Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường

Bộ sưu tập hơn 3000 chủng xạ khuẩn {những chủng này được phân lập ngẫu nhiên từ các mẫu đất của Việt Nam [14]} tại Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam Viện Vi Sinh và công nghệ sinh học, Đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

NGUYỄN ĐÌNH HẢI

NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN VN08A12 - STREPTOMYCES TOXYTRICINI CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ

BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ

NANÔ SINH HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

NGUYỄN ĐÌNH HẢI

NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN VN08A12 - STREPTOMYCES TOXYTRICINI CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ

BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành : Công nghệ Nanô sinh học

Mã số : Chuyên ngành đào tạo thí điểm

NANÔ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYÔN §øC QUANG

Hà Nội – 2012

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

CHƯƠNG 2 3

2.1 Tổng quan chung về xạ khuẩn 3

2.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 3

2.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 4

2.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn 5

2.2 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 6

2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 6

2.2.2 Phân loại hóa ho ̣c (Chemotaxonomy) 7

2.2.3 Đặc điểm hóa sinh 8

2.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) 8

2.2.5 Phân loại dựa trên trình tự gene 16s rRNA 9

2.2.6 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11

2.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn 12

2.4 Bệnh bạc lá lúa và các biện pháp phòng trừ 15

2.5 Tình hình nghiên cứu kiểm soát bệnh bằng biện pháp sinh học 16

CHƯƠNG 3 17

3.1 Vật liệu nghiên cứu 17

3.1.1 Chủng xạ khuẩn VN08A12 và sản phẩm lên men 17

3.1.2 Vi sinh vật kiểm định 17

3.1.3 Các chủng Xoo 17

3.1.4 Giống đỗ xanh thử nghiê ̣m nghiên cứu 18

3.1.5 Chuột thí nghiệm 18

3.1.6 Môi trường nghiên cứu 19

3.1.7 Dụng cụ, thiết bị và máy móc 20

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Định loại chủng xạ khuẩn 20

3.2.2 Chọn lọc môi trường nuôi cấy phù hợp nhất cho khả năng sinh kháng sinh của VN08A12 27

3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của dịch lên men xạ khuẩn lên cây đậu xanh 30

3.2.4 Phương pháp thử nghiệm ảnh hưởng của dịch lên men xạ khuẩn lên chuột 30

CHƯƠNG 4 32

4.1 Phân loại chủ ng xạ khuẩn VN08A12 32

4.1.1 Đặc điểm sinh học 32

4.1.2 Đặc tính hóa sinh 33

4.1.3 Trình tự 16S-rRNA củ a chủng VN08-A12 38

4.2 Kết quả chọn lọc môi trường sinh kháng sinh phù hợp cho VN08A12 42

4.3 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đỗ xanh 44

4.4 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trưởng và phát triển của chuột bạch 45

CHƯƠNG 5 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

BĐ Môi trường APM dùng bã đậu thay thế cho khô đậu tương BĐ1 Môi trường thay thế dùng bã đậu ủ 1 ngày

BĐ4 Môi trường thay thế dùng bã đậu ủ 4 ngày

CT Công thức

DNA Deoxyribonucleic acid

NA Nutrient agar

YM Yeast - extract Mannitol

YS Yeast - extract Soluble starch

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng 14

Bảng 3.1 Các môi trường dùng cho nghiên cứu 19

Bảng 3.2 Danh sách về thành phần các môi trường dùng cho VN08A12 27

Bảng 4.1.2 Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau của VN08A12 33

Bảng 4.1.3 Kết quả Search Blast trình tự gen 16s – rRNA trên GenBank 40

Bảng 4.2 Vòng ức chế của chủng VN08A12 đối với 10 nòi Xoo (D-d, cm) 42

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trưởng và phát triển của đỗ xanh 44

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trưởng và phát triển của chuột bạch 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Bản đồ phân bố 10 chủng X oryzae pv oryzae ở miền Bắc - Việt Nam 18

