Đồ án môn học Công nghệ thực phẩm Tổng quan tài liệu về ứng dụng biosensor trong kiểm soát chất lượng thực phẩm

1.4 Nguyên tắc và cấu tạo của các loại biosensor 1.4.1 Biosensor đo điện thế Biosensor này hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo probe electr

LỜI MỞ ĐẦU

Trong công nghệ thực phẩm, thiết bị phân tích thích hợp không chỉ kiểm soát và đo lường các thông số quan trọng của sản phẩm mà còn kiểm soát toàn bộ quá trình Phân tích thực phẩm gồm nhiều lĩnh vực, bao gồm xác định vấn đề dinh dưỡng (calories, hàm lượng béo, carbohydrate, protein, vitamin, và chất khoáng), hàm lượng vi sinh vật (vi sinh

vật gây bệnh như Samonella, Listeria, Campylobacter, Escherichia coli O157, Yersina, Shigella hay Vibrio; vi sinh vật gây hư hỏng như Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Faecal streptococci, Clostridium perfringens, hay Pseudomonas,…); gia vị thực phẩm

(aspartame, saccharin, benzoate, sorbate, ascorbate, và sulphure dioxide) hay dư lượng thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ Bên cạnh xác định được thành phần và đặc tính của thực phẩm, phương pháp phân tích cũng cho biết được các biến đổi hóa học xảy ra trong quá trình thu hoạch, chế biến, và bảo quản Tuy nhiên, khó khăn trong phân tích không chỉ vì

có nhiều thành phần cần xác định mà còn vì có nhiều chất khác che lấp mất chất cần phân tích

Một thiết bị phân tích tốt phải thỏa mãn: độ chọn lọc cao, độ nhạy cao, độ tin cậy cao, thời gian phân tích ngắn, ổn định, đơn giản, chi phí thấp, nhỏ gọn, dễ tự động hóa Biosensor có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm, kiểm tra chất lượng, an toàn vì

nó đạt khá đầy đủ các tiêu chuẩn trên

Trong bài báo cáo này, em sẽ trình bày về những ứng dụng của biosensor trong kiểm soát chất lượng thực phẩm

MỤC LỤC

PHẦN 1 Error! Bookmark not defined

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR 4

1.1 Khái niệm về biosensor 4

1.2 Đặc điểm – Yêu cầu về biosensor 5

1.3 Phân loại biosensor 5

1.4 Nguyên tắc và cấu tạo của các loại biosensor 6

1.4.1 Biosensor đo điện thế 6

1.4.2 Biosensor đo cường độ dòng điện 8

1.4.3 Biosensor đo nhiệt 8

1.4.4 Biosensor áp điện: 10

1.4.5 Biosensor quang 11

1.4.6 Biosensor enzyme 13

1.4.7 Biosensor miễn dịch: 13

1.4.8 Biosensor vi sinh vật 13

1.5 Cách sử dụng biosensor 14

1 5.1 Xác định trực tiếp trong môi trường mẫu Phương pháp gián đoạn 14

1.5.2 Flow injection analysis (FIA) 14

1.6 Các lĩnh vực ứng dụng của biosensor 16

PHẦN 2 17

ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN THỰC PHẨM 17

2.1 Kiểm soát chất lượng rượu vang 17

2.1.1 Biosensor xác định hàm lượng glucose 17

2.1.2 Biosensor xác định ethanol 24

2.1.3 Biosensor xác định glycerol 30

2.1.4 Kiểm soát đồng thời ethanol, glucose, glycerol 30

2.2 Kiểm soát chất lượng của cá 35

PHẦN 3 40

ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 40

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM 40

3.1 Biosensor quang 41

 Biosensor dựa trên hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt 41

3.2 Biosensor áp điện 47

3.3 Biosensor điện hóa 50

PHẦN 4 55

ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH THUỐC TRỪ SÂU TRONG THỰC PHẨM 55

4.1 Phương pháp ức chế enzyme 55

4.2 Phương pháp sử dụng enzyme thủy phân 58

4.2.1 Biosensor đo điện thế 59

4.2.2 Biosensor đo quang 60

4.2.3 Biosensor đo cường độ dòng điện 61

PHẦN 5 62

ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 62

THUỐC KHÁNG SINH (ANTIBIOTIC) TRONG THỰC PHẨM 62

5.1 Phân tích dư lượng β-lactam trong sữa 62

5.2 Phân tích streptomycin và dihydrostreptomycin trong sữa, mật ong và thịt heo 66

PHẦN 6 68

ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 68

KIM LOẠI NẶNG TRONG THỰC PHẨM 68

6.1 Biosensor phát hiện kim loại nặng dựa vào tính ức chế enzyme 69

6.2 Biosensor sử dụng protein 71

PHẦN 7 74

KẾT LUẬN 74

PHẦN 8 75

PHỤ LỤC 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

PHẦN 1

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR

1.1 Khái niệm về biosensor

Biosensor là một thiết bị phân tích nhằm chuyển tín hiệu từ phản ứng hóa học hoặc đáp ứng sinh học thành tín hiệu điện Cấu tạo biosensor gồm cơ quan tiếp nhận có bản chất sinh học (bioreceptor) gắn với bộ chuyển đổi hóa lý (physico-chemical transducer) [1]

 Biorecptor có chức năng nhận biết chất cần phân tích và chuyển đổi nó thành sản

phẩm, đồng thời sinh ra những tín hiệu hóa lý mà transducer có thể nhận dạng và định lượng được

Bioreceptor có thể là enzyme, kháng thể, acid nucleic, DNA, RNA, vi khuẩn, sinh vật đơn bào, mô hay cơ quan cao hơn Việc lựa chọn thành phần này tùy thuộc vào chất cần phân tích

 Transducer: tác dụng của transducer là nhận dạng tín hiệu từ bioreceptor và

chuyển nó thành tín hiệu điện

Transducer có nhiều dạng, tùy thuộc vào thông số cần đo như sự thay đổi điện hóa, quang, khối lượng (mass), nhiệt độ,…Nếu tính chọn lọc của biosensor là do thành phần sinh học quyết định thì transducer sẽ quyết định độ nhạy của biosensor

Hình 1.1: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của biosensor: bioreceptor (a) chuyển cơ chất (S)

thành sản phẩm (P) Transducer (b) chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện của transducer Bộ vi xử lý tín hiệu (d) Màn

hình hiển thị (e)

Việc kết hợp mỗi loại bioreceptor với mỗi loại transducer đã tạo ra những loại biosensor khác nhau Thực tế, hai thành phần này phải tương thích với nhau để có thể ra

được tín hiệu điện Ví dụ: sử dụng transducer đo nhiệt độ trong khi phản ứng chuyển hóa chất phân tích không xảy ra sự thay đổi enthalpy thì sẽ không có tín hiệu điện ở đầu ra

1.2 Đặc điểm – Yêu cầu về biosensor

Để định lượng, biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt [1]

Các phép đo có khả năng lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng một loại biosensor trong cùng một mẫu phân tích

Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai

Tính chọn lọc của biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ biến năng Một biosensor có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp Tính nhạy cảm của biosensor thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sự thay đổi về tín hiệu trả lời: a = s m

trong đó a: Độ dao động về biên độ của dòng ra

m: Độ dao động về biên độ của dòng vào s: Độ nhạy cảm của biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp của biosensor trong một ứng dụng cụ thể

Đối với biosensor đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với logarite của nồng độ chất phân tích Theo định luật Nernst: a = s (logc)

Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời với nồng độ khác nhau của chất phân tích Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian

Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ

1.3 Phân loại biosensor

Có 2 cách phân loại biosensor:

- Dựa vào nguyên tắc chuyển đổi các tín hiệu sinh học của transducer, người ta chia biosensor thành 4 loại:

 Biosensor điện hóa gồm 2 nhóm nhỏ như biosensor đo cường độ dòng điện (amperometric biosensor) và biosensor đo điện thế (potentiometric biosensor)

 Biosensor đo nhiệt (thermometric biosensor)

 Biosensor áp điện (piezoelectric biosensor)

 Biosensor đo quang (optical biosensor hay photometric biosensor)

- Dựa vào loại bioreceptor gắn trên transducer, người ta chia biosensor thành 3 loại:

 Biosensor enzyme (enzyme-based biosensor);

 Biosensor miễn dịch (Immunological biosensor);

 Biosensor vi sinh vật (Microbial biosensor)

1.4 Nguyên tắc và cấu tạo của các loại biosensor

1.4.1 Biosensor đo điện thế

Biosensor này hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode) để từ đó suy

ra được nồng độ chất phân tích do tín hiệu thu được tỉ lệ với nồng độ logarithm của nồng

độ (theo định luật Nerst)

Transducer của biosensor gồm điện cực đo và điện cực so sánh

1.4.1.1 Điện cực đo

Điện cực đo nơi xảy ra phản ứng oxy hóa khử, tạo ra điện thế phụ thuộc vào hoạt

độ của ion cần phân tích Thông thường điện cực đo được phân ra làm 2 loại: điện cực khí

và điện cực màng

 Điện cực khí: là một hệ gồm một kim loại trơ (thường là Pt, Au, ) tiếp xúc đồng thời với khí và dung dịch chứa ion của khí này Thông dụng nhất là điện cực hydro, điện cực oxy, điện cực clo

 Điện cực màng chọn lọc ion: thông thường là các bán pin có lớp màng phân cách dung dịch cần phân tích với một dung dịch chuẩn ở bên trong Điện cực thủy tinh đo

pH là điện cực màng chọn lọc ion thông dụng nhất, dùng để kiểm soát nồng độ ion H+ (pH) hay các cation hóa trị 1 Phần cuối của điện cực là một bầu thủy tinh có thành

