Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn agrobacterium tu mefaciens

Từ những nghiên cứu cơ bản trong những năm 70-80 của thế kỷ trước, con người đã bước đầu tạo ra được các giống cây trồng chu yên gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chông chịu sâ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TR ỜNGĐẠIHỌCS PHẠM HA NỘI 2

HOÀNG THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU XÂY DỤNG HỆ THốNG TÁI SINH VÀ B

Ớc ĐẦU CHUYỂN GEN CHỈ THỊ VÀO CÂY KHOAI

TÂY THÔNG QUA VI KHUAN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VÃN THẠC sĩ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2010

Đê hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê

Hu y Hàm, Viện trưởng Viện Di tru yền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trọng điêm Công nghệ Te bào thực vật, Viện Di tru yền Nông nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Lý Thu là người thầy đă tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự đào tạo và giúp đỡ nhiệt tình của các giáo viên Bộ môn sinh - Trường đại học sư phạm Hà Nội 2, những người thầy đã dạy tôi trong suốt quá trình học tập để tôi hoàn thành chương trình các môn học cao học

Đông thời tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thê cán bộ khoa học của Phòng Thí nghiệm trọng điêm Công nghệ Te bào thực vật, Viện Di tru yền Nông nghiệp Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình tôi đã luôn luôn bên tôi, quan tâm

và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp và bạn bè đã dành cho tôi

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với nhừng sự giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 20 ỉ 0

Học viên

Hoàng Thị Thủ y

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010 Tác giả

Hoàng Thị Thủ y

L ỜI CAM ĐOAN iii

M ỤC L ỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆ U, CÁC CHỮ V IẾ T T ẮT vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆ U, CÁC CHỮ V IẾ T T ẮT vii

DANH MỤC CÁC B ẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

M Ở ĐẦU 1

Ch ưo ’ng 1 4

T ỔNG QUAN T ÀI L IỆ U 4

1 1 M ộ t số đặ c đ i ếm s inh họ c của cây kh oa i tây 4

1.1.1 Hệ thống phân loại cây khoai tây 4

1.1.2 Đặc điêm hình thái 4

1 2 Nh ân g iố ng bằ ng nu ôi cấy mô tế bà o 5

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 6

1.2.2 Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật 7

1.2.3 Tái sinh cây khoai tây 8

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cay in vitro 8

1 3 Cơ s ở kh oa h ọc củ a cô ng n g hệ ch uy ển gen vào th ực vậ t 1 1 1.3.1 Các phương pháp chuyến gen vào thực vật 11

1.3.2 Hệ thống vector chuyển gen 21

1 4 T ìn h hìn h ng h iên cứu tron g và ng oà i n ưó c 2 3 1.4.1 Các nghiên cứu sản xuất, nhân giong khoai tây 23

1.4.2 Một số thành tựu về cây trồng biến đối gen 2 5 Chu’O’ng 2 29

V ẬT L IỆ U, NỘI DUNG V À PHƯ ƠNG PHÁP NGHI Ê N cứu 2 9

2 1 Vậ t liệu ng hiên cứu 2 9

2.1.1 Vật liệu thực vật 2 9 2.2.2 Vật liệu di truyền 2 9

2 2 Nộ i d un g ng hiên cứu 3 0

2.2.1 Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi 30

2.2.2 Nghiên cứu tải sinh chồi 30

2 3 Ph ươ ng phá p n gh iên cứu 3 1 2.3.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 31

2.3.2 Phương pháp chuân bị mâu thực vật 32

2.3.3 Phương pháp chuân bị dịch vi khuân 32

2.3.4 Phương pháp chuyên gen 33

2.3.5 Môi trường nuôi cấy 34

2.3.6 Phương pháp đánh giá biêu hiện gen gus tạm thời 35

2 4 B ố trí th í ng hiệm 3 5 2.4.1 Nghiên cứu xây dựng hệ thong tái sinh 35

2.4.2 Nghiên cửu chuyến gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium tumefaciens 37

2 5 Cá c ch ỉ tiêu đ án h giá 3 9 2 6 Xử lý s ố liệu 3 9 2 7 T h iết b ị ng hiên cứu 3 9 2 8 Địa đ iểm và th ời g ia n ngh ỉên cứu 3 9 KÉ T QUẢ NGHIÊ N cứu V À T HẢO L UẬN 4 0 3 1 Xâ y d ựn g q uy trìn h tạo ca llu s và tá is in h cây ở kho ai tây 4 0 3.1.1 Anh hưởng của các nên khoáng tới kha năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau ở cây khoai tây 40

3.1.2 Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus ở khoai tây 42

3.1.3 Anh hưởng của các loại xytokinỉn tới khả năng tạo callus ở khoai tây 46

3.1.4 Anh hưởng của xaccarozo' tới khả năng tạo callus ở khoai tây 49

3.1.5 Anh hưởng của Casein hydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus 52

3.1.6 Nghiên cứu tái sinh chồi 55

3 2 Ng hiên cứu ch uy ển g en và o kh oa i tâ y thô ng q ua Agrobacterium tumefaciens 5 6

3.2.1 Lựa chọn chủng vi khuân A tumefaciens thích hợp cho chuyên gen ở

giong khoai tây Atlantic 56 3.2.2 Lựa chọn vector thích hợp cho chuyến gen vào cây khoai tây thông

qua vi khuân A tumefaciens 59 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuân (OD 600nm ) lên tỉ lệ biêu

hiện tạm thời của gen gus 61 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ

biêu hiện tạm thời của gen gus 62 3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỷ lệ biếu hiện tạm thời của gen gus ở cây khoai tây Atlantic 63

KÉ T L UẬN V À ĐÈ NGHỊ 6 6

T ÀI LI Ệ U T HAM KHẢO 6 7

Ph ụ lụ cl: Th àn h p hầ n môi trườn g M S (M u ras h ig e a n d S koog s, 197 2 ) 7 3

Ph ụ lụ c 2 : Th àn h p hầ n mô i trườ ng N6 (Ch u và cộng s ự, 1975 ) 7 4

Ph ụ lụ c 3 : Mô i trưírng nu ô i cấy s ử dụ ng tro ng ngh iên cứu 7 6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIỂT TẮT

& cs và cộng sự

2,4D Dichlorophenoxy acetic acid

AS Acetos yringone

BAP 6- Benzyl amino purin

bar Gen mã hóa tông hợp phosphinothricin acetyl transferase ĐHST Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

GA Gibberellic Acid

gus Gen mã hóa tông hợp Ị3-glucuronidase

IAA p- Indole- Acetic Acid

Kinetin 6- furfuryl amino purin

LB Luria Bertani Medium

MS Murahige and Skoogs, (1962)

NAA Napthalene acetic acid

N6 Chu & cs, 1975

Bảng 3.1 Anh hưởng của các nên khoảng tới khả năng tạo callus từ mô lá cây

khoai tây 40

Bảng 3.2 Anh hưởng của các nên khoảng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân 41

cây khoai tây 41

Bảng 3.3 Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lả cây khoai tây 43

Bảng 3.4 Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 45

Bảng 3.6 Anh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 48

Bảng 3.8 Anh hưởng của xaccarozo’ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 51

Bảng 3.10 Anh hưởng của casein hydrolysate tới khả nàng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 54

Bảng 3.12 Lựa chọn chủng vi khuân thích hợp cho chuyên gen ở giông khoai tây Atlantic 56

