (Alzheimer), rõ ràng y học là lĩnh vực được lợi nhiều nhất từ công nghệ này Đối với việc sửa sang sắc đẹp đã có sự hình thành nano phẩu thuật thẩm mỹ,nhiều lọai thuốc thẩm mỹ có chứa các loại hạt nano để làm thẩm mỹ và bảo vệ da Đây là một thị trường có sức hấp dẫn mạnh, nhất là đối với công nghệ kiệt xuất mới ra đời như công nghệ nano

Ngoài ra, các nhà khoa học tìm cách đưa công nghệ nano vào việc giải quyết các vấn đề mang tính toàn cầu như thực trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng Việc cải tiến các thiết bị quân sự bằng các trang thiết bị, vũ khí nano rất tối tân mà sức công phá khiến ta không thể hình dung nổi.[11-12]

1.2.2 C ảm biến sợi nano vàng dùng cho phát hiện cholesterol

1.2.2.1 S ợi nano

Sợi nano được định nghĩa là vật liệu ở dạng sợi với đường kính sợi trong khoảng 1-100 nm Như thế, chúng ta phải bó ít nhất 1 triệu sợi nano lại với nhau để có một vật thể có kích thước ngang bằng sợi tóc người với đường kính trung bình là 100 micron Khi ở dạng siêu nhỏ sợi nano, phần lớn các lớp nguyên tử cấu tạo nên sợi sẽ nằm trên bề mặt, dẫn đến các tính chất của sợi, đặc biệt là điện trở của sợi, rất nhạy với các thay đổi của môi trường bên ngoài Tính chất này làm sợi nano trở thành vật liệu lý tưởng để chế tạo các cảm biến sinh học thế hệ mới - cảm biến sợi nano sinh

học - với khả năng hoàn toàn mới mà linh kiện truyền thống không có

Hình I.5: Sợi nano chế tạo bởi nhiều phương pháp khác nhau (A); Đơn sợi nano với kích thước 40-50 nm (B); Sợi nano với hai điện cực nối ra mạch điều khiển bên ngoài (C)

Tuy các nhóm nghiên cứu đã gần như làm chủ được công nghệ chế tạo sợi nano, nhưng việc chế tạo được linh kiện nano (hình I.5C) với các đường dẫn kết nối ra mạch điều khiển bên ngoài vẫn còn là một vấn đề vô cùng khó khăn Để đi đến linh kiện như hình I.5C, các nhà khoa học phải thực hiện rất nhiều bước thực nghiệm như chọn lọc đơn sợi, rồi chế tạo điện cực cho đơn sợi đó Các công việc này là rất khó khăn và đòi hỏi nhiều thời gian vì cấu trúc siêu nhỏ của sợi Việc này cần đến các thiết bị chuyên dụng, đắt tiền Ngoài ra, độ lặp lại của linh kiện cũng không cao do việc chế tạo thủ công, đơn chiếc Việc sử dụng các thiết bị quang khắc nano chuyên dụng như lithography chùm điện tử (E-Beam nanolithography), chùm ion hội tụ (Focused Ion Beam), kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscope) để chế tạo các đơn sợi

ở các vị trí định sẵn sẽ loại bỏ được việc chọn lọc sợi và dễ dàng hơn trong việc tạo điện cực kết nối mạch ngoài Tuy thế các thiết bị quang khắc nano nói trên đều rất đắt tiền, đi kèm với năng suất thấp, dẫn đến giá thành chế tạo linh kiện quá cao, hạn chế khả năng nghiên cứu cũng như ứng dụng rộng rãi của linh kiện sợi nano nói chung và cảm biến sợi nano nói riêng [13]

1.2.2.2 C ảm biến sợi nano vàng

Gần đây, với hệ số bề mặt với thể tích cực lớn (ultrahigh ratios of surface to volume) vật liệu ở dạng sợi nano đã đưa ra các tiềm năng ưu việt trong việc chế tạo các linh kiện và cảm biến thông minh thế hệ mới Trong rất nhiều ứng dụng mới của linh kiện dựa trên cấu trúc sợi nano, sợi nano vàng (Au) đã và đang hứa hẹn nhiều tiềm năng trong trong việc chế tạo cảm biến sinh học Sợi nano vàng với diện tích tiếp xúc mặt ngoài cực lớn (>1000 m2/g) sẽ tạo điều kiện cho quá trình gia tăng khả năng hoạt hóa bề mặt bởi một lượng lớn enzyme, điều đó sẽ khiến cho cường độ dòng thu nhận lớn hơn rất nhiều lần so với việc dùng sợi micro trong quá trình thực nghiệm Không chỉ có vậy, sợi nano vàng còn sở hữu đặc tính siêu dẫn tương tự như các-bon ống nano giúp cho quá trình đáp ứng và thu nhận tín hiệu trở nên nhanh và nhạy hơn