độ xác định Nhúng vào dung dịch H+ là dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl Toàn

bộ bộ phận trên được đặt trong ống bảo vệ Bằng việc thay thế thành phần của thủy tinh sao cho điện thế màng không phụ thuộc vào giá trị pH, thường sử dụng Al2O3 và

B2O3 ta có thể tạo ra các điện cực màng thủy tinh dùng xác định các cation hóa trị I như Na+, K+, NH4+…Nếu điện cực thủy tinh đo pH được phủ một lớp màng kị nước thấm khí thì đầu đo sẽ xác định được các khí hòa tan hoặc các ion có thể chuyển thành khí hòa tan Các khí như CO2, NH3, H2S có thể khuếch tán qua màng và làm thay đổi pH của dung dịch tùy thuộc vào nồng độ khí

1.4.1.2 Điện cực so sánh

Điện cực so sánh là điện cực không tham gia phản ứng với bất kỳ thành phần nào trong dung dịch cần khảo sát, phải thuận nghịch và tuân theo phương trình Nerst, phải có điện thế không đổi theo thời gian và có thể lấy lại giá trị thế ban đầu sau khi có dòng điện nhỏ chạy qua… Điện cực chuẩn thường là điện cực kim loại loại hai (kim loại M phủ một lớp hợp chất ít tan MA của kim loại đó và được nhúng vào trong dung dịch muối có chứa anion A có nồng độ xác định) Thông thường người ta thường sử dụng 2 loại điện cực Calomel và điện cực Ag/AgCl làm điện cực so sánh

 Điện cực Calomel: được tạo thành bởi kim loại Hg tiếp xúc với dung dịch chứa muối Hg2Cl2 bão hòa và KCl có nồng độ xác định (bão hòa hay 1M)

 Điện cực Ag/AgCl: được sử dụng rộng rãi để làm điện cực chuẩn thay cho điện cực calomel Nồng độ dung dịch KCl sử dụng là bão hòa hay 3.5M

Chú thích:

a) Màng bán thấm b) Thành phần sinh học c) Màng thủy tinh d) Điện cực thủy tinh đo pH e) Điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh g) Dung dịch HCl

f) Điện cực đo Ag/AgCl h) Điện cực so sánh

Hình 1.2: Cấu tạo của một biosensor enzyme đo điện thế

Ứng dụng của biosensor đo điện thế: dùng để đo nồng độ ure trong máu và nước tiểu, đo nồng độ glucose, amino acid, amydalin, penicillin, adenosine, acetylcholine, kim loại nặng, dư lượng thuốc trừ sâu, tổng chất độc (total toxicity), đo nồng độ anti-dinitrophenol, anti-digoxin,

1.4.2 Biosensor đo cường độ dòng điện

Nguyên tắc hoạt động của biosensor đo cường độ dòng điện là xác định cường độ dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế cố định giữa hai điện cực (điện cực

đo và điện cực so sánh) Khi đó cường độ dòng điện hàm của mật độ các hạt tích điện trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực Bằng cách đo cường độ dòng điện, ta có thể suy ra được nồng độ của các chất cần phân tích

Cấu tạo transducer gồm điện cực so sánh thường là điện cực Ag/AgCl và điện cực

đo Điện cực đo hiện nay đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxy và điện cực hydroperoxyde

Hình 1.3: Cấu tạo của một enzyme-based biosensor đo cường độ dòng điện đơn

giản (điện cực clark)

Ứng dụng của biosensor đo cường độ dòng điện: xác định nồng độ glucose,

polysaccharide, alcohol, lactate, amino acid,

1.4.3 Biosensor đo nhiệt

Hầu hết các phản ứng xúc tác sinh học là tỏa nhiệt, lượng nhiệt sinh ra (tính được

từ sự thay đổi enthalpy) thường tỉ lệ với hàm lượng chất cần phân tích, do đó dựa vào lượng nhiệt này ta có thể đo được nồng độ chất cần phân tích

Khi nhiệt lượng tỏa ra càng lớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn Do đó để tăng nhiệt lượng tỏa ra, có thể cố định đồng thời 2 hoặc 3 enzyme (cũng có thể lên tới 4-5 enzyme)

Qua nghiên cứu ta thấy cứ 0.1 mM cơ chất chuyển hóa hoàn toàn thành sản phẩm

sẽ tạo ra 100 kJ/mol Các thiết bị này phải luôn được đặt trong hệ thống cách nhiệt để giữ môi trường ổn định nhiệt độ

Các thiết bị có thể nhận dạng được sự thay đổi nhiệt độ là cặp nhiệt điện và nhiệt điện trở

1.4.3.1 Cặp nhiệt điện (thermocouples)

Cấu tạo của nó gồm hai dây dẫn nối với nhau nhờ mối hàn Sức điện động E của mạch phụ thuộc vào bản chất của dây dẫn và vào nhiệt độ T1, T2 Thông thường nhiệt độ của một mối hàn được giữ ở giá trị không đổi và biết trước, gọi là nhiệt độ chuẩn T1 =

Tref Nhiệt độ của mối hàn thứ hai khi đặt trong môi trường nghiên cứu sẽ nhạy cảm với

sự thay đổi nhiệt độ của môi trường gây ra do phản ứng xúc tác bởi enzyme

Ưu điểm: Kích thước nhỏ nên có thể đo nhiệt độ ở từng thời điểm và tăng vận tốc đáp ứng, không phải kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ

Nhược điểm: độ nhạy với sự thay đổi nhiệt độ trong phản ứng enzyme khá thấp

Nó được ứng dụng chủ yếu trong y học để đo nồng độ các chất trong máu

1.4.3.2 Nhiệt điện trở (thermistor)

Nguyên lý hoạt động của nó là đo điện trở của kim loại, do điện trở đó thay đổi khi nhiệt độ thay đổi

Một ví dụ về phương pháp sử dụng enzyme – nhiệt điện trở:

Hình 1.4: Cấu tạo của biosensor đo nhiệt : a Ống mao dẫn; b Lớp vỏ áo nhiệt; c

Thiết bị trao đổi nhiệt; d Lớp cách nhiệt; e Nhiệt điện trở so sánh; f Cột chứa

enzyme; g Nhiệt điện trở đo; h ống mao dẫn; i Nguồn điện

Cơ chất được đi vào thiết bị trao đổi nhiệt rồi qua cột enzyme để phản ứng với enzyme và giải phóng ra nhiệt, nhiệt độ giải phóng ra sẽ được đo bởi nhiệt điện trở so sánh Kết quả đo được sau đó đi ra qua bộ xử lý để thu nhận tín hiệu

Mối quan hệ giữa điện trở và nhiệt độ được xác định theo phương trình:

Trong đó R1: điện trở của nhiệt điện trở so sánh, R2: điện trở của nhiệt điện trở đo,

T1: nhiệt độ của mẫu sau khi qua bộ phận gia nhiệt, T2: nhiệt độ của mẫu sau khi qua cột enzyme, B: Hằng số nhiệt độ của nhiệt điện trở

Sự thay đổi điện trở giữa thermistor đầu vào và đầu ra sẽ được chuyển thành độ chênh lệch điện thế thông qua cầu cân bằng Wheatstone

Ưu điểm của biosensor sử dụng nhiệt điện trở là nó đơn giản, được sử dụng khá phổ biến, độ nhạy với sự biến đổi nhiệt độ phản ứng (nhất là trong phản ứng enzyme) lớn hơn so với cặp nhiệt điện, có thời gian đáp ứng nhanh và kích thước nhỏ gọn Tuy nhiên khi sử dụng biosensor kiểu này có thể gây sai số lớn nếu không đảm bảo hằng số nhiệt độ của nhiệt điện trở giống nhau ở thermistor so sánh và thermistor đo

Ứng dụng của biosensor đo nhiệt thường dùng trong công nghệ sinh học để định lượng ADP, ATP, glucose,…

1.4.4 Biosensor áp điện:

Nguyên lý của loại biosensor này là dựa vào sự dao động của các tinh thể Các chất điện môi tự nhiên như thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như liti sulfat, thạch anh tổng hợp… dao động khi chịu tác động của từ trường Tần số dao động của tinh thể phụ thuộc vào độ dày và sự biến dạng của tinh thể, mỗi tinh thể có một tần số dao động đặc trưng Tần số dao động này thay đổi theo sự hấp thụ hay nhả hấp thụ từ bề mặt tinh thể, thông thường nó sẽ tăng khi có tạp chất hấp thu lên trên bề mặt của tinh thể Đo tần số dao động

sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo

Tần số dao động được tính theo công thức:

trong đó: F: Chênh lệch tần số dao động (Hz),Fo: tần số dao động cộng hưởng của tinh thể (MHz) m: chênh lệch khối lượng của chất hấp thu (g), A: diện tích bề mặt hấp thu (cm2)

Với công thức trên, có thể ước lượng rằng khi tần số cộng hưởng của tinh thể sử dụng là 9MHz thì độ nhạy của phép đo là 400 Hz/µg Tinh thể thạch anh có tần số cộng hưởng 9Mhz thưòng được sử dụng nhất, nó rộng khoảng 15 mm và dày 0.15 mm, có hình dĩa, khối vuông hay tam giác Trên mỗi mặt của tinh thể được phủ lớp kim loại mỏng dày

từ 0.3 – 1 mm, lớp này sẽ đóng vai trò là điện cực, đó có thể là vàng, bạc, nhôm hay niken, cuối cùng là lớp mỏng bioreceptor được gắn lên bề mặt của điện cực

Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, methane, lưu huỳnh dioxit và cơ chất phosphate hữu cơ Ta có thể dùng nó để xác định nồng độ formaldehyde nhờ formaldehyde dehydrogenase hay xác định dư lượng thuốc trừ sâu vô cơ phospho vốn kìm hãm enzyme xholinesterase

Ưu điểm của nó là cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền Tuy nhiên nó không được dùng để phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không khí

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo của enzyme-based biosensor điện áp

1.4.5 Biosensor quang

Nguyên tắc hoạt động của biosensor quang như sau: Dung dịch phân tích được tiếp xúc với màng và khi phản ứng ở bioreceptor xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc phát ra ánh sáng màu Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của mẫu phân tích thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của các chất tạo thành do phản ứng xúc tác bởi enzyme

Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc phổ quang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang Nó có khả năng chỉ báo những thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợi dẫn Những thiết bị này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng được

đo

1.4.5.1 Điện cực đo phản xạ quang

Điện cực này hoạt động theo nguyên tắc: năng suất phản xạ từ mặt phản xạ tuân theo phương trình: ,%

0 0

I

I R

Kĩ thuật này được dùng để định lượng glucose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH methyl-2-benzotiazolinon) và DMAB (3-dimethyl-aminobenzoic acid) Hai enzyme glucoxydase (GOD) và peroxydase được cố định bằng cách hấp thụ lên bề mặt tấm nền đã phủ thuốc nhuộm Khi mẫu phân tích tiếp xúc với tấm nền thì phản ứng xảy ra như sau:

H2O2

Nếu H2O2 có nồng độ cao thì phải dùng enzyme catalase Mẫu phân tích sau đó được đem đo năng suất phản xạ ở bước sóng thích hợp và từ đó sẽ tính được hàm lượng glucose

Với biosensor dựa trên nền tảng của sự phản xạ toàn phần (total internal reflection – TIR) thì bề mặt dây dẫn được phủ kháng thể, sẽ tiếp xúc với mẫu phân tích Khi sóng ánh sáng đi đến lớp màng nhạy thì chỉ có một phần nhỏ sóng ánh sáng bị hấp thụ vào trong môi trường, còn tất cả chúng bị phản xạ lại nhiều lần và dần dần nguồn sáng bị suy giảm Dựa vào lượng ánh sáng phản xạ, ta có thể tính được hàm lượng mẫu phân tích

Hình 1.2: Biosensor dựa trên hiện tượng phản xạ toàn phần

1.4.5.2 Điện cực đo phát quang

Nguyên tắc hoạt động của điện cực này là: cơ chất tác dụng với enzyme cố định để tạo thành sản phẩm có khả năng phát ra ánh sáng màu Đo ánh sáng màu đó ở một bước sóng nhất định sẽ suy ra được nồng độ cơ chất

Dựa vào đặc tính này, người ta thường sử dụng nó để xác định các vi khuẩn trong thực phẩm Khi các vi khuẩn tác dụng đặc hiệu với ATP và D-luciferin dưới tác dụng của enzyme luciferase sẽ tạo thành oxyluciferin, AMP Pyrophosphate, CO2 và ánh sáng vàng

đo được ở bước sóng 562nm Từ đó xác định lượng vi khuẩn có mặt trong thực phẩm

1.4.6 Biosensor enzyme

Biosensor enzyme là biosensor sử dụng enzyme làm bioreceptor Enzyme này sẽ xúc tác cho phản ứng chuyển cơ chất thành sản phẩm mà transducer có thể định tính và định lượng được Nồng độ chất phân tích sẽ được xác định dựa vào tín hiệu transducer có được Enzyme sử dụng có thể ở dạng hòa tan trong dung dịch hoặc ở dạng màng cố định lên transducer Tất cả các loại transducer nhắc đến đều có thể gằn với màng enzyme

1.4.7 Biosensor miễn dịch:

Biosensor miễn dịch là biosensor sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên làm bioreceptor Nguyên tắc hoạt động của nó là dựa vào tín hiệu sinh ra khi có sự tương tác giữa các kháng nguyên – kháng thể

Mỗi kháng thể là một protein hình chữ Y, gồm 4 chuỗi polypeptide, trong đó có hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ liên kết với nhau bởi các cầu disulfite Một phần cấu trúc của các chuỗi là cố định, nhưng các phần đầu mút của hai nhánh chữ Y lại biến đổi và tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng với các chất hóa học khác gọi là kháng nguyên Kháng nguyên là các “chất lạ” có bản chất protein hay hydrat cacbon

Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định bằng nhiều cách, trong đó có

kĩ thuật ELISA (enzyme linked immunosorben assay: kĩ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn enzyme)

Vi sinh vật được cố định bởi phương pháp vật lí như cố định trong gel, hay màng thẩm

tách Transducer có thể là điện cực đo điện thế hay điện cực đo cường độ dòng điện vì có sẵn màng thấm khí kị nước (teflon hay silicone) Vi sinh vật được cố định nằm giữa màng này và màng thẩm tách Ngược lại với biosensor enzyme, khi vi sinh vật được cố định thì biosensor này phải được giữ ở canh trường cơ bản để giữ hoạt tính

Mặc dù biosensor vi sinh vật có nhiều ứng dụng to lớn nhưng việc chế tạo nó lại gặp nhiều khó khăn Nó phải đáng tin cậy, độ lặp lại cao, và duy trì được hoạt tính của hệ enzyme Sự phát triển của vi sinh vật rất khó kiểm soát do nó còn phụ thuộc vào nhiều thông số hóa lí khác Hơn nữa, màng dùng để cố định vi sinh vật không đủ cứng để chứa

số lượng vi sinh vật ngày càng tăng dẫn đến sự rò gỉ tế bào ra ngoài môi trường

1.5 Cách sử dụng biosensor

1 5.1 Xác định trực tiếp trong môi trường mẫu Phương pháp gián đoạn

Đặt mẫu trong tế bào đo (measuring cell) để biosensor được hoạt động trong điều kiện bình thường (đặc biệt là pH và nhiệt độ)

Điện cực so sánh, như điện cực calomel chuẩn (SCE) được đặt kế bên điện cực đo (ví dụ điện cực enzyme) Điện cực so sánh có thể kết hợp với điện cực làm việc, như trường hợp điện cực thủy tinh cảm biến pH Các điện cực nối với millivolt kế (millivoltmeter) để đo điện thế hay với potentiostat để đo cường độ dòng điện Hệ thống nối với recorder kiểm soát độ ổn định của biosensor và quá trình tiến tới trạng thái ổn định của đường cong đáp ứng Recorder có thể thay bằng bộ xử lý dữ liệu thể hiện đường cong đáp ứng và liên hệ trực tiếp với nồng độ chất phân tích, do đó làm tăng tốc độ đo

Trong phương pháp này, nếu thể tích mẫu đem phân tích quá nhỏ, sự tiêu thụ cơ chất bởi biosensor enzyme có thể gây lệch đường cong đáp ứng Phép đo trực tiếp trong môi trường mẫu thường chỉ sử dụng khi thiết kế biosensor, nghiên cứu thời gian đáp ứng

và dựng đường chuẩn Nhược điểm: không thể đo liên tục, và thường đo bằng thủ công

1.5.2 Flow injection analysis (FIA)

Khi chất phân tích là chất lỏng đang chảy thì FIA được sử dụng Hợp chất có thể tách khỏi những yếu tố gây nhiễu trước đó, tùy thuộc vào tính đặc hiệu của detector Phương pháp tách thường thực hiện bằng kỹ thuật sắc ký, như HPLC Tuy nhiên, khi biosensor có độ chọn lọc cao thì không cần tách Nếu thể tích mẫu rất lớn, hợp chất có thể được xác định trực tiếp như chất lỏng đang chảy Cách khác, mẫu được tiêm trực tiếp với lượng nhỏ vào chất lỏng mang chảy liên tục mà không cần phân đoạn không khí (air segmentation), đây là nguyên tắc cơ bản của FIA Bọt khí không được thêm vào dòng chất mang của FIA, mặc dù nó cần phối trộn các chất trước Mẫu lỏng được cho vào

(a) Xác định cơ chất:

Xác định cơ chất của phản ứng enzyme bằng biosensor kết hợp với FIA thường đơn giản Cơ chất chỉ đơn giản được tiêm vào dòng chất mang qua van tiêm (injection valve) Cơ chất được phát hiện và xác định khi nó tiếp xúc với biosensor

Hệ thống FIA gồm có 2 bơm điều khiển bằng máy tính (để vận chuyển chất mạng

và inject mẫu), injection valve với loop (lần lượt nhận mẫu và chất mang), biosensor, detection cell, và linking tubes có đường kính trong 0.5 – 1 mm

Không giống như phương pháp gián đoạn, đường cong đáp ứng không bao giờ được tới đường thẳng (ứng với trạng thái ổn định) nhưng lại có dạng peak với chiều cao tương ứng với nồng độ chất phân tích Nồng độ trong mẫu được xác định bằng cách so sánh với dung dịch chuẩn biết trước (dung dịch này được inject vào cùng điều kiện)

FIA có ưu điểm là làm việc với lượng mẫu nhỏ (25 – 200µl) và tốc độ bị giới hạn bởi thời gian đáp ứng của biosensor Nếu tốc độ mẫu đi qua biosensor được xem là hằng

số, thì đáp ứng của biosensor nhanh sẽ làm cho chiều cao peak cao hơn trong FIA, cải thiện được tín hiệu

(b) Xác định chất ức chế:

Việc xác định chất ức chế của phản ứng enzyme cần sự có mặt của cơ chất Có 2 khả năng:

