NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ HOÀN KIẾM, HÀ NỘI

Tên đề tài Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội 2.. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc hữu đồ

đại học quốc gia hà nội VIệN VI SINH VậT Và CÔNG NGHệ sinh học

-o0o -

BÁO CÁO ĐỀ TÀI ĐẶC BIỆT CẤP ĐHQG

đề tài nghiên cứu khoa học 2007-2008

NGHIấN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI

ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ

HOÀN KIẾM, HÀ NỘI

Mó số: QG.07.24

Chủ trì đề tài : Nguyễn Thị Hoài Hà

Hà nội - 2008

BÁO CÁO TÓM TẮT

1 Tên đề tài

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một

số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội

2 Các thành viên tham gia đề tài

3 Tóm tắt tổng quan của đề tài

Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận Hồ Hoàn Kiếm một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm Chất lượng nước thay đổi dẫn tới sự phát triển thường xuyên và không bình thường của vi khuẩn lam, làm biến đổi cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở

hồ Hoàn Kiếm đã được cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trường cho khu

microcystin Microcystin là chất ức chế đối với enzyme protein phosphatases (nhóm PP1 và PP2A) [30] Độc tố cũng gây ảnh hưởng xấu lên hai loại protein serine và threonin phosphatases Đã có một số bài báo chứng minh hiện tượng nước

nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con người Microcystin thường tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dưới dạng tự do trong nước

Đã có không ít các công trình nghiên cứu hiện tượng nở hoa nước và giảm thiểu tác hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác

nhau Để bảo vệ môi trường nước hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc

điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội

4 Mục tiêu của đề tài

* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lưu giữ được các chủng vi khuẩn lam

Microcystis trong Bảo tang Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi

trường - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

* Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn

5 Tóm tắt nội dung nghiên cứu của đề tài

- Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nước hồ Hoàn Kiếm tại thời điểm thu mẫu

- Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

của các chủng Microcystis

- Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn được

- Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc

- Hồ Hoàn Kiếm đang ở tình trạng ô nhiễm, hàm lượng COD, BOD vượt tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần Với giá trị NH4+ từ 0,129- 0,699 (mg/l), NO2- từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO3- từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO43- từ 0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lượng dinh dưỡng N, P khá cao

- Đã phân lập thuần khiết và nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi

Microcystis theo phương pháp của Shirai có cải tiến Môi trường thạch agarose B12

với tỷ lệ 0,4% là môi trường thích hợp nhất cho việc phân lập Microcystis

- Các chủng Microcystis đều sinh trưởng tốt trên môi trường Bold 3N với số

lượng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×106 tế bào/mlsau 15 đến 19 ngày nuôi cấy Đặc biệt chủng LT2 số lượng tế bào đạt cao nhất là 68,6 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 19

Trên môi trường J, các chủng Microcystis sinh trưởng số lượng tế bào của các

chủng đạt từ 40,42 – 76,46 ×106 tế bào/mlsau 15 đến 19 ngày nuôi cấy Trong đó chủng LT2 vẫn phát triển với số lượng tế bào đạt cao nhất 76,46 × 106

tế bào/mlsau ngày thứ 19 Trên môi trường B12, số lượng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×106 tế bào/mlsau 12 đến 15 ngày nuôi cấy Ở môi trường này chủng LT8 phát triển với mật độ tế bào đạt cao nhất 54,78 ×106

tế bào/ml sau ngày thứ 15

- Có 7 loại axít béo không no dạng C15, C17 và C19 trong tế bào 2 chủng

Microcystis LT2 và LT8 trong đó thành phần axit palmitic (C16H32O2) chiếm lượng lớn nhất với 1,302 μg/mg trọng lượng khô ở chủng LT2, chủng LT8 là 0,9683 μg/mg trọng lượng khô Kết quả cho thấy có sự sai khác nhau về lượng của 7 loại axit béo có ở trong tế bào 2 chủng LT2 và LT8

- Dựa vào phương pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học

và phương pháp phân loại hiện đại dựa trên phân tích trình tự rADN 16S, 2 chủng

vi khuẩn LT 2, LT8 được xác định là Microcystis aeruginosa, 2 chủng vi khuẩn nước N4 và N7 được xác định thuộc các loài Sphingomonas mali và Sphingomonas

asaccharolytica

- Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lượng độc tố MC – RR đạt lớn nhất là 512,8 ng/mg trọng lượng khô, độc tố MC – YR là 236,8 ng/mg và thấp nhất

là độc tố MC – LR: 114,25 ng/mg

- Hai chủng vi khuẩn Sphingomonas tuyển chọn được có khả phân giải

microcystin khá nhanh Ở nồng độ microcystin 3 µg/l thời gian bán phân giải là 1,34 giờ và với nồng độ 20µg/l, thời gian là 3,43 giờ

- Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của các chủng vi khuẩn

Sphingomonas mali N4 và Sphingomonas asaccharolytica N7 là 30°C Sau 7 ngày

sự phân giải gần như hoàn toàn là 100%

7 Các công trình công bố và sản phẩm đào tạo

 Công trình công bố

- Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà

2008 Đánh giá sự biến động số lượng theo mùa và theo tầng nước của vi khuẩn

lam Microcystis aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Đại học

Quốc gia Hà Nội Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 125 – 128

- Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà

2008 Tìm hiểu khả năng phân giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis trong hồ

Hoàn kiếm bằng vi khuẩn Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội Khoa học

Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 119 – 122

 Đào tạo 4 Cử nhân

- Bước đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân

giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội 2007 Khoá

luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Đặng Thị Kim Anh

- Bước đầu đánh giá khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam

Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn Sphingomonas 2008 Khoá luận tốt nghiệp

hệ đại học chính quy của Nguyễn Thị Hoài

- Khảo sát sự biến động theo mùa của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa ở

hồ Hoàn Kiếm và khả năng ức chế sinh trưởng của chúng bằng dịch chiết vỏ chuối,

vỏ quýt 2009 Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Lê Thị Trang

- Phân lập, nghiên cứu một số đặc tính của tảo độc Microcystis tách chiết độc

tố và thăm dò biện pháp xử lý.2009 Đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hữu Hiếu

- Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết độc tố microcystin

8 Tình hình sử dụng kinh phí của đề tài

ABSTRACT OF PROJECT

1 Title of the project: “Study on biological characteristis and capacity of

biodegradation toxin of some Microcystis isolated from Hoan Kiem Lake, Hanoi”

2 Coodinator: Nguyen Thi Hoai Ha

Member: Luu Thuy Giang

Nguyen Quang Huy

Le Trung Thuy Pham Thi Bich Dao Tran Thi Diep

3 Introduce

Hoan Kiem Lake is a famous place because of its historical and cultural value This is the habitat of valuable and rare species with endemicity and is also diversifying about the component of microalgae species In recent years, the socioeconomic developmental process caused a lot of influences on the lake ecosystem especially on water quality Mesotrophic situation of this lake resulted in the bloom water reducing specific microalgae species and concurrently increasing the species component and density of toxic algae Among toxic cyanobacterial

genera, Microcystis accounts for highest population (approximately 80% of total cyanobacterial strains that cause the bloom water) Microcystis aeruginosa Krutzing

is the most popular species This is a species which produces hepatotoxin, a type of liver toxin, composed from cyclic peptides called microcystin

