Nghiên cứu phức hợp các hạt nano-kháng thể nhằm phát hiện vi khuẩn vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes

Ứng dụng các hạt nano trong việc phát hiện các vi khuẩn có thể cải tiến độ nhạy và hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán phân tử truyền thống.. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

VŨ THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU PHỨC HỢP CÁC HẠT NANO-KHÁNG THỂ NHẰM PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC

PHẨM LISTERIA MONOCYTOGENES

Chuyên ngành: Công nghệ nano sinh học

Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ HIÊN

Hà Nội – 2012

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes 3

1.2 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes 5

1.2.1 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng phương pháp nuôi cấy 6

1.2.2 Phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes bằng các thuật miễn dịch 7

1.2.2.1 Phương pháp ELISA 8

1.2.2.2 Phương pháp Western blot 9

1.2.2.3 Phương pháp Dot blot 10

1.2.3 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng kỹ thuật lai phân tử ADN 11

1.2.3.1 Phát hiện L monocytogenes bằng phương pháp lai hóa ADN trên giá thể 11

1.2.3.2 Phát hiện L monocytogenes bằng phương pháp PCR 11

1.2.4 Phát hiện L monocytogenes bằng cảm biến sinh học 12

1.3 Hạt nano 14

1.3.1 Đặc điểm chung 14

1.3.2 Hạt nano từ 14

1.3.2 Hạt nano vàng 20

1.3.4 Chấm lượng tử 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 27

2.1.1 Vật liệu 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Các dung dịch 28

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 29

2.2 Phương pháp thí nghiệm 30

2.2.1 Phương pháp chức năng hóa bề mặt chấm lượng tử 30

2.2.1.1 Phương pháp carboxyl hóa bề mặt chấm lượng tử 31

2.2.1.2 Phương pháp amin hóa bề mặt chấm lượng tử 32

2.2.2 Phương pháp tạo phức hợp hạt từ và chấm lượng tử với protein 33

2.2.2.1 Phức hợp hạt từ Dynabead – protein 33

2.2.2.2 Phức hợp hạt từ chitosan–protein 34

2.2.2.3 Phức hợp chấm lượng tử–protein 35

2.2.3 Phương pháp phân tích kết quả tạo phức 37

2.2.3.1 Phương pháp quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR) 37

2.2.3.2 Kính hiển vi điện tử quét (SEM) 39

2.2.3.3 Kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) 40

2.2.3.4 Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide 41

2.2.4 Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L monocytogenes 45

2.2.4.1 Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L monocytogenes trong dung dịch 45

2.2.4.2 Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L monocytogenes trên màng nitrocellulose 46

2.2.5 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes trên màng nitrocellulose bằng phức hợp hạt nano–kháng thể 47

2.2.5.1 Phát hiện bằng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể 47

2.2.5.2 Phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn dòng gắn hạt vàng 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Tạo phức hợp hạt từ Dynabeads–protein 48

3.2 Tạo phức hợp hạt từ chitosan–protein 53

3.3 Tạo phức hợp chấm lượng tử–protein 58

3.3.1 Biến đổi bề mặt chấm lượng tử 58

3.3.2 Phức hợp chấm lượng tử-protein 64

3.4 Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu với vi

khuẩn L monocytogenes 68

3.4.1 Liên kết trong dung dịch 68

3.4.2 Liên kết trên màng nitrocellulose 70

3.4.3 So sánh phức hợp hạt từ Dynabeads protein và phức hợp hạt từ chitosan protein 72

3.5 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng kháng thể đơn dòng gắn chấm lượng tử hoặc gắn hạt vàng 73

KẾT LUẬN 75

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

EDC 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide

ELISA Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme

(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) FESEM Kính hiển vi điện tử quét phân giải cao

FTIR Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier

(Fourier transform infrared spectroscopy)

Kháng thể Kháng thể đơn dòng kháng L monocytogenes

L monocytogenes Listeria monocytogenes

MES 2–(N–morpholino) ethanesulfonic acid

MPA Mercaptopropionic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

QD Chấm lượng tử (Quantum dots)

QD–COOH Chấm lượng tử có nhóm carboxyl

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Hình 1.2 Khuẩn lạc L monocytogenes sau 24h nuôi cấy ở 35oC trên môi

trường BBL CHROMagar Listeria

Hình 1.3 Cấu trúc kháng thể

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng của phương pháp ELISA thông thường

Hình 1.5 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng phương pháp

Western blot

Hình 1.6 Phát hiện vi khuẩn L.monocytogenes bằng phương pháp Dot blot

Hình 1.7 Cảm biến sinh học

Hình 1.8 Hình ảnh đơn giản về vật liệu thuận từ

Hình 1.9 Hình dạng điển hình của các tiểu cầu có chứa hạt nano

Hình 1.10 Sơ đồ phân tách tế bào đơn giản nhất

Hình 1.11 Nguyên lí dẫn truyền thuốc dùng hạt nano từ tính

Hình 1.12 Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần từ trái

qua phải

Hình 1.13 Mô hình chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdS/ZnSe

Hình 1.14 Huỳnh quang của chấm lượng tử khi kích thước lõi giảm dần

Hình 1.15 Chấm lượng tử gắn các phân tử sinh học

Hình 1.16 Hình ảnh chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu của các tế bào ung

thư

Hình 1.17 Hình minh họa ứng dụng của chấm lượng tử nano composit

trong dẫn truyền thuốc

Hình 2.1 Các liên kết mang bản chất hóa học

Hình 2.2 Hệ giao thoa kế Michelson

Hinh 2.3 Sơ đồ cấu tạo kính hiển vi điện tử quét SEM

Hình 2.4 Mô hình cấu trúc của phân tử protein trước và sau khi được biến

tính bởi SDS

Hình 3.1 Hình ảnh SEM của hạt từ Dynabeads® My One Carboxylic Acid

Hình 3.2 Cơ chế gắn protein lên hạt từ Dynabeads sử dụng chất nối EDC

Hình 3.3 Phổ FTIR của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo

phức với BSA

Hình 3.4 Điện di dịch tan sau phản ứng tạo phức hợp hạt từ Dynabeads

với lượng protein BSA khác nhau 2, 4, 6: BSA trước phản ứng 3,5,7: BSA trong dịch tan sau phản ứng

Hình 3.5 Ảnh SEM của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo

phức hợp với protein BSA

Hình 3.6 Ảnh FESEM của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo

phức hợp với protein BSA

Hình 3.7 Sự hình thành của chitosan và chitosan biến tính trong nước

Hình 3.8 Mô hình hạt nano từ bọc chitosan biến tính sử dụng chất nối để

tạo phức hợp với protein

Hình 3.9 Cơ chế gắn protein lên hạt từ chitosan sử dụng chất nối BS3

Hình 3.10 Phổ FTIR của hạt từ chitosan (a) và hạt từ chitosan gắn BSA sử

dụng chất nối EDC (b)

Hình 3.11 Phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn BSA khi sử dụng chất nối

BS3(a) và khi không sử dụng chất gắn hay chất nối (b)

Hình 3.12 Ảnh FESEM của hạt từ chitosan gắn BSA với các tỉ lệ khối

lượng khác nhau Hạt từ chitosan:BSA (w/w): (b) 50:1; (c) 25:1;

(d) 25:2 (e) 25:4 (a) Hạt từ chitosan

Hình 1.13 Mô hình cấu trúc của các phân tử TOP (A), TOPO(B), HDA (C)

Hình 3.14 Phản ứng trao đổi ligand biến đổi bề mặt chấm lượng tử

Hình 3.15 Ảnh huỳnh quang của chấm lưởng tử dưới đèn UV trước (a) và

sau (b) khi biến đổi bề mặt với MPA

Hình 3.16 Ảnh huỳnh quang của chấm lưởng tử dưới đèn UV trước (a) và

sau (b) khi biến đổi bề mặt với AET

Hình 3.17 Phổ FTIR của chấm lượng tử trước khi biến đổi bề mặt

Hình 3.18 Hình ảnh phổ FTIR của chấm lượng tử đã biến đổi bề mặt với

MPA (a) và AET (b)

Hình 3.19 Sơ đồ phản ứng NHS_ester với chấm lượng tử

Hình 3.20 Sơ đồ phản ứng gắn protein lên QD–NH2 bằng BS3

Hình 3.21 Ảnh FESEM của QD–NH2 trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp

với kháng thể đơn dòng

Hình 3.22 Ảnh FESEM của QD–COOH trước (a) và sau (b) khi tạo phức

hợp với kháng thể đơn dòng

Hình 3.23 Ảnh điện di dịch nổi sau phản ứng 100µg QD–NH2 với lượng

BSA khác nhau sử dụng chất nối BS3

Hình 3.24 Kết quả điện di dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên chấm

lượng tử 1: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên QD–COOH 2: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên QD–