Bảng 3.13 Lựa chọn vector thích hợp cho chuyên gen vào mầu lả 59

cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuân A tumefaciens 59

Bảng 3.14 Lựa chọn vector thích hợp cho chuyên gen vào đoạn thân 60

cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuân A tumefaciens 60

Bảng 3.15 Anh hưởng của mật độ vi khuân tới tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus ở cây khoai tây chuyên gen 61

Bảng 3.17 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở mâu khoai tây sau khi chuyên gen 64

Hình 1.1.Cẩu trúc Ti-plasmid 18

Hình 1.2 Cấu trúc đoạn T-DNA 18

Hình 1.3 Quá trình chuyên T-DNA vào tê bào thực vật 19

Hình 1.4 Sơ đô cảu trúc vector nhị thê 21

Hình 1.5 Sơ đo cấu trúc vector liên hợp 23

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIAl301 29

Hình 2.2 Cẩu trúc vectorp6d35S-GUS 30

Hình 3.1 Anh hưởng của các nên khoảng tới khảnăng tạo callus từ mô lả 41

cây khoai tây (1 Môi trường: N6; 2 Môi trường: MS) 41

Hình 3.2 Anh hưởng của các nên khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân khoai tây (3 Mỏi trường: N6; 4 Môi trường: MS) 42

Hình 3.3 Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lả cây khoai tây 44

CT1(1); CT9(2); CT(7) 44

Hình 3.4 Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây CT1(1); CT9(2); CT(6) 46

Hình 3.5 Anh hưởng của xytokinin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 48 Hình 3.6 Anh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 49

Hình 3.7 Anh hưởng của xaccarozcr tới khả năng tạo callus từ mâu lả cây khoai tây 51

Hình 3.8 Anh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 52

Hình 3.9 Anh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ mâu lả cây khoai tây 53

Hình 3.10 Anh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 54

Hinh3.ll Tái sinh chồi từ mâu callus tạo thành từ đoạn thân cây khoai tây

Attlantic 56 Hình 3.12 Biếu hiện tạm thời của gen gus trên mẫu lả khoai tây Atlantic sau khi lây

nhiêm với các chủng vi khuân A tumefaciens khác nhau 58 Hình 3.13 Biêu hiện tạm thời của gen gus trên đoạn thân khoai tây Atlantic sau khi

lây nhiêm với các chủng vi khuân A tumefaciens khác nhau 58 Hình 3.14 Lựa chọn vector chuyến gen thích hợp vào mẫu lả khoai tây

Atỉantic(AA39: p6d35S-GUS; AA43: pCAMBIA1301) 60 Hình 3.15 Lựa chọn vector chuyên gen thích hợp vào đoạn thân khoai tây Atlantic

(AA39: pCAMBỈA 1301; AA43: p6d35S-GUS) 60 Hình 3.16 Anh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus

lên mâu lá khoai tây 63 Hình 3.17 Anh hưởng của hàm lượng AS lên tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus ở

thân khoai tây 63 Hình 3.18 Anh hưởng của thời gian lây nhiêm lên tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus ở đoạn thân khoai tây 65

MỞ ĐÀU

1 Đặ t vấ n đ ề

Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm quan trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô Ớ một số nước, khoai tây được xem là thực phẩm chính hàng ngày mặc dù giá thành thấp nhưng có giá trị dinh dưỡng cao

Việt Nam, có thời kỳ coi khoai tây là nhóm cây lương thực có tầm quan trọng thứ

ba sau lúa và ngô Cây con được nhân giống in vitro thường được dùng đế sản xuất khoai tây giống phục vụ cho việc tạo củ in vitro [10] Hiện nay, nhiều cơ quan như Viện Khoa

học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Cây lương thực và Cây thực phâm, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Công ty Giống cây trồng Trung ương đã đầu tư cho việc nghiên cứu, sản xuất các giống khoai tây sạch bệnh, tu y nhiên cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có

hệ thống sản xuất, xác nhận giống và cung ứng giống khoai tây hoàn chỉnh [53]

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chúng ta đã chứng kiến các bước phát triên vượt bậc của công nghệ sinh học Từ những nghiên cứu cơ bản trong những năm 70-80 của thế kỷ trước, con người đã bước đầu tạo ra được các giống cây trồng chu yên gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chông chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, chịu hạn, mặn, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dường, tăng cường hoạt chất sinh học và ứng dụng trong sản xuất Một trong những phát triên hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyến gen đế sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tể như: kháng ngu yên, kháng thê, interferon, vaccine [35]

Hiện nay người ta đã thành công trong việc chu yên gen tông hợp vaccine ở thực vật như lúa, thuốc lá, khoai tây, cà rốt, rau diếp, chuối, cà chua [20], [32], [33], [34], [41], [45], [47], Các nghiên cứu đă cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chu yến gen là rất lớn, nó không những sẽ góp phần giảm rất đáng kê giá thành vaccine mà còn mở ra những triến vọng mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật cho mọi mặt của đời sống Cây

khoai tây là một trong những đối tượng thực vật có vai trò quan trọng trong thành công của lĩnh vực này

Việt Nam có khả năng phát triên mạnh cây khoai tây, nhất là ở vùng đồng bằng Bắc

Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc trung Bộ và Tây Ngu yên, ước tính, ít nhất có khoảng 200.000

ha đất có thế trồng được khoai tây Tu y nhiên trong những năm gần đây, diện tích trồng khoai tây chỉ dao động trong khoảng 30.000-35.000 ha với năng suất bình quân khoảng từ 10-11 tấn/ha Một trong những ngu yên nhân chủ yếu dẫn đến năng suất thấp và diện tích trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt Củ giống trồng phổ biến là loại củ giống chất lượng thấp (tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao, già sinh lý và độ thuần chủng thấp) [53]

Xu ấ t p há t từ th ực tế trên , ch ú ng tô i đă tiến hàn h đề tà i:“ Nghiên cứu xây

dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyến gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuân Agrobacterium tumefaciens“

• Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình biến nạp gen vào cây

khoai tây thông qua A tumefacines như: Chủng vi khuân Agrobcicterium thích hợp cho

biến nạp gen, mật độ vi khuân, thời gian lây nhiễm, AS

4 Ý ng h ĩa kh oa h ọc và th ực tiễn củ a đ ề tà i

*Ý nghĩa khoa học

Ket quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tái sinh, khả

năng tiếp nhận gen từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số giống khoai tây

* Ỷ nghĩa thực tiên

Là cơ sở đê áp dụng chu yên gen quan tâm vào cây khoai tây nhăm tạo ra các giống khoai tây biến đôi gen

5 Ph ưo ng p há p ng h iên cứu

■ Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

(theo qu y trình của Yee shirley và cộng sự, 2001)

■ Phương pháp chu yển gen (theo qu y trình của De Block, 1988)

■ Phươ ng phá p đá nh g iá biếu hiện g en g us tạ m

Ch ưo ng 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 M ộ t số đặ c đ iểm s inh họ c của cây kh oa i tây