Vì thế, cảm biến sợi nano vàng với đặc tính hiệu năng cao, thời gian thu nhận tính hiệu nhanh, siêu dẫn cùng với việc tương thích và có ái lực cao với các nhóm chức như –SH, –COOH và –NH2 được sử dụng nhiều trong việc gắn kết các phần tử sinh học như enzyme, DNA, protein, virus Thêm vào đó điện cực sợi nano vàng tượng đối trơ với hầu hết các hệ dung dịch phân tích trong một khoảng điện thế rộng, tạo tiền đề cho việc chế tạo một thế hệ cảm biến mới, siêu nhanh, nhạy và giá thành hạ Đến nay, có nhiều phương pháp và công nghệ khác nhau đã được phát triển để chế tạo sợi nano Au, sau đó lắp nghép các sợi đó lại để có được cảm biến hoàn chỉnh Tuy nhiên do độ phức tạp cao trong quá trình chế tạo, vẫn còn nhiều khó khăn trong việc sản xuất hàng loạt, giảm giá thành chế tạo cũng như đưa các cảm biến sợi nano Au ứng dụng vào thực tiễn Để phát huy được các ưu điểm ưu việt của cảm biến sinh học

dựa trên sợi nano Au, phương pháp chế tạo đơn giản, với chi phí thấp, ở qui mô lớn,

đã được nghiên cứu và phát triển, đó là phương pháp phương pháp Bốc bay và Ăn mòn dưới góc nghiêng (Deposition and Etching under Angle- DEA), được nghiên

cứu và phát triển bởi Phòng Thí Nghiệm Công nghệ Nano – ĐHQG TP HCM

Đây là một phương pháp chế tạo mới cho phép chế tạo sợi nano Au với giá thành thấp

ở qui mô lớn sẽ được sử dụng để chế tạo các chip silicon trên đó có chứa các sợi nano

Au Hơn nữa, mỗi đơn sợi nano Au trên chip silicon đều được kết nối riêng biệt ra thiết bị điều khiển bên ngoài, tạo ra linh kiện sợi nano hoàn chỉnh, sẵn sàng cho việc

đo đạc và thực nghiệm tiếp theo Khả năng chế tạo được chip chứa sợi nano Au như thế sẽ đóng một vai trò rất quan trọng cho việc hoàn thành nghiên cứu về chế tạo và ứng dụng của cảm biến sinh học dựa trên sợi nano Au.[14-18]

1.3 Phương pháp đơn lớp tự lắm ghép

1.3.1 C ố định enzyme

Việc cố định các thành tố sinh học, nhất là enzym thường đem lại nhiều tác dụng hơn trong phản ứng như:

 Làm cho enzym trong nhiều trường hợp bền hơn

 Tách phức enzym – chất mang ra khỏi mẫu dễdàng

 Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong một thời gian dài

Tuy nhiên, việc sử dụng enzym cố định cũng có những hạn chế nhất định như:

Người ta thường cố định các thành phần sinh học lên một chất mang rắn bằng nhiều cách Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu cầu nhất định, nhất là khi các cảm biến sinh học (biosensor) được đưa vào sử dụng trong thực tế:

 Các cấu tử sinh học phải giữ được hoạt độ khi gắn trên bề mặt cảm biến sinh học

 Màng sinh học phải được gắn chặt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ được cấu trúc và chức năng

 Màng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong một thời gian dài

 Vật liệu sinh học cần có tính đặc trưng riêng đối với từng cấu tử sinh học

Để cố định các thành phần sinh học trong Cảm biến sinh học, người ta thường sử dụng các kỹ thuật như hấp thụ vật lý, bao gói trong khuôn gel hoặc trong polymer, liên kết đồng hóa trị với chất mang và liên kết chéo các protein.[19-20]

1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme

1.3.2.1 Phương pháp vật lý

Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau:

 Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein như lực Van der Waals, liên kết hydro và liên kết kỵ nước Khi chất mang không có lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui vào trong các lỗ xốp của chất mang

 Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kết ion (Liên kết này bền hơn so với hấp phụ)

Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên kết ion:

 Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin

 Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide kim loại

 Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose

 Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang

Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết

cố định

 Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận với nồng độ của nó ởmột giới hạn nhất định

 pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện

ở chất mang cũng như ởprotein enzym Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion Đồng thời sựthay đổi pH đột ngột thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym

 Lực ion của môi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch Tuy nhiên,

sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định

 Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym

 Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tử càng nhỏ thì hấp phụ càng cao Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt hơn và bền hơn

Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzym trong dung dịch không giữ được hoạt tính trong thời gian dài Do đó sự cố định hóa học, sử dụng các liên kết đồng hóa trị sẽ đảm bảo độ bền của enzym trong một thời gian khá dài.[21-24]

1.3 2.2 Phương pháp liên kết ngang (crosslinking)

Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và không có tính hòa tan

Có thể tạo liên kết ngang các phân tử của cùng enzym hay cố kết hai hay nhiều protein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trên protein mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA) Ngay cả cơ quan hay các tế bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang Glutaraldehyde là một trong những tác nhân tạo liên kết ngang thường được sử dụng trong việc cố định enzyme Tác nhân này có hai nhóm chức aldehyde ở các đầu mạch, các nhóm chức này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tử protein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:

Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang

Có 3 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang:

 Phương pháp ngâm: điện cực sau khi được làm sạch bề mặt được ngâm vào trong dung dịch tác nhân tạo liên kết và enzyme để cố định enzyme lên bề mặt điện cực Ưu điểm của phương pháp này là phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các enzyme lên đa số các bề mặt điện cực, đặc biệt

là các bề mặt nhỏ

 Phương pháp kết hợp trực tiếp: dung dịch enzyme và tác nhân liên kết được nhỏ trực tiếp lên bề mặt điện cực Ưu điểm của phương pháp này là tiết kiệm

enzyme, nó thường được sử dụng để cố định các loại enzyme có giá thành cao, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là chỉ thích hợp đối với các điện cực có bề mặt lớn

 Phương pháp sử dụng bình phun: điện cực được ngâm trong enzyme sau đó được làm khô và glutaraldehyde được phun lên bề mặt điện cực dưới dạng hơi sương ở một khoảng cách đủ lớn để tránh tạo giọt, sau khi tạo liên kết ngang điện cực được rửa lại với nước Ưu điểm của phương pháp này là lớp enzyme mỏng làm cho cảm biến có thời gian đáp ứng ngắn.[25]

1.3 3 Phương pháp đơn lớp tự lắp ghép (self assembly monolayer – SAM)

1.3.3.1 Khái ni ệm về phương pháp đơn lớp tự lắp ghép

SAM là một đơn lớp có độ dày cỡ phân tử được hình thành do sự tự sắp xếp của các phân tử theo một trật tự dựa trên sự hấp thụ hóa học của các phân tử đó hướng đến một trạng thái năng lượng ổn định trên một bề mặt rắn SAM là dạng cơ bản nhất của một màng mỏng hữu cơ ở kích thước nano, chúng ổn định hơn màng mỏng được tạo bằng phương pháp Langmuir – Blodgett do các phân tử được hấp thụ lên bề mặt rắn thông qua liên kết hóa học Sự hấp thụ hóa học của một phân tử lên trên một bề mặt sẽ khóa lại một nhóm chức của phân tử đó (nhóm chức để liên kết với bề mặt rắn) và nhóm chức còn lại tự do với khả năng sử dụng cho nhiều ứng dụng khác nhau SAM

có thể được tạo thành từ các phân tử có kích thước lớn hoặc nhỏ khác nhau Để tạo thành đơn lớp không có sai hỏng, thích hợp cho việc gắn kết các phân tử sinh học thì người ta ưu tiên sử dụng SAM được tạo thành từ các phân tử có mạch alkane dài với

bề mặt được sắp xếp và đóng gói tốt hơn SAM của các phân tử có kích thước nhỏ thích hợp hơn trong trường hợp cần có các sai hỏng để tạo thành các kênh chuyển điên tích cho dòng điện tích tạo thành từ phản ứng có thể di chuyển đến bề mặt của điện cực

Sự hình thành của các phân tử tự lắp ghép một cách có trật tự cung cấp một môi trường rộng lớn cho các ứng dụng bề mặt ở cấp độ phân tử SAM cung cấp một hệ thống thuận tiện, linh hoạt và đơn giản cho sự hình thành của đơn lớp được sắp xếp với khả năng thay đổi tính chất bề mặt của kim loại, oxide kim loại và bán dẫn ở cấp