They have effect on both animals and plants in waters microcystin usually accumulates in cells or releases to surrounding waters Thus the research on toxic

cyanobacteria Microcystis in Hoan Kiem lake, Hanoi and finding effective methods

to diminish their negative effects are essential In this report, we describe the

isolation, selection and classification location as well as biological characters of

some Microcystis strains from Hoan Kiem lake, as a basic for the next researches

4.The airm of project

- Isolation, identification, inoculation and maitainance of Microcystis strains

(blue-green, Cyanobacteria) at Microalgal Technology and Enviromental Biology

Lab, Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National of University,

- Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated

- Identification of Microcystis isolated

- Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC

- Capacity of toxin degradation by fresh bacteria

6 Results obtained

- Hoankiem lake is in pollution condition in the aspect of chemical evacuation such as COD and BOD concentration is over the corresponding ones in Vietnamese standard system, TCVN 4942-1995 (type B) 20 times Concentration of ammonium cation 0,129- 0,699 (mg/l), nitrite 0.012- 0,05 (mg/l), nitrate 0,047- 0,129 (mg/l), and phosphate 0,08- 0.64 (mg/l) that demonstrate concentration of nitrogen and phosphorus are relatively high

- Based on modified Shirai method, 10 pure strains of Microcystis were

isolated and cultured B12 medium (0.4% agarose) was selected as the most suitable

for Microcystis isolation

- All of Microcystis strains were grown well on the Bold 3N medium that the

numbers of cell from 68,6 ×106 cells/ml after 15-19 days of culture Especially, the

maximal cell number of LT2 strain increased to 68,6 ×106 cells/ml after 19th culture For J medium, the cell density was from 40,42 – 76,46 ×106 cells/ml after 15-19 days of culture in which LT2 was the best growth strain with the numbers of cell 76,46 ×106 cells/ml after 19th culture

- Analytical results of unsaturated fatty acid in Microcystis LT2 and LT8

strains showed different 7 types of C15, C17 and C19 in which Palmitic acid occupied as major part with 1,302 μg/mg and 0,9683 μg/mg (in dry weight) in LT2 and LT8, respectively The results indicated the diference in the concentration between 7 types of fatty acid

- Based on morphological and molecular taxonomy (for example comparision the sequence of 16S rDNA), LT2 and LT8 cyanobacterial strains were

identified as M aeruginosa; aquatic N4 and N7 bacterial strains were type of

Sphingomonas mali và Sphingomonas asaccharolytica.

- HPLC analysis showed the maximal concentration of MC-RR of 512,8 ng/mg in dry weight, 236,8 ng/mg of MC-YR and the lowest 114,25 ng/mg MC-

LR

- Sphingomonas strain was demonstrated to degrade microcystin in relatively

good level Time for degradation of a half of 3 µg/l and 20µg/l microcystin was 1,34 h and 3,43 h; respectively

- The suitable temperature for microcystin degradation by Sphingomonas

mali N4, Sphingomonas asaccharolytica N7 strains was at 30°C The degradation

was completely after 7 day

7 Publications and training activity

Publications

- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha

Investigate water quality and the composition of algae in some lakes in Hanoi

2008 Vietnam National University, Hanoi Journal Natural Science Vol 24, No 18,

pp 125 – 128

- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha

Study on toxin lysis in blue green algae by some strains bacteria isolated in Hoan Kiem lake 2008 Vietnam National University, Hanoi Journal Natural Science Vol

24, No 18, pp 119 – 122

Training activity

Master thesis completed in 2009

- Lysis of Microcystis and degradation of microcystin by aquatic bacteria

2007-2009 Tran Thi Diep‟s official undergraduate thesis

Bacheler thesis completed

- Isolation and screening of Microcystis toxin-degrading bacterial strains in

Hoankiem lake, Hanoi, 2007 Dang Thi Kim Anh‟s official undergraduate thesis

- Investigation of Microcystis aeruginosa microcystin degradation by

Sphingomonas 2008 Nguyen Thi Hoai ‟s official undergraduate thesis

- Study on the seasonal fluctuation of cyanobacterial Microcystis aeruginosa

in Hoankiem lake and growth restriction by banana skin and mandarin peel extracted solution, 2009 Le Thi Trang‟s official undergraduate thesis

- Isolation and study on Microcystis toxic cyanobacterial characteristics:

toxin extraction and treatment investigation, 2009 Nguyen Huu Hieu‟s official undergraduate thesis

8 Contributions of project:

- Here is the first report that described isolation, maintaince and preservation

Project Coodinator Institute of Microbiology and Biotechnology

Nguyen Thi Hoai Ha

Vietnam, National University, Hanoi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM 3

1.2 VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC 3

1.2.1 Vi khuẩn lam Microcystis 6

1.2.2 Độc tố microcystin của Microcystis 6

1.2.3 Cơ chế gây độc của microcystin 8

1.3 SỰ PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƯỚC Sphingomonas 9

1.3.1 Vi khuẩn Sphingomonas 9

1.3.2 Cơ chế phân giải độc tố microcystin của Sphingomonas 10

1.4 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘC TỐ TỚI NGƯỜI VÀ GIA SÚC 11

1.5 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LAM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 13

1.5.1 Trên thế giới 13

1.5.2 Ở Việt Nam 14

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

2.1.3 Máy móc, dụng cụ 17

2.1.4 Hóa chất 17

2.1.5 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Phương pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đánh giá chất lượng nước 18

2.2.2 Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis 18

2.2.2.1 Làm giàu mẫu 18

2.2.2.2 Phương pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa 18

2.2.3 Phân loại vi khuẩn lam Microcystis 19

2.2.3.1 Bằng phương pháp hình thái 19

2.2.3.2 Phương pháp tách ADN 19

2.2.3.3 Hóa phân loại phân tích thành phần acid béo 20

2.2.4 Xác định mật độ tế bào 21

2.2.5 Phương pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis 22

2.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng trên máy quang phổ 22

2.2.7 Các phương pháp sắc ký 22

2.2.7.1 Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) 23

2.2.7.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 23

2.2.8 Phương pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas 24

2.2.9 Phương pháp xác định khả năng phân giải microcystin 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU THỦY LÝ, THỦY HÓA NƯỚC HỒ HOÀN KIẾM 26

3.1.1 Nhiệt độ 26

3.1.2 pH 26

3.1.3 Các chất lơ lửng SS 26

3.1.4 Hàm lượng oxy hòa tan trong nước (DO- Dissolve oxygen) 27

3.1.5 Nhu cầu oxy hóa học (COD- Chemical oxygen demand) 27

3.1.6 Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD- Biochemical oxygen demand) 27

3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI Microcystis PHÂN LẬP ĐƯỢC 27

3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 27

3.2.2 Phân lập các khuẩn lạc của Microc ystis 29

3.2.3 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4, LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trên các môi trường khác nhau 32

3.2.4 Thành phần acid béo trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 35

3.2.5 Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 36

3.3 TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ MICROCYSTIN 38

3.3.1 Sắc ký bản mỏng (TLC) 38

3.3.2 Xác định hàm lượng microcystin trên máy quang phổ 38

3.3.3 Hàm lượng microcystin trên sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 39

3.4 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NƯỚC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MICROCYSTIN 44

3.4.1 Phân lập các chủng vi khuẩn nước 44

3.4.2 Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 2 chủng N4 và N7 47

3.5 KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA 2 CHỦNG Sphingomonas N4 VÀ N7 49

3.5.1 Hiệu quả phân giải microcystin của 2 chủng N4 và N7 49

3.5.2 Xác định điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của chủng Sphingomonas N4 và N7 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 1 62