NH2 3: Kháng thể đơn dòng C86030M khi chưa phản ứng với chấm lượng tử (3 vạch với khối lượng phân tử 30kDa, 50 kDa và

160 kDa, tương ứng với chuỗi nhẹ, chuỗi nặng của kháng thể và

kháng thể hoàn chỉnh 4: Thang protein

Hình 3.25 Ảnh nhuộm Gram (a) Vi khuẩn L monocytogenes (b) Phức hợp

hạt từ Dynabeads–BSA (c) Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng

thể đơn dòng sau khi bắt vi khuẩn L monocytogenes trong dung

dịch (d) Đối chứng: Phức hợp hạt từ Dynabeads–BSA sau khi ủ

vi khuẩn L monocytogenes trong dung dịch

Hình 3.26 Cấu trúc hóa học của màng Nitrocellulose

Hình 3.27 Hình minh họa phương pháp li giải tế bào trên màng

nitrocellulose

Hình 3.28 Hình ảnh quan sát màng nitrocellulose bằng kính hiển vi quang

học (a) Đối chứng: Màng không có dịch li giải vi khuẩn sau khi

nhỏ và rửa hạt từ không có kháng thể Màng có dịch li giải vi

khuẩn L monocytogenes (b) và E coli (c) sau khi nhỏ và rửa

phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng kháng L

monocytogenes

Hình 3.29 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes sau khi li giải trên màng

Nitrocellulose dùng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể (a) hoặc kháng thể phức hợp hạt vàng–kháng thể (b)

Hình 3.30 Sơ đồ biểu diễn việc sử dụng một cặp phức hợp hạt nano –kháng

thể để phát hiện vi khuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 So sánh các phương pháp ELISA trong việc phát hiện vi khuẩn

L monocytogenes

Bảng 2.1 Bảng các hóa chất sử dụng trong luận văn

Bảng 2.2 Các dung dịch sử dụng trong luận văn

Bảng 2.3 Bảng các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong luận văn

Bảng 2.4 Các mẫu phân tích FTIR

Bảng 2.6 Thành phần của một gel polyacrylamide

Bảng 2.7 Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng hạt từ Dynabead với BSA

Bảng 2.8 Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng chấm lượng tử có nhóm

amin (QD–NH2) với BSA

Bảng 2.9 Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng chấm lượng tử với kháng

thể đơn dòng kháng L monocytogenes

Bảng 2.10 Các mẫu nhuộm Gram

Bảng 3.1 So sánh hạt từ Dynabeads và hạt từ chitosan

MỞ ĐẦU

Ngộ độc thực phẩm đã và đang là vấn đề được cộng đồng trên toàn thế giới quan tâm Nguyên nhân chính gây ra các ca ngộ độc thực phẩm là do các vi

khuẩn như Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes Trong đó, số

ca tử vong do vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra đứng thứ hai (chỉ sau vi khuẩn Salmonella) trong tổng số các ca tử vong do nhiễm khuẩn từ thực phẩm Listeria monocytogenes là vi khuẩn gram dương, có thể tồn tại trong điều

kiện khắc nghiệt như pH thấp, nồng độ muối cao [41] và nhiệt độ thấp (-0,1oC) [62] Do đó chúng có thể gây ra ngộ độc cho con người từ những thực phẩm đông lạnh Mặc dù hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm nhưng khi đi vào

cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội gây bệnh Một tỉ lệ lớn

dân số, ước tính khoảng 3-10%, có mang vi khuẩn Listeria monocytogenes trong

đường tiêu hóa của họ mà không thấy bất cứ dấu hiệu gì của bệnh tật [53] Tỉ lệ

tử vong do vi khuẩn này là rất cao, 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh [66, 54] Mỗi năm tại Úc có 40-44 ca tử vong [61]; từ năm 1993-1997, mỗi năm Hoa Kỳ có 100 ca tử vong [10] Ở Việt Nam cũng đã có nhiều ca

nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes bị tử vong do không được phát hiện và

điều trị kịp thời Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp phát hiện vi khuẩn này như nuôi cấy trong môi trường chọn lọc [29], PCR [33], Western blot [3], ELISA [11], nhận biết đặc trưng loài [16] … nhưng hầu hết các phương pháp này đều đòi hỏi nhiều thời gian và công sức

Hiện nay, công nghệ nano phát triển rất nhanh tạo ra những vật liệu nano tiên tiến (vật liệu có kích thước nano mét) mang lại nhiều ứng dụng to lớn trong lĩnh vực dược phẩm và y sinh Trong các loại vật liệu nano, các hạt nano như hạt nano từ, hạt nano vàng và chấm lượng tử (quantum dots) là những loại vật liệu nano được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi nhất Hạt từ với tính chất từ đặc trưng cho phép điều khiển bằng một từ trường ngoài, do đó có nhiều ứng dụng trong phân tách, chọn lọc và làm giàu tế bào [27] Đặc biệt là hạt nano từ ít gây độc cho cơ thể nên được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong dẫn truyền thuốc và trị liệu gen [37,38, 39] Hạt nano vàng gắn với các phân tử sinh học là một sản phẩm với rất nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học, trong chẩn đoán và điều trị các tế bào ung thư, đặc biệt trong công nghệ chế tạo các loại kit chẩn đoán nhanh các loại bệnh truyền nhiễm [9] Chấm lượng tử với khả năng phát huỳnh

quang và độ bền màu với ánh sáng đã vượt qua các chất màu hữu cơ và trở thành một trong số các vật liệu sáng giá của công nghệ nano Chấm lượng tử được sử dụng trong đánh dấu tế bào và các phần tử sinh học, dẫn truyền và phân phối thuốc và trong các công cụ chẩn đoán mới [68]

Với sự nguy hại của Listeria monocytogenes như đã nêu ở trên thì việc tìm

ra phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Listeria monocytogenes nói riêng và

các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nói chung là rất cần thiết Ứng dụng các hạt nano trong việc phát hiện các vi khuẩn có thể cải tiến độ nhạy và hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán phân tử truyền thống Giải pháp sử dụng các hạt nano hứa hẹn nhiều ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học và các kít chẩn

đoán Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu phức hợp các

hạt nano–kháng thể nhằm phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm

Listeria monocytogenes”

Ở Việt Nam, phức hợp hạt nano với kháng thể thường được tạo ra bằng cách sử dụng các bộ kit của nước ngoài rất đắt tiền Một số nhóm nghiên cứu tạo phức hợp hạt nano với kháng thể dựa vào lực hút tĩnh điện giữa hai phần tử mang điện tích trái dấu Tuy nhiên, phức hợp tạo thành kém bền khi pH của dung dịch đệm thay đổi Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu và xây dựng quy trình tạo các phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt từ và chấm lượng tử bằng phương pháp hóa học sử dụng các chất nối Phức hợp tạo thành bằng phương pháp này có độ bền cao Để có thể gắn các phần tử sinh học lên các hạt nano, các hạt này cần được chức năng hóa các bằng các chất hoạt động

bề mặt [40], polymer [45] hoặc các hợp chất hóa học có nhóm chức amin, carboxyl [42]

Các nội dung của luận văn là:

1 Chức năng hóa bề mặt chấm lượng tử

2 Nghiên cứu và xây dựng quy trình tạo phức hợp hạt nano với kháng thể đơn dòng bằng phương pháp hóa học sử dụng chất nối

3 Phân tích các phức hợp hạt nano–kháng thể đơn dòng tạo thành

4 Chứng minh các phức hợp hạt nano–kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu

với vi khuẩn Listeria monocytogenes

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (L monocytogenes) (Hình 1.1) là vi khuẩn gram dương thuộc chi Listeria Vi khuẩn này có hình que, không bào tử, yếm khí, kích thước khoảng 0,5µm1,5µm Vi khuẩn L monocytogenes có kháng

nguyên thân O và kháng nguyên lông H, được chia thành 7 loại huyết thanh (từ

I đến VII)

Hình 1.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Vi khuẩn L monocytogenes được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong tự nhiên

như đất, nước, thảm thực vật mục nát, trong các động vật hoang dã, các loại sản phẩm chế biến từ sữa, thịt cá tươi sống và các sản phẩm của thịt cá, rau xanh Một số loại thực phẩm như ngô, sô cô la, xà lách, tôm và gạo đã được báo cáo

có nhiễm vi khuẩn L monocytogenes [55] Vi khuẩn này có sức đề kháng cao

nên chúng tồn tại khá lâu ngoài môi trường Con đường lây lan chủ yếu là qua đường tiêu hóa, ít gặp qua đường hô hấp Ở trẻ sơ sinh, bệnh truyền qua rau thai hoặc lây lúc trẻ lọt qua đường sinh dục của người mẹ