- chất ức chế được tiêm (inject) vào dòng chất mang chứa cơ chất

- hay cơ chất được tiêm vào dòng chất mang chứa chất ức chế

Phương pháp thứ nhất chỉ thực hiện khi phản ứng ức chế nhanh (ví dụ, sự ức chế urease bởi fluoride ion) và có nhược điểm là tiêu thụ cơ chất nhiều

Phương pháp thứ hai: được sử dụng rộng rãi hơn vì tính ức chế thường chậm, đặc biệt ức chế không thuận nghịch Phương pháp này làm thuận tiện quá trình “ủ” enzyme khi có mặt chất ức chế và phản ứng hoạt hóa của nó bằng chất hoạt hóa Hệ thống này thường đòi hỏi ít cơ chất hơn, kinh tế hơn Kỹ thuật này thường áp dụng đo organophosphate (azinphos, bromophos, dichlorovos, fenitrothion, malathion, paraoxon,

và parathion) và carbamate (carbofuran và carbaryl) với detection limit là 0.5 – 275 ppb

Hệ thống cũng được dùng khi xây dựng đường chuẩn Đầu tiên, cho chất mang (không có chất ức chế) đi qua detection cell để có peak so sánh tương ứng với tín hiệu cao nhất Một loạt dung dịch với nồng độ chất ức chế khác nhau để đạt được tín hiệu tương ứng với phần trăm ức chế

Phần trăm ức chế được tính:

Trong y học, đa số biosensor sử dụng là biosensor enzyme, nó được dùng để phát hiện và chẩn đoán bệnh tật Ngày nay nó còn là công cụ hữu hiệu để chăm sóc sức khỏe tại nhà với rất nhiều tính năng tốt Điển hình nhất là biosensor đo nồng độ glucose trong máu cho người bệnh tiểu đường, hoặc biosensor đo nồng độ ure trong máu dành cho người mắc bệnh thận có ý nghĩa quan trọng Nó là một loại thiết bị cầm tay với loại chip chế tạo trên cơ sở của điện cực chọn lọc ion và điện cực đo dòng điện, kích thước nhỏ, dễ mang theo, tiện sử dụng, giúp cho người bệnh có thể sử dụng ở bất cứ nơi nào khi cần

Trong lĩnh vực môi trường, biosensor tỏ ra là một công cụ hữu hiệu để đo các chất độc hữu cơ, vô cơ trong nguồn nước để có biện pháp xử lý nước thích hợp như kim loại nặng, các loại thuốc trừ sâu, vi sinh vật, chỉ số BOD,… Biosensor vi sinh vật là hay sử dụng nhất với thời gian phân tích khá ngắn (khoảng 15 phút)

Trong ngành thực phẩm, việc kiểm tra chất lượng thực phẩm dựa trên các phương pháp truyền thống thường mất nhiều thời gian từ vài giờ đến vài ngày Nhưng với kỹ thuật dùng biosensor đã mang lại cho ngành công nghiệp thực phẩm một thiết bị theo dõi

và đo lường nhanh, độ nhạy cao, sử dụng thuận lợi hơn so với những phương pháp truyền thống, trong đó biosensor đã được ứng dụng để kiểm soát thành phần các chất dinh dưỡng, số lượng vi sinh vật, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc kháng sinh, kim loại nặng trong thực phẩm cũng như kiểm soát một số quá trình lên men

2.1 Kiểm soát chất lượng rượu vang

Rượu vang là hỗn hợp gồm hàng trăm hợp chất tồn tại đồng thời với nồng độ khác nhau Chất chiếm ưu thế hơn là nước, ethanol, glycerol, đường, acid hữu cơ, và những ion khác Ngoại trừ ethanol và glycerol; alcohol béo và có vòng, amino acid, và hợp chất phenolic có nồng độ rất ít [4]

Glucose không chỉ là nguồn carbon cho quá trình lên men của nấm men mà còn là

cơ chất làm hạn chế sự phát triển của nó (do tạo ra áp lực thẩm thấu cao) Ethanol không chỉ là sản phẩm chính của quá trình lên men ethanol mà còn là yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men Hàm lượng ethanol sinh ra trong quá trình lên men từ khoảng vài phần trăm đến 14% Nếu trên khoảng này, ethanol sẽ ức chế hoạt động của enzyme và quá trình lên men sẽ ngừng lại Glycerol là sản phẩm thứ hai của quá trình lên men cồn, tạo ra

độ nhớt và vị ngọt cho rượu vang, ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của sản phẩm Hàm lượng glycerol tạo ra suốt quá trình lên men khoảng 1:10 so với alcohol, và nồng độ cuối cùng trong sản phẩm là từ 1 – 10 g/l [4] Do đó việc kiểm soát nồng độ các chất này trong quá trình lên men cũng như trong sản phẩm cuối cùng là điều hết sức cần thiết

2.1.1 Biosensor xác định hàm lượng glucose

Glucose có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau Biosensor đo cường độ dòng điện, biosensor đo điện thế, biosensor đo quang, biosensor đo nhiệt, biosensor đo áp điện đã được ứng dụng trong xác định glucose

Enzyme glucose oxidase là enzyme phổ biến nhất dùng làm bioreceptor Nó xúc tác phản ứng xảy ra như sau khi có mặt glucose và O2:

Do nồng độ glucose tỷ lệ với lượng O2 tiêu thụ và lượng H2O2 tạo ra nên có thể sử dụng điện cực phát hiện O2 hoặc H2O2 có phủ màng enzyme glucose oxidase để xác định nồng độ glucose

2.1.1.1 Biosensor dựa trên phát hiện oxy hay H 2 O 2

Biosensor dựa trên việc phát hiện oxy đơn giản nhất là sử dụng điện cực oxy của Clark làm điện cực làm việc

Cấu tạo của điện cực Clark gồm một cathode Pt (nơi oxy bị khử) và một điện cực

so sánh Ag/AgCl Cả hai điện cực được đặt vào chất điện phân là KCl bão hòa Hệ thống điện cực này được ngăn cách với môi trường nghiên cứu bằng một màng thấm khí kỵ nước (bằng teflon hay polypropylen) chỉ cho oxy thấm qua [1]

Hình 2 1: Cấu tạo của điện cực Clark trong biosensor đo cường độ dòng điện; A - ống

bảo vệ; B – đầu để nạp điện thế; C – điện cực Ag/AgCl; D – dung dịch chất điện phân KCl; E – điện cực Pt; F – màng chỉ cho oxy thấm qua; G – vòng chữ O để cố định màng;

điện cực bị giảm, cường độ dòng điện cũng giảm Do đó, có thể nói, cường độ dòng điện

tỷ lệ nghịch với nồng độ cơ chất Dòng điện được đo sau khi khuếch đại và được chỉ thị trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ oxy hay áp suất riêng phần của oxy Thông thường, người ta còn sử dụng enzyme catalase đồng cố định với enzyme oxidase

để khôi phục lại một nửa lượng O2 tiêu thụ Chú ý: toàn bộ dung dịch tiếp xúc với biosensor đều phải bão hòa oxy, và trước mỗi lần đo biosensor cũng phải được nhúng trong dung dịch đệm bão hòa oxy cho đến khi tín hiệu ổn định thì mới đem nhúng sang dung dịch chứa cơ chất [3]

Hình 2.2: Đường cong biểu diễn sự thay đổi cường độ dòng điện khi biosensor tiếp xúc

với mẫu chứa cơ chất của enzyme

Điện cực này có ưu điểm là không bị các thành phần khác trong dung dịch gây nhiễu (do có màng bán thấm ngăn không cho các chất đến điện cực trừ O2) nhưng cũng có nhược điểm là tín hiệu điện phụ thuộc vào nồng độ oxy trong dung dịch (do phải đảm bảo dung dịch phân tích phải được bão hòa oxy trước) nên làm giảm tính chính xác và khả năng tái sử dụng của phép đo, hơn nữa tín hiệu nền cao làm giới hạn phát hiện cao Để khắc phục nhược điểm đó, điện cực phát hiện H2O2 được thay thế cho điện cực oxy [3]

Khi đặt điện thế là +0,65V lên điện cực Pt (so với điện cực Ag/AgCl) Pt sẽ đóng vai trò là anode và tại anod xảy ra phản ứng sau:

H2O2  O2 + 2H+ + 2e Dòng điện sinh ra tỷ lệ với lượng H2O2 bị oxy hóa ở điện cực Phương pháp này phát hiện trực tiếp H2O2 còn được gọi là “thế hệ thứ nhất” của biosensor

Ưu điểm của điện cực này là nhỏ gọn, khoảng tuyến tính rộng [3]

2.1.1.2 Một số loại biosensor đo cường độ dòng điện khác

Ở “thế hệ thứ nhất” của biosensor, O2 và H2O2 là chất trao đổi điện tử với điện cực, nhưng như thế sẽ phải đặt một điện thế khá lớn lên điện cực, điều này sẽ gây lệch kết quả, nguyên nhân là do có một số hợp chất khác cũng bị oxy hóa ở điện cực cùng với H2O2

Do đó, “thế hệ thứ hai” của biosensor là sử dụng mediator (chất vận chuyển điện tử trung gian nhân tạo) làm chất trao đổi điện tử với điện cực, như thế sẽ giảm được điện thế đặt vào điện cực (chỉ còn khoảng 0,19 V so với điện cực chuẩn) [1] Mediator sử dụng nhiều nhất là ferrocene Phản ứng của nó như sau:

Hình 2 3: Cơ chế vận chuyển điện tử nhờ mediator

FAD (flavin adenine dinucletide) là cofactor của enzyme glucoxidase, nó lấy điện

tử từ cơ chất và trở thành dạng khử FADH2, khi có ferrocene, FADH2 bị oxy hóa trở lại thành FAD Trong quá trình ferrocene chuyển thành ferrocinium ion, điện tử được truyền cho điện cực, làm sinh ra dòng điện