PHỤ LỤC 2 65

PHỤ LỤC 3 66

PHỤ LỤC 4 77

PHỤ LỤC 5 78

PHỤ LỤC 6 1

DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG

Danh mục hình

Hình 1.1 Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội 3

Hình 1.2 Microcystis flos-aquae [62] 6

Hình 1.3 Microcystis aeruginosa [63] 6

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [54] 7

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [54] 7

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [54] 8

Hình 1.7 Hình dạng tế bào của Sphingomonas [57] 9

Hình 1.8 Con đường phân giải mycrocystin nhờ Sphingomonas [20] 11

Hình 2.1 Sơ đồ vị trí thu mẫu 16

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trường C 28

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trường Bold 3N 28

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trường B12 28

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trường J 28

Hình 3.5 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT1 29

Hình 3.6 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT2 29

Hình 3.7 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT3 30

Hình 3.8 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT4 30

Hình 3.9 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT5 30

Hình 3.10 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT6 30

Hình 3.11 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT7 31

Hình 3.12 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT8 31

Hình 3.13 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT9 31

Hình 3.14 Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT10 31

Hình 3.15 Sinh trưởng của các chủng Microcystis trong môi trường dịch thể Bold 3N 33

Hình 3.16 Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trường dịch thể Bold 3N 33

Hình 3.17 Sinh trưởng của các chủng Microcystis trong môi trường dịch thể J 34

Hình 3.18 Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trường dịch thể J 34

Hình 3.19 Sinh trưởng của các chủng Microcystis trong môi trường dịch thể B12 35 Hình 3.20 Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trường dịch thể B12 35

Hình 3.21 Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của 2 chủng LT2, LT8 và các loài có quan hệ họ hàng gần 37

Hình 3.22 Kết quả chạy TLC trước khi nhuộm nihyđrin 38

Hình 3.23 Kết quả chạy TLC sau khi nhuộm nihyđrin 38

Hình 3.24 Đồ thị đường chuẩn microcystin 39

Hình 3.25a Sắc ký đồ microcystin RR chuẩn 40

Hình 3.25b Sắc ký đồ microcystin YR chuẩn 40

Hình 3.25c Sắc ký đồ microcystin LR chuẩn 41

Hình 3.25d Sắc ký đồ microcystin của chủng LT2 41

Hình 3.25e Sắc ký đồ microcystin của chủng LT8 42

Hình 3.26 Nuôi cấy làm giàu các chủng vi khuẩn nước trên môi trường NA và M7 45

Hình 3.27 Cấy pha khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường NA 45

Hình 3.28 Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N4 và các loài có quan hệ họ hàng gần 48

Hình 3.29 Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N7 với các loài có quan hệ họ hàng gần 49

Hình 3.30 Thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau của 2 chủng N4, N7 50

Hình 3.31 Khả năng phân giải microcystin của vi khuẩn Sphingomonas N4 ở các nhiệt độ khác nhau 52

Hình 3.32 Khả năng phân giải của vi khuẩn Sphingomonas N7 ở nhiệt độ khác nhau 53

Danh mục bảng Bảng 1.1 Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16] 4

Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng Microcystis trên môi trường Bold3N 32

Bảng 3.2 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng Microcystis trên môi trường J 33

Bảng 3.3 Khả năng sinh trưởng của các chủng Microcystis trên môi trường B12 34

Bảng 3.4 Thành phần acid béo có trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 36

Bảng 3.5 Hàm lượng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8 43

Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn nước N4 và N7 46

Bảng 3.7 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng N4 và N7 46

Bảng 3.8 Hằng số tốc độ phân giải (K) và thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau 50

Bảng 3.9 Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N4 ở các nhiệt độ khác nhau 52

Bảng 3.10 Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N7 ở các nhiệt độ khác nhau 52

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Các chữ viết tắt Tên đầy đủ

Adda

3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acid MC-LR Leucine and arginine in the positions of X and Z of

microcystin MC-RR Arginine and arginine in the positions of X and Z of

TLC Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

HPLC Sắc ký lỏng cao áp (High permormance liquid

chromatography)

bp Cặp bazơ (Base pair)

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận Hồ Hoàn Kiếm một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm Chất lượng nước thay đổi dẫn tới sự phát triển thường xuyên và không bình thường của vi khuẩn lam, làm biến đổi cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở

hồ Hoàn Kiếm đã được cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trường cho khu

số bài báo chứng minh hiện tượng nước nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con người [16,17, 19, 20, 21] Microcystin thường tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dưới dạng tự do trong nước [16, 18, 35, 36, 42] Đã

có không ít các công trình nghiên cứu hiện tượng nở hoa nước và giảm thiểu tác hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác

nhau Để bảo vệ môi trường nước hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc

điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội”

Mục tiêu của đề tài

* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lưu giữ được các chủng vi khuẩn lam

Microcystis trong Bảo tàng Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi

trường - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

* Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn

Nội dung của đề tài

- Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nước hồ Hoàn Kiếm tại thời điểm thu mẫu

- Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

của các chủng Microcystis

- Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn được

- Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc

ký lỏng cao áp (HPLC)

- Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nước)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM

Hồ Hoàn Kiếm nằm ở trung tâm thủ đô Hà Nội, xưa là một đoạn của dòng sông hồng và còn có tên gọi khác là sông Nhị Diện tích hồ ước tính khoảng 12 hecta, chiều dài Nam - Bắc là 700m Chiều rộng Đông – Tây là 200m

Hình 1.1 Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội

Trong vài thập kỷ gần đây song song với quá trình phát triển kinh tế

xã hội của Hà Nội,do không có biện pháp ngăn chặn những tác động gây ô nhiễm làm biến đổi hệ sinh thái hồ, ảnh hưởng tới chất lượng nước hồ, hàm lượng N và P tăng lên đã dẫn tới

sự phát triển bùng nổ của vi khuẩn lam Hồ Hoàn Kiếm trở thành một trong những hồ phú dưỡng ở Hà Nội Trong hồ có sự phát triển mạnh mẽ của một số vi khuẩn lam thuộc chi

Microcystis, tạo thành những váng lớn nổi bồng bềnh che kín mặt một góc hồ Kết

thúc sự nở hoa, vi khuẩn lam chết hàng loạt gây mùi hôi lan xung quanh khu vực hồ [6]

1.2 VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC

Vi khuẩn lam là nhóm cơ thể cổ xưa nhất và mang nhiều tên gọi khác nhau trong quá trình nghiên cứu: thực vật phân cắt (Schizophyceae), tảo nhầy (Myxophyceae), tảo lam (Cyanophyta), vi khuẩn lam (Cyanobacteria) Từ năm

1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh Trong phân loại hiện đại, sinh vật chưa có cấu trúc nhân hoàn hảo (Procaryota) gồm

vi khuẩn lam và vi khuẩn, căn cứ vào đặc điểm cả hai đều không có nhân điển hình, chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể Vi khuẩn lam và vi khuẩn còn có những nét giống nhau như: màng tế bào đều cấu tạo từ murein, một loại glucozaminopeptit;

trong tế bào chất có nhiều riboxom; nhiều loài vi khuẩn và vi khuẩn lam đều có khả năng đồng hoá được N2 tự do; cả hai đều có thể hình thành các pha cyanophase và bacteriophase Vi khuẩn lam khác với các ngành tảo và thực vật bậc cao ở cấu trúc rất cổ xưa, tế bào không có cấu trúc nhân điển hình và không có các giai đoạn phân chia nhân Vi khuẩn lam phân bố khắp nơi trên trái đất, đa số sống trong nước ngọt, một số phân bố trong thuỷ vực nước mặn giàu chất hữu cơ hoặc trong nước lợ [7]