1.1.1 Hệ thống phân loại cây khoai tây

Khoai tây - Solanum tuberosum L., thuộc họ Cà - Solanaceae

Giới ựegnum): ae Plant

và cũng có chức năng giống các rễ khác

Rễ khoai tây phát triển mạnh ở thời kỳ ra hoa (ở dưới mặt đất lúc này đã hình thành

củ và củ bắt đầu lớn lên)

b) Thân

Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo dích dắc, có 3-4 cạnh, cao trung bình

từ 40-70 cm đến 1-1,2 m Phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà chiều cao cây có thê khác nhau Thân thường có màu xanh hoặc xanh nhạt

hay đậm, đôi khi có màu phớt hồng hoặc tím tu ỳ thuộc vào từng giống Trên thân có lớp lông tơ mềm (khi cây còn non) cứng dần và rụng theo thời gian sinh trưởng

c) Lá

Lá khoai tây tương tự như lá cà chua nhưng khác một số điêm- thuộc lá phức tạp, bản lá to, có 3-7 đôi mọc đối xứng qua trục và 1 lá lẻ trên cùng thường lớn hơn được gọi là

lá chét đỉnh Lá khoai tây dài khoảng 10-15 cm, mặt lá phăng hoặc gợn sóng, lá bản to hơn

lá cà chua Màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiệnchăm sóc mà có thê màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt

d) Hoa

Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên 1 chùm hoa Nó thuộc loại hoa lường tính

và có cấu tạo 5:5:5; cuống ngắn Màu sắc hoa thường trắng, cũng có the là phớt hồng, hồng, tím hoặc màu đở phụ thuộc vào từng loại và giống

e) Quả

Quả thuộc loại quả mọng Hình dạng quả tròn hoặc trái xoan Khi chín, quả màu trắng bạc hoặc phớt hồng, mùi vị dễ chịu Quả có từ 2-3 ngăn, trong đó có chứa nhiều hạt (30-300 hạt)

f) Hạt

Hạt khoai tây có dạng hình dẹt, màu cà phê sáng hoặc màu đen.Khốilượng

1000 hạt khoảng 0,5 g Thời gian ngủ nghỉ hạt lâu

g) Củ

Củ là bộ phận làm thực phâm cho con người Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ được hình thành là do thân phát triển dưới mặt đất, trong điều kiện bóng tối Hình dạng củ khoai tây có thể tròn, elip, tròn dài đôi khi hình vuông Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống, có thê là màu trắng, trắng nhạt, vàng, vàng nhạt trên củ có nhiều mắt củ, nhưng phân bố không đều số lượng mắt củ nhiều hay ít tu ỳ thuộc vào từng giống Trên mắt củ có mi mắt và mắt Mi mắt dài hay ngắn, mắt nông hay sâu là do đặc tính

di tru yền của giống Trên mỗi mắt thường có 2-3 mầm ngủ và thường tập trung nhiều trên đỉnh củ [7]

1 2 Nh ân g iố ng bằ ng nu ôi cấy mô tế bà o

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.2.1.1 Tỉnh toàn năng của tế bào

Cơ sở nền tảng của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là học thu yết về tính toàn năng của

tế bào do nhà thực vật học người Đức Habcrland đưa ra vào năm 1902 Ke thừa quan điếm của ông, các nhà sinh học hiện đại cho rằng tất cả các tế bào cấu tạo nên cơ thê thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di tru yền đủ đê mã hoá hình thành một cơ thê, các nhà nghiên cứu cho rằng mỗi tế bào thực vật khi tách ra khỏi cơ thê nếu được nuôi trong điều kiện thích hợp thì có thế phát triển thành một cơ thế hoàn chỉnh Từ đó đến nay, rất nhiều các công trình nghiên cứu đã tạo ra được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay từ một phần của cơ quan Điều đó khẳng định tính toàn năng của tể bào thực vật là cơ

sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật [2], [5], [18]

1.2.1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan khác nhau, có chức năng khác nhau và được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tu y nhiên mọi tế bào đều bắt nguồn từ một tế bào hợp tử ban đầu Te bào hợp tử đầu tiên lúc đầu phân chia thành khối tế bào chưa chu yên hoá Các tế bào chưa chu yên hoá này tiếp tục phân chia và biến đổi thành các tế bào chu yên hoá đặc trưng cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau Đó là hiện tượng phân hoá tế bào Tuy nhiên, các tế bào chu yên hoá thành các tế bào chu yên biệt lại không mất hoàn toàn sự biến đổi của mình Trong những điều kiện thích hợp nhất định chúng có thế trở thành dạng tế bào chưa chu yên hoá Hiện tượn g này gọi là hiện tượng phản phân hoá tế bào [2], [5]

Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt động của các gen Trong một giai đoạn phát triên nhất định của cây, một số gen nào đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá đê cho ra một tính trạng biếu hiện mới Ngược lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tê bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triên của cơ thê thực vật được hài hoà

Sự hoạt hoá mô, cơ quan của cơ thê Khi tách riêng từng tê bào, hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [5]

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là kỹ thuật điều khiên sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa và sự phân hoá và phản phân hoá tế bào thực vật Đe điều khiến được phát sinh hình thái của tế bào, người ta bô sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật chính là auxin và xytokinin

Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ, hoặc callus) của mô nuôi cấy khác nhau Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/xytokinin thấp thì mô nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo callus [5], [18]

1.2.2 Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật

Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và phát sinh cây hoàn chỉnh đạt hiệu xuất cao là tiền đề quan trọng cho thí nghiệm chu yển gen Đối với mồi loài thực vật, nhất thiết phải nghiên cứu tối ưu hoá kỹ thuật nuôi cấy thích hợp Sau đây là các hướng tái sinh cây từ mô thực vật có thế được sử dụng đế biến nạp gen :

Nuôi cấy callus: Callus là khối tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di tru yền thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di tru yền cao Callus thu

được bằng nuôi cay in vitro tò các cơ quan của thực vật như thân, lá, rễ, hoa trong môi

trường dinh dưỡng có chứa chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin và điều kiện nuôi cấy thích hợp Callus có thế được du y trì liên tục trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chu yến định kỳ Callus khi cấy chu yến lên môi trường thích hợp có thế phát sinh chồi trực tiếp hoặc tạo phôi soma và nảy mầm thành cây hoàn chỉnh Đây là hệ thống nuôi cấy có th ể được sử dụng để biến nạp gen đạt hiệu quả cao Cây chu yên gen phát triển từ một tê bào callus không bị thê khảm [2],

Nuôi cấy tế bào hu yền phù: Là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi trường long Các tế bào này cũng được tạo ra từ callus có nguồn gốc từ thân, lá,

rễ, hoa phôi .Tu y nhiên trở ngại của phương pháp này cần thời gian nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây [52]

Nuôi cấy tế bào trần: Te bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối ngu yên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh được gọi là tế bào trần (protoplast) Các tế bào trần sau khi được nuôi cấy trên môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triên thành khối callus và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, ứng dụng có ý nghĩa nhất ở phương pháp này là tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp protoplast và úng dụng đê biến nạp gen [11]

Ngoài ra, hệ thống tái sinh cây thông qua tạo đa chồi từ mảnh lá hoặc đoạn thân không có chồi bên, cũng có thể được sử dụng để chu yển gen

1.2.3 Tái sinh cây khoai tây

Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem là mấu chốt qu yết định đến sự

thành công trong qu y trình tạo cây chu yên gen Nhiêu nhà nghiên cứu thực nghiệm đã thu được tế bào sống sót trên môi trường chọn lọc nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh Do vậy hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh được cây hoàn chỉnh là công việc quan trọng đầu tiên khi tiến hành biến nạp gen Một trong yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy và tái sinh cây như: Nguồn mẫu vật nuôi cấy, môi trường và điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng và các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc

Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tái sinh thành công cây khoai tây in

vitro từ các ngu yên liệu như thân, lá thông qua con đường nuôi cấy thu ỷ canh in vitro phục

vụ sản xuất củ bi khoai tây (Solanum tuberosum L.) và vi ghép in vitro cây cà chua