Hình 4.1.1 Hình thái học của chủng xạ khuẩn VN08A12 32

Hình 4.1.2A Khả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau 35

Hình 4.1.2B Khả năng chịu muối và khả năng đồng hóa 37

Hình 4.1.3 Trình tự 16S-rRNA của chủng VN08A12 38

Hình 4.1.4 Cây phân loa ̣i chủng VN08-A12 dựa trên 41

Hình 4.1.4 Cây phân loa ̣i chủng VN08-A12 dựa trên 41

Hình 4.2A Trên môi trường YS 43

Hình 4.2B Trên môi trường 43

Hình 4.2 Vòng kháng khuẩn của VN08A12 trên các môi trường 43

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là một trong

những bệnh gây hại chính ở Việt Nam cũng như ở các vùng trồng lúa trên thế giới Bệnh

đã gây giảm năng suất lúa gạo ở Châu Á lên tới 60% tổng năng suất lúa hàng năm [4,8] Có rất nhiều biện pháp ngăn chă ̣n sự bùng phát dịch bệnh như: chọn lọc và phát triển các dòng lúa mang các gene kháng bệnh, dùng chất hóa học để diệt trừ vi khuẩn gây bệnh, phòng trừ dịch hại tổng hợp [17] Tuy nhiên, các biện pháp này vẫn chưa đem lại hiê ̣u quả cao

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật nhân sơ thuộc vào giới các vi khuẩn gram dương Xạ khuẩn có những đặc điểm quý riêng biệt; đó là nguồn sản xuất tự nhiên các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học [20] Gần đây người ta ước tính rằng cứ 10000 chất kháng sinh được khám phá ra từ các vi sinh vật, thì 2/3 các chất đó được sản xuất từ xạ khuẩn; và nhiều chất trong số đó là các thuốc kháng sinh đang được ứng dụng và sản xuất rộng rãi ngày nay Các nghiên nhà cứu chỉ ra rằng: cứ 1000 chủng xạ khuẩn được phân lập một cách ngẫu nhiên, thì khoảng 10 chủng sẽ sinh streptomycin và 4 chủng sẽ sinh tetracycline [2,3] Bộ sưu tập hơn 3000 chủng xạ khuẩn {những chủng này được phân lập ngẫu nhiên từ các mẫu đất của Việt Nam [14]} tại Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (Viện Vi Sinh và công nghệ sinh học, ĐHQGHN) hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học mới dùng cho

việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn X oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở Việt

Nam hiện nay

Vì thế, việc sử dụng xạ khuẩn và các chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra

để khống chế sinh học (sử dụng cân bằng các vi sinh vật và các sản phẩm tự nhiên của chúng để kìm hãm, ức chế vi sinh vật gây bệnh do đó thúc đẩy cây trồng phát triển tốt hơn) và kiểm soát bệnh bạc lá lúa có triển vọng là một phương pháp hiệu quả và thân thiện về mặt sinh thái và môi trường Xuất phát từ thực tiễn trên , chúng tôi tiến hành

đề tài: “Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 – Streptomyces toxytricini có tiềm

năng ứng dụng trong xử lý dịch bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường”

1.2 Mục đích của đề tài

 Phân loại đến cấp độ loài của chủng xạ khuẩn có tiềm năng được sử dụng trong việc phòng chống dịch bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam

 Tiến hành thử nghiệm tác động của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trên động vật nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp quan trọng (cây đậu xanh)

để kiểm tra sự tương tác của chủng xạ khuẩn với các sinh vật trong môi trường sống

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan chung về xạ khuẩn

2.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất

mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng

số VSV [32] Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Cho tới nay khoảng hơn

8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [2] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như

Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất

kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [5]

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

 Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 -1 mm đến 2 mm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [5,9] Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Kích thước của hệ sợi

xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 - 50 mm, dễ quan sát bằng mắt thường Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5- 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường

 Khuẩn ty

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản Nhiều loại chỉ có

hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi

đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng Độ dài của khuẩn

ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 mm/giờ [32] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genome và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy sợi được hình thành và phát triển Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên trong chứa các bào tử nang [6]

2.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh

- gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo

(S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [5] Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 - 400 A0 chia 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt

độ, pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [9] Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi

2.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành

tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A0, khi già có thể đạt tới 150- 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0 Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom

và các dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [16,18,21] Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [2]

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP)

và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m -

2.2 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn

Hiê ̣n nay có nhiều phương pháp được sử du ̣ng để phân loa ̣i xa ̣ khuẩn mô ̣t cách nhanh chóng như: đặc điểm hình thái, nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử

2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh

dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát

mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt

là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử Theo Pridham và cộng sự [27], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên như ta

đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử

2.2.2 Phân loa ̣i hóa ho ̣c (Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vâ ̣t Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào

- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG

- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter Đây là đặc điểm phân loại cơ bản cho các chi đó

- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng

và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên

tử carbon thứ 10 Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [6]

- Photpholipit có 5 typ photpholipit (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn

Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào

2.2.3 Đặc điểm ho ́ a sinh

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ

bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa

để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi

2.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy)

Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số Phương pháp này dựa trên

sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng [32]

- Công thức của Sokal và Michener (SSM)

d S

N S

nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn,

37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định

2.2.5 Phân loa ̣i dựa trên trình tự gene 16s rRNA

Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic Trên cơ sở trình tự DNA , người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử” Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả mức độ sử dụng trong phân loại vi sinh vật Một số phương pháp phân loại vi sinh vật:

Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại

DNA nhiễm sắc thể

Thành phần bazơ (G+C) Chi Biến tính DNA: DNA

Loài và dưới loài Các phần DNA được cắt

bằng enzyme giới ha ̣n

Đa hình các đoa ̣n giới ha ̣n của RNA riboxom

Trình tự axitamin Chi và trên chi

So sánh bằng phản ứng huyết

Các kiểu điện di Điê ̣n di enzyme đa vi ̣ trí Các dòng trong loài

Thành tế bào

Cấu trúc peptidoglycan

Loài và chi Polysacharid

Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, RNA) Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử 16S rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Cho đến nay , đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai DNA Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rRNA 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống

nhau trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của trình tự rRNA 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%

Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật Trong 3 loại gen rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại Gen

mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các chủng Ngược lại, gen mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn (3000) nucleotide do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA

2.2.6 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt

tên năm 1943 [32] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10

μm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng

nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản

vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào

tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 μm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy Thường trên môi trường có nguồn đạm vô

cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ

sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể

biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại

nhóm VSV này Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300

C,

pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh) Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật Cho

đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử

dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau

2.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn

Các chất có hoạt tính sinh học là những hợp chất hữu cơ được tạo ra bởi sinh vật

mà không liên quan trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển hay sinh sản bình thường ở sinh vật

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn tạo ra nhiều các chất có hoa ̣t tính sinh ho ̣c có giá trị

ứng dụng cao, đặc biệt là kháng sinh Chi Streptomyces chiếm hơn hai phần ba nguồn

các kháng sinh tự nhiên đã phát hiện được, trong đó nhiều kháng sinh đã được ứng dụng và có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh như aminoglycosides, anthracyclines, chloramphenicol, beta-lactams, macrolides và tetracyclines [13] Xạ khuẩn sản sinh một lượng lớn kháng sinh với những cấu trúc hóa học đa dạng Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng xạ khuẩn đều sinh kháng sinh và vai trò của kháng sinh trong chu trình sống của xạ khuẩn cũng chưa được hiểu rõ Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế bào hay được phóng thích ra ngoài môi trường [1] Các chủng xạ khuẩn thuộc cùng một loài có thể sản sinh các loại kháng sinh khác nhau; mặt khác, các chủng thuộc các loài khác nhau có thể sản sinh cùng loại kháng sinh Việc sản sinh kháng sinh bởi xạ khuẩn không chuyên biệt cho loài mà chuyên biệt với chủng, do vậy đặc điểm phân loại của xạ khuẩn không hữu dụng cho việc dự đoán dạng kháng sinh do chủng sản xuất Kháng sinh do xạ khuẩn tạo ra có cấu trúc hóa học rất đa dạng như aminoglycosides, anthracyclines, glycopeptides, beta-lactams, macrolides, nucleosides, peptides, polyenes, polyethers

và tetracyclines Các chất biến dưỡng thứ cấp này được tạo ra thông qua các con

đường chuyển hóa đường, shikimate, acetate/malonate, nucleosides, mevalonate và amino acids rất thường được tích lũy trong giai đoạn từ cuối pha log đến đầu pha ổn định [10] Bảng 2.1 Giới thiê ̣u Kháng sinh và các hợp chất có hoa ̣t tính sinh ho ̣c được phát triển từ xạ khuẩn và một số vi sinh vâ ̣t khác

Bảng 2.1 Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng

2.4 Bệnh bạc lá lúa và các biện pháp phòng trừ

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra là một

trong những bệnh gây hại chính ở Việt Nam cũng như ở các vùng trồng lúa trên thế giới

Do tổn thất nặng nề của bệnh Xoo gây ra, việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa tập trung vào

các phương pháp làm giảm sự xâm nhiễm và phát triển của vi khuẩn gây bệnh trên vật chủ cây lúa và việc này có thể thực hiện được qua sử dụng các chất hóa học, các dòng lúa mang gene kháng bệnh và các tác nhân khống chế sinh học

 Kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng các thuốc hóa học: người ta dùng thuốc Bordaux trộn với đường hoặc không, hỗn hợp xà phòng với đồng (Cu), và thuốc diệt nấm, đồng và thủy ngân (Cu-Hg), và một số thuốc kháng sinh như streptomycin và kháng sinh diệt nấm

như zineb, carbendazim đã ức chế vi khuẩn X oryzae pv oryzae trong phòng thí nghiệm

[8] Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có thuốc hóa ho ̣c để kiểm soát bệnh Xoo một cách

hiệu quả và kinh tế Nguyên nhân là do các quần thể vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng và dễ dàng phát sinh những đột biến kháng với các thuốc hóa học đã dùng điều này dẫn đến sự

phát triển và tồn tại các chủng X ryzae pv oryzae kháng thuốc

 Dùng các gene kháng bệnh, hiê ̣n nay là phương pháp chính để làm giảm tác hại của bệnh bạc lá lúa Cho đến nay, khoảng 29 gene chính kháng bệnh bạc lá lúa đã

được định dạng [17,23] trong số đó có 3 gene: Xa4 và Xa5 và Xa7 là những gen đơn kháng hữu hiệu với một số chủng Xoo gây bê ̣nh ở Viê ̣t Nam Ở lúa, gene kháng Xoo này là gen kháng đơn [25,28], do việc sử dụng liên tục và trên diện rộng các gene

kháng bệnh đơn, dẫn đến sự chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh phá vỡ sức kháng bệnh của cây [17] Vì thế, lai tổ hơ ̣p nhiều gen kháng được cho là giải pháp nhằm ta ̣o đươ ̣c giống kháng bê ̣nh bền vững Theo Kinoshita (1995), việc phối hợp nhiều gene kháng vào các giống lúa là một con đường duy nhất để phát triển sức kháng bệnh bạc

lá lúa lâu dài Cho đến nay , có nhiều nhà nghiên cứu đã lai tổ hợp nhiều gene kháng hữu hiê ̣u khác nhau vào mô ̣t giống Các gene khác nhau kháng các nòi, các dạng sinh học của vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tổ hợp các gene đó làm rộng phổ tác động

kháng lại sự đa dạng của các chủng Xoo gây bệnh Hơn nữa, bằng cách tổ hợp các

gene chính và các gene phụ kháng bệnh bạc lá lúa sẽ làm kéo dài sức kháng bệnh ở cây lúa Tuy nhiên phương pháp này tốn rất nhiều thời gian và công sức

2.5 Tình hình nghiên cứu kiểm soát bê ̣nh bằng biê ̣n pháp sinh ho ̣c

Như đã đề cập ở trên, các biện pháp kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng thuốc hóa học hoặc các gene kháng chưa giải quyết được tận gốc để phòng trừ bê ̣nh , vì thế khống chế sinh học kết hợp với các biện pháp kể trên có thể là giải pháp tốt hơn để điều trị bệnh bạc lá lúa Trước đây, các nghiên cứu về khống chế sinh học chưa được chú ý nhiều, nhưng gần đây, đã có mô ̣t số công trình nghiên cứu về vấn đề này

Các nghiên cứu của Gnanamanickam và các cộng sự của ông tại Ấn Độ và

Philipines đã tìm thấy Pseudomonas P fluorescens và một số chủng Bacillus Bacillus

spp, B lentus, B cereus và B circulans, được phân lập từ các mẫu vùng rễ lúa, ức chế

sự phát triển của X ryzae pv oryzae trong phòng thí nghiệm Đặc biệt là từ chủng

P.fluorescens, các nhà nghiên cứu đã xác định được chất 2,4-diacetylphloroglucinol,

được sinh ra từ chủng này, có khả năng kìm hãm sự phát triển của bệnh bạc lá lúa Ngoài ra chất 2,4-diacetylphloroglucinol có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh cây như vi khuẩn, nấm, virus và giun sống kí sinh và có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh cây củ cải đường, lúa mạch và cây thuốc lá Về các

chủng Bacillus, các nghiên cứu của Gnanamanickam et al., (2009), Vasudevan (2002)

chỉ ra rằng chúng có khả năng làm giảm bệnh bạc lá lúa từ 21-59% Năm 2008, Ji và

cộng sự thông báo chủng Lysobacter antibioticus 13-1, được phân lập từ rễ lúa của tỉnh

Yunnan, Trung Quốc, có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loài nấm và vi khuẩn

gây bệnh thực vật, trong đó có X ryzae pv oryzae Chủng này có khả năng kìm hãm sự phát triển của X ryzae pv oryzae hiệu quả lên tới 69.7% Những thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy hiệu quả làm giảm sự có mặt của X ryzae pv oryzae trên lúa từ 59.1- 73.5% Hiệu quả ức chế X ryzae pv oryzae của chủng Lysobacter antibioticus 13-1 thử

trên các dòng lúa khác nhau có biến động tùy theo từng dòng lúa Thêm vào đó hiệu quả

ức chế này còn phụ thuộc vào từng chủng hoặc nòi X ryzae pv oryzae gây bệnh Năm

2009 S SUBRAMANIAN và cô ̣ng sự đã phát hiê ̣n ra chủng Streptomyces noursei có

khả năng sinh ra chất kháng sinh ức chế được một số vi khuẩn như Bacillus sp.,

khuẩn Xanthomonas oryzae [12] Những kết quả nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng: mô ̣t số

vi khuẩn và các chất có hoa ̣t tính sinh ho ̣c có khả năng ức chế vi khuẩn gây bê ̣nh ba ̣c lá lúa

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Chủng xạ khuẩn VN08A12 và sản phẩm lên men

Chủng xạ khuẩn VN08A12 được phân lập từ mẫu lá rụng tại động Phong Nha-

Kẻ Bàng, Quảng Bình Sản phẩm lên men của VN08A12 khi nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng MAPM (Môi trường sinh kháng sinh cải tiến) do Viện vi sinh và Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp (Hoa et al, 2012)

Mười nòi vi khuẩn Xanthomonas oryze pv oryzea (có kí hiệu từ R1 đến R10) do

GS TS Phan Hữu Tôn, khoa công nghệ sinh học, trường Đại học Nông nghiệp cung cấp (Tôn et al, 2003)

3.1.2 Vi sinh vật kiểm định

Bốn vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh : Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus

Pseudomonas puttida do Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, viện Vi sinh vật và Công

nghệ sinh học cung cấp

3.1.3 Các chủng Xoo

Trong nghiên cứu này , chúng tôi sử dụng 10 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc

lá lúa ở miền Bắc Việt Nam, các chủng này có kí hiệu từ R1 đến R10 do Bô ̣ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học , Khoa công nghê ̣ sinh ho ̣c , Trường Đa ̣i ho ̣c Nông nghiê ̣p Hà Nô ̣i cung cấp Những chủng vi khuẩn này được phân lâ ̣p từ các mẫu lá lúa

bị bệnh từ các vùng trồng lúa chí nh ở miền Bắc Viê ̣t Nam (Phan Hữu Tôn và cô ̣ng sự, 2003) [29]

Hình 3.1 Bản đồ phân bố 10 chủng X oryzae pv oryzae ở miền Bắc - Việt Nam

Trong số 10 nòi Xoo, nòi R2 là một trong 2 nòi (R2 và R3) phân bố rộng nhất vì

thế R2 được chọn như là chủng chỉ thị cho nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính kháng

Xoo trong nghiên cứu này

3.1.4 Giống đỗ xanh thƣ ̉ nghiê ̣m nghiên cƣ́u

Đỗ xanh là loại cây họ Đậu (Fabaceae) Đặc điểm của đỗ xanh là giàu hàm

lượng prôtêin, nên nó là cây thực phẩm quan trọng cho người và gia súc Trong quá trình thử nghiệm tính thân thiện sản phẩm lên men của VN08A12 lên thực vật, chúng tôi đã sử dụng giống đỗ xanh KT11- là giống chịu thâm canh thích ứng rộng với các thời vụ và các vùng sinh thái, là giống hiện đang được trồng phổ biến ở Viê ̣t Nam hiện

nay

3.1.5 Chuột thí nghiệm

Chuột thí nghiệm (chuột bạch) do Viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội cung cấp

3.1.6 Môi trường nghiên cứu

Bảng 3.1 Các môi trường dùng cho nghiên cứu

Khoai tây 300 gNaHPO4.12H2O 2 g Ca(NO3)2.4H2O 0.5 g Peptone 5 g Saccarose 15 g Agar 15 g Nước chưng cất 1000ml

Glucose 20 g

K2HPO4 0.2 g MgSO4.7H2O 0.2 g CaCO3 5 g

Nuôi cấy vi khuẩn

Azotobacter

FeCl3.6H2O 0.1 g

Na2MoO4 0.05 g Thạch 15 g

H2O 1000 ml

6 Nutrient Agar

Cao thịt 3 g Peptone 5 g Thạch 15 g

3.2.1.1 Đi ̣nh loại bằng đặc điểm sinh học

Cấy các chủng xạ khuẩn thành từng khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch YS (Hop & Ando, 2010) có thành phần như sau:

Môi trường này được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút và đổ ra đĩa petri, dùng que cấy đã khử trùng lấy một vòng xạ khuẩn ria một đường zikzak trên mặt thạch

Sau khi nuôi từ 4 – 5 ngày ở 30ºC lấy ra quan sát hình thái khuẩn lạc Các đặc điểm hiển vi như từng phần của hệ sợi cơ chất, hình thái của hệ sợi khí sinh, cấu trúc của các chuỗi bào tử và các dạng bào tử được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi liên kết với một máy ảnh và một phần mềm lưu trữ ảnh

Chủng xạ khuẩn được cấy trên đĩa petri chứa môi trường YS, gài lamel vào thạch chếch 45º Sau đó nuôi 4 – 5 ngày ở 30ºC rồi đem soi các lamel có xạ khuẩn dưới kính hiển vi (Sakiyama et al, 2009)

3.2.1.2 Đi ̣nh loại bằng các đặc tính hóa sinh

Đầu tiên, nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường ISP9 dịch thể (150 vòng/phút ở

20oC) khoảng 2 ngày để xạ khuẩn phát triển Thành phần môi trường ISP9 dịch thể gồm có:

bổ sung đường) và môi trường đối chứng + (Shirling & Gottlieb, 1966)