Độc tố vi khuẩn lam phổ biến nhất là độc tố gan (hepatotoxin) và độc tố thần kinh (neurotoxin) Một số loài vi khuẩn lam có chứa cả hai loại độc tố trên Các

quần thể nở hoa trong thuỷ vực nước ngọt chủ yếu thuộc về chi Microcystis thường

gây độc [8, 9], nhưng cũng có các chủng thuộc chi này không gây độc [29] Có ý kiến cho rằng độc tính không phải là tính trạng đặc hiệu ở những loài nhất định nào

đó, như với microcystin (hepatotoxin) thì độc tính của một chủng phụ thuộc vào điều kiện là chủng đó có mang gen mã hóa cho microcystin hay không [38, 39] Thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn lam cũng chỉ ra rằng sản sinh microcystin là tính trạng không đổi của một số chủng nhất định, hiếm khi bị tác động bởi các yếu tố môi trường [16, 49] Trong khi các điều kiện dẫn tới sự nở hoa của vi khuẩn lam đã được sáng tỏ, thì các yếu tố dẫn tới sự bùng nổ của các chủng gây độc so với các chủng không độc vẫn chưa được làm sáng tỏ [15, 20, 22, 34]

Bảng 1.1 Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16]

Loài Loại độc tố Nơi phát sinh

circinalis)

Microcystins Anh

Loài Loại độc tố Nơi phát sinh

Sự nghiên cứu vi khuẩn lam gây độc ở nhiều nước trên thế giới cho thấy có

khoảng 60% các mẫu vi khuẩn lam được điều tra mang độc tố (bảng 1.1) Tuy

nhiên, độc tố của hiện tượng nở hoa nước có thể thay đổi theo thời gian và không gian Nếu chứng minh được quần thể vi khuẩn lam trong một hồ nào đó có mang độc tính nhưng mật độ của chúng thấp thì không nhất thiết phải báo động cho cộng

đồng về những tác hại của chúng đối với sức khỏe con người và môi trường [16, 22,

43, 48, 50]

1.2.1 Vi khuẩn lam Microcystis

Trong số các loài vi khuẩn lam được xác định gây độc cho con người thì

Microcystis aeruginosa được xem là thường gặp nhất, là một trong những loài vi

khuẩn lam tham gia đáng kể hình thành hiện tượng nở hoa của nước Với đặc điểm

là tập đoàn bao gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ cỡ từ 2- 3 µm và mỗi tế bào đều chứa một không bào khí Chính sự tập hợp của hàng nghìn không bào khí định vị trong vô số các tế bào này giúp chúng nổi trên mặt nước và thu nhận được nguồn ánh sáng mặt trời, thông qua quá trình quang hợp tổng hợp sắc tố diệp lục tạo nên váng xanh trên mặt nước [25]

Hình 1.2 Microcystis flos-aquae [62]

Hình 1.3 Microcystis aeruginosa [63]

1.2.2 Độc tố microcystin của Microcystis

Microcystin [16, 40] là những độc tố vi khuẩn lam gặp phổ biến và rộng rãi

nhất Hợp chất này được tách ra đầu tiên từ loài vi khuẩn lam Microcystis

aeruginosa do vậy được gọi là microcystins Chúng là các heptapeptide mạch vòng

do có chứa 1 amino acid đặc hiệu (ADDA) chuỗi bên [24] Cho đến nay, đây là những dạng cấu trúc chỉ gặp ở microcystins và nodularin (một loại pentapeptide vòng của vi khuẩn lam ở trong nước lợ) Người ta đã biết khoảng 70 loại độc tố microcystins khác nhau Chúng khác nhau ở các nhóm metyl và 2 amino acid bên trong chuỗi Từ đó dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc bậc 4, tính độc cũng như các

đặc tính ưa nước hoặc kỵ nước Microcystin gắn protein phosphataza 1 và 2 là những loại protein quan trọng trong tế bào nhân thật bằng 1 liên kết đồng hóa trị không thuận nghịch Các kênh gắn acid mật được tìm thấy trong tế bào gan là con đường cho phép microcystin đi vào trong tế bào Đối với động vật có xương sống, liều lượng gây chết của microcystin sẽ làm cho gan bị hoại tử trong thời gian vài giờ hoặc vài ngày Có lẽ rằng các cấu trúc kỵ nước có thể đi xuyên qua 1 vài loại tế bào mà thậm chí không theo kênh acid mật

Ngoài ra, Fitzgeorge đã cung cấp bằng chứng cho rằng các MC-LR thường gặp có thể huỷ hoại cấu trúc của mô mũi Trong khi đó, độc tính gây ra do hấp thụ qua đường miệng thường ít gây ảnh hưởng hơn nếu so với tiêm vào dưới màng bụng trong các thí nghiệm mà người ta tiêm sẽ khiến chúng có tác dụng phá huỷ màng tế bào và làm gia tăng độc tính của anatoxin-a (một loại độc tố thần kinh) [49]

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [54]

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [54]

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [54]

Biến thể xảy ra chủ yếu tại các vị trí 1 và 2 Ví dụ, Microcystin-LR chứa leucine amino acid (L) và arginine (R) tại các vị trí 1 và 2 tương ứng Microcystin-

RR có arginine ở cả hai vị trí Các nghiên cứu cơ chế độc học tế bào đã cho biết microcystins ảnh hưởng đến các cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân và điều này giúp giải thích khả năng kích thích gây ung thư của chúng

1.2.3 Cơ chế gây độc của microcystin

Cơ chế gây độc của microcystin ở mức độ phân tử là ức chế các hepatocyte protein phosphatases P 1 (PP1) và 2A (PP2A) – hai enzyme điều chỉnh nhiều quá trình diễn ra trong tế bào động vật và thực vật Sự kìm hãm này dẫn tới sự siêu phosphoryl hóa của tế bào cytoskeratin Trong tế bào gan của người và động vật, điều này còn làm tăng sự phá vỡ các vi sợi hình thành nên khung tế bào Khi các vi sợi trở lên tách rời màng tế bào sẽ làm xuất hiện các bóng nước trong màng, đồng thời làm màng tế bào bị co lại, dịch tế bào thoát ra Đây được xem là nguyên nhân gây ra chảy máu gan, phá vỡ cấu trúc của gan thường thấy ở động vật Sự tiếp xúc lâu dài với nồng độ microcystin thấp trong nước uống là nhân tố gây ra ung thư gan

ở người [14] Các nghiên cứu cơ chế động học tế bào đã cho biết microcystin ảnh hưởng lớn đến cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân, điều này giúp giải thích khả năng kích thích gây ung thư của chúng Độc tố này cũng gây ảnh hưởng xấu đến hai loại enzyme là serin – photphatase và threonin – photphatase liên quan tới

sự điều hòa phát triển các tế bào nhân thật (Eukaryote), điều khiển sự hoạt động của

tế bào động thực vật trong quá trình phân chia, sinh trưởng, trao đổi chất, sao chép