độ phân tử Chúng có thể giúp loại bỏ vấn đề về tương thích bề mặt, làm tăng tính ổn định nhiệt của thiết bị và có thể được sử dụng để nâng cao hiệu ứng lượng tử ngoài của diode phát quang hữu cơ Chúng cũng có tác dụng như là một bề mặt mới để nghiên cứu các quá trình sinh học và sinh hóa Hai loại SAM phổ biến nhất được nghiên cứu và ứng dụng hiện nay là SAM của các hợp chất sulfur hữu cơ trên bề mặt vàng và của các hợp chất silane trên bề mặt bán dẫn và oxide kim loại.[26-28]

1.3.3.2 S ự hình thành SAM

Bề mặt kim loại hay oxide kim loại sạch có khuynh hướng hấp thụ các chất hữu cơ

để tạo thành SAM do việc hấp thụ này làm giảm năng lượng tự do của bề mặt tương tác giữa kim loại/oxide kim loại với môi trường xung quanh Sự hình thành SAM từ dung dịch loãng cho một đơn lớp được sắp xếp có trật tự trong khi ở nồng độ cao và thời gian dài thì có thể tạo thành màng đa lớp Chất hấp thụ có thể bao phủ hoàn toàn

bề mặt trong một thời gian ngắn (vài millisecond đến vài phút) đối với dung dịch có nồng độ millimolar, tuy nhiên để tạo thành một đơn lớp có độ xếp chặt các phân tử là tối đa và giảm các sai hỏng thì cần đến hàng giờ cho quá trình sắp xếp lại Bieri và cộng sự đã chứng minh là sự tạo thành SAM của rất nhiều hợp chất sulfur hữu cơ là

vô cùng phức tạp, nó khác xa so với trường hợp hấp thụ Langmuir đơn giản và bao gồm 2 bước chính là sự sắp xếp lại của các phân tử theo sau bởi quá trình khử proton Việc sử dụng 2 hợp chất silane hay sulfur hữu cơ với một tỷ lệ mole đặc biệt có thể tạo thành một đơn lớp hỗn hợp Người ta đã chứng minh rằng đơn lớp hỗn hợp có thể được sử dụng để cố định các phân tử sinh học mà không gặp phải trở ngại về cản trở không gian

Sự hình thành SAM của sulfur hữu cơ trên bề mặt vàng: SAM của sulfur hữu

cơ là hệ thống đơn lớp được nghiên cứu nhiều nhất cho đến nay với những tính chất

ưu việt nhất như các phân tử được sắp xếp có trật tự cao, cấu trúc của nhóm bề mặt linh hoạt và phương pháp chuẩn bị và phân tích đơn giản SAM của các sulfur hữu cơ thường được sử dụng đối với bề mặt kim lọại như vàng, platin, bạc, đồng, palladium… và sự sắp xếp của các phân tử SAM trên bề mặt phụ thuộc chủ yếu vào

độ dài của chuỗi alkan của chúng Khả năng tương thích cao của sulfur hữu cơ đối với các kim loại như vàng chủ yếu dựa vào tương tác acid – base yếu theo lý thuyết về acid base mạnh và yếu Những đơn lớp này chủ yếu hình thành từ các hợp chất thiol, dialkyl disulfide và sulfide trong các dung môi có độ tinh khiết cao như ethanol, acetone, hexane, nước…

Hình I.6: sự hình thành SAM từ sulfur hữu cơ

Alkane thiol dùng trong tự lắp ghép có cấu tạo gồm 3 thành phần chính: nhóm hoạt động bề mặt (sulfur) liên kết mạnh với bề mặt kim loại (vàng, platin, bạc), chuỗi alkyl tạo sự ổn định cho đơn lớp bằng tương tác Van der Waals, và một nhóm chức năng ω đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết các phân tử sinh học với đơn lớp Thông qua việc lựa chọn nhóm chức năng, tương tác đặc trưng giữa bề mặt và dung dịch (hóa trị, tĩnh điện hay kỵ nước)có thể được sử dụng để liên kết các phân tử tới bề mặt tương tác Cơ chế của quá trình hấp thụ các hợp chất sulfur hữu cơ lên platin (Pt), bạc (Ag) và vàng (Au) sử dụng phản ứng điện hóa cho thấy không có phản ứng điện hóa xuất hiện trong quá rình hấp thụ hóa học trên bề mặt Pt trong khi trên bề mặt Au

và Ag thì có phản ứng anode với các hợp chất thiol và phản ứng cathode với các hợp

chất dialkyl disulfide Quá trình hấp thụ hóa học bị ảnh hưởng lớn bởi các chất oxi hóa khử, pH của dung dịch, oxi hòa tan, điện thế của kim loại đối với dung dịch có chứa chất hấp thụ.[29-30]