L monocytogenes có bảy yếu tố độc lực: (1) Protein bề mặt internalin, có

hai dạng InlA và InlB đóng vai trò thậm nhập vào tế bào InlA thâm nhập vào các tế bào không thực bào như tế bào biểu mô, còn InlB thâm nhập vào các tế

bào gan [20]; (2) Protein bề mặt p104 có khả năng bám dính vào tế bào ruột [49]; (3) Listeriolysin O là một hemolysins (ngoại độc tố có khả năng ly giải tế bào hồng cầu) có vai trò gây ra bệnh listeriosis [31]; (4) Protein ActA; (5) Metalloprotease; (6) Clp proteases và ATPases; (7) Protein P60 là enzyme hydrolase xúc tác trong phản ứng trong giai đoạn cuối cùng của sự phân chia tế bào Các yếu tố độc lực này tham gia vào quá trình lây nhiễm theo những cách riêng và có thể gây ảnh hưởng tới dẫn truyền tín hiệu của tế bào chủ với mục

đích tăng cường khả năng lây nhiễm Như vậy, với tất cả các đặc điểm này L monocytogenes có thể gây ra nhiều căn bệnh nguy hiểm cho con người

Khi xâm nhập vào trong cơ thể, L monocytogenes gây bệnh bằng cách sinh sản và phát triển Nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn L monocytogenes phát triển là từ 30°C đến 37°C Khác với các vi khuẩn khác, L.monocytogenes có thể tồn tại và

phát triển ở nhiệt độ 4°C Thậm chí chúng còn có thể tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt như pH thấp, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp (-0,1oC) [41, 62]

Với những đặc điểm đó, L.monocytogenes thể gây ra ngộ độc cho con người từ

những thực phẩm đông lạnh Mặc dù hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm nhưng khi đi vào cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội

gây bệnh Một tỉ lệ lớn dân số, ước tính khoảng 3-10%, có mang vi khuẩn L monocytogenes trong đường tiêu hóa của họ mà không thấy bất cứ dấu hiệu gì

của bệnh tật [53]

Đối tượng mắc bệnh do vi khuẩn L monocytogenes gây ra thường là những

người có sức đề kháng yếu như phụ nữ mang thai, trẻ em và người già Khi xâm

nhập vào cơ thể, vi khuẩn L monocytogenes thường không phát bệnh ngay mà ủ

bệnh sau một thời gian khá lâu, trung bình khoảng 3 tuần, thậm chí đến 2 tháng Các triệu chứng của bệnh ban đầu giống như cúm (sốt, khó chịu, đau cơ…) [66] Nếu độc tố đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính sau khi ăn thực phẩm bị ô nhiễm khoảng 24 - 72 giờ, với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau quặn bụng, nhức đầu

Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực phẩm, mà chúng còn gây ra những biến chứng nguy hiểm như viêm màng não, nhiễm trùng huyết, sẩy thai tự nhiên hoặc bệnh listeriosis ở trẻ sơ sinh [66] Bệnh listeriosis có nguy cơ gây tử vong cao hơn so với các bệnh do các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm khác gây ra Tỉ lệ tử vong do vi khuẩn này là rất cao, 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh [55, 66]

Vi khuẩn L monocytogenes đã gây ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm tại

nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ… Các vụ ngộ độc này thường dẫn tới tình trạng tử vong Theo thống kê từ năm 2002 tại Mỹ, hàng năm

tại nước này, số bệnh nhân nhiễm bệnh do vi khuẩn L monocytogenes khoảng

2500 người, với gần 500 người chết Tại Anh từ năm 2001-2005 có 1993 người mắc, với trên 300 ca tử vong Ở Canada, hàng năm vẫn thường xảy ra các vụ

ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn L monocytogenes gây ra Gần đây, tại Trung

Quốc cũng đã báo cáo vài vụ ngộ độc do vi khuẩn này Ngoài ra, còn các trường hợp [61]; từ năm 1993-1997, mỗi năm Hoa Kỳ có 100 ca tử vong [10]

Nhằm hạn chế tình trạng nhiễm khuẩn L monocytogenes, cơ quan y tế các

nước châu Âu, châu Mỹ, nước Úc, Nhật Bản thường xuyên đưa ra những lời cảnh báo, đồng thời đưa ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt các nguồn nguyên liệu thực phẩm Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, vi khuẩn

L monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học

có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm

Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7000-10000 nạn nhân, trong đó có 100-200 ca tử vong, gây thiệt hại cho Nhà nước hàng tỉ đồng Tuy nhiên, với điều kiện phát triển nhanh các loại thức ăn công nghiệp cũng như việc kinh doanh tràn lan nhiều loại thực phẩm không rõ nguồn gốc như hiện nay, thì thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn này không phải là ngoại lệ Mặt khác, công tác điều tra dịch tễ và sàng lọc tác nhân gây bệnh chưa được đúng mức (phần lớn các tỉnh, thành chưa có đủ điều kiện xét nghiệm loại vi khuẩn này), vì vậy biện pháp tuyên truyền để phòng ngừa vẫn là

cách tốt nhất Gần đây, Việt Nam cũng đã có nhiều ca nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes bị tử vong do không được phát hiện và điều trị kịp thời Vì vậy, việc tìm ra phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Listeria monocytogenes nói

riêng và các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nói chung là rất cần thiết

1.2 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes

Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi

khuẩn L monocytogenes như phương pháp nuôi cấy [22], phương pháp miễn

dịch [51, 58], phương pháp phân tử [63] cảm biến sinh học [32]… Sau đây,

chúng tôi trình bày một số phương pháp điển hình trên

1.2.1 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy là phương pháp truyền thống để phát hiện vi khuẩn

L monocytogenes Phương pháp này thường rất nhạy và luôn là “tiêu chuẩn

vàng” cho các phương pháp khác Phương pháp nuôi cấy dựa trên việc làm giàu chọn lọc (selective enrichment) và đĩa cấy chọn lọc (selective plating) để phân lập các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng thuần khiết, từ đó khảo sát và định loại vi khuẩn Việc xác định vi khuẩn dựa vào các đặc trưng của vi khuẩn như hình thái khuẩn lạc, lên men đường và thuộc tính tán huyết [22] Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được vô trùng trước khi sử dụng Đối với hầu hết các vi khuẩn thì điều kiện nhiệt độ để vi khuẩn sinh trưởng và phát triền tốt là 37oC

trong 16 giờ, nhưng đối với vi khuẩn L.monocytogenes lại có sự khác biệt,

chúng có thể phát triển ngay khi nhiệt độ xuống tới 4oC và thường được nuôi ở

30oC đến 35oC trong 24 giờ đến 48 giờ

Hai phương pháp nuôi cấy được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vi khuẩn

L monocytogenes trong các mẫu thực phẩm là FDA BAM (Food and Drug

Administration Bacteriological and Analytical Method – Phương pháp phân tích

vi sinh của Cục quản lý thuốc và thực phẩm) và ISO 11290 (International Organization of Standards–các tiêu chuẩn của tổ chức quốc tế) [22] Cả hai phương pháp này đều yêu cầu ủ 25g mẫu thực phẩm trong dung dịch chọn lọc (selective broth) để làm chậm sự phát triển của các sinh vật cạnh tranh, trước khi cấy lên môi trường thạch và sinh hóa chọn lọc (thạch Oxford, PALCAM, MOX hoặc LPM) Đối với FDA BAM, mẫu được ủ trong 48h ở 30oC trong môi trường tăng sinh chọn lọc như acriflavin, naladixic acid Đối với phương pháp ISO

11290, quá trình làm giàu vi khuẩn L monocytogenes trải qua hai giai đoạn: (1)

các mẫu thực phẩm được làm giàu trong 24h trong môi trường Fraser; (2) mẫu thực phẩm được ủ trong môi trường Fraser pha loãng 2 lần trong 24 giờ, sau đó mẫu được chia ra làm nhiều phần, mỗi phần lại được ủ tiếp trong môi trường Fraser không pha loãng để làm giàu vi khuẩn Dung dịch Fraser chứa các tác nhân tăng sinh chọn lọc acriflavin và naladixic acid

Năm 2002, các nhà khoa học Anh đã nuôi cấy phân lập vi khuẩn

L.monocytogenes từ mẫu phân sau khi các mẫu được giữ ở 4oC với các thời gian khác nhau [15] Kết quả báo cáo này cho thấy kỹ thuật nuôi cấy sau khi mẫu được ủ lạnh (4oC) cho kết quả tốt hơn khi mẫu không được ủ lạnh Báo cáo cũng đưa ra kết quả là sau khi mẫu vi khuẩn được làm giàu lạnh ở tuần thứ 3 đến tuần thứ 7 cho kết quả phân lập tốt nhất Năm 2005, Odumeru cùng cộng sự đã công

bố là sau 24h được cấy và ủ ở 35oC trong môi trường BBL HROMagar

Listeria, vi khuẩn L monocytogenes phát triển thành những khuẩn lạc tròn riêng

biệt và có màu xanh lơ (Hình 1.2) [48]