(Lycopersicum esculentum) và cây khoai tây(Solanum tuberosum) [10]

ĩ.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cay in vitro

Môi trường nuôi cấy qu yết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro

Ngoài chức năng làm giá thê cho mẫu cấy, môi trường nuôi cấy còn có nhiệm vụ chính là cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để cho mẫu cấy tồn tại, phân hoá và phát triên vấn

đề đặt ra ở đây là khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thế

- Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dường cơ bản cần thiết cho sự sinh

trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cay in vitro Thành phần của môi

trường hoá học thay đôi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi câynhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2],

+ Nhóm ngu yên tố đa lượng: Ngu yên tố đa lượng là ngu yên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, bao gồm các ngu yên tố sau: N, p, K, s, Mg và Ca Các ngu yên

tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đôi chât của tế bào và có chức năng xây nên thành tế bào

+ Nhóm các ngu yên tố vi lượng: Ngu yên tố vi lượng là ngu yên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo tu y chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô Neu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu

Bo mô nuôi cấy phát triển callus rất nhanh, nhưng có hiệu xuất tái sinh thấp Hàm lượng của các ngu yên tố đa lượng và các ngu yên tố vilượng phụ thuộc vàotừng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy

+ Nguồn cacbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu, vì vậy buộc phải bô sung nguồn cacbon đế mẫu nuôi cấy có thê tông hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia Thông thường nguồn cacbon bô sung là đường xaccarozơ và glucozơ với liều lượng 20-30g/lít Guatheret (1959) cho thấy đối với phần lớn các mô, đường xaccarozơ và glucozơ là nguồn cacbon tốt nhất [13] Trong trường hợp cần thiết có thê thay thế bằng các loại đường khác như: maltoza, lactozo' hay fructozơ

+ Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cay in vitro vẫn có khả năng tự tổng

hợp được một so vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng và phát triên nhanh của chúng Các vitamin thường được sử dụng như: B] (thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biên đôi cacbon và tham gia vào thành phần tô hợp enzim xúc tác quá trình oxy hóa khử cacbon ở axit hữu cơ Nồng độ thường dùng từ 0,1-10 mg/1 B6

(piridoxin) tham gia vào thành phần các enzim khử cacbon và thay đôi vị trí nhóm amin trong các axit amin, nồng độ thường dùng

từ 0,1-1 mg/1 B5 (axit nicotinic) đi vào thành phần các enzim oxy hóa khử deh ydrrogenase xúc tác việc tách h ydro khỏi các axit hữu cơ Nồng độ thường dùng từ 0,5-1 mg/1 Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tông hợp thành tê bào thực vật [13]

+ Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của callus và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men Trong thành phần nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, myo-inositol và các chất hoạt tính auxin, các gluoxit của xytokinin

+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết sức

quan trọng đến kết quả nuôi cay in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình

nuôi cấy Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt

là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất điều hoà sinh trưởng đối với

từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì vậy, đê nuôi cay in vitro thành

công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thê để tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất là auxin, xytokinin và gibberellin

Các chất thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự dãn tế bào, sự hình thành rễ bất định và callus Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng các loại auxin là: IAA, NAA

và 2,4-D Các loại auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-0,5 mg/1 tu ỳ từng loài cây, từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy

Các chất thuộc nhóm xytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi Các chất thuộc nhóm này thường được sử dụng là: Kinetin và BAP Tỉ lệ giữa auxin và xytokinin qu y định sự biệt hoá của mô, tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành callus Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ auxin/xytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỷ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo callus

+ Độ pH của môi trường: Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy Thực tế đă chứng

minh pH thấp (pH<4,5) hoặc cao (pH>7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triên của mô

và tế bào nuôi cấy Cụ thê, nếu pH của môi trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đôi Fe, làm giảm hay ngừng hắn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy Thông thường độ pH dao động trong khoảng từ 5,5-6,5 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng cơ bản

và quan trọng nhất trong nuôi cay in vitro

+ Nhiệt độ: Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào

và các quá trình trao đổi chất trong mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của mô nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy cần được giừ ổn định ở 25±2°c

+ Ánh sáng: Các nghiên cứu đă cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng Đặc biệt thời gian chiếu sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 12-16 giờ/ngày Ánh sáng của đèn hu ỳnh quang với cường độ 2000-3000 Lux, tương đương với khoảng cách 30cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với

cường độ thấp là phù hợp với nuôi cay in vitro Nuôi cay callus có thế không cần ánh sáng

Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy Ánh sáng đở làm tăn g chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của callus Nguồn chiếu sáng bằng đèn Compact 3U có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây và cây hoa chuông [10]

1 3 Co ’ s ở kh oa họ c của cô ng ng h ệ ch uy ển g en vào th ực vậ t

1.3.1 Các phương pháp chuyên gen vào thực vật

1.3.1.1 Phương pháp chuyến gen trực tiếp

■ Chuyến gen nhờ kỹ thuật xung điện (electroporation)

Kỹ thuật này áp dụng cho việc chu yên gen vào tê bào trân Người ta chuân bị một huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tô hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao khoảng 200-600 v/cm trong khoảng thời gian ngắn 4-5 phần nghìn giây Ket quả làm cho màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời

có đường kính khoảng 30 [im, mà qua đó các DNA biến nạp ở bên ngoài có thê xâm nhập

vào trong tế bào Quá trình biến nạp được thực hiện trong các cuvet chu yên dụng hoặc các

“buồng xung điện” có các tấm cực bằng kim loại đặt cách nhau 1 - 4 mm Sau quá trình điện xung, tế bào trần được nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc

đe tách các tế bào trần đă thu nhận DNA Sau đó các tế bào trần này được nuôi cấy tái sinh cây và tiếp tục chọn lọc Các yếu tố chính tác động lên hiệu quả biến nạp bằng xung điện bao gồm: cường độ điện trường, điện dung, tính chất ion và nồng độ đệm, thời gian tiền xử

lý

■ Kỹ thuật chuyên gen nhờ silicon carbide

Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất Sợi silicon carbide có đường kính rất nhở khoảng 0,6 |im và dài khoảng 1 0 - 8 0 |Lim Khi lắc một hu yền phù tế bào đơn cùng plasmit tái tô hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lac vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập vào Sau đó các tế bào này được nuôi cấy tạo callus, tái sinh cây và chọn lọc đê tách ra những cây mang gen chu yên [14] Hu yền phù tế bào đơn thường được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy chuyến là giai đoạn tốt nhất đê thực hiện quy trình chu yên gen

Hiệu quả chu yên gen phụ thuộc vào kích thước sợi silicon carbide, thông sô vortex, dụng cụ chứa mẫu, ngu yên liệu thực vật và đặc điêm tế bào thực vật, đặc biệt là độ dày của thành tế bào

Ưu điếm của phương pháp này là đơn giản, chi phí thấp và áp dụng được cho nhiều loài thực vật Tu y nhiên nhược điểm lớn nhất là hiệu quả chu yến gen thấp và tổn thương gây ra cho tế bào có thể ảnh hưởng tới khả năng tái sinh sau này [46]

■ Chuyên gen bằng sủng băn gen

Chuyên gen bằng súng bắn gen là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là các phần tử kim loại nặng (wonfam hay vàng) có kích thước hiến vi (0,5 - 5 |Lim) có tỷ trọng cao

đê đạt được gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di tru yền của tế bào [14], [42]