ADN và sự biểu hiện các tính trạng có liên quan Điều đó cho thấy microcystin có thể ảnh hưởng đến các chức năng của tế bào nhân thật ở mức độ phân tử và từ đó có thể ảnh hưởng tới các động vật thủy sinh sống trong môi trường có sự tiếp xúc với độc tố này Microcystin thường tích lũy trong các tế bào vi khuẩn lam, khi nước nở hoa, độc tố dạng tan hoặc theo phương thức tự nhiên hoặc do sự điều khiển của tế

bào mà giải phóng vào nước Trong trường hợp nở hoa bởi Microcystis thì

microcystin ở dạng không hòa tan, khá bền vững, sẽ có thể tồn tại vài tuần trước khi

bị phân giải sinh học [10]

1.3 SỰ PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƯỚC

Sphingomonas

1.3.1 Vi khuẩn Sphingomonas

Hình 1.7 Hình dạng tế bào của

Sphingomonas [57]

Sphingomonas là một vi khuẩn Gram

âm, không bào tử, dị dưỡng, hoàn toàn hiếu khí và sinh sắc tố xanh hoặc vàng nhạt

Chúng có khả năng di động nhanh nhờ các lông roi và đa số có khả năng phát quang dưới ánh sáng cực tím

Sphingomonas là vi khuẩn hình que có kích thước 0.3-0.8 x 1.0-2.7µm, chúng có

màu vàng hoặc màu trắng Sphingomonas hoàn toàn không có lipopolysaccarid

(LPS) – chứa nội độc tố Thay vào đó, nó có một màng tế bào bao gồm có protein, photphoslipid, quinone để hô hấp và màng ngoài chứa glycosphingolipit (GSLs) GSLs giữ một vị trí giống như LPS trong các vi khuẩn Gram âm khác và xuất hiện với nhiều chức năng tương tự, như là một trở ngại đối với các thực thể kháng khuẩn

Cũng bởi phần hydrocarbon của một GSL ngắn hơn của LPS nên bề mặt tế bào của

Sphingomonas có nhiều hydrophobic hơn các vi khuẩn Gram âm khác Đây có thể

là một lí do giải thích cho việc loài vi khuẩn này có khả năng làm giảm các hydrocarbon thơm, đa hydrophobic và tính nhạy cảm của nó đối với việc ngăn các

kháng khuẩn hydrophobic Sphingomonas được tìm thấy phổ biến trong môi trường

tự nhiên bao gồm trong nước (nước ngọt và nước mặn), trên cạn, trong rễ cây, trong các mẫu xét nghiệm bệnh và nhiều nơi khác Sự phân bố rộng rãi của chúng trong môi trường là do chúng có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ, có thể sinh

trưởng và tồn tại dưới các điều kiện dinh dưỡng thấp Nhiều loài Sphingomonas

cũng được tìm thấy ở các nơi có chứa các hợp chất độc như PCBs, creozot, pentachlorophenoL, thuốc diệt cỏ…Các nghiên cứu cho thấy trong môi trường bị ô

nhiễm, Sphingomonas có khả năng sử dụng chất gây ô nhiễm làm nguồn năng

lượng để có thể cạnh tranh được với các sinh vật khác trong các môi trường khác nhau [20]

1.3.2 Cơ chế phân giải độc tố microcystin của Sphingomonas

Sphingomonas đã được David G Bourne chứng minh là chủng vi khuẩn có

chứa các enzyme tham gia vào con đường phân giải độc tố microcystin Sự phân giải độc tố này được xúc tác bởi enzyme nội bào [20]

Việc sử dụng các chất ức chế protease kinh điển cho phép: (1) phân loại các enzyme này thành các họ protease cơ bản và (2) tích lũy tức thời trong điều kiện invitro các sản phẩm trung gian từ sự phân hủy MC - LR Vị trí phân cắt ban đầu trên phân tử MC - LR bởi enzyme được xác định là liên kết peptides 3 - amino - 9 - methoxy - 2,6,8 - trimethyl - deca - 4,6 dienoic acid (Adda) - Arg

Hai sản phẩm phân giải trung gian được tìm thấy là MC - LR mạch thẳng:

NH2 - Adda - Glu(iso) -methyldehydroalanine - Ala - Leu - ß - methylaspartate - Arg - OH (chất A) và sản phẩm còn lại là tetrapeptide: NH2 - Adda – Glu (iso) - methyldehydroalanine - Ala -OH (chất B) là kết quả của sự làm giảm MC - LR nhờ hai enzyme trung gian

Chính hiện tượng mở vòng độc tố MC - LR nhờ enzyme microcystinase của

vi khuẩn khiến chất này trở nên không độc do đó giảm đáng kể tương tác với các protein phosphatase

Con đường phân hủy MC - LR bởi Sphingomonas được đề xuất như sau:

Hình 1.8 Con đường phân giải mycrocystin nhờ Sphingomonas [20]

1.4 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘC TỐ TỚI NGƯỜI VÀ GIA SÚC

Có rất nhiều nghiên cứu cho thấy động vật bị ngộ độc do uống nước có chứa

vi khuẩn lam gây độc Báo cáo đầu tiên vào năm 1800 về hiện trạng gia súc bị chết

do uống phải nước có chứa vi khuẩn lam gây độc Chất độc này gây hại lên đường bài tiết, gây dị ứng da, ảnh hưởng tới màng nhầy ruột hoặc làm con vật bị ốm Báo cáo tiếp theo về các phản ứng dị ứng qua da hoặc kích thích da nổi ngứa do nước

chứa các loài vi khuẩn lam khác nhau như Anabaena, Aphanizomerzon, Nodularia,

Oscillatoria, Gloeotrichia Các vận động viên khi tiến hành bơi, lội, người đi bơi

mặc áo tắm hoặc áo lặn đã giữ lại các tế bào vi khuẩn lam, do cọ sát mà các tế bào

bị vỡ ra và giải phóng độc tố, từ đó chất độc tác động lên da [16]

Vào năm 1959, ở Canada mặc dù đã có gia súc bị chết và được cảnh báo về nguồn nước sử dụng song người ta vẫn bơi trong một hồ có chứa nhiều vi khuẩn lam Kết quả là có 13 người bị ốm, đau đầu, đau cơ, ỉa chảy nặng Trong dịch tiết

của một bệnh nhân người ta đã phát hiện ra một số lượng lớn tế bào Microcystis spp., và một số đoạn sợi tảo của Anabaena circinalis [19]

Năm 1979, ở Úc để ngăn chặn sự nở hoa của Cylindropermopsis raciborskii

trong nguồn nước uống, người ta đã xử lý chúng bằng đồng sunfat Điều này đã làm cho độc tố trong tế bào được giải phóng gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng và làm 141 người phải nhập viện [34]

Năm 1988, ở Brazil tiếp sau trận lụt do vỡ con đập Itaparica thuộc bang Bahia, khoảng 2000 ca bệnh về đường tiêu hoá đã được báo cáo sau 42 ngày và có

88 người đã chết Các điều tra nguyên nhân sau đó cho biết có hàm lượng độc tố vi khuẩn lam rất cao [16]

Năm 1989, ở Anh có 10 trong số 20 lính đã bị ốm sau khi bơi tập trong nước

bị ô nhiễm bởi vi khuẩn lam Microcystis spp., đã phải nhập viện [17]

Năm 1993, ở Trung Quốc một số ca bệnh ung thư gan được chẩn đoán là có liên quan đến việc sử dụng nước uống trên bề mặt bị nhiễm nhiều vi khuẩn lam [16, 18]