Hình 1.2 Khuẩn lạc L monocytogenes sau 24h nuôi cấy ở 35oC

trên môi trường BBL CHROMagar Listeria

Phương pháp nuôi cấy vi sinh mất khá nhiều thời gian (khoảng 5 ngày) [29] và cần các môi trường tăng sinh và phân lập chọn lọc cho từng loại vi khuẩn nên không phù hợp với nhu cầu phát hiện nhanh vi khuẩn trong các mẫu thực phẩm hoặc chẩn đoán nhanh nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm cho người bệnh để có phương pháp điều trị kịp thời Các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật miễn dịch và kỹ thuật lai hóa ADN cho kết quả nhanh hơn và tiện lợi hơn

1.2.2 Phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes bằng các thuật miễn dịch

Các kỹ thuật miễn dịch (ELISA, Western blot, Dot blot) dựa trên nguyên lí tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

Ái lực của kháng thể đối với kháng nguyên là hợp lực của các lực liên kết yếu như liên kết hydro, liên kết kị nước, lực Van Der Waals, các liên kết tĩnh điện… Các lực liên kết yếu này chỉ có tác dụng trong một bán kính nhỏ, do đó

sự đặc hiệu trong cấu trúc không gian ba chiều của hai vùng phân tử có vai trò quyết định đối với ái lực của kháng thể đối với kháng nguyên

1.2.2.1 Phương pháp ELISA

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay còn gọi

là kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme là phương pháp dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện (Hình 1.4)

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng của phương pháp ELISA thông thường

ELISA là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để phát hiện các tác nhân gây bệnh ELISA được chia làm ba loại là ELISA trực tiếp (Direct ELISAs), ELISA kiểu sandwich (Sandwich ELISAs) và ELISA cạnh tranh (Competitive ELISAs) Cả ba loại ELISA này đều đã được sử dụng để phát hiện

vi khuẩn L monocytogenes nhưng mỗi loại lại có ưu nhược điểm và ngưỡng

phát hiện khác nhau (Bảng 1.1) [12]

Phương pháp ELISA có thể tăng độ nhạy hơn nữa bằng cách đánh dấu huỳnh quang cho các kháng thể gọi là kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme có đánh dấu huỳnh quang (ELFA - enzyme-linked fluorescent assay ) Sewell cùng cộng

sự (2003) đã sử dụng phương pháp này để phát hiện vi khuẩn L monocytogenes

bằng một thiết bị thương mại VIDAS có chứa kháng thể đơn dòng cộng hợp huỳnh quang và đã phát hiện được ở nồng độ 104 – 105 cfu/ml [58] Hai nhóm độc lập Gangar [21] và Silbernagel [59] cùng cộng sự của họ cũng đưa ra kết quả tương tự nhóm Sewell

Bảng 1.1 So sánh các phương pháp ELISA trong việc phát hiện vi khuẩn

Yêu cầu mẫu có số lượng lớn Mức độ nền có thể cao

Phải có kháng thể thứ cấp Mất nhiều thời gian hơn ELISA trực tiếp

1cfu/25g sau khi được làm giàu [14]

ELISA

cạnh tranh

Ít dương tính giả

Phải có kháng nguyên thuần, tinh sạch

104-105 cfu/ml [58]

1.2.2.2 Phương pháp Western blot

Western blot là phương pháp phổ biến trong chẩn đoán phân tử dùng để phát hiện và định lượng các loại kháng nguyên Kháng nguyên ban đầu được điện di biến tính bằng phương pháp điện di SDS–PAGE, sau đó chuyển kháng nguyên từ gel lên màng Nitrocellulose hoặc PVDF, block màng bằng protein để tránh các liên kết không đặc hiệu của kháng thể lên màng Cuối cùng các kháng nguyên sẽ được phát hiện bởi các kháng thể đặc hiệu đã được đánh dấu bằng các chất phát quang [51]

Siragusa cùng cộng sự đã sử dụng phương pháp Western blot chứng minh

độ đặc hiệu của kháng thể đơn dòng trong việc phát hiện vi khuẩn L

monocytogenes (Hình 1.5) [60] Nhóm nghiên cứu Vũ Xuân Nghĩa cùng cộng

sự đã sử dụng phương pháp Western blot để phát hiện vi khuẩn L monocytogenes Kết quả nghiên cứu cho thấy, đã phát hiện được L monocytogenes ở nồng độ 105 cfu/ml [3]

Hình 1.5 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng

phương pháp Western blot [60]

1.2.2.3 Phương pháp Dot blot

Dot blot cũng là phương pháp hay được dùng trong chẩn đoán kháng nguyên

vì đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và khá chính xác Cơ chế của Dot blot khá giống với Western blot, nhưng có điểm khác đó là Dot blot không cần điện di protein và chuyển sang màng mà ta sử dụng kháng nguyên tinh sạch Màng được phủ bằng protein, cuối cùng ngâm màng trong dung dịch có chứa kháng thể đặc hiệu đã được đánh dấu Sau đó rửa màng Nếu có mặt kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì chấm nhỏ kháng nguyên sẽ có kháng thể bám vào và có thể phát hiện vì kháng thể đã được đánh dấu Năm 1990, Siragusa cùng

cộng sự đã chứng minh sự đặc hiệu của kháng thể đơn dòng với vi khuẩn L monocytogenes bằng phương pháp Dot blot Bằng phương pháp này, Siragusa đã phát hiện được L monocytogen ở nồng độ 106 cfu/ml (Hình 1.6) [60]

Hình 1.6 Phát hiện vi khuẩn L.monocytogenes bằng phương pháp Dot blot

Trong ba phương pháp, mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng Western blot là phương pháp cho độ chính xác nhất do các protein được điện di

phân tách nhau ra Độ nhạy của phương pháp này là 105 cfu/ml Nhược điểm của phương pháp Western blot là phức tạp, nhiều bước, nhiều dụng cụ máy móc và lâu cho kết quả ELISA là phương pháp cho độ nhạy cao (103 cfu/ml) Tuy vậy, phương pháp ELISA cũng khá phức tạp và nhiều bước Còn phương pháp Dot blot tuy độ chính xác và độ nhạy có phần kém hơn hai phương pháp trên nhưng kết quả vẫn khá tốt (độ nhạy 106 cfu/ml) Bù lại, phương pháp Dot blot lại đơn giản, dễ thực hiện, cần ít dụng cụ, máy móc và cho kết quả nhanh

1.2.3 Phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng kỹ thuật lai phân tử ADN 1.2.3.1 Phát hiện L monocytogenes bằng phương pháp lai hóa ADN trên

giá thể

Sự hiện diện của ADN đích được phát hiện bằng cách sử dụng một đầu dò oligonucleotide (đoạn ADN ngắn) có trình tự bổ sung với trình tự ADN đích Đầu dò oligonucleotide được đánh dấu để dễ dàng phát hiện Trước đây các mẫu

dò thường được đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ Năm 1993, Datta cùng

cộng sự đã phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng cách sử dụng các mẫu dò

ADN được đánh dấu bởi P32 và HRP ( Horseradish Perosidase – là một enzyme được tìm thấy trong cải horseradish, khi bị oxy hóa sẽ sinh ra các thay đổi về tính chất mà có thể được phát hiện bởi các phương pháp đo quang phổ) [13] Gần đây, việc sử dụng các mẫu dò có gắn biotin, mẫu dò được đánh dấu huỳnh cho phép phát hiện các trình tự đích với độ nhạy cao tương đương với đầu dò phóng xạ mà không gây nguy hiểm

1.2.3.2 Phát hiện L monocytogenes bằng phương pháp PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ ADN polymerase do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985

Thực chất đây là một phương pháp tổng hợp ADN in vitro, không cần sự hiện

diện của tế bào

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp PCR là sử dụng một enzyme chịu nhiệt để khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo quy luật hàm số mũ Tất cả các ADN polymerase khi tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần

có mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới [2]