Nhược điểm của mediator này là dạng ferrocinium ion rất dễ bị phân tán trong môi trường mẫu do đó, để hạn chế điều này, người ta thường gắn mediator vào polymer dẫn điện (ví dụ như polypyrrole) hay polymer không dẫn điện (ví dụ poly vinyl imidazole) – thường được tạo ra từ các monomer tương ứng trên điện cực bằng phương pháp điện hóa Khi đó, tốc độ vận chuyển điện tử và độ bền của biosensor tăng, tránh thát thoát mediator [26]

Ngoài việc sử dụng ferrocene làm mediator, người ta còn sử dụng kết hợp cặp enzyme oxidase – peroxidase để phát hiện H2O2 do peroxidase có khả năng trao đổi electron trực tiếp với điện cực và có tính đặc hiệu cao đối với H2O2 Peroxidase sử dụng nhiều nhất là horseradish peroxidase (HRP) do peroxidase này có khả năng vận chuyển electron nhanh hơn các loại khác [26]

Hình 2 4: Cơ chế vận chuyển electron khi sử dụng cặp enzyme oxidase – HRP

2.1.1.3 Screen-print biosensor để xác định hàm lượng glucose

Tuy đã sử dụng thêm enzyme HPR để cải thiện tốc độ vận chuyển điện tử nhưng tốc độ này vẫn còn khá chậm, do đó, ta lại có thể sử dụng thêm mediator để tăng tốc độ vận chuyển electron và giảm điện thế đặt vào Đó là trường hợp của ví dụ này [8]

Screen-print là một kỹ thuật để chế tạo transducer điện hóa của biosensor Transducer được chế tạo bằng phương pháp screen-print được gọi tắt là screen-print transducer Cấu tạo của nó gồm “đường dẫn” Ag, điện cực carbon làm việc, điện cực carbon đếm, và điện cực Ag/AgCl so sánh Những điện cực này được in trên lớp màng polymer (tùy theo từng trường hợp mà lớp màng này có thể khác nhau, trong trường hợp chế tạo biosensor đo nồng độ glucose, người ta dùng màng polyethylen telephtarate) bằng phương pháp screen-print Một lớp màng cách điện sẽ được in trực tiếp lên điện cực trừ những vùng xảy ra phản ứng enzyme [7]

Hình 2 5: Điện cực screen-print điển hình (kích thước của nó có thể thay đổi tùy từng

trường hợp chế tạo)

Biosensor sử dụng screen-print transducer được gọi là screen-print biosensor Để xác định nồng độ glucose trong sản xuất rượu vang, người ta sử dụng screen-print

e Điện cực phân cực

biosensor khi đồng cố định hai enzyme horseradish peroxidase (HRP) và glucose oxidase (GOD) lên bề mặt điện cực carbon (điện cực làm việc) bằng cách tạo liên kết ngang với glutaraldehyde (GA) Biosensor này rất tiện lợi, có thể chế tạo nhỏ gọn để cầm tay, chi phí thấp, có thể chỉ dùng 1 lần, nhưng cũng đảm bảo được độ nhạy và chính xác của phép

đo

Trước khi phân tích, dung dịch mẫu được hòa trộn với mediator (khoảng 0.1 mmol/dm3) Điện thế đặt vào điện cực làm việc là – 0,16V (so với điện cực Ag/AgCl) Phản ứng xảy ra ở điện cực khi nhúng biosensor vào dung dịch mẫu được thể hiện trên hình 2.6 Quá trình vận chuyển electron đến điện cực xảy ra do sự chuyển đổi giữa các dạng oxy hóa và khử của các cặp chất và cuối cùng là cặp oxy hóa khử của mediator sẽ đóng vai trò trao đổi electron trực tiếp với điện cực, làm sinh ra cường độ dòng điện tỷ lệ với lượng glucose tham gia phản ứng Bằng cách đo cường độ dòng điện và từ đường chuẩn, ta có thể suy ra được nồng độ gluose trong mẫu

Hình 2 6: Cơ chế phản ứng xảy ra ở điện cực (ox: dạng oxy hóa, red: dạng khử)

Với biosensor như thế, ta có thể xác định được hàm lượng glucose trong nước nho, hoặc rượu vang với khoảng tuyến tính 4,9 – 49,0 µmol/dm3

2.1.1.4 Biosensor quang

Ngoài ra, người ta còn có thể sử dụng biosensor đo quang sử dụng phẩm lam Phổ

(Prussian blue – PB) [6]

Prussian blue là muối feri-ferocyanua của kali, natri hoặc amoni, có màu lam đậm

Nó là chất xúc tác điện cho quá trình oxy hóa – khử của H2O2 Dạng khử của Prussian blue (còn gọi là Prussian white – PW) có tác dụng xúc tác quá trình khử O2, và dạng oxy hóa của nó lại có tác dụng xúc tác quá trình oxy hóa hydrogen peroxide [5]

Khi PB thay đổi dạng oxy hóa, nó sẽ thay đổi màu sắc Bằng cách đo độ hấp thu của lớp màng PB, ta có thể suy ra được nồng độ chất cần phân tích

Cấu tạo biosensor gồm có màng mỏng polyester, màng này có một mặt được bảo

vệ bằng đệm silicone và một mặt phủ bằng màng PB, cuối cùng màng enzyme glucose oxidase phủ trên màng PB

Trước khi tiến hành phân tích, màng PB sẽ bị khử thành dạng PW không màu bằng cách cho vitamin C vào Màng PW trong suốt không màu sẽ bị khử lại thành PB khi có

H2O2 sinh ra trong phản ứng enzyme (phương trình (1)) Máy quang phổ sẽ đo độ hấp thu của PB ở bước sóng 720 nm

Hình 2 7: Cơ chế hoạt động của biosensor đo quang xác định hàm lượng glucose

Biosensor có thể được lắp vào hệ thống FIA: tiêm mẫu (0,25 ml) vào dòng chất mang chứa 0,01 M ascorbic acid với tốc độ dòng 2,25 ml/min Nó khá đặc hiệu với glucose, các chất khác như sulfate, phosphate, carbonate, actate, citrate đều không gây ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

pH và tác nhân tái sinh (vitamin C) là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc phân tích của biosensor pH của dòng chất mang giảm thì độ nhạy tăng, do trong môi trường acid H2O2 là chất oxi hóa mạnh, vitamin C là chất khử yếu Nhưng nếu pH quá thấp thì sẽ làm biến tính enzyme, độ nhạy cũng giảm Nếu pH > 8 sẽ có hiện tượng enzyme bị phân hủy và làm trôi màng PB Để tránh ức chế enzyme và làm hỏng màng

PN, ta nên dùng dung dịch đệm potassium actate pH 5,0 Ngoài ra trong dung dịch đệm

có chứa ion Kali nên sẽ giảm được thời gian “tái sinh” màng do cation kim loại có tác dụng khử PB thành PW Khi tăng hàm lượng vitamin C trong dòng chất mang sẽ làm giảm độ nhạy của phép đo

Thông số kỹ thuật của biosensor: biosensor trong hệ thống FIA có khoảng tuyến tính là 0,1 – 1 mM, phân tích được 15 mẫu/h

Bảng 2 1: Kết quả phân tích nồng độ glucose (mM) trong một số loại nước uống bằng

biosensor và phương pháp quang phổ

Hai loại enzyme được sử dụng rộng rãi làm bioreceptor trong xác định ethanol là alcohol oxidase (AOD) và alcohol dehydrogenase (ADH) [3]

Alcohol oxidase (AOD) có cofactor tự nhiên flavine adenine dinucleotide (FAD)

Nó thủy phân các alcohol phân tử thấp thành aldehyde với O2 làm chất nhận điện tử Do bản chất oxi hóa mạnh của oxi mà quá trình oxi hóa alcohol bằng AOD là không thuận nghịch Phương trình phản ứng:

Cũng như trong trường hợp xác định glucose, hàm lượng ethanol trong mẫu tỷ lệ với hàm lượng H2O2 sinh ra và hàm lượng O2 tiêu thụ Do đó, ta có thể sử dụng điện cực

pH2O2 và pO2 gắn với màng enzyme AOD để xác định nồng độ ethanol trong mẫu

Alcohol dehydrogenase (ADH) ổn định và đặc hiệu hơn so với AOD, nhưng nó lại cần coenzyme là nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), dạng khử của nó (NADH)

RCH2OH + O2 AOD RCHO + H2O2

không bị oxy hóa bởi oxy, do đó, nó phải cần một số loại mediator để oxy hóa NADH như flavine mononucleotide (FMN) Phản ứng xảy ra ở điện cực như sau:

CH3CH2OH + NAD+  CH3CHO + NADH + H+ NADH + FMN + H+  NAD+ + FMNH2

FMNH2  FMN + 2H+ + 2e Điện cực sẽ nhận 2e này và sinh ra dòng điện trong mạch, dựa vào cường độ dòng điện sinh ra, ta biết được nồng độ ethanol tương ứng Mặc dù loại biosensor alcohol dehydrogenase có thể loại trừ ảnh hưởng của oxy nhưng nó lại khá tốn kém và phức tạp hơn biosensor alcohol oxidase do nó cần thêm co-enzyme tan là NAD+

Các ví dụ điển hình để xác định hàm lượng ethanol được giới thiệu sau đây

2.1.2.1 SIREbiosensor để xác định nồng độ ethanol trong rượu vang

Phương pháp này khác với phương pháp thông thường (phuơng pháp enzyme cố định trên điện cực) là bioreceptor là enzyme tan, nó được bơm liên tục qua đầu điện cực [9]

SIRE Biosensor P100 có 1 buồng phản ứng (buồng phản ứng) đặt trước transducer

đo cường độ dòng điện Dung dịch đệm được bơm liên tục qua buồng Buồng phản ứng đặt ở đầu điện cực và bao bọc bởi màng bán thấm dùng để giữ bioreceptor bên trong buồng phản ứng Điện cực được nhúng vào dung dịch mẫu và phân tử mẫu sẽ khuếch tán qua màng, vào trong buồng phản ứng Bioreceptor được bơm cùng với dung dịch đệm, giữ trong buồng phản ứng trong khoảng thời gian định trước, đo và sau đó được thải ra Nghĩa là bioreceptor chỉ được sử dụng 1 lần Phản ứng xảy ra giữa bioreceptor và chất phân tích bên trong buồng phản ứng sẽ tạo thành sản phẩm Sản phẩm này sẽ bị oxi hóa bởi điện cực, nơi có đặt hiệu điện thế Đầu tiên, tín hiệu được đo sau thời gian phản ứng định trước với sự có mặt của bioreceptor Tín hiệu thứ hai sẽ được đo mà không có enzyme, và đó là tín hiệu nền Sự khác nhau giữa 2 loại tín hiệu này sẽ cho ta biết nồng độ chất phân tích

SIRE biosensor có thể đo được nhiều chất khác nhau như glucose, L- lactate, sucrose, ethanol, methanol, hydrogen peroxide (H2O2), phenylalanine, galactose và oxalate; thường ứng dụng trong dược, lên men, và công nghiệp thực phẩm Trong những trường hợp đó, những oxidase tương ứng kết hợp với catalase được dùng làm bioreceptor trong SIRE biosensor P100 với quá trình oxy hóa hydrogen peroxide ở 650mV Trong bài

này, alcohol dehydrogenase (ADH) từ Sacchromyces cerevisae được dùng làm

bioreceptor với sự có mặt của NAD+

Phản ứng xảy ra trong buồng phản ứng như sau:

Theo trên, tín hiệu từ NADH sẽ tăng theo nồng độ ethanol

Hình 2 8: Hình minh họa cấu tạo của transducer

Transducer đo cường độ dòng điện của SIRE biosensor cấu tạo bởi 3 điện cực Điện cực làm việc và điện cực đếm làm bằng dây Pt; điện cực so sánh là dây bạc Quá trình oxi hóa điện của NADH thành NAD+ tăng theo điện thế

Nguyên lý hoạt động của SIRE biosensor như sau: dòng dung dịch đệm (sodium phophate, pH 7,4 hay 8,1) được mở ra và đầu dò của biosensor nhúng vào dung dịch mẫu (đã hòa tan trong dung dịch đệm) Khi đó, bioreceptor (ADH, BSA, và NAD+ tan trong dung dịch đệm) được tiêm vào dòng dung dịch đệm cho tới khi vào được buồng phản ứng Sau đó dòng đệm ngừng lại, dung dịch mẫu khuếch tán vào buồng phản ứng qua màng bán thấm và bioreceptor xúc tác phản ứng xảy ra, sinh ra acetaldehyde và NADH từ ethanol và NAD+ Sau 1 khoảng thời gian xác định (thời gian phản ứng) dòng điện sẽ được đo Đây là tín hiệu từ quá trình oxi hóa điện của NADH và từ những chất electro-active trong matrix Sau khi tín hiệu đầu được đo, dòng đệm lại được mở lên lần nữa, dung dịch bioreceptor bị thải ra khỏi hệ thống Sau đó, dòng đệm ngừng lại, đo dòng điện lần 2, là tín hiệu do những electro-active trong matrix (tín hiệu nền) Lấy tín hiệu đầu trừ

đi tín hiệu nền cho ta tín hiệu chỉ của NADH – chất tỉ lệ với nồng độ ethanol trong dung dịch mẫu

Toàn bộ quá trình được điều khiển tự động bởi bộ vi xử lý Việc đo, bao gồm cả rửa chỉ khoảng 50s – 4 phút, phụ thuộc thời gian đặt

Ethanol + NAD+ ADH Acetaldehyde + NADH + H+

Biosensor được tối ưu hóa về điện thế đặt thích hợp (+950mV), pH của dung dịch đệm (pH 8,5), nhiệt độ (308K), nồng độ NADH (nồng độ NADH trong khoảng 0 – 10-5thì tín hiệu tăng tuyến tính, thời gian phản ứng là 15 s, nhiệt độ 298 K), nồng độ NAD+(15 mM), hàm lượng dehydrogenase (200 U/ml), dung dịch BSA (20 mg/ml)

Thời gian phản ứng phải vừa đủ, nếu quá lâu thì ethanol sẽ không ngừng khuếch tán vào buồng phản ứng và enzyme sẽ đạt bão hòa, làm cho đường chuẩn không còn tuyến tính, đồng thời NADH tạo thành khuếch tán ra khỏi buồng phản ứng; nhưng cũng không quá nhanh để cho ethanol có thời gian khuếch tán vào buồng phản ứng Nồng độ ethanol càng nhỏ thì thời gian càng lâu

SIRE biosensor có thể xác định được hàm lượng ethanol trong rượu vang với khoảng tuyến tính 0.1 mM đến 12,5 mM, thời gian phân tích khảng từ 50 s – 4 phút/lần

đo

2.1.2.2 Biosensor sử dụng enzyme Quinohemoprotein alcohol dehydrogenase

Cấu tạo biosensor gồm màng enzyme cố định trên điện cực carbon (hoặc print transducer) Dung dịch enzyme dùng để cố định gồm: enzyme Quinohemoprotein alcohol dehydrogenase (QH-ADH), polymer oxy hóa khử PVI13dmeOs (Os(4,40-dimethylbipyridine)2Cl), tác nhân liên kết ngang Poly(ethylene glycol)diglycidyl ether (PEGDGE) [10]

screen-Hình 2 9: Cơ chế tác dụng của enzyme QH-ADH

Quinohemoprotein alcohol dehydrogenase là enzyme được phân lập từ loài

Gluconobacter Cấu trúc của nó gồm 3 phần: phần 1 chứa Pyrroloquinoline quinone

(PQQ – là một cofactor thứ 3 sau NAD và FAD) là nơi xảy ra phản ứng oxy hóa đầu tiên,

phần thứ hai nhóm heme c, phần thứ 3 là cofactor không có tính oxy hóa khử

Nguyên tắc xác định ethanol như sau: ethanol đầu tiên bị oxy hóa ở vùng PQQ sinh

ra electron, electron này được những nhóm heme c vận chuyển đến bề mặt protein, từ đây electron sẽ tiếp tục trao đổi với điện cực, làm sinh ra dòng điện trong mạch

Biosensor được gắn vào hệ thống FIA Cơ chế hoạt động và đo đạc như đã trình bày phần trước

2.1.2.3 Biosensor với bioreceptor là vi sinh vật

Vi sinh vật cũng thường được sử dụng làm bioreceptor trong biosensor, và nó thường được đi kèm với các transducer khác nhau như transducer đo điện thế, đo cường

độ dòng điện hay đo điện dung [11]

Cấu tạo biosensor: gồm nấm men Saccharomyces ellipsoideus hay vi khuẩn Candida tropicalis cố định lên màng bán thấm O2 của điện cực cảm biến O2 (như mô tả ở trên) bằng liên kết ngang với gelatin với tác nhân liên kết là glutaraldehyde, sau đó nó được bao bên ngoài bằng màng thẩm tách

Trong quá trình hô hấp, nấm men sẽ đồng hóa ethanol kèm theo tiêu thụ oxy Do

có tiêu thụ oxy nên nồng độ oxy hòa tan xung quanh màng tế bào giảm và do đó làm giảm tín hiệu ở đầu ra Từ tín hiệu đầu ra này ta sẽ biết được nồng độ ethanol

Khi bắt đầu phân tích, nhúng biosensor vào dung dịch đệm bão hòa oxy Oxy sẽ khuếch tán qua màng teflon và một phần oxy sẽ được vi sinh vật tiêu thụ, cường độ dòng điện đo được là thể hiện quá trình hô hấp của vi sinh vật Sau đó biosensor được nhúng vào mẫu chứa ethanol, lúc này vi sinh vật sử dụng ethanol làm cơ chất và tăng tốc độ hô hấp, do đó nồng độ oxy hòa tan giảm, cường độ dòng điện giảm cho đến khi đạt trạng thái cân bằng, đo cường độ dòng điện thu được Độ chênh lệch giữa cường độ dòng điện trước

và sau khi có mặt ethanol tỷ lệ với nồng độ ethanol trong mẫu

Thông số kỹ thuật:

a Thông số kỹ thuật của biosensor có bioreceptor là S ellipsoideus [11]

Nồng độ tế bào cố định lên bề mặt cảm biến nếu quá thấp thì tín hiệu nền không thay đổi dù có mặt ethanol, nếu nồng độ quá cao thì cảm biến không dò tìm được oxy hòa tan Do đó, nồng độ tế bào tối ưu là 0,5 ml huyền phù tế bào với độ hấp thu 0.1 (ở  = 660 nm)

Nhiệt độ làm việc tối ưu: 25oC

pH không ảnh hưởng gì đến tín hiệu thu được, do có màng bán thấm oxy ngăn cản không cho có ion đi xuyên qua

Thời gian đáp ứng của biosensor: 5 phút

Giới hạn dò tìm: 5,7M

b Thông số kỹ thuật của biosensor có bioreceptor là Candida tropicalis [12]

Tế bào C.tropicalis đông khô cần dùng là 4,42 mg/cm2, gluraldehyde là 0,1% với 4,42 mg/cm2 gelatin

Dung dịch đệm phosphate dùng cho biosensor có pH 7,5; 50mM

Nhiệt độ tối ưu hoạt động: 30oC

Khoảng tuyến tính: 0,5 – 7,5 mM với thời gian đáp ứng là 2 phút

Phản ứng xảy ra trong quá trình phân tích:

Bằng cách sử dụng điện cực pH2O2 (như nêu ở phần trên), ta có thể biết được nồng

độ glycerol trong dung dịch

2.1.4 Kiểm soát đồng thời ethanol, glucose, glycerol

Trong công nghệ sản xuất rượu vang, ethanol, glucose và glycerol có thể được kiểm soát đồng thời nhờ biosensor do Mihaela Niculessu và cộng sự (2003) nghiên cứu và phát triển

Cấu tạo biosensor như sau:

Enzyme có chứa pyrroloquinoline quinone (PQQ) là một loại enzyme không phụ thuộc vào oxy, không cần cofactor, có khả năng vận chuyển trực tiếp electron giữa trung tâm hoạt động và điện cực, do đó nó làm cho cấu tạo biosensor đơn giản hơn

Do enzyme dehydrogenase thông thường khi tham gia xúc tác cần phải có mặt NAD+ nên ta có thể thay thế nó bằng enzyme PQQ - glucose dehydrogenase – viết tắt là

PQQ - GDH (phân lập từ loài Erwinia 34-1); PQQ - alchol dehydrogenase – viết tắt PQQ – ADH (phân lập từ loài Glucanobacter 3-3), PQQ - glycerol dehydrogenase – viết tắt PQQ – GlyDH (phân lập từ loài Glucanobacter 3-3)

Enzyme được cố định lên điện cực carbon bằng liên kết ngang poy(ethyleneglycol)-diglycidyl ether (PEGDGE) vào polymer oxy hóa khử có gắn

Glycerol-3-phosphate + O2 + H2O Glycerol-3-phosphate Glycerone-3-phosphate + H2O2

oxidase Glycerol + ATP (Mg2+) Glycerokinase Glycerol-3-phosphate + ADP

Nguyên tắc hoạt động:

Tất cả các phép đo đều thực hiện trong tế bào điện hóa có 3 điện cực: điện cực graphite (chuẩn bị như trên) là điện cực làm việc, Ag/AgCl làm điện cực so sánh, Pt là điện cực đếm (couter electrode) Đặt điện thế +200 mV lên điện cực làm việc (so với Ag/AgCl) rồi đo cường độ dòng điện

Cơ chất chính của enzyme (glucose đối với GDH, glycerol đối với GlyDH và ethanol đối với ADH) sẽ bị oxi hóa trong khi cofactor của enzyme bị khử đồng thời Dạng hoạt động của enzyme sẽ được tái sinh khi tiếp xúc với chất trung gian oxy hóa khử nhân tạo điện hóa (electrochemical mediator - PVI13dmeOs) luôn duy trì ở dạng oxi hóa do có điện thế dương đặt ở điện cực Cơ chế của quá trình này được thể hiện trên hình

Hình 2 10: Cơ chế hoạt động của biosensor sử dụng PQQ-enzyme

Nồng độ các chất được xác định dựa vào phương pháp lập đường chuẩn

Biosensor sẽ được gắn vào các hệ thống bơm hóa chất tự động (flow injection line – FIA), chất phân tích được tiêm từ từ vào dòng chất mang và đến tế bào điện hóa (gồm điện cực làm việc, so sánh, và điện cực đếm) Điện thế làm việc được điều khiển bởi ổn

áp (potentiostat) Điện cực được tối ưu hóa về thành phần (tỉ lệ enzyme/polymer/tác nhân liên kết ngang), tốc độ dòng, pH và được kiểm định trên mẫu chuẩn

Hình 2 11: Hệ thống FIA với 2 biosensor đo glucose và biosensor đo ethanol

Sau đó, điện cực đã tối ưu hóa đó sẽ đem thử trên mẫu thật (rược vang) và cho kết quả nồng độ chất phân tích Những tính chất chính của biosensor được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 2 3: Các tính chất của biosensor với DL: giới hạn dò tìm, LR: khoảng tuyến tính,

Imax và Km được tính từ phương trình Michaelis – Menten: I = (I max x [A])/(K m + [A]) với [A] là nồng độ chất cần phân tích, S: độ nhạy (S = I max /K m x diện tích điện cực)

(mM)

Imax(µA)

S (mA/Mcm2)

DL (µM)

LR (µM) Glucose

Ethanol

Glycerol

0,8 0,6 1,31

4963

9400

1797

88,62 223,8 19,5

9 1,2

1

20-800 2,5-250 1-200

Bảng 2 4: Nồng độ ethanol, glucose và glycerol trongrượu vang

2.1.5 Phân tích lactate trong mẫu rượu vang

Lactate được hình thành trong quá trình lên men bình thường của alcohol Nó là sản phẩm bậc 2 của quá trình lên men kị khí, do sự khử các tiền chất của nó như pyruvate với sự có mặt của NADH2 Lactate có thể tạo ra từ glutamate và alanine Việc kiểm soát thường xuyên, đồng thời và chọn lọc lactate là rất quan trọng trong quá trình làm rượu vang do thông số lactate không chỉ xác định được chất lượng vang mà còn ảnh hưởng đến mùi vị của vang [14]

Trên thực tế, đã có nhiều phương pháp cổ điển dùng xác định lactate như sắc kí khí, so màu, và phương pháp enzyme nhưng những phương pháp này sử dụng dụng cụ phức tạp, và phụ thuộc vào lượng chất phân tích, do đó đòi hỏi những phương pháp mới thay thế ra đời

Biosensor có thể xem là phương pháp thay thế đầy triển vọng do nó không đắt tiền, đáng tin cậy, đơn giản, nhanh và có tính kinh tế cao (so với những phương pháp cũ)

Biosensor xác định lactate sử dụng 2 enzyme, lactate oxidase hay lactate dehydrogenase Enzyme thứ 2 cần cofactor là NAD+ nên làm cho việc phân tích phức tạp

hơ, tăng chi phí Hơn nữa, còn phải thêm enzyme bổ sung, glutamate pyruvate transaminase để tăng hiệu quả phản ứng do đó giá thành của nó vẫn còn cao

Biosensor sử dụng lactate oxidase (LOX) phổ biến hơn biosensor sử dụng dehydrogenase do trái với cái thứ 2, LOX có sẵn cofactor FAD

L.V Shkotova và cộng sự (2007) đã phát triển biosensor đo cường độ dòng điện sử dụng điện cực Pt SensLab cố định lactate oxidase để xác định lactate trong dịch nho trước (must) trong suốt quá trình lên men và trong rượu vang

Có 2 phương pháp cố định enzyme lên transducer: phương pháp hấp thụ vật lí trong polymer Resydrol và phương pháp trùng hợp điện hóa trong polymer PEDT (poly(3,4-ethylenedioxythiophene)) Phương pháp thứ nhất có khoảng tuyến tính hẹp hơn (0,004 – 0,5 mM lactate) và độ nhạy cao hơn (320 nA/mM) so với phương pháp thứ hai (khoảng tuyến tính: 0,05 – 1,6 mM và độ nhạy 60 nA/mM)

Phản ứng enzyme cơ bản trong xác định lactate bằng biosensor đo cường độ dòng điện sử dụng lactate oxidase như sau (khi đặt điện thế +300mV lên điện cực Pt (so với Ag/AgCl):

Quá trình phân giải lactate sẽ làm tích lũy H2O2, nó sẽ được phân tích bằng transducer đo cường độ dòng điện

Bảng 2 5: Kết qủa phân tích lactate trong mẫu rượu vang

Phương pháp sắc ký ion

Nồng độ lactate (g/l) – Phương pháp biosensor

Từ bảng trên, ta thấy kết quả phân tích bằng biosensor không chênh lệch nhiều so với phương pháp sắc kí ion

LOX

L – lactate + O2 pyruvate + H2O2

Bảng 2 6: Phân tích mẫu rượu vang trong quá trình lên men

Nồng độ lactate (g/l) Mẫu số Ngày thứ

2

3 4,1

0,31 0,82 0,32 0,99 0,26 0,64 0,29 0,31 0,35 0,44 0,77 0,25 0,23 Bốn mẫu đầu có kết quả không tương hợp nhau giữa 2 phương pháp, có thể do nồng độ lactate trong giai đoạn đầu rất nhỏ, độ nhạy của biosensor đo cường độ dòng điện hoạt động không hiệu quả, chưa detect chính xác được

2.2 Kiểm soát chất lượng của cá

Amine có hoạt tính sinh học có thể được xem như chất chỉ thị chất lượng trong thực phẩm do nó tác động đến sức khỏe của con người (về thần kinh, dạ dày, tiêu hóa) nếu tồn tại trong thực phẩm với hàm lượng lớn Những chất này không những được tổng hợp bằng con đường sinh học trong tế bào động vật, thực vật mà còn do quá trình decarboxyl hóa aminoacid Hàm lượng và loại amine sinh học tạo thành bị ảnh hưởng bởi thành phần thực phẩm, môi trường vi sinh vật và những thông số khác thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình bảo quản thực phẩm (Halasz và cộng sự, 1994) Do nồng độ amine sinh học thay đổi trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm nên nó được xem như chỉ số chất độ tươi hóa học của những thực phẩm như cá, olive, hay trái cây Amine sinh học dễ nhiễm nhất là histamine và chất độ histamine còn gọi là “chất độc

cá scombroid” (scombroid là một loại cá thu Nhật bản) Hàm lượng histamine nhiều nhất

có thể có trong thực phẩm là 100 mg/kg (theo luật của Ý và hội đồng Châu Âu – European Commission) [33]

Những phương pháp đã được sử dụng để phân tích và định lượng amine sinh học là sắc ký khí (Staruskiewiecz và Bond, 1981) và sắc ký lỏng cao áp ngược pha (Reggiani, 1990; Hyvonen, 1992; Saito, 1992), sắc ký trao đổi ion (Hoekstra và Johnson, 1998),… nhưng những phương pháp này cần nhiều bước chuẩn bị mẫu phức tạp và những thiết bị đắt tiền

Gần đây, đã có nhiều biosensor điện hóa ra đời để dò tìm hàm lượng amine sinh học (Bouvrette và cộng sự, 1997; Chemnitius và Bilitewski, 1996; Compagnone và cộng

sự, 2001; Draisci và cộng sự, 1998; Esti và cộng sự, 1998; Niculescu và cộng sự, 2000;

Enzyme thường được sử dụng làm bioreceptor cho biosensor, trong đó nhiều nhất là enzyme amine oxidase (AO), xúc tác phản ứng xảy ra như sau:

Do trong phản ứng cũng có sự tiêu thụ O2 và tạo thành H2O2 nên có thể sử dụng các điện cực phát hiện O2 hay H2O2.

Biosensor đo cường độ dòng điện để phát hiện amine sinh học được cấu tạo bởi điện cực carbon được phủ enzyme AO hay hai enzyme đồng cố định AO- HRP với sự có mặt của mediator điện hóa (polymer oxy hóa khử Os) [26]

Hình 2.12: Cơ chế phản ứng xảy ra ở điện cực enzyme AO

R – CH2 – NH2 + H2O + O2 R – CHO + H2O2 + NH3

amine oxidase

Hình 2.13: Cơ chế phản ứng xảy ra ở điện cực khi đồng cố định 2 enzyme AO và HRP

Enzyme được cố định lên điện cực carbon bằng liên kết ngang poy(ethyleneglycol)-diglycidyl ether (PEGDGE) vào polymer oxy hóa khử có gắn mediator Os (Os(4,4-demethylbipyridine)2Cl), PVI13dmeOs

Điện thế đặt vào của 2 điện cực 1 enzyme và 2 enzyme lần lượt là +200 mV và -50

mV so với Ag/AgCl, khi đó quá trình trao đổi điện tử với điện cực (theo cơ chế như trong hình 2.13) sẽ làm sinh ra dòng điện, bằng cách đo dòng điện sinh ra, có thể suy ra được nồng độ amine sinh học

Theo kết quả khảo sát được, biosensor 2 enzyme có độ nhạy cao hơn (0,073 A/Mcm2 đối với histamin) và giới hạn dò tìm thấp hơn (0,33 µM đối với enzyme) so với biosensor 1 enzyme (độ nhạy: 0,007 A/Mcm2 và giới hạn dò tìm: 2,2 µM)

Hai loại biosensor này chỉ phát hiện được hàm lượng tổng amine sinh học

2.3 Phân tích polyphenol trong dầu oliu

Extra virgin olive oil là loại có độ acid thấp nhất (dưới 1%) Bởi vì nó là lớp dầu ép

ra đầu tiên, nên là loại tốt nhất và ngon nhất Mầu của nó là vàng nhạt tới vàng hơi lục Dùng loại này trộn với xá lách hay chấm bánh mì thay bơ [16]

Hợp chất phenolic là chất chống oxi hóa và là yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng của dầu extra-virgin olive Nồng độ phenolic có liên quan với những thông số chất lượng khác như mức độ oxi hóa (thông quá chỉ số peroxide) hay acid béo tự do

Nồng độ phenolic của dầu virgin olive phụ thuộc vào cây trồng, địa phương, mức

độ chín, điều kiện bảo quản trái olive cũng như phương pháp trích li và điều kiện bảo quản dầu olive

Ở đây, người ta giới thiệu cách kiểm soát sự thay đổi nồng độ polyphenol trong dầu extra-virgin olive bằng biosensor sử dụng tyrosinase đo cường độ dòng điện hoạt động trong dung môi hữu cơ

Nguyên tắc: dựa vào hoạt tính xúc tác của tyrosinase Ưu điểm chính của nó là không cần quá trình trích li trước đó, và hoạt động trong dung môi hữu cơ, do đó thời gian phân tích được rút ngắn, hơn nữa nó có thể gắn trong hệ thống FIA Ngoài ra phương pháp này so với những phương pháp cổ điển khác (HPLC và phản ứng Folin – Cio – calteau) không tốn nhiều thời gian, dễ hoạt động, thời gian phân tích ngắn hơn

Cấu tạo: biosensor sử dụng tyrosinase làm bioreceptor cố định lên màng Immobilon Màng enzyme gắn ở đầu điện cực đo cường độ dòng điện, nằm giữa màng thấm khí (ở đây là khí O2) và màng thẩm tách; toàn bộ hệ thống được gắn lên nắtp kim loại (metallic cap) của cảm biến bằng vòng Teflon chữ O N-hexane là chất mang với vận tốc dòng 2 ml/phút Thể tích bơm vào (loop volume) là 75 µl

Hình 2.14: Sơ đồ cấu tạo (a) và tế bào điện hóa (b) sử dụng trong biosensor

Màng enzyme: hòa tan 2 mg enzyme và 3 mg bovine serum albumin (BSA) trong

60 µl đệm phosphate 0,06 M, pH 6,6, KCl 0,1M, thêm 20 µl glutaraldehyde 2,5% vào Lấy 70 µl trải thành màng 2 x 2 rồi cắt thành 0,5 x 0,5 mm Những miếng màng này rửa bằng dung dịch đệm glycerine 0,5 M, pH 10 trong 10 phút vào làm khô ở -16oC, rồi rửa lại lần nữa trong đệm phosphate trong 10 phút

Lượng giảm tín hiệu oxy được tính theo công thức: - [(L1 – Lo)/Lo] x 100 trong đó

Lo là tín hiệu trước khi thêm cơ chất và L1 là tín hiệu sau khi thêm cơ chất

Phản ứng xảy ra trong quá trình phân tích:

phenol + O2  hydroquinone + H2O2Nồng độ oxy tiêu thụ được detect bởi transducer Để lập đường chuẩn, ta chỉ cần ngâm biosensor vào trong dung dịch phân tích chứa trong dung dịch hữu cơ (n – hexane)

và trong đệm phosphate ph 6,6; KCl 0,1M Kết quả cho thấy khi làm việc trong dung môi

hữu cơ sẽ cho tín hiệu cao hơn khi làm việc trong môi trường nước, do đó mẫu dầu có thể làm việc trực tiếp trong dung môi hữu cơ mà không cần trích li hay xử lí mẫu trước

Bảng 2 7: So sánh tính chất của biosensor khi phân tích với 2 cơ chất khác nhau

(ppm/A.U.%)

(ppm) Phenol

Cathecol

0,2 0,1

10

20

0,5 – 6 0,5 - 5

Biosensor sau khi sử dụng được bảo quản ở nhiệt độ -16oC và có độ bền trong vài tuần

Bảng 2 8: So sánh kết quả 2 phương pháp phân tích bằng FIA và gián đoạn

tế, những bệnh do Salmonella, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Campyobacter coli và Bacillus cereus vẫn chưa giảm bớt

Escherichia coli thuộc họ vi khuẩn đường ruột, sống bình thường ở ruột người và

loài vật, nhiều nhất trong ruột già Vi khuẩn này theo phân ra ngoài thiên nhiên, do đó thường thấy trong đất nước, không khí Nó có khả năng gây các bệnh nhiễm khuẩn đường

tiểu, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, tiêu chảy và viêm đường mật E.coli O157:H7 thuộc dòng E.coli, được xem là một trong những vi sinh vật gây bệnh quan trọng nhất

trong thực phẩm (Griffin và Tauxe, 1991; Buchanan và Doly, 1997) Dòng O157:H7 này sản sinh ra nhiều loại độc tố trong đường ruột, và gây ra những tác hại nghiêm trọng như chảy máu ruột hay hội chứng dung huyết – suy thận, thậm chí gây chết, đặc biệt là ở trẻ

em (Rowe và cộng sự, 1991) E.coli rất dễ nhiễm vào thịt bò xay, sữa nguyên liệu và thịt

gà, do đó việc kiểm soát những loài gây bệnh này là hết sức quan trọng trong sản xuất và chế biến thực phẩm

Salmonella cũng là một loài vi sinh vật gây bệnh nhiễm vào thực phẩm Bệnh

nhiểm khuẩn do Salmonella vẫn đang là mối nguy lớn đối với con người, nó có thể trở thành một dịch bệnh ở các nước đã và đang phát triển Do đó ở Mỹ, hàng năm người ta

tiến hành khoảng 5 triệu thí nghiệm chỉ để phân tích và dò tìm Salmonella

Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm vẫn là mối quan tâm lớn Các phương pháp cổ điển như phản ứng chuỗi polymerase (PCR), đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch, hay phương pháp miễn dịch học là những phương pháp cổ điển được dùng rộng rãi nhất để phân tích vi sinh vật gây bệnh Phương pháp PCR tuy thời gian phân tích ngắn hơn những phương pháp khác (chỉ khoảnh 5 – 24h) nhưng nó không thể phân biệt được tế bào vi khuẩn đó còn sống hay không do DNA vẫn tồn tại ngay cả khi vi khuẩn chết Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp cổ điển nhất để định tính vi sinh vật, nhưng lại rất