ưu điêm:

- Có thê áp dụng hầu hết với các loại mô, tế bào

- Chuyên DNA ngoại lai vào tê bào nhanh

- Dễ sử dụng, qu y trình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thê được xử lý tron g thời gian ngắn

- Các vector được thiết kế đơn giản, không đòi hỏi các trình tự DNA cho đoạn

T-DNA như chu yển gen bang Agrobacterỉum

- Cần một lượng nhỏ DNA plasmid

- Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thế quan sát thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp

Nhược đỉêm:

- Nhiều bản sao được chu yến vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biêu hiện của các gen không bền vững

- Tần số biến nạp thấp, thường xu yên nhận được thế khảm

- Thiết bị đắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có thê mua được, giá thành vật tư đắt

■ Biến nạp bằng hoả chat PEG (polyethylene glycol)

Cũng giống như phương pháp chu yển gen bằng xung điện, phương pháp chu yển gen nhờ PEG thường được sử dụng để chu yển gen vào các tế bào trần

Ớ nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan nữa mà kết dính lại trên màng sinh chất Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của

Ca2 + hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chu yển nạp vào trong tế bào trần [14]

Ưu điêm:

- Hiệu quả chu yên gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công

- Có thê chu yến gen vào tế bào trần của bất kỳ loài thực vật nào

- Không đòi hởi thiết bị đắt tiền

Nhitợc điểm:

- Quá trình biến nạp khó điều khiên, số bản sao của gen trong tế bào biến nạp có thê lớn

- Tần số biến nạp thành công biến động giữa các thí nghiệm

- Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp của các tế bào trần, gây khó khăn cho việc phân tích biêu hiện của gen

- Đòi hởi một hệ thống tái sinh tế bào trần vốn còn gặp khó khăn ở nhiều loài cây trồng do phụ thuộc vào các yếu tố ngoài thí nghiệm như: loài, kiểu gen trong loài, phản ứng tổn thương và tái sinh

■ Phương pháp vi tiêm

Phương pháp chu yển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết bị hiển vi và máy vi nhu động để chu yển gen trực tiếp vào tế bào Kỹ thuật này có ưu điếm là: lượng DNA được biến nạp là tu ỳ ý và xác định, DNA được đưa vào đúng vị trí mong muốn, thậm trí là nhân tế bào Có thê áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như hạt phấn, phôi non mà các kỹ thuật khác không thê thực hiện đ- ược và có thế biến nạp vào các loài cây trồng, có thê thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm Tu y nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi lần biến nạp chỉ đưa được DNA vào một tế bào duy nhất và chỉ có the thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao với những thiết bị tương đối đắt tiền [14]

■ Phương pháp vĩ tiêm

Sử dụng kim tiêm có đường kính lớn hơn đường kính tế bào đê đưa DNA vào tế bào Các tế bào này bị phá vờ và DNA xâm nhập vào các tế bào bị tổn thương, sau đó được chu yến vào các tế bào bên cạnh Kỹ thuật này đơn giản nhưng hiệu quả chu yển gen thấp [24] Chuyển gen bằng vĩ tiêm thường áp dụng cho những đối tượng có bầu nhụy lớn, dễ thao tác

■ Phương pháp Agrolistic

Phương pháp Agrolistic kết hợp ưu điểm của hai phương pháp bắn gen và chu yến

gen thông qua Agrobacterium Trong phương pháp này, vector thiết kế có đoạn T-DNA

mang gen quan tâm được chuyến đồng thời với các gen mă hoá protein

virDlvà virD2 vào tế bào thực vật bằng kỹ thuật bắn gen, nhờ đó kích thích sự gắn kết của T-DNA trong hệ gen thực vật [44]

1.3.1.2 Phương pháp chuyên gen gián tìêp

■ Chuyên gen nhờ virus

Virus được sử dụng làm vector chu yên gen cho cây trồng do rất dễ thâm nhập và lây lan trong cơ thê thực vật Mặt khác trong câu tạo của virus cũng có mặt axit nucleic làm cơ

sở cho việc găn các gen cân chuyên vào Tu y nhiên đê trở thành vector chu yên gen thì virus cần có các tiêu chuấn sau:

- Genome virus là DNA chứ không phải RNA

- Có khả năng di chu yến từ tế bào này sang tế bào khác qua các lồ thành

tế

bào (plasmodest)

- Có khả năng tải được các đoạn DNA gắn vào

- Có phổ ký chủ rộng

- Không gây hại hoặc gây hại không đáng kể

Tu y nhiên hiện nay việc chu yển gen nhờ virus rất ít được sử dụng, do virus về ngu yên tắc không tru yền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây chu yến gen nhờ vi rút phải tiến hành bằng phương pháp vô tính Điều này không phải thực hiện được vói tất cả các loài cây Đây chính là một nhược điêm lớn của phương pháp chu yến gen bang virus

■ Chuyên gen thông qua vi khuân Agrobacterium

Từ những năm đầu của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện ra mộtloại

vi khuấn Agrobacterỉum có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật

Agrobacterium là một loại vi khuân gram âm Cả chủng A tumefaciens và A rhizogenes đều được sử dụng phổ biến trong chu yển gen vào thực vật Theo cơ chế tự

nhiên, hai loại này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết thực vật hai lá mầm, kết quả là gây ra những khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy root) [2], [15],

[19] Những tế bào của khối u hay lông rễ có thể phát triên in vitro khi vắng mặt bất cứ chất ĐHST thực vật nào Đây là do trong tế bào của các dạng hoang dại A tumefaciens và

A rhizogenes chứa một loại plasmid đặc biệt gọi

là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid) Ti-plasmid có kích thước khoảng 200 kb đã được xác định trình tự, chứa một đoạn DNA có chiều dài khoảng 25 kb gọi là T- DNA (transfer

DNA) có thê chu yên sang tê bào chủ theo cơ chê tự thiên [27] Do đó Agrobacterium là một

hệ thống chu yên gen tự nhiên Bằng cách cải biên (cắt bỏ các gen gây khối u hay lông rễ, cài xen vào vùng T-DNA những gen thích họp, gen này sẽ được chu yến và gắn vào hệ gen

tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này có ỷ nghĩa rât quan trọng cho sự ra đời của

phương pháp chu yên gen vào thực vật nhờ vi khuân A tumefaciens

Phương pháp chu yến gen nhờ Agrobacterium đă được áp dụng thành công trên nhiều

đối tượng cây trồng đặc biệt là cây hai lá mầm như: khoai tây, cà chua, thuốc lá [22], đậu tương, bông và một số cây hoà thảo như: lúa, ngô đà làm cho phương pháp chuyển gen

bang Agrobacterium trở nên hấp dẫn [13], [29], [31] Sự chu yến nạp nhờ vi khuẩn vào cây

một lá mầm khó thành công do cây một lá mầm như hoà thảo thường không có phản ứng với sự thương tôn vết thương không dẫn đến sự phản phân hoá tế bào lân cận Mặt khác, vi khuân khó gắn kết với thành tế bào, hoạt tính promoter T- DNA giảm, hoạt động của vùng vir bị ức chế

- Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid:

Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng A tumefaciens gây nhiễm và tồn tại

bền vững ở nhiệt độ dưới 30°c Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, tồn tại trong

tế bào như một đơn vị sao chóp độc lập (hình 1.1) dài khoảng 200 kb và có trọng lượng phân tử bằng 3 - 5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn Phân tích di tru yền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phố biến nhất, có 4 vùng tương đồng, trong đó vùng T-DNA và vùng gây độc (vùng VIR), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid và chu yên nạp

Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA được chu yên từ vi khuân sang genom của cây chủ và tồn tại bền vững ở đó Tu y nhiên, vùng này không mã hoá những sản phấm trung gian cho quá trình chu yến T-DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u

nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thê vi khuân (gen chv)

Cảc gen gây khối u sân sinh cytokinin Tồng hợp opin

Hình 1.1.Cẩu trúc Ti-plasmid

- Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA:

Ket quả phân tích trình tự gen trên DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp gần như hoàn toàn dài khoảng 25 bp, gọi là đoạn biên (hình 1.2) Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chu yên T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật

T-Vùng gây khôi u (One)

T G G CGG A T AT A T A TG TG G TG T A A A C T G A CA G GA T A T AT GG CG GG T A A A C

H

Hình 1.2 Câu trúc đoạn T-DNA Ớ đoạn biên phải (Righ

boder-RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình

chu yến T-DNA Đoạn biên trái (Left bođer-LB) gián tiếp tham gia vào quá trình

chu yến T-DNA và là dấu hiệu đê quá trình này kết thúc bình thường [7], [41]

ơ Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật là một

đoạn DNA liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một

đoạn gen liên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mă hoá

những enzym cần thiết cho quá trình sinh tống hợp opin; (2) Các gen gây khối u

như tmsl, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

auxin và cytokinin [30]

- Cơ chế phân tử của chu yên gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào ở cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất của phenol như:

Acetos yringon, h ydroxy-acetos yringon Dưới tác dụng dẫn dụ của các hợp chất này, A

tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào cây chủ Protein VirA nằm trên thành tế bào

vi khuấn Agrobacterỉum sẽ nhận biết sự có mặt và tương tác vói các phân tử acetosyringon

Tiếp đến VirA sẽ phosphoryl hoá protein VirG làm cho VirG trở thành dạng hoạt động Đen

lượt VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác như virB, virC, vỉrD và virE cũng như tăng cường mức độ phiên mã của gen virG bằng cách tương tác với trình tự điều hoà của VIR

box Sợi dưới của T-DNA bị cắt ở vị trí giữa nucleotid thứ 3 và 4 của trình tự biên nhờ hoạt động của VirDl/VirD2 endonuclease [38] Đồng thời với quá trình cắt là quá trình tổng hợp mới sợi thay thế cho sợi bị cắt Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T, sợi T được chu yến sang tế bào thực vật với đầu 5’ đi trước [50] Đầu 5’ của sợi T được liên kết đồng hoá trị với protein VirD2 ở vị trí axit amin tyrosine 29 [27]

Trong quá trình di chu yên, protein VirE2 găn với sợi T tạo thành phức hợp T dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác động của các enzyme thuỷ phân và các enzyme endonuclease có trong dịch bào của tế bào cây chủ Protein VirB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khuấn và tế bào cây chủ giúp cho sợi T có thế được vận chu yến sang tế bào cây chủ [50] Protein VirD2 gắn ở đầu 5’ của sợi T đóng vai trò là tín hiệu nhận biết trong hệ thống vận chu yên này [30] Sau khi T- DNA qua màng tế bào, chúng đi thắng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật ở

Tại đó nhờ sự điều khiên của gen thực vật mà các gen trên T-DNA bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triên thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u [6], [49]

- Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua A tumefaciens

Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chu yên gen phụ thuộc vào một loạt các yếu

tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh hoàn chỉnh cây chu yến gen từ các tế bào và mô mang gen chu yến nạp Đối với phương pháp chu yến gen

thông qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi

khuẩn, các yếu tố liên quan đến thực vật và một số các yếu tố khác Các yếu tố liên quan đến vi khuân bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuân, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của

gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vector Các yếu tố liên quan đến thực

vật gồm: loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của các tế bào đích [14], [22]

Mật độ vi khuân cũng ảnh hưởng tới hiệu quả chu yên nạp T-DNA Theo Hiei và

cộng sự (1994) thì mật độ vi khuân Agrobacterium thích hợp nhât cho chu yên gen vào lúa

từ 1,0 X 106 đến 1,0 X 101 0 cfu/ml [29], mật độ này cũng đã được nhiều thử nghiệm thành công ở ngô [31]

Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào khả năng chuyển T-DNA của các gen vỉr Tăng khả năng biêu hiện của các gen vir đạt được bằng cách gây tiền cảm ứng vi khuấn với

hợp chat phenol như acetosyringone (AS) Tiền xử lý trong môi trường chứa AS đă làm tăng tần suất biến nạp gen ở các cây thuốc lá Bố sung AS vào môi trường nuôi cộng sinh

cũng ảnh hưởng tới hiệu quả chu yến gen thông qua Agrobacterium

Ngoài ra pH của môi trường lây nhiễm cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự chu yến nạp

T-DNA vào tế bào thực vật Khả năng cảm ứng gen vir tăng khi giá trị pH dao động từ 5,2 -

5,8

Nhiệt độ thích hợp cho chuyên nạp T-DNA phụ thuộc vào loài và mô thực vật Đối với lá cây thuốc lá thì nhiệt độ thích hợp là 22 c Hiệu quả chu yển gen vào

ngô thu được ở nhiệt độ 20°c cao hơn ở 23°c khi sử dụng vector nhị thể [26], còn nhiệt độ thích hợp cho chu yển gen vào hu yền phù ở lúa là 23 - 25°c và ở ngô là 23°c [26],

1.3.2 Hệ thong vector chuyển gen

1.3.2.1 Hệ vector nhị thể

Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng

T-DNA mà vẫn điều khiến được sự chu yên và xâm nhập của T-T-DNA vào hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thê trong đó vùng T-DNA và

vùng vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng/4 tumefaciens

Đoạn khời dộng Gen quan tâm

Vùng khan dầu sao chép

Hình 1.4 Sơ đồ câu trúc vector nhị thê

Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector nhị thê:

(1) Vector chu yến gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phố vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm:

- Các đơn vị sao chép để DNA plasmid có thể tự nhân lên trong cả E coli và

Agrobacterium

- Các gen chọn lọc, gen chỉ thị

- Vùng đa nhân dòng nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải đế chèn gen mong muốn

(2) Vector bô trợ: năm trong A tumefaciens, với toàn bộ vùng vir được giữ lại nhưng

loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và biên phải, biên trái Plasmid này được

cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triên thành khối U, nhưng vẫn du y trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật

Hai cấu trúc này cùng được đưa vào Agrobacterium, khi các gen trên vector bô trợ

hoạt động thì các sản phâm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chu yến gen dẫn đến việc chu yến đoạn T-DNA sang tế bào thực vật

Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thê không bền vững trong E

coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động Tu y nhiên, vector nhị thê có một số ưu điểm như:

- Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid

- Kích thước vector khá nhỏ

Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chu yển gen từ E coli sang A tumefaciens đã tăng lên

Hiện nay, vector nhị thê được sử dụng rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyến gen [6J

1.3.2.2 Hệ vector liên hợp

Vector liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giừa vùng tương đồng nằm

trên plasmid vi khuấn (như vector của E coli) với vùng T-DNA trên Ti- plasmid của A

tumefaciens Trong đó, người ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng mã hoá chức năng gây khối

u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid (hình 1.5)

Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:

(1) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kanamycin của vi khuẩn

(2) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và được sử dụng

đê bô trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước lớn và thiêu vùng MCS)

Chúng được nhân lên trong E coli và chu yên sang A tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp

Do không thế sao chép trong A tumefaciens nên chúng mang những đoạn tương đồng với

T-DNA

(3) Vector trợ giúp: tồn tại trong E coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di động (mob) và gen chu yên (tra) giúp cho quá trình tiêp hợp và chu yên vào A tumefaciens [48],

1 4 T ìn h hìn h ng h iên cứu tron g và ng oà ỉ nướ c

1.4.1 Các nghiên cứu sản xuất, nhân giống khoai tây

Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã và đang có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất và trong nghiên cứu phát triên khoa học công nghệ trên thế giới và Việt Nam

* Nghiên cứu trong nước:

Trong các giải pháp nhân giống khoai tây vô tính thì công nghệ nhân giống bằng

invitro có nhiều ưu thế Từ năm 1978, qua nghiên cứu thử nghiệm của nhiều nhà khoa học, của nhiều cơ quan ở nhiều vùng sinh thái, đến năm 1984 đã thành công ở vùng Đà Lạt Từ

năm 1984 đến nay, nông dân Đà Lạt trồng khoai tây bằng giống sản xuất từ in vitro, năng

suất bình quân 35-40 tấn/ha, cao tới 60 tấn/ha, bên vừng, song diện tích trồng khoai tây ở đây còn ít, khoảng 300-500 ha Công nghệ này còn đang được ứng dụng đê sản xuất vật liệu

bố mẹ đê sản xuất hạt khoai tây lai và bảo quản những nguồn gen quý của khoai tây Đây là công trình do Trung tâm Công nghệ Sinh học miền Nam chủ trì, Viện KHKTNNVN là cơ quan phối hợp [54]

Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Khoa học và Công nghệ - Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn áp dụng qu y trình trên diện tích 1 ha nhà lưới, thời gian 2007-

Hình 1.5 Sơ đô câu trúc vector liên hợp

2008 đã sản xuất được 700.000 tấn củ giống siêu nguyên chủng từ nuôi cấy mô Tỉnh tiếp tục phấn đấu sản xuất được 1.000 tấn giống xác nhận vào năm 2010, đáp ứng nhu cầu trồn g cho 60% diện tích khoai tây [54]

Từ việc ghép ngọn cây cà chua trên gốc cây khoai tây, Ngu yễn Thị Trang Nhã [53]

đă cho ra đời loại cây trồng mới vừa cho thu hoạch củ khoai tây lại vừa cho trái cà chua với năng suất cao, đồng thời hàm lượng các chất trong củ khoai tây cũng như quả cà chua đều cao hơn loại cây đơn (cây chưa ghép) Cụ thể, khi được trồng thử nghiệm trên đồng ruộng tại Đà Lạt, loại cây “hai trong một” này đã cho năng suất khá cao, bình quân đạt hơn 19 tấn

củ khoai tây/ha và hơn 38 tấn cà chua/ha/vụ trên cùng diện tích, trong khi hàm lượng các chất trong củ và quả như vitamin c trong cà chua ghép đạt 8,77% (cà chua thường trồng đối chứng là 3,53%), còn khoai tây ghép là 0,27% (khoai tây không ghép là 0,03%); tinh bột trong cà chua ghép là 0,02% (không ghép là 0,02%), khoai tây ghép là 2,04% (không ghép

là 1,66%) Việc ghép và trồng thành công không chỉ giúp tiết kiệm diện tích đất, công chăm sóc, phân bón mà còn mở ra nhiều triên vọng mới về cây giống kháng bệnh cho nông dân Đà Lạt

* Nghiên cứu ở nước ngoài:

Trong sản xuất giống khoai tây, điều mong muốn tốt nhất là: giống phải có độ sạch cao, ít sử dụng hóa chất độc hại cho môi trường và giống thương mại phải được sản xuất ra

từ giống gốc tạo ra bằng điều kiện nhân tạo Trên thế giới, việc sản xuất giống khoai tây sạch bệnh ngày càng được chú ý, cụ thể: Ớ Hungari 100% các vật liệu khởi đầu là từ nhân

giống in vitro Ở Ba Lan gần 100% các vật liệu khởi đầu từ nhân giống in vitro Ớ Đức, các nhà chọn tạo giống chịu trách nhiệm về sản xuất giống tiền gốc với mức độ 95% từ in vitro

Ở Hà Lan, việc sử dụng vật liệu in vitro đang tăng lên một cách vừng chắc Ở Hàn Quốc,

công nghệ sản xuất giống khoai tây sạch bệnh đã phát triên ở trình độ cao Giống khoai tâ y

sạch bệnh chủ yếu được sản xuất từ in vitro và công nghệ thủ y canh Năm 2001, diện tích

trồng khoai tây bằng nguồn giống khoai tây sạch bệnh chiếm khoảng 50% tông diện tích trồng khoai tây ở Hàn Quốc [54]

Các thành tựu trên đà cho thấy kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào đã và đang đóng góp quan trọng trong việc nhân nhanh, chọn tạo và cải thiện giống cây trồn g nông - lâm nghiệp Nhiều giống cây trồng có giá trị đang được úng dụng vào thực tiễn sản xuất và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân, các công ty ở nhiều quốc gia Trong tương lai gần, nhiều giống cây trồng chất lượng cao được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào sẽ thay thế dần các cây giống sản xuất từ phôi hạt, đặc biệt là các cây nông nghiệp

1.4.2 Một số thành tựu về cây trồng biến đối gen ĩ

4.2.1 Thành tựu về cây trồng biến đổi gen

Hiện nay, phần lớn những nghiên cứu về cây trồng biến đổi di tru yền (GMC) đều được tiến hành ở các nước phát triển, chủ yếu là Bắc Mỹ và Tây Âu Tại các nước công nghiệp, các công ty công nghệ sinh học đã đi đàu trong việc ứng dụng kỹ thuật biến đối gen vào cây trồng nông nghiệp Tu y nhiên, gần đây, nhiều nước đang phát triển cũng đã bắt đầu những nghiên cứu về công nghệ gen

Thử nghiệm ngoài đồng ruộng đầu tiên là cây thuốc lá biến đôi gen kháng thuốc diệt cỏ, được tiến hành ở Mỹ và Pháp năm 1986 Trong giai đoạn 1986 - 1997, bắt đầu thời điêm thương mại hoá cây trồng biến đôi gen Các thử nghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên đối tượng là 60 loại cây trồng Trong thời kỳ này, những loại cây trồng biến đổi gen được thử nghiệm là : Ngô, cà chua, đậu tương, cải dầu, khoai tây và bông với các đặc tính được quan tâm nhất như kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu và kháng virus Các cây chu yên gen đầu tiên được thương mại hoá trên thị trường Mỹ là cây cà chua chuyến gen Flavor Saver mang gen chín chậm

Năm 2009 có 25 nước canh tác các giống cây trồng biến đối gen đã được thương mại hóa và có 32 nước cho phép nhập khâu và sử dụng cây trông biên đôi gen làm lương thực và thức ăn chăn nuôi, nâng tông sô nước cho phép sử dụng cây trồng biến đôi gen trên toàn thế giới lên con số 57 nước Ưu tiên hàng đầu của CNSH trong giai đoạn 2010 - 2015

là phát triên và sử dụng hệ thông quản lý mới, phù hợp hơn, tiết kiệm thời gian và chi phí hơn Tiếp theo là tăng cường hồ trợ tài

chính, khoa học và chính sách cho các hoạt động nghiên cứu phát triên và ứng dụng cây trồng biến đôi gen trên toàn cầu

1.4.2.2 Các nghiên cứu chuyến gen vào cây khoai tây

a) Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 2007, Soto đã nghiên cứu biến nạp gen bar kháng thuốc diệt cỏ vào đoạn thân

cây khoai tây Theo phương pháp này hiệu quả biến nạp đạt 68%, chồi tái sinh hình thành sau 4-5 tuần nuôi cấy trong môi trường chọn lọc có bô sung 2 mg/1 phosphinothricin [43] Theo Gonzalez (2008), có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng đến quá trình biến nạp của khoai tây như ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng, ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy hay nồng độ AS Ông cho rằng, ở 28°c, nồng độ AS 200 uM cho hiệu quả biến nạp cao hơn so với nồng độ AS 400 uM Tu y nhiên ngược lại ở 25°c hiệu quả biến nạp như nhau ở hai nồng độ AS này [28]

Tô chức Dịch vụ nghiên cứu Nông nghiệp (ARS) của Bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ đà phát triên một dòng khoai tây mới kháng được tu yến trùng gây bệnh sưng rễ (Columbia root-knot nematode: CRN), một vi sinh vật gây thiệt hại hàng năm cho ngành khoai tây Hoa

Kỳ khoảng 40 triệu USD Tu yên trùng này phát triên ở vùng Tây Bắc Thái Bình Dương và một số vùng trồng khoai tây chủ lực ở Hoa Kỳ Người ta thường sử dụng hoá chất dạng xông hơi đê quản lỷ tu yến trùng Kiểm soát CRN bằng hoá chất khá hiệu quả, nhưng rất đắt tiền Người ta ước chừng người trồng khoai tây phải mất 20 triệu USD mỗi năm đế kiếm soát tu yến trùng Tính trạng kháng tuyến trùng CRN được quan sát từ giống khoai tâ y

hoang dại Solatium bulbocastanum Nhưng loài hoang dại và loài thuần hoá có bộ nhiễm sắc

thế khác nhau, không tương hợp nhau, do đó, không thể áp dung lai cổ điển để có con lai mong muốn Vì thế, các nhà khoa học đă áp dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần Họ tiến hành dung hợp tế bào trần của s bulbocastanum và giống khoai thuần, rồi tiến hành lai hồi

giao đe loại bỏ các tính trạng không mong muốn Các gen marker liên kết với gen kháng RMcl của giống khoai tây hoang dại đã được sử dụng đế xác

định của mức độ kháng sau khi lai Giống khoai tây mới này sẽ phải được khảo nghiệm trên đồng ruộng hai năm trước khi nó có thê trở thành giống thương mại

b) Tình hình nghiên cứu trong nước

Công nghệ sinh học đă làm nên nhiều điều kỳ diệu, góp phần tăng năng suất và đáp ứng nhu cầu của cuộc sống Chỉ tính riêng trong lĩnh vực nông nghiệp, nhiều giống cây trồng vật nuôi có giá trị đă được chọn tạo bằng công nghệ sinh học Nhiều gen quỷ như các gen qu y định năng suất, chất lượng, chống chịu đă được phân lập và chu yến gen vào cây trồng, vật nuôi tạo nên những giống lý tưởng Ở Việt Nam, nghiên cứu chu yến gen vào cây trồng đang đựơc tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng chủ yếu tại Viện công nghệ sinh học, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện sinh học nhiệt đới và Viện nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long

Trong lĩnh vực chu yển gen, do còn nhiều hạn chế về thiết bị, kỹ thuật nên các công trình về chu yến gen còn ít nhưng trong thời kỳ gần đây cũng thu được những thành công

bước đầu Năm 1994, Phan Tố Phượng và cộng sự đã chu yên gen qua Agrobacterium vào cây Arabỉdopsis Cùng năm đó tại thành phố Hồ Chí Minh, Ngu yễn Thị Liên Chi và cộng sự

đă chu yến thành công gen kháng kanamycin vào cây thuốc lá Năm 1995, Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự đã thu được những cây cà chua có khả năng kháng kanamycin với nồng độ 100 mg/1 và các mô lá, thân, rễ, đều có phản ứng mầu với X-Gluc biếu hiện sự có mặt của gen

gus Tiếp đó năm 1997 Trần Thị Phương Liên và Nông Văn Hải đă tiên hành nghiên cứu và

chu yên tố hợp gen GUS-BNG vào cây thuốc lá Đặng Trọng Lương và Ngu yễn Đức Doanh cũng đă sử dụng phương pháp chu yến gen gián tiếp đế đưa gen Cryla(c) vào một số giống

bắp cải và đã thu được những giống mới có giá trị kinh tế cao

Tại Viện di tru yền nông nghiệp, nhiều công trình nghiên cứu chu yển gen đã được tiến hành nhằm mục đích xây dựng qu y trình chu yên gen vào một số cây trồng quan trọng, làm cơ sở cho bước chu yến gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng Một số phòng thí nghiệm đã thu được thành công nhất định khi nghiên cứu và áp dụng thành công đế đưa các gen giá trị vào hàng loạt các cây trồng quan trọng như: lúa, cà chua, khoai tây, bắp cải, xúp

lơ

Ở Việt Nam cho đến nay chưa có nghiên cứu nào về chu yên gen vào khoai tây Ngu yên nhân là do chưa có văn bản qu y phạm về hệ thống tiêu chuân giống khoai tây của Việt Nam đê làm cơ sở cho việc sản xuất, kiêm định và xác nhận chất lượng giống khoai

tây; công nghệ bảo quản khoai tây giống cũ kỹ và thiếu thốn; hệ thống phòng nuôi cay in

vitro, phòng kiếm tra bệnh, hệ thống nhà lưới, địa điêm nhân giống còn chưa đáp ứng yêu

cầu Có lẽ, đây chính là lý do vì sao các dự án nông nghiệp công nghệ cao của nước ta thực hiện chậm chạp, thậm chí thất bại và chặng đường vươn tới nền nông nghiệp hiện đại vẫn còn xa vời

Ch ưo ng 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2 1 Vậ t liệu ng hiên cứu

(h ygromycin phospho transferase) do Viện Di tru yền nông nghiệp cung cấp Trong vùng

T-DNA có gen chỉ thị gus, gen này được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi đoạn ỉntron Catalase Đoạn gen khởi động (Promoter) của gen gus

là CaMV35S, đoạn kết thúc là chuỗi NOS polyA Chỉ thị chọn lọc thực vật là gen hpt (gen

kháng hygromycin) được điều khiến bởi CaMV35S, kết thúc bởi chuỗi polyadenine (hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ câu trúc vectorpCAMBIAl301 Chủng AGL-1 mang vector nhị

phân p6d35S-GƠ5 (ký hiệu AA39) được sử

dụng trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của vector chuyên gen đến khả năng

biêu hiện gen gus tạm thời ở khoai tây Vector này cũng mang gen chỉ thị gus, được

điều khiên bởi promoter ưbiquitin (ưbi), và gen chỉ thị chọn lọc hpt được điều khiển bàng

promoter p6 d35 S-GUS (hình 2.2)

Hình 2.2 Cấu trúc vectorp6d35S-GUS

2 2 Nộ i d un g ng hiên cứu

2.2.1 Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi

- Đánh giá ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng taọ callus từ các dạng mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của Casein h ydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

2.2.2 Nghiên cứu tái sinh chòi