Phương pháp PCR là một phương pháp khuếch đại ADN nhanh và đặc hiệu được ứng dụng rất nhiều trong việc phát hiện các vi khuẩn và virus Phương

pháp PCR đã được sử dụng để phát hiện vi khuẩn L monocytogenes trong thực

phẩm [33] Phương pháp PCR có độ nhạy cao so với phương pháp miễn dịch nhưng bước chuẩn bị mẫu lại phức tạp Phương pháp PCR có nhiều loại khác nhau, trong đó Real-time PCR là loại được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vi

khuẩn gây bệnh trong thực phẩm L monocytogenes [28, 46, 52] Một bộ kít

thương mại dựa trên phương pháp PCR có tên gọi là Probelia® (Bio-Rad) được

so sánh với phương pháp tiêu chuẩn ISO 11.290-1 để phát hiện vi khuẩn L monocytogenes trong các mẫu cá hồi bởi Wan và cộng sự [63] Kết quả chỉ ra

rằng phương pháp Probelia® PCR cho hiệu quả tốt như phương pháp ISO

11.290-1 Tuy nhiên, sử dụng các phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn L monocytogenes trực tiếp từ các mẫu thực phẩm gặp khó khăn khi lượng vi sinh

vật trong mẫu quá thấp Ví dụ như trong mẫu thực phẩm ăn nhanh có nhiễm vi

khuẩn L monocytogenes, Gombas và cộng sự (2003) đã phát hiện ra rằng 70%

số mẫu có nồng độ thấp hơn 0,3 tế bào/g [23] Vì vậy để phát hiện được vi khuẩn thì việc làm giàu là rất cần thiết [47] Ngoài phương pháp nuôi cấy để làm giàu vi khuẩn, gần đây người ta hay sử dụng các hạt nano (đặc biệt là hạt từ) cho mục đích này [7]

1.2.4 Phát hiện L monocytogenes bằng cảm biến sinh học

Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì:

“Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi” Nguyên lí chung của cảm biến sinh học là chuyển đổi các phản ứng hay tương tác sinh học thành các tín hiệu điện Khi mẫu cần phân tích (phần tử sinh học đích) tiếp xúc với bộ cảm biến, tương tác sinh học sẽ chuyển đổi thành các tín hiệu có thể phân tích được như tín hiệu điện, nhiệt, quang…

Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính: (1) Đầu thu sinh học: có tác dụng tương tác với tác nhân sinh học cần phân tích; (2) Tác nhân cố định: giúp gắn các đầu thu lên trên giá đỡ; (3) Bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học thành các tín hiệu có thể đo đạc được; (4) Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra (bộ phận này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị khác có thể xử lý)

Gần đây, cảm biến sinh học là thiết bị mà các nhà khoa học rất quan tâm nghiên cứu, ứng dụng cho nhiều lĩnh vực và đối tượng Một trong những ứng dụng quan trọng của cảm biến sinh học là phát hiện các vi khuẩn gây bệnh Leonard cùng cộng sự đã sử dụng cảm biến sinh học BIAcore 3000 kháng thể đa

dòng đã phát hiện được vi khuẩn L monocytogenes Tế bào vi khuẩn L monocytogenes được ủ với kháng thể đa dòng trong khoảng thời gian ít hơn 30

phút [32] Tuy nhiên, các cảm biến sinh học chỉ cho phép phát hiện được một đối tượng trong một thời điểm

Hình 1.7 Cảm biến sinh học

Hiện nay, công nghệ nano đã và đang phát triển rất mạnh với hàng loạt các ứng dụng của vật liệu nano trong y – sinh học, đặc biệt là các hạt nano Năm

2007, Wang cùng cộng sự đã sử dụng hạt nano từ và chấm lượng tử trong cảm

biến quang để phát hiện vi khuẩn L monocytogenes Hạt nano từ và chấm lượng

tử được bọc strepravidin trên bề mặt liên kết với kháng thể được đánh dấu biotin Hạt từ gắn kháng thể được sử dụng để chọn lọc tế bào đích, sau đó dùng chấm lượng tử gắn kháng thể để phát hiện bằng phép đo huỳnh quang Bằng

phương pháp này Wang đã phát hiện được L monocytogenes ở nồng độ 3

cfu/ml, thời gian phát hiện là 1,5 giờ [64] Năm 2012, Wei Sun cùng cộng sự đã

sử dụng các hạt nano vàng trong cảm biến DNA điện hóa để phát hiện vi khuẩn

L monocytogenes tại nồng độ ADN là 2,9x10-13 mol/l

Sử dụng các hạt nano vào trong các phương pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn đang là một hướng rất mới, làm tăng độ nhạy, độ chính xác của phương pháp đem lại hiệu quả cao Chính vì vậy, trong đề tài luận văn này chúng tôi tập trung nghiên cứu sử dụng phức hạt nano–kháng thể đơn dòng để phát hiện vi

khuẩn L monocytogenese dựa trên kỹ thuật miễn dịch

1.3 Hạt nano

1.3.1 Đặc điểm chung

Hạt nano là vật liệu nano không chiều, tức là cả ba chiều đều có kích thước nano mét, không còn chiều tự do nào cho điện tử, ví dụ như hạt nano từ, hạt nano vàng, chấm lượng tử… Các hạt nano có kích thước khoảng 1-100 nm

Ở kích thước này chúng làm nên rất nhiều tính chất kỳ diệu mà các loại vật liệu khối không có

Hạt nano có hai đặc trưng quan trọng, đó là hiệu ứng kích thước và hiệu ứng bề mặt Khi kích thước của vật liệu giảm xuống, tỉ số giữa nguyên tử bề mặt trên tổng số nguyên tử tăng lên Giả sử vật liệu nano hình cầu, gọi ns là số nguyên tử bề mặt, n là tổng số nguyên tử thì mối liên hệ giữa hai số này là ns = 4n2/3 suy ra tỉ số giữa số nguyên tử bề mặt với tổng số nguyên tử sẽ là f = ns/n = 4/n1/3 = 4r0/r, trong đó r0 là bán kính nguyên tử, r là bán kính hạt nano Như vậy khi kích thước giảm (r giảm) thì tỉ số này tăng lên, và khi kích thước giảm xuống cỡ nano mét thì tỉ số này tăng lên đáng kể Không phải chỉ có vật liệu nano mới có hiệu ứng bề mặt mà vật liệu khối cũng có hiệu ứng đó, nhưng rất nhỏ lên thường bỏ qua Còn ở vật liệu nano hiệu ứng này khá rõ nét và có ảnh hưởng lớn đến tính chất của vật liệu Hiệu ứng bề mặt có tính liên tục, không có

sự “nhảy bậc” về tính chất khi vật liệu thu nhỏ dần kích thước Nguyên tử bề mặt có nhiều tính chất khác biệt so với các nguyên tử bên trong lòng vật liệu, chúng có vai trò quan trọng trong các quá trình hóa học, vật lý [1] Khác với hiệu ứng bề mặt, hiệu ứng kích thước lại có sự khác biệt rõ rệt khi vật liệu chuyển từ kích thước khối đến kích thước nano Nó là yếu tố làm nên nhiều sự

kì lạ của vật liệu nano Khi kích thước vật liệu tiến đến cỡ nano mét thì nhiều tính chất của vật liệu thay đổi hẳn, mà không có sự chuyển tiếp một cách liên tục như tính chất bề mặt ở trên

1.3.2 Hạt nano từ

Hạt nano từ là vật liệu từ ở kích thước nano mét.Vật liệu từ là loại vật liệu

mà dưới tác dụng của từ trường ngoài có thể bị từ hóa, tức là có những tính chất

từ đặc biệt Bất cứ vật liệu từ nào đều có sự hưởng ứng với từ trường ngoài (H), thể hiện bằng độ từ hóa (từ độ - M) Tỷ số c = M/H được gọi là độ cảm từ Tùy thuộc vào giá trị độ cảm từ có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau Vật liệu có c < 0 (~ -10-6) được gọi là vật liệu nghịch từ Vật liệu nghịch từ là vật

liệu không có momen từ nguyên tử (tức là momen từ sinh ra do các điện tử bù trừ lẫn nhau), vì thế khi đặt một từ trường ngoài vào, nó sẽ tạo ra các momen từ ngược với từ trường ngoài [4] Vật liệu có c > 0 (~ 10-6) được gọi là vật liệu

thuận từ Vật liệu thuận từ là vật liệu có momen từ nguyên tử, nhưng momen từ

này cũng rất nhỏ, có thể xem một cách đơn giản, các nguyên tử của vật liệu từ như các nam châm nhỏ (Hình 1.8), nhưng không liên kết được với nhau (do khoảng cách giữa chúng xa và momen từ yếu) Khi đặt từ trường ngoài vào vật liệu thuận từ, các “nam châm” (momen từ nguyên tử) sẽ có xu hướng bị quay theo từ trường, vì thế momen từ của chất thuận từ là dương, tuy nhiên do mỗi

“nam châm” này có momen từ rất bé nên momen từ của chất thuận từ cũng rất nhỏ Hơn nữa do các nam châm này không hề có tương tác với nhau nên chúng không giữ được từ tính, mà ngay lập tức bị mất đi khi ngắt từ trường ngoài [4]