Năm 1994, ở Thuỵ Điển do quản lý không tốt nguồn nước chưa được xử lý nhà máy đường, nên khi chảy ra nó hoà lẫn vào nước sông Điều này khiến loài vi

khuẩn lam Planktothrix agardhii đã phát triển mạnh tạo nên hiện tượng nở hoa

nước Kết quả phân tích cho thấy rằng loài này chứa độc tố microcystin Trong tổng

số 304 nông dân sử dụng nguồn nước này thì có 121 người, kể cả động vật nuôi của

họ đã bị tiêu chảy, viêm cơ [16, 18]

Năm 1995, ở Úc, kết quả điều tra với 852 bệnh nhân tiếp xúc với nước có chứa vi khuẩn lam cho thấy rằng sau 2 –7 ngày nhiều bệnh nhân bị mắc tiêu chảy, sốt dị ứng da… Ở Monte Hermosa (Achentina) vào tháng 11/1995 đã có 45 triệu

con ngao Mesoderma marcoides đã bị chết do sự nở hoa của tảo gây hại Cũng vào năm này ở Việt Nam, loài Noctiluca scintilans nở hoa ở khu vực vịnh Vân Phong –

Khánh Hoà vào tháng 5 và 6 đã làm chết 20 tấn tôm hùm với thiệt hại lên đến 6 tỷ đồng [5]

1.5 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LAM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.5.1 Trên thế giới

Những quan sát và phát hiện sớm nhất về vi tảo (trong đó có vi khuẩn lam)

đã được các nhà thực vật học mô tả Các nhà nghiên cứu cho rằng nhận thức của con người về sự nở hoa gây độc của vi khuẩn lam được biết đến từ thế kỷ 12 và thời gian gần đây họ đã cảnh báo các cư dân ở nhiều quốc gia như Trung quốc, Bắc Phi, Nam Phi về việc sử dụng nguồn nước tại các thủy vực có váng tảo màu xanh [2, 47, 48]

Các biện pháp phân giải độc tố microcystin đã được nghiên cứu bởi Harada, ông đã đưa ra các biện pháp làm giảm hàm lượng microcystin trong nước từ kết quả của các quá trình pha loãng, hấp thụ các hạt vật chất, sự phân giải phụ thuộc nhiệt

độ, pH, sự quang phân và sự phân giải sinh học [13] Năm 1997, Takenaka và Watanabe đã kiểm tra các loài vi khuẩn phân lập từ một hồ ở Nhật Bản và phát hiện

ra rằng thông qua hoạt động của enzyme alkalil protease, Pseudomunas aeruginosa

(Sphingomonas) có khả năng làm giảm MC – LR Đó là các loài có khả năng mở

vòng độc tố và tạo ra dạng mạch thẳng dẫn tới lượng độc tố giảm 160 lần Nhiều nghiên cứu về việc sử dụng ozon để giảm bớt hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam

đã chỉ ra: với tốc độ bơm ozon vào trong nước là 1gm O3 /m3 nước/giờ, hầu hết các

tế bào vi khuẩn có thể bị tiêu diệt trong 15 phút [8] Tương tự như vậy các nghiên cứu về tính ổn định của microcystin dưới tác động của tia UV cho thấy độc tố bị phân giải nhanh bởi tia UV ở bước sóng dài tương ứng với sự hấp thụ tối đa lượng độc tố [14]

Trong điều kiện tự nhiên, các vi sinh vật, đặc biệt là các vi khuẩn nước đóng vai trò quan trong trong việc phân giải độc tố không hòa tan mà được giải phóng vào nước Người ta đã chứng minh được rằng microcystin có thể bị phân giải bởi các vi sinh vật có trong hệ sinh thái thủy vực tự nhiên [12] Đặc biệt, sự phân giải

sinh học microcystin còn xảy ra nhanh hơn ở các thủy vực có sự nở hoa bởi vi khuẩn lam Thực tế cho thấy các biện pháp cơ học nhằm lọc, vớt bỏ tảo tiêu tốn nhiều thời gian, công sức lại không cho hiệu quả cao hoặc các biện pháp lý học, hóa học (dùng CuSO4, vôi, Al2(SO4)3, ferric chlorit…) thường không khả thi khi áp dụng đối với các thủy vực sử dụng cho mục đích sinh hoạt bởi một lượng hóa chất tồn dư [8] Nhiều nghiên cứu đã khẳng định tro của lúa mạch, gỗ mục và một số loại

lá đặc biệt là lá sồi có tác dụng ức chế một cách đáng kể sự sinh trưởng của vi khuẩn lam gây độc [15] Dịch chiết từ vỏ quýt và vỏ chuối lùn cũng có khả năng ức chế hiện tượng nước nở hoa bởi vi khuẩn lam [3]

nổ của loài Noctiluca scintilans liên quan đến hiện tượng phú dưỡng ở vịnh Văn

Phong – Khánh Hoà Nguyễn Thị Minh Huyền (1996) có những ghi nhận đầu tiên

về một số lòai tảo độc ở vùng biển Bạch Long Vĩ Chu Văn Thuộc (1998) nghiên cứu tảo biển độc hại ở vùng cửa sông ven biển miền bắc Việt Nam [2, 3, 4, 5, 6, 9]

Năm 1996-1999, đề tài quốc gia do Đặng Ngọc Thanh làm chủ trì đã được thực hiện với nội dung nghiên cứu về thành phần loài ở biển Việt Nam và một số vấn đề liên quan đến sinh thái tảo độc [6] Theo Trịnh Thị Thanh và Đặng Thị Sy tại một số đầm ao nuôi thả cá ở Thanh Trì, mặc dù ngành vi khuẩn lam (cyanobacteria)

có thành phần loài không lớn (khoảng 24 loài, chiếm khoảng 13%) nhưng thường đạt sinh khối cao vào tháng 6 và 7, đặc biệt tại các ao có sử dụng phân bắc làm nguồn thức ăn cho cá [6, 9] Kết quả điều tra nghiên cứu các hồ chứa và một số thuỷ

vực thuộc các tỉnh phía Bắc được tiến hành bởi Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (2006) cho thâý những loài tảo có tiềm năng độc gây nở hoa nước

thuộc về các chi Microcystis, Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria và

Gomphospheria [4] Theo Dương Đức Tiến (2001-2005) đã xác định trong hồ Hoàn

Kiếm và một số thuỷ vực miền Nam Việt Nam có các chi Microcystis,

Cylindrospermopsis, Anabaena, Oscillatoria, Lyngbya thuộc ngành vi khuẩn lam

(Cyanobacteria) chiếm đa số về thành phần loài gây nở hoa nước Trong đó có các

loài có khả năng gây độc như Microcystis aeruginosa, M viridis, M botrys, M

wesenbergii và Cylindrospermopsis raciborskii [9]

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm:

- Vi khuẩn lam Microcystis được phân lập từ hồ Hoàn Kiếm

- Vi khuẩn Sphingomonas được phân lập từ hồ Hoàn Kiếm

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm thu mẫu: Hồ Hoàn Kiếm

Thời gian tiến hành nghiên cứu: Từ tháng 1/2007 đến tháng 12/2008 tại phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi trường, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

Thời điểm thu mẫu: Thu mẫu vào hai đợt Đợt 1: 6/3/2007, Đợt 2: 8/5/2007

Vị trí các điểm thu mẫu: thu mẫu tại 6 điểm như trong hình sau

Hình 2.1 Sơ đồ vị trí thu mẫu

D1: Cửa cống hàng Khay D2: Đối diện ngân hàng Incombank – Lê Thái Tổ D3: Ngân hàng ANZ D4: Nhà hàng thủy tạ D5: Cửa cống đối diện tổng công

ty điện lực Việt Nam D6: Đền Ngọc Sơn

2.1.3 Máy móc, dụng cụ

Sử dụng máy móc và dụng cụ có tại phòng Công nghệ Tảo và Sinh học môi trường, các phòng thí nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc Gia