1.3.3.3 Các phương pháp phân tích SAM

Việc phân tích một đơn lớp có thể được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau như phép đo góc tiếp xúc, các phép đo điện hóa như quét thế vòng tuần hoàn hay phổ tổng trở điện hóa Một đơn lớp cũng có thể được phân tích bởi phương pháp phổ hồng ngoại, phổ X-ray photoelectron, ellipsometry, cộng hưởng Plasmon bề mặt, kính hiển vi quét mục tiêu như kính hiển vi điện tử quét hay kính hiển vi quét xuyên ngầm, kính hiển vi lực nguyên tử…

Phương pháp đo góc tiếp xúc: chất lượng và độ đồng đều của một đơn lớp với độ

dài khác nhau có thể được xác định bằng phép đo góc thấm ướt Nhóm bề mặt ngoài trên chuỗi hydrocarbon của đơn lớp SAM quyết định tính ưa nước hay kỵ nước của

đơn lớp đó và do đó phương pháp đo góc thấm ướt hay góc tiếp xúc (CA) có thể được

sử dụng để xác định sự hình thành của đơn lớp SAM

Phương pháp đo phổ hồng ngoại (FT-IR): phương pháp phổ là một phương

pháp hữu hiệu để xác định định hướng và sự sắp xếp của phân tử trong đơn lớp SAM

Kính hiển vi quét mục tiêu: chất lượng và độ đồng đều bề mặt của một đơn lớp

với độ dài khác nhau (từ micro đến nano) có thể được xác định trực tiếp bằng hình ảnh độ gồ ghề bề mặt bởi kính hiển vi lực nguyên tử (AFM), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi quét xuyên ngầm (STM)

Phương pháp điện hóa: trong các phương pháp điện hóa thì phổ tổng trở (EIS) và

quét thế vòng tuần hoàn (CV) là hai phương pháp hữu hiệu nhất để nghiên cứu quá trình chuyển điện tích và phát hiện các sai hỏng và lỗ trong đơn lớp SAM Phương pháp CV có thể dùng để xác định các trạng thái oxi hóa khử, cấu tạo bề mặt, các vùng sai hỏng và độ bao phủ Phổ tổng trở có thể cung cấp thông tin về cơ chế của quá trình chuyển điện tử bằng cách đo điện dung lớp kép và điện trở của đơn lớp [31]

1.4 K ỹ thuật quét thế vòng tuần hoàn

Phương pháp quét thế vòng tuần hoàn (CV – cyclic voltammetry) thuộc loại

phương pháp đo điện hóa, nó được sử dụng để nghiên cứu các phản ứng oxi hóa khử khống chế bởi quá trình khuếch tán

Đây là phương pháp thực nghiệm điện hóa điều khiển bằng thế Áp điện thế biến thiên theo thời gian lên một điện cực và quan sát đáp ứng điện tương ứng, phân tích đáp ứng điện này sẽ thu được thông tin nhiệt động học và động lực học của sự truyền điện tích giữa điện cực và dung dịch, cũng như động lực học và cơ chế của phản ứng hóa học gây ra do sự chuyển điện tích này

1.4.1 Nguyên lý

Một nguồn phân thế (potentiostat) làm nhiệm vụ điều khiển các thông số thực nghiệm Mục đích của nó là quét một điện thế tuần hoàn tuyến tính biến thiên theo thời gian (hình I.7) trên một điện cực (gọi là điện cực làm việc) và xuất ra kết quả là một đường cong dòng-thế

Quá trình quét thế được thực hiện từ thế đầu tiên (Eđ) đến thế cuối (Ec) và ngược lại với vận tốc quét là v [V/s] Nếu quét thế từ phía dương đến phía âm thì

E = Eđ + vt (thế thuận)

E = Es – vt (thế nghịch)

Từ hình dạng của đồ thị quét thế vòng có thể xác định được phản ứng xảy ra trên điện cực là thuận nghịch, bất thuận nghịch hay giả thuận nghịch; điện thế tại đó xảy ra các phản ứng oxi hóa, khử; điện dung của tế bào điện hóa; số điện tử trao đổi cho quá trình xảy ra và động học của phản ứng điện cực

Hình I.7 Đồ thị quét thế theo thời gian trong phép đo CV

Xét quá trình oxi hóa khử O + ne  R Nếu quét từ điện thế đầu tiên Eđdương hơn điện thế điện cực tiêu chuẩn danh nghĩa E′o thì chỉ có dòng không Faraday đi qua Khi

điện thế đạt đến E′o thì sự khử bắt đầu và có dòng Faraday đi qua Điện thế càng dịch

về phía âm, nồng độ của chất O giảm xuống và sự khuếch tán tăng lên, do đó dòng điện cũng tăng Khi nồng độ chất O giảm đến 0 ở sát bề mặt điện cực thì dòng điện đạt giá trị cực đại, sau đó lại giảm xuống vì nồng độ chất O trong dung dịch giảm xuống Khi quét thế ngược lại về phía dương, chất R bị oxi hóa thành O khi điện thế quay về đến E′o và dòng anod đi qua (hình I.8)

Hình I.8 Quan hệ dòng-điện thế trong quét thế vòng thuận nghịch

Phản ứng điện hóa xảy ra ở điện cực làm việc (WE – working electrode) Cường

độ dòng điện ở WE gây ra do sự dịch chuyển điện tử chính là dòng điện cảm ứng (dòng Faraday) Nguồn phân thế sẽ cấp điện thế cho điện cực phụ hay còn gọi là điện

cực đối (CE - counter electrode) để cân bằng dòng điện cảm ứng ở điện cực WE bằng

cách tạo ra dòng điện tử chuyển động ngược hướng với dòng điện trên điện cực WE, nghĩa là nếu sự khử xảy ra ở điện cực WE thì sự oxi hóa sẽ xảy ra trên điện cực so

sánh (RE – reference electrode)

Chiều thuận Chiều ngịch

Hình I.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quét thế vòng tuần hoàn

Quá trình xảy ra trên điện cực đối thường không được quan tâm, trong nhiều thực nghiệm thì cường độ trên RE nhỏ, có nghĩa là sản phẩm điện phân không ảnh hưởng đến quá trình xảy ra trên WE

Dòng điện cảm ứng ở WE được biến đổi thành thế ngõ ra với một độ nhạy riêng, đơn vị là A/V, được xác định theo kiểu số hoặc tương tự Đáp ứng CV là đồ thị của dòng điện theo điện thế Trong quá trình thuận dạng oxi hóa bị khử, còn trong quá trình nghịch dạng khử ở gần điện cực bị oxi hóa Phản ứng hóa học xảy ra tại điện cực

có thể ảnh hưởng mạnh mẽ đến dạng của đồ thị CV

1.4.2 Đồ thị quét thế vòng

Tương ứng với mỗi giá trị điện thế áp vào, máy đo sẽ ghi nhận giá trị dòng đáp ứng và xuất ra kết quả dưới dạng đồ thị dòng điện (hay mật độ dòng) theo điện thế Hình dạng của đồ thị CV có thể biến đổi tùy theo tính chất động học của phản ứng khảo sát cũng như tốc độ quét thế Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp, tương ứng với một cặp oxi hóa khử, đồ thị CV có thể có các dạng như sau:

Hệ bất thuận nghịch: Phản ứng chỉ xảy ra theo một chiều oxi hóa hoặc khử, đồ thị CV

xuất hiện một peak oxi hóa hoặc khử tương ứng (Hình I.10.A)

Hệ giả thuận nghịch: thường gặp trong thực tế, ở hệ này dạng khử sẽ bị oxi hóa khi

phân cực về phía dương và ngược lại dạng oxi hóa sẽ bị khử khi phân tích về phía âm

so với thế cân bằng, tuy nhiên tốc độ của các quá trình này không bằng nhau, đồ thị

CV hoàn toàn không đối xứng như trong hệ thuận nghịch (Hình I.10.B)

Hệ thuận nghịch: phản ứng oxi hóa khử xảy ra tại bề mặt điện cực là thuận nghịch

Đồ thị CV xuất hiện cả hai peak oxi hóa và khử rất đối xứng, tuy nhiên hệ này rất ít gặp trong thực tế (Hình I.10.C).[32-33]