Vật liệu có c > 0 với giá trị rất lớn có thể là vật liệu ferri từ Chất sắt từ

được biết đến là chất có từ tính mạnh, tức là khả năng cảm ứng dưới từ trường ngoài mạnh (ví dụ: Fe, Co, Ni, Gd…) Vật liệu sắt từ là vật liệu có momen từ nguyên tử Nhưng nó khác biệt so với chất thuận từ ở chỗ các momen từ này lớn hơn và có khả năng tương tác với nhau (tương tác trao đổi sắt từ) làm cho độ từ hóa tồn tại ngay cả khi không có từ trường) [4]

Hình 1.8 Hình ảnh đơn giản về vật liệu thuận từ

Nếu kích thước của hạt giảm đến một giá trị nào đó (thông thường từ vài cho đến vài chục nano mét), phụ thuộc vào từng vật liệu cụ thể, tính sắt từ và ferri từ biến mất, chuyển động nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật liệu trở thành

vật liệu siêu thuận từ Đối với vật liệu siêu thuận từ, khi ngưng tác động của từ

trường ngoài, vật liệu sẽ không còn từ tính nữa Đây là một đặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho các ứng dụng y sinh học

Hạt từ dùng trong y sinh học cần thỏa mãn bốn điều kiện sau:

(1) Hạt nano phải có tính chất siêu thuận từ để đảo từ nhanh

(2) Tính đồng nhất của các hạt cao, từ độ bão hòa lớn và vật liệu có tính tương hợp sinh học (không có độc tính) [26]

(3) Đối với các ứng dụng in-vivo, các hạt sắt từ cần phải được bọc với

một chất polyme tương thích sinh học (trong hoặc sau khi chế tạo) để chống sự tái kết hợp, chống sự thay đổi cấu trúc ban đầu và sự thoái hóa khi đưa vào hệ sinh học

Hạt từ thường được bao bọc trong một vỏ hoặc nền phi từ tính có kích thước vài trăm nano mét (còn gọi là các tiểu cầu chứa hạt nano) để tránh kết tụ khi không có mặt của từ trường ngoài Việc bao bọc như thế tạo ra một bề mặt

có tính tương hợp sinh học và dễ dàng chức năng hóa Việc chế tạo các tiểu cầu bên trong có kích thước micro hoặc nano là một quá trình trong đó các hợp chất của sắt được bọc bên trong các lớp vỏ polymer Lớp vỏ này có tác dụng được bảo vệ và cách ly vật liệu làm lõi với môi trường, ngăn chặn sự kết tụ giữa các hạt, đồng thời giúp bề mặt hạt có khả năng tương thích với các phần tử sinh học

Các tiểu cầu có thể có cấu trúc đa dạng và gồm có các phần chính là lõi và

vỏ Hình dạng và các tính chất của lõi và vỏ, theo lý thuyết cho thấy có thể được điều chỉnh bằng cách khống chế các thành phần và các thông số chế tạo Dưới đây là một số dạng tiểu cầu tiêu biểu theo lý thuyết (Hình 1.9) Việc tạo ra các tiều cầu có các tính chất như mong muốn và mang lại những lợi ích có tính ứng dụng trong khoa học sự sống, công nghệ sinh học, y học, dược học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, sản suất giấy…

Hình 1.9 Hình dạng điển hình của các tiểu cầu có chứa hạt nano

Hạt nano từ được ứng dụng rất phổ biến trong y sinh như phân tách và chọn lọc các phần tử sinh học (tế bào, DNA…), dẫn chuyển thuốc, cảm biến sinh học…

Phân tách và chọn lọc

Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại phần tử sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ phân tích hoặc cho các mục đích khác Phân tách và chọn lọc phần tử sinh học sử dụng các hạt từ là một trong những phương pháp thường được sử dụng Tùy vào đối tượng cần nghiên cứu mà yêu cầu về kích thước và lớp vỏ bọc của hạt từ cũng khác nhau

Quá trình phân tách dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa các phần tử sinh học (tương tác kháng nguyên–kháng thể, lai hóa DNA theo nguyên tắc bổ sung) Hạt từ đã chức năng hóa về mặt được liên kết với các phần tử sinh học như kháng thể, đoạn DNA sợi đơn tạo thành một phức hợp hạt từ -phần tử sinh học Phức hợp này sẽ liên kết đặc hiệu với phần tử sinh học đích Sau đó, dùng từ trường ngoài (nam châm) tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các phần tử sinh học đích, các phần tử sinh học còn lại không liên kết với hạt từ sẽ bị loại ra khỏi dung dịch (Hình 1.10)

Hình 1.10 Sơ đồ phân tách tế bào đơn giản nhất

Tách tế bào bằng từ trường đã được ứng dụng thành công trong y sinh học Đây là một trong những phương pháp rất nhạy để có thể tế bào ung thư từ máu, đặc biệt là khi nồng độ tế bào ung thư rất thấp, khó có thể tìm thấy bằng các phương pháp khác [34] Người ta có thể phát hiện kí sinh trùng sốt rét trong máu bằng cách đo từ tính của kí sinh trùng đánh dấu từ [50] hoặc đánh dấu các tế bào hồng cầu bằng chất lỏng từ tính [56] Ngoài ra, trong phản ứng PCR trong sinh học nhằm khuếch đại DNA nào đó, quá trình làm giàu DNA ban đầu cũng được thực hiện nhờ hạt nanô từ tính [27] Với nguyên tắc tương tự như phân tách tế bào, hạt nanô từ tính được dùng để phân tách DNA Amagliani G cùng cộng sự

đã sử dụng hạt từ để phân tách DNA của vi khuẩn L monocytogenes trong sữa,

sau đó khuếch đại bằng phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn này [7]

Dẫn truyền thuốc

Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu, đó là tính không đặc hiệu Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh sẽ phân bố không tập trung nên các tế bào khỏe bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc Chính vì thế việc dùng các hạt nano từ làm hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ những năm 1970 [43, 57], những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt

từ tính Có hai lợi ích cơ bản khi sử dụng phương pháp này là: (1) thu hẹp phạm

vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; (2) giảm lượng thuốc điều trị

Hạt nano từ có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị Lúc này hạt nano có tác dụng như một hạt mang Thông thường hệ thuốc/hạt đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn Khi các hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào một vị trí nào đó trên cơ thể Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ [5] Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào Gradient từ trường có tác dụng tập trung hệ thuốc/hạt

Hình 1.11 Nguyên lí dẫn truyền thuốc dùng hạt nano từ tính

Người ta đã thành công trong việc hướng thuốc doxorubicin đến tế bào u bướu ở đuôi chuột [65] Kết quả là kích thước của bướu giảm đi hoàn toàn nếu

sử dụng hạt nanô từ tính dẫn thuốc Trong khi các thí nghiệm dựa trên thuốc không được dẫn bằng hạt nanô từ tính có nồng độ cao hơn 10 lần vẫn không triệt tiêu được bướu Phương pháp này được mở rộng sang một số loài động vật khác

và thu được kết quả tương tự [24, 25]

Hạt nanô từ còn được ứng dụng trong trị liệu gen Một gen trị liệu được gắn với hạt nanô từ tính Hạt nanô từ tính được giữ ở một vị trí nào đó dưới tác dụng của từ trường ngoài Khi siêu vi tiếp xúc với mô thì làm gia tăng khả năng truyền gen và biểu hiện gen [39]

Cảm biến sinh học sử dụng hạt từ

Cảm biến sinh học có sử dụng hạt từ còn được gọi là cảm biến từ tính

Loại cảm biến này có rất nhiều ứng dụng khác nhau, như phát hiện vi khuẩn E coli [19], Salmonella [67], Staphylococcus aureus… hoặc là thiết bị chẩn đoán

trong y học Và ưu điểm của cảm biến từ tính là cho kết quả nhanh, nhạy và chính xác Vì thế mà hiện nay, cảm biến từ tính được nghiên cứu và ứng dụng rất phổ biến

Hạt nano vàng (AuNPs) là các hạt vàng kích thước nano mét tồn tại ở dạng dung dịch huyền phù có độ bền cao, các cụm nguyên tử vàng với các kích thước nằm trong khoảng 1 - 100 nm Ở kích thước nano, ngoài hai hiệu ứng chung của các hạt nano (hiệu ứng kích thước và hiệu ứng bề mặt), hạt nano vàng còn có thêm một hiệu ứng rất đặc biệt đó là hiệu ứng plasmon bề mặt Khi sóng điện từ tác dụng lên hạt nano vàng, tùy vào kích cỡ của hạt, sóng điện từ sẽ có tác dụng sóng tuân theo hiệu ứng cộng hưởng plasmon của các điện tử tự do bề mặt hoặc sóng điện từ sẽ có tác dụng hạt khi kích cỡ của hạt nano vàng nhỏ hơn 2nm và

sự phát huỳnh quang sẽ tuân theo quy luật lượng tử Khi kim loại vàng ở dạng hạt nano, hạt không còn màu vàng hay bạc "cố hữu" ở trạng thái khối mà phát ra nhiều màu sắc khác nhau tùy vào kích cỡ và hình dạng (Hình 1.12)