Trung tâm Công nghệ Môi trường và Phát triển bền vững- Đại học Khoa học

Tự nhiên

Kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản)

Kính lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)

Máy đo pH (Osi, Pháp)

Máy sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, HPLC

1100, Đức)

2.1.4 Hóa chất

Hóa chất dùng cho phân tích và thử nghiệm khi tiến hành đề tài gồm:

Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ

CH3COONa Merk, Đức Nihyđrin Merk, Đức Methanol Merk, Đức n- butanol Merk, Đức Isopropanol Merk, Đức Ethyl axetat Merk, Đức

10  Taq buffer dNTP mix 2.5mM

Taq polymeraza (5U)

2.1.5 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn

Nuôi vi khuẩn lam Microcystis trên 6 loại môi trường là Bold 3N, B12, J, BG11, C, MA (Phụ lục 1)

Nuôi cấy vi khuẩn Sphingomonas trên 2 môi trường NA và M7 (Phụ lục 2)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đánh giá chất lượng nước

- Điều tra thu mẫu theo quy phạm của Bộ Tài nguyên và Môi trường

- Các chỉ tiêu được phân tích dựa theo „Standard methods for the

examination of water and waste water‟ của tổ chức Y tế Mỹ (Phụ lục 3)

2.2.2 Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis

2.2.2.1 Làm giàu mẫu

Phương pháp phân lập Microcystis bước 1 làm giàu mẫu [31]

Quan sát nước nở hoa ở hồ Hoàn Kiếm ở thời điểm thu mẫu cho thấy loài

chủ yếu trong quần xã là Microcystis aeruginosa chiếm trên 80% Hút 1000 µl mẫu

nước hồ có các loài vi khuẩn lam khác nhau, cho vào ống Eppendorf, ly tâm 7000vòng/phút trong 10 phút và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0,05% nhằm mục đích loại bỏ bớt các loài tảo khác

Lớp dịch nổi bên trên là vi khuẩn lam, sau đó hút 100 µl dịch nổi bên trên cho vào nuôi cấy trong các bình tam giác dung tích 500 ml chứa 200 ml môi trường B12 Nuôi giữ trong điều kiện nhiệt độ 30oC dưới ánh sáng đèn neon với cường độ ánh sáng là 1500lux theo quang chu kỳ là 12 giờ chiếu sáng và 12 giờ tối Sau thời gian 3 tuần nuôi cấy, quan sát khả năng sinh trưởng của mẫu vi khuẩn lam đã được làm giàu bằng kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần

2.2.2.2 Phương pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa

Quy trình phân lập được tiến hành theo phương pháp của Shirai có cải tiến [31] Các tập đoàn vi khuẩn lam sau khi làm giàu được xác định dưới kính hiển vi là

các chủng thuộc chi Microcystis trong mẫu nước được ly tâm 10.000 vòng/phút

trong 15 phút nhằm tiếp tục loại bỏ các loài tảo khác Tập đoàn vi khuẩn lam nổi phía trên được hút ra, đặt vào đĩa petri và tách riêng rẽ từng tập đoàn ra dưới kính lúp Olympus Các tập đoàn đó được hút riêng vào từng ống Eppendorf, sau đó tiếp tục sử dụng máy vortex mẫu nhằm mục đích phân tách tập đoàn thành các tế bào riêng rẽ Pha loãng mẫu theo phương pháp của Bold và cấy trang trên các môi trường dinh dưỡng agaroza có nhiệt độ tạo gel cực thấp (type IX, Sigma) với nồng

độ 0,4%, các hộp đĩa thạch được quấn kín bằng paraphin và đặt dưới đèn neon với cường độ ánh sáng 1000 – 1500 lux ở nhiệt độ 30oC Sau thời gian từ 07 – 30 ngày, quan sát khuẩn lạc bằng kính lúp Olympus Những khuẩn lạc sạch sau khi mọc trên môi trường thạch agaroza được tách sang các lọ Penicillin chứa 5ml môi trường dịch thể Theo dõi sự phát triển của tế bào vi khuẩn lam, quy trình được tiến hành lặp đi lặp lại cho đến khi thu được các chủng thuần khiết

2.2.3 Phân loại vi khuẩn lam Microcystis

2.2.3.1 Bằng phương pháp hình thái

Các chủng Microcystis sau khi đã phân lập thuần khiết được quan sát dưới

kính hiển vi quang học Olympus có độ phóng đại 400-1000 lần để quan sát các đặc điểm hình thái và kích thước tế bào của chúng Để định loại, chúng tôi sử dụng các tài liệu chính sau:

- Phân loại thực vật học bậc thấp

- Phân loại Vi khuẩn lam ở Việt Nam [07]

- The on-line database of Cyanobacterial genera [27]

2.2.3.2 Phương pháp tách ADN

ADN được chiết xuất và tách từ sinh khối ướt theo phương pháp [44] Lấy 3 vòng que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuôi, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 8000 vòng trong15 phút và rửa 2 lần bằng 300µl dung dịch muối EDTA pH 8,0 (0,5M Na2EDTA, 0,15M NaCl) Sau đó tạo dịch huyền phù trở lại trong 200µl đệm 10 x

TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm, 1: 2) Bổ sung 10µl của

lyzozym (Sigma, 1mg/ml Lysozym), giữ ở 37oC trong nồi cách thuỷ trong 15 phút

Bổ sung dung dịch Tris-SDS (0,1M Tris-HCl pH 9,0 và 1% SDS) với thể tích bằng thể tích mẫu Dịch mẫu được giữ ở 60oC trong nồi cách thuỷ khoảng 10-30 phút

Sự tan tế bào được xác định bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự tăng độ nhớt tương ứng Dịch tan tế bào được làm lạnh trong đá trong 10 phút, bổ sung 150µl cloroform-isoamyl alcohol, 24:1, v/v (giữ ở 4oC) với thể tích bằng 1/3thể tích mẫu Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 10.000 vòng trong 20 phút để phân lớp Sau đó chuyển phần nhớt ở phần đầu sang Eppendorf (Cỡ 1,5ml) mới và ADN được tách

ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95,5% giữ ở-22oC) với thể tích gấp đôi thể tích mẫu và 2µl của 3M Na acetate (pH=4,5)

Ngâm ADN trong 100µl ethanol 70% trong 30 phút và sau đó ngâm liên tiếp trong ethnol 80, 90, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phút Sợi ADN làm khô bằng nhiệt độ phòng trong 10 phút và được làm tan trở lại trong 20µl đệm 0,1 x TE (10 x TE) ở 4oC qua đêm

Dịch đem phân tích bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260 và 280nm ADN hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260nm ở bước sóng 280 chứng tỏ sự

có mặt của protêin Bước sóng 230nm biểu hiện sự có mặt của chất đệm, các muối như EDTA và của ARN Các tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 1,0 : 0,45 : 0,515 Hàm lượng ADN được tính như sau: 1 đơn vị OD (mật độ quang, Optical Durity) ở 260nm tương đương với 50µg/ml ADN

Cách tính: Đơn vị mẫu x độ loãng x chỉ số/1000 = ADN µg/µl

Nếu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và RNazaA

2.2.3.3 Hóa phân loại phân tích thành phần acid béo

Lấy 50mg mẫu cho vào ống thủy tinh nút vặn (cỡ 13mm x 100mm) [32] Alkal hóa bằng 1.0ml chất phản ứng I (reagent I, gồm 15g sodium hydroxide (NaOH), 50ml methanol và 50ml Milli- Q) Tế bào được thủy phân ở 1000C tại nồi nhiệt khô trong 5 phút Sau đó làm huyền phù bằng máy Vortex trong 5 giây rồi tiếp tục cho thủy phân trong 25 phút Dịch thủy phân được làm lạnh ở nhiệt độ phòng

Methyl hóa dung dịch Alkal với 0.2ml chất phản ứng 2 (65ml 6N hydrochloric acid

và 55ml methanol) Sau khi metyl hóa, giữ ở 800C trong nồi cách thủy khoảng 10 phút Dung dịch methyl hóa được bổ sung 1.25ml của chất thử 3 (gồm 50ml n-hexane-methyl tert butyl ether, 1:1, v/v) và được trộn đều bằng máy lắc 2000rpm trong 10 phút Dịch nhớt phía trên được loại bỏ Dung dịch được bổ sung 3ml thuốc thử 4 (1.2g sodium hydroxide trong 100ml Milli-Q) và được trộn đều bằng tay trong

5 phút Ly tâm ở 2500rpm trong 10 phút Dịch trên cùng được chuyển sang ống thủy tinh mới có nút vặn và cho bay hơi bằng khí nitrogen thông thường tới khi khô Cuối cùng, toàn bộ dịch mẫu được làm tan với 50µl của diethyl ether 300 (hoặc acetone – 300, n-hexane) Toàn bộ mẫu được chấm vào sắc ký bản mỏng (TCL) rồi được đặt trong bồn thủy tinh chứa 100ml n-hexane-diethyl ether (4:1,v/v) trong 30 –

45 phút Thành phần acid béo được hiên vệt bằng iot trong 30 – 45 phút Acid béo

có cực và không cực xuất hiện như những vệt xanh Những vệt được cạo và rửa giải hai lần bằng diethyl ether 300 Trộn đều dung dịch silicagel trên máy lắc 2000rpm trong 10 phút và ly tâm 2500rpm trong 5 hoặc 10 phút Dung dịch được bay hơi bằng khí nitrogen thông thường tới khi khô mẫu Mẫu được hòa tan trở lại với 50µl chất phản ứng 3 Dùng pipet nhỏ vào lọ nhỏ GC có nút đậy Sau đó, đem phân tích trên máy sắc ký khí (gas chromatography)

Nếu a là số lượng tế bào vi khuẩn lam đếm được trên buồng đếm thì số lượng

tế bào tảo trong 1 ml là:

X = a × 104 (tế bào)

2.2.5 Phương pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis

Trong thí nghiệm của chúng tôi, microcystin của Microcystis được tách chiết

theo phương pháp đông tan [44] Thu sinh khối bằng cách ly tâm với tốc độ 7000 vòng/20 phút sau đó lọc dịch nổi bằng thiết bị lọc GF/C (Whatman) Dịch nổi được lọc qua màng lọc kích thước 0,2 μm (Milipore) Sinh khối thu được đông khô ở nhiệt độ – 83oC, chiết rút độc tố bằng Methanol : nước cất (80:20) và bằng Methanol : n.Hexan (85:15) Lọc qua cột C18 để loại bỏ sắc tố chiết từ tế bào

Microcystis Dịch chiết lỏng được giữ trong catrid Sep-Pak (Water) và rửa bằng

dung dịch methanol 20% Dịch chiết được chạy qua sắc ký bản mỏng (TLC) để làm sạch độc tố, cạo phần độc tố trên bản TLC Microcystin sau đó được tách ra nhờ xử

lý với 3 ml methanol 90%, đem sấy khô qua dòng khí nitrogen và hoà tan trong một lượng nhỏ hỗn hợp nước- ethanol 20% Thành phần và nồng độ của dịch chiết được xác định bằng máy HPLC (Hewlett Packard model 1100 LC) qua cột ODS II (4,6 mm; 150 mm) với methanol chứa 0,05 M phosphatase, pH 3 (tỷ lệ 6:4 theo thể tích), tách trong pha động

2.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng trên máy quang phổ

Độc tố microcystin được phân tích trên máy quang phổ theo phương pháp [28 ] Hàm lượng microcystin được tính toán theo phương trình đường chuẩn thu được của microcystin chuẩn Dựa vào đồ thị chuẩn của microcystin theo mật độ quang, xác định hàm lượng microcystin có trong dịch chiết

Phương pháp xây dựng đường chuẩn hàm lượng microcystin theo mật độ quang: Dịch chiết MC - LR chuẩn có nồng độ 10ng/ml được pha loãng gấp 1000,

3000, 5000, 7000, 9000, 11000 lần với hỗn hợp dung môi methanon : nước theo tỷ

lệ 80 : 20 Tiến hành đo ở bước sóng 242 nm trên máy quang phổ ERMA 11 TOKYO Căn cứ vào các giá trị mật độ quang đo ta lập được đồ thị biểu thị mối quan hệ với nồng độ dịch chiết microcystin

2.2.7 Các phương pháp sắc ký

Là phương pháp hiệu quả cho việc định tính, định lượng và tinh sạch các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các

chất giữa hai pha là pha động và pha tĩnh Pha động có thể là chất khí hoặc lỏng để đẩy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh Pha tĩnh chứa chất rắn hoặc lỏng gọi là các hợp chất phụ có khả năng chứa các chất hòa tan Mẫu phân tích chứa một hay nhiều cấu

tử, khi tiếp xúc với pha tĩnh và pha động các cấu tử khác nhau tách nhau ra do chúng có áp lực khác nhau với cả hai pha

- Pha động là dung môi thích hợp đựng trong bình có nắp đậy kín

Trong quá trình sắc ký dung môi di chuyển làm dịch chuyển các thành phần trong mẫu (đã được chấm thành từng vết trên phiến kính trải chất hấp phụ)

Tiến hành thí nghiệm:

- Pha mẫu sau cô quay thành 1ml bằng hỗn hợp dung môi methanol: nước (80:20), chấm toàn bộ mẫu lên trên bản silicagel Đặt bản mỏng trong bồn thủy tinh chứa 50ml hỗn hợp dung môi ethyl acetat: isopropanol: nước = 8:5:3 (v/v), trong 45-60 phút Sau khi làm khô tới nhiệt độ phòng, nhuộm TLC bằng nihydrin 2% trong butanol bão hòa Sấy khô, quan sát các vết xuất hiện trên nền TLC Sau đó đánh dấu, cạo các vết lên cùng với microcystin chuẩn Tái chiết rút độc tố này bằng hỗn hợp dung môi methanol : nước (80:20) Đem dịch này ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/ phút, trong 15 phút Sau đó, lọc dịch qua cột C18

2.2.7.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Sắc ký lỏng cao áp [27 ] là phương pháp chia hỗn hợp các chất trong cột sắc

ký trong đó pha động ở trang thái lỏng nhờ một áp lực lớn được đẩy qua pha tĩnh Trong HPLC, mẫu phân tích được bơm vào cột sắc ký qua một van bơm sáu chiều, sau đó nhờ bơm cao áp mà pha động được đẩy qua cột với tốc độ dòng không đổi trong suốt thời gian chạy sắc ký Ở đây pha động vừa đóng vai trò là chất mang,