Theo thuyết Plasmon, khi trường điện từ của ánh sáng tới đập vào cụm các nguyên tử vàng, các electron tự do bề mặt tồn tại trong vùng dẫn của AuNPs dao động qua lại, do đó tạo nên vùng cộng hưởng plasmon, tại đó có đỉnh hấp thụ trong vùng khả kiến 530 - 540 nm [30] Vùng plasmon bề mặt được sử dụng như một chất chỉ thị cho việc hình thành nên các hạt nano vàng từ muối của chúng

Độ nhạy của hấp thụ plasmon bề mặt được là cơ sở cho cơ chế phát hiện liên quan đến các thiết bị cảm biến sử dụng AuNPs [44]

Hình 1.12 Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích

thước tăng dần từ trái qua phải Các tính chất vật lý của AuNPs phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, khoảng cách giữa các hạt (mật độ) và bản chất của hoạt động bề mặt được sử dụng để ngăn cản việc kết đám giữa các hạt [6] Theo lý thuyết Mie, hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt bị biến mất khi kích thước hạt nhỏ hơn 2 nm và lớn hơn 500 nm [18] Các thanh nano vàng (nanorod) có hai dạng cộng hưởng plasmon, một dải là cộng hưởng theo chiều dọc của thanh ở 550 - 600 nm và một dải còn lại theo chiều vuông góc với thanh ở 520 nm [35] Dải bước sóng theo chiều dọc của thanh rất nhạy cảm và sự thay đổi hệ số tỉ lệ của thanh sẽ thay đổi vùng hấp thụ từ vùng nhìn thấy tới vùng hồng ngoại gần (near - infra red - NIR) [36] Thuộc tính quang học duy nhất này của các thanh nano vàng được sử dụng trong chữa trị bằng tia hồng ngoại gần và tán xạ Raman được kích thích của các phân tử sinh học được hấp thụ Do đó, bằng việc thay đổi kích thước và hình dạng của AuNPs, cộng hưởng plasmon có thể phù hợp và đáp ứng với các ứng dụng trong hiện ảnh tế bào, phân phát thuốc và chữa trị

Hạt nano vàng có sáu điện tử tồn tại trong vùng dẫn Đặc điểm này khiến chúng trở nên dễ dàng liên kết được với các nhóm thiol và amine Do đó, AuNPs được gắn bằng các loại protein dẫn đến các ứng dụng sinh học quan trọng bao gồm phân phát thuốc hướng đích, hiện ảnh tế bào, và cảm biến sinh học Hơn nữa, các điện tử tự do khiến cho nghiên cứu về hình ảnh được dựa trên các so sánh về độ tương phản việc thay đổi mật độ điện tử trong các mô khác nhau Với

mật độ điện tử cao, AuPNs đóng vai trò như một tác nhân làm tăng độ tương phản một cách tuyệt vời trong việc phát hiện các khối u, vùng đích trong cơ thể

Đánh dấu sinh học

Thuộc tính nổi bật và tiêu biểu nhất của AuNPs được khai thác đó là tạo ra

độ tương phản và làm mạnh tín hiệu màu Ví dụ trong kính hiển vi điện tử truyền qua, đặc tính hấp thụ mạnh điện tử của hạt nano vàng khiến chúng trở nên vật liệu phổ biến và thích hợp nhất cho việc nhuộm để tăng cường tính tương phản của các vật liệu hấp thụ kém điện tử Kích thước nhỏ của chúng và khả năng chức năng hóa của hạt , có thể ứng dụng trong việc gắn với các kháng thể (immunostaining), nghĩa là chúng có thể cung cấp độ phân dải rất cao và đặc biệt trong rất nhiều ứng dụng đánh dấu sinh học khác Tương tự như thế, đặc tính quang học–khả năng hấp thụ mạnh, tán xạ và đặc biệt là cộng hưởng Plasmon bề mặt giúp chúng trở nên công cụ hữu ích trong các kĩ thuật ứng dụng hiệu ứng quang học bao gồm các sơ đồ kết hợp gồm hiện ảnh nhiệt –quang (photo–thermal), hay quang- thanh (photo–acoustic imaging) Hơn nữa, các hạt nano vàng có thể được đánh dấu phóng xạ bới các kích thích neutron, cho phép việc phát hiện ở mức độ cực nhạy và được sử dụng như một tác nhân làm tăng

độ tương phản của tia X

Phân phát thuốc và chuyển gen

Các hạt nano vàng có thể đóng vai trò như thụ thể mang cho các ứng dụng phân phát thuốc và chuyển gen Các phân tử hoạt hóa sinh học được hấp thụ lên

bề mặt của hạt nano vàng có thể được dẫn đường vào các tế bào và được giải phóng Vận chuyển DNA, là một nguyên tắc cơ bản của liệu pháp gen Khả năng hấp thụ mạnh ánh sáng của hạt nano vàng cho phép chúng trở nên phù hợp với các đối tượng môi trường kích thích nhiệt; năng lượng hấp thụ ánh sáng được tiêu tan vào các hạt xung quanh, làm tăng nhiệt độ của môi trường xung quanh Hiệu ứng này có thể được sử dụng để mở các viên nang polymer dạng bọc kích thước micro, ví dụ cho mục đích phân phát thuốc Những thuộc tính khác như các hạt được chức năng hóa như nhau, có thể được gắn đặc hiệu với các tế bào cụ thể nào đó Ứng dụng này rất quan trọng trong các ứng dụng điều trị như bệnh ung thư hay nhiệt điều trị bằng cách nung nóng các mô có sẵn các hạt nano để phá hủy các tế bào ung thư ác tính Tuy nhiên, đối với các ứng dụng

in vivo những yếu tố gây độc của các hạt nano lại đang trở thành vấn đề nổi cộm

cần quan tâm và cần được nghiên cứu kĩ lưỡng với sức khỏe Mặt khác, người ta chưa biết được khả năng ảnh hưởng của các hạt nano này khi tồn tại trong môi trường tới vi sinh vật và hệ thống sinh thái

Cảm biến sinh học

Các thuộc tính quang học của chúng có thể thay đổi khi gắn với phân tử sinh học cụ thể, cho phép phát hiện và định lượng phân tích Phổ hấp thụ của hạt nano vàng có thể thay đổi đột ngột khi các hạt trở nên co cụm với nhau Sự co cụm của các hạt ảnh hưởng đến chất lượng của các sản phẩm này đã thương mại hóa nhưng nó có thể cực kì hữu dụng trong phát hiện ADN với độ nhạy cực cao, thậm chí là chỉ vài cặp ADN liên kết bổ sung lỗi

Một chiến lược khác cho việc sản xuất cảm biến là hiệu ứng dập tắt huỳnh quang Các phân tử huỳnh quang được kích thích và gần các hạt nano vàng có thể truyền năng lượng của chúng vào kim loại tạo nên một sự hồi phục không phát xạ của các chất huỳnh quang Trong một số các sơ đồ phát hiện khác, chất phân tích thay thế các phân tử huỳnh quang từ bề mặt của các hạt hoặc thay đổi

sự hình thành của chúng, mục đích để sự phát quang của các phân tử reporter bị thay đổi trong sự xuất hiện của chất phân tích Trong khi rất nhiều các thuộc tính quang học khác của hạt nano vàng đã được khai thác trong những ứng dụng gần đây, vẫn còn vô số các ứng dụng tiềm năng mà chúng ta chưa khai thác hết Điều này sẽ cuối cùng dẫn đến các phép phân tích được thiết lập kỹ lưỡng, quy trình hiện đại cho việc đa dạng các ứng dụng sinh học trong tương lai gần

1.3.4 Chấm lượng tử

Chấm lượng tử là các nano tinh thể bán dẫn bị giới hạn ba chiều về kích thước Kích thước của chúng khoảng từ 1-20nm Chúng có những tính chất rất khác so với vật liệu khối do xuất hiện một số tính chất mà khi ở kích thước nano hay bị giam hãm ba chiều chúng mới có được như hiệu ứng kích thước, hiệu ứng lượng tử, hiệu ứng quang… Do có những tính chất đặc biệt đó nên chấm lượng

tử có rất nhiều ứng dụng hữu ích trong thực tế Hình 1.13 là mô hình chấm lượng tử lõi vỏ CdS/ZnSe, lõi là CdS và vỏ là ZnSe

Hình 1.13 Mô hình chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdS/ZnSe

Chấm lượng tử bán dẫn có những tính chất quang đặc biệt mà ở bán dẫn khối không có Những tính chất này là kết quả của việc giam giữ lượng tử của hàm sóng điện tử chấm lượng tử Việc điều khiển được tính chất quang của chấm lượng tử thông qua thay đổi kích thước của chúng khiến chúng thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học khi nghiên cứu về các lĩnh vực vật liệu, hóa học, sinh học và các ứng dụng trong kỹ thuật khác Sự giam giữ lượng tử sẽ làm mở rộng vùng cấm của chấm lượng tử, dịch phổ về phía bước sóng ngắn hơn tức năng lượng cao hơn Khi kích thước của chấm lượng tử giảm, các mức năng lượng lượng tử hóa tăng, do đó năng lượng tổng cộng của vùng cấm tăng khiến cho phổ hấp thụ và phát quang của chúng dịch về phía bước sóng ngắn hơn Hình 1.14 là mô hình của chấm lượng tử lõi vỏ khi kích thước của chúng giảm dần thì phổ huỳnh quang tương ứng của chúng dịch dần về phổ

có bước sóng ngắn hơn

Hình 1.14 Huỳnh quang của chấm lượng tử khi kích thước lõi giảm dần

Chấm lượng tử với tính chất quang đặc biệt thay đổi theo kích thước của nó

đã và đang dành được nhiều sự quan tâm nghiên cứu trong các lĩnh vực, trong

đó có lĩnh vực y–sinh Một số ứng dụng nổi bật của chấm lượng tử trong y–sinh như đánh dấu các phần tử học, dẫn truyền thuốc Hình 1.15 là hình ảnh chấm lượng tử gắn các “đầu dò” sinh học ứng dụng trong y–sinh

Hình 1.15 Chấm lượng tử gắn các phân tử sinh học

Đánh dấu các phân tử sinh học

Nhờ có tính chất phát huỳnh quang đặc biệt, chấm lượng tử thường được sử dụng để đánh dấu các phân tử sinh học Chấm lượng tử ứng dụng trong chụp ảnh sinh học và chẩn đoán y sinh phải phát quang ổn định và phân tán tốt trong nước, cũng như các dung dịch đệm sinh học có độ thay đổi lớn về pH và nồng

độ muối Việc tạo ra chấm lượng tử biến đổi bề mặt và gắn các phần tử sinh học lên bề mặt chấm lượng tử ổn định trong nước là những thách thức lớn đối với các nhà khoa học Erogbogbo và cộng sự đã chế tạo được chấm lượng tử trong các vi hạt (micelle) phospholipid với tính chất quang ổn định Vi hạt này được

sử dụng để dán nhãn huỳnh quang cho các tế bào tuyến tụy bị ung thư [17], nhằm phát hiện ung thư tuyến tụy Hình 1.16 là hình ảnh của các tế bào ung thư

đã được ghi lại nhờ sự phát huỳnh quang của chấm lượng tử bám trên đó

Hình 1.16 Hình ảnh chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu của các tế bào ung thư

Dẫn truyền thuốc

Chấm lượng tử đang được nghiên cứu để làm chất đánh dấu trong dẫn truyền thuốc để ứng dụng trong y học và dược học nano Như chúng ta đã biết, chất dẫn truyền thuốc phải được làm bằng vật liệu tương hợp sinh học, đảm bảo thời gian lưu hành đủ lâu dài trong các mạch máu và có dược động học được tối

ưu hóa, được chức năng hóa để có thể vượt qua các rào cản sinh lý Liposome và mixen đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi để phân phối thuốc Hiện nay người ta đang chế tạo các nanocomposite từ các liposome, chấm lượng tử để tích hợp khả năng dẫn thuốc của các liposome và tính chất phát huỳnh quang bền của chấm lượng tử (Hình 1.17) Tuy nhiên, đây là một công nghệ tương đối mới, khá phức tạp Vì vậy, một cách tiếp cận phổ biến hơn và đơn giản hơn là chế tạo hạt nano polime có chứa thuốc và chấm lượng tử (C) hoặc sử dụng chấm lượng tử

có gắn trực tiếp thuốc và kháng thể hay các pepdide để dẫn thuốc (D, E) [68]

Hình 1.17 Hình minh họa ứng dụng của chấm lượng tử nano composit

trong dẫn truyền thuốc

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Vật liệu

 Hạt nano từ bọc chitosan biến tính (10 mg/ml).Viện Khoa học Vật liệu Viện Khoa học và Công nghệ Việt Namcung cấp

 Hạt từ Dynabeads ® MyOneTM Carboxylic Acid (10 mg/ml) (Invitrogen)

 Chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdSe/ZnS/ZnSe N10-2-2-10 (QDs).Viện Khoa học Vật liệu Viện Khoa học và Công nghệ Việt Namcung cấp

 Kháng thể đơn dòng C86030M (Biodesign)

 Kháng thể đơn dòng C86920M gắn hạt nano vàng (Biodesign)

 Vi khuẩn L monocytogenes Trung tâm Công nghệ Gen, Học viện Quân

Y cung cấp

 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Viện Công nghệ sinh học Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Bảng các hóa chất sử dụng trong luận văn

1 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC) (Sigma)

2 2–(N–morpholino) ethanesulfonic acid (MES)(Biobasic)

3 Acetic acid

4 Acrylamide 40% (Sigma)

5 Borate (sodium tetraborate) (Biobasic)

6 Boric acid (Biobasic)

7 BSA (20mg/ml, Biobasic)

8 Coomassie Brillant Blue G250 (Biobasic)

9 Chloroform (CHCl3) (AR)

10 Glycine (Biobasic)

11 HCl(AR)

12 Màng nitrocellulose(Rolle/ roll– 0.45 micromet, Whatman)

13 Mercaptopropionic acid (MPA) (Aldrich)

14 Methanol (CH3OH) (AR)

MPA CHCl3 1ml; TMAH 1,84ml; MPA 400µl

PBS 5x Na2HPO4 0,5M; NaH2PO4 0,5M; NaCl 0,876g; pH 7,5

1,5 M Tris HCl 1,5 M Tris HCl; pH 8,8

Dung dịch nhuộm gel 0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40%

methanol; 7% acetic acid

MES1 (Dynabeads) MES 25mM; NaCl 125mM; pH 5,5

MES 2 (QDs) MES 20mM; NaCl 100mM; pH 5,5

TBS Tris HCl 50mM; NaCl 100mM; pH 7,5

Borate Borax 0,2M; Boric acid 0,2M; pH 8,6

Blotting 10x(1000ml) Tris–base 30g; Glycine144,13g

Blotting1x (1000ml) Blotting 10x100ml; Methanol 200ml; Nước 700ml Dung dịch biến tính 0,5M NaOH; 1,5M NaCl

Dung dịch trung hòa 1,5M NaCl; 0,5M Tris HCl, pH 7,5

Dung dịch SSC SSC 15mM; NaCl0,15 M

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

Bảng 2.3 Bảng các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong luận văn

1 Bàn soi tử ngoại UV Transilluminatior 2000 (Bio–Rad)

2 Bộ diện di protein (Bio–Rad)

3 Các loại pipetment (Bio–Rad)

4 Cân phân tích (GR–200, AND)

5 Lò vi sóng (Electrolux)

6 Máy đo pH để bàn (Sension3, HACH)

7 Máy đo phân bố kích thước hạt (Dynamic Light Scattering, HORIBA)

8 Máy đo quang phổ UV–vis (SmartSpec plus, Bio Rad)

9 Máy khuấy từ có gia nhiệt (IKA RTC basic)

10 Máy khử ion nước hai lần (Water Pro RO, Mỹ)

11 Máy lắc tròn (GFL, Germany)

12 Máy li tâm loại nhỏ MIKRO 120 (Hettich zentrifugen, Germany)

13 Máy rung siêu âm (Elma, Germany)

14 Tủ lạnh - 400C (Biomedical freezer, SANYO)

15 Tủ lạnh 40C (SANAKY)

16 Thiết bị rung lắc tự động nhiều chỗ (IKA MS 3 digital)

17 Kính hiển vi quang học

18 Máy đo SEM

19 Máy đo FESEM

20 Máy đo quang phổ hấp thụ hồng ngoại (FTIR)

2.2 Phương pháp thí nghiệm

2.2.1 Phương pháp chức năng hóa bề mặt chấm lượng tử

Tinh sạch chấm lượng tử trước khi biến đổi bề mặt

Ban đầu chấm lượng tử lõi vỏ (QDs) được giữ trong toluene và có nhiều phân tử TOP, TOPO và HDA dư nên trước khi biến đổi bề mặt QDs được tinh sạch bằng methanol Hòa tan dung dịch QDs ban đầu trong toluene vào methanol theo tỉ lệ là 1:10, trộn đều hỗn hợp thu được, ủ ở –200C trong 10 phút,

li tâm 1000 vòng/phút trong 2 phút, thu kết tủa và loại bỏ dịch tan Kết tủa được làm khô ở nhiệt độ phòng, bảo quản 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp