Xác định các tác nhân gây bệnh trên cá cảnh biển tại thủy cung Vinpearl, bước đầu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của một số thực vật trên tác nhân gây bệnh cho cá

TRẦN THỊ KHÁNH MAI XÁC ĐỊNH CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRÊN CÁ CẢNH BIỂN TẠI THỦY CUNG VINPEARL BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ THỰC VẬT TRÊN TÁC NHÂN GÂY BỆNH CHO CÁ ĐỒ

TRẦN THỊ KHÁNH MAI

XÁC ĐỊNH CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRÊN CÁ CẢNH

BIỂN TẠI THỦY CUNG VINPEARL BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ THỰC VẬT TRÊN TÁC NHÂN GÂY BỆNH CHO CÁ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD:ThS VĂN HỒNG CẦM

TS ĐỖ LÊ HỮU NAM

Nha Trang, 07/2013



nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang trong thời gian từ ngày 20/2/2013 đến 15/6/2013 Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo Đặc biệt, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ths Văn Hồng Cầm đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức chỉ dạy cho tôi nhiều kiến thức và kỹ năng quý báu trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Tôi cũng xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

Ban giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, thầy Đỗ Lê Hữu Nam và cô Trương Thị Thu Thủy - cán bộ quản lý Phòng Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã truyền dạy những kiến thức nền tảng cho tôi trong suốt 4 năm trên giảng đường Đại học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sự quan tâm, dạy dỗ và động viên của gia đình cũng như sự giúp đỡ của bạn bè trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Trong thời gian thực hiện đề tài, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng nhưng do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên không thể tránh khỏi nhiều thiếu sót Rất mong nhận được sự quan tâm, góp ý của quý thầy cô giáo và các bạn để đề tài hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 6 năm 2013 Sinh viên thực hiện

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CẢNH BIỂN 3

1.1.1 Đa dạng sinh học cá biển 3

1.1.2 Giá trị kinh tế của cá cảnh biển 3

1.1.3 Một số bệnh thường gặp trên cá cảnh biển 7

1.2 MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ THỰC VẬT 16

1.2.1 Những hạn chế của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn trên thủy sản 16

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các hợp chất chiết xuất từ thực vật trong và ngoài nước 17

1.3 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 19

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 21

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 21

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 21

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Đối tượng chính 21

2.2.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định 21

2.2.3 Một số loại thực vật thí nghiệm 21

2.3.2 Môi trường và hóa chất 22

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 23

2.4.2 Phương pháp thu mẫu và phân lập các tác nhân gây bệnh 24

2.4.3 Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn và định danh chủng vi khuẩn đích gây bệnh 26

2.4.4 Lập kháng sinh đồ 28

2.4.5 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thực vật 29

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 KẾT QUẢ 30

3.1.1 Kiểm định chỉ tiêu nấm và ký sinh trùng 30

3.1.2 Phân lập vi khuẩn và định danh sơ bộ 30

3.1.3 Xác định độc lực của vi khuẩn và định danh vi khuẩn mục tiêu 31

3.1.4 Kháng sinh đồ 36

3.1.5 Khả năng kháng khuẩn của một số loại thực vật 37

3.2 THẢO LUẬN 39

3.2.1 Định danh vi khuẩn dựa trên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa 39

3.2.2 Xác định tác nhân gây bệnh trên cá cảnh biển 39

3.2.3 Khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh 43

3.2.4 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ một số loài thực vật 44

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 KẾT LUẬN 45

4.2 KIẾN NGHỊ 45

ABIS Advanced Bacterial Identification Software (Phần mềm

định danh vi khuẩn )

ATCC American Type Culture Collection (Bộ sưu tập chủng

giống Hoa Kỳ) CFU Colony-forming unit (Số đơn vị khuẩn lạc)

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institude (Tiêu chuẩn

cơ sở lâm sàng và phòng thí nghiệm) KIA Kligler Iron Agar

LD50 Lethal Dose, 50% (liều lượng chất độc gây chết cho 50%

số cá thể đem thí nghiệm) McF McFarland

Bảng 1.1 Tổng số cá cảnh biển giao dịch trên toàn cầu trong những năm 1990 4

Bảng 1.2 Các nước xuất khẩu và nhập khẩu cá cảnh biển chính trên thế giới 5

Bảng 3.1 Kết quả cảm nhiễm chủng D1-8 trên cá Khoang cổ đỏ (A frenatus) 32

Bảng 3.2 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn D1-8 35

Bảng 3.3 Bảng kết quả xác định kháng sinh đồ của 2 chủng D1-8 và D2-10 36

Bảng 3.4 Kết quả kháng khuẩn của dịch chiết một số loại thực vật 38

Bảng 3.5 Các đặc điểm sinh hóa của chủng D1-8 so sánh với các chủng Aeromonas phân lập từ một số nghiên cứu 40

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các yếu tố gây bệnh cho động vật thủy sản 7

Hình 1.2 Mối tương quan giữa vật chủ, môi trường, tác nhân gây bệnh và khả năng hình thành bệnh 10

Hình 1.3 Một số bệnh phổ biến do vi khuẩn gây ra trên cá biển 13

Hình 1.4 Một số bệnh trên cá biển do ký sinh trùng gây ra 14

Hình 1.5 Các khối u trên cá do virus Lymphocystis gây ra 15

Hình 1.6 Bệnh hoại tử tuyến tụy do virus IPNV gây ra trên cá hồi 16

Hình 1.7 Cá bị xung huyết trên thân 19

Hình 1.8 Cá bị đục mắt 19

Hình 1.9 Bóng hơi (trái) và thành ruột (phải) bị xuất huyết 20

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các tác nhân gây bệnh tổng quát 23

Hình 2.2 Hình ảnh giải phẫu cá và các vị trí nội quan 25

Hình 2.3 Cá Khoang cổ đỏ (trái) và thao tác tiêm vi khuẩn vào cá (phải) 28

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng D1-8 trên môi trường TCBS 31

Hình 3.2 Biểu đồ xác định chỉ số LD50 của chủng D1-8 33

Hình 3.3 Biểu độ xác định tỷ lệ chết tích lũy theo ngày của chủng D1-8 33

Hình 3.4 Khả năng làm tan huyết của chủng D1-8 34

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng D1-8 bằng kit API-20E 34

Hình 3.6 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng 8 loại kháng sinh của hai chủng D1-8 (trái) và D2-10 (phải) 37

Hình 3.7 So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ 5 loài thực vật 37

Hình 3.8 Hệ thống bể nuôi tuần hoàn khép kín tại Thủy cung Vinpearl 42

Hình 3.9 Các sản phẩm kháng sinh Amoxicilin dùng cho cá cảnh 43

và nghệ thuật mà còn là hình thức bảo tồn chuyển vị (exsitu conservation) giúp bảo tồn một số loài quý hiếm có nguy cơ đe dọa cao Tại thành phố biển Nha Trang, một

số thủy cung nổi tiếng được nhiều người biết đến như Thủy cung Vinpearl, Hồ cá Trí Nguyên và Bảo tàng Hải Dương học

Trong những năm gần đây, dịch bệnh trên cá mỗi ngày càng diễn biến phức tạp và khó kiểm soát Cá cảnh trong các thủy cung cũng không tránh khỏi các vấn

đề về dịch bệnh Thủy cung Vinpearl thường phải đối mặt với tình trạng cá trong các bể thủy sinh chết hàng loạt không rõ nguyên nhân, làm thiệt hại lớn đến doanh thu của khu du lịch Xác định nguyên nhân gây bệnh và đề ra biện pháp phòng và điều trị bệnh là cần thiết

Hiện nay, kháng sinh đã và đang được sử dụng rộng rãi để phòng và trị bệnh trên động vật nói chung (Feinman, 1998; Barbosa và Levy, 2000; Blackman, 2002) và trong nuôi trồng thủy sản (Reilly và Kaeferstein, 1997) nói riêng Tuy nhiên do việc sử dụng kháng sinh không đúng quy cách, lạm dụng thuốc quá mức

đã gây nên hiện tượng tạo ra và lây lan các dòng vi khuẩn kháng thuốc (Feinman, 1998; Levy, 1998; Witte, 1998), làm giảm hiệu quả sử dụng, tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn; ngoài ra còn tác động xấu đến môi trường nuôi và làm giảm sức sống của cá (Nguyễn Thị Vân Thái và cs., 2003; Mai Văn Tài, 2004; Nguyễn Thị Vân Thái, 2004)

Do đó, trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thực vật đã trở nên phổ biến hơn, được xem như một giải pháp có biên độ an toàn cao để phòng và trị bệnh trên động vật thủy sản (Nguyễn Ngọc Phước và cs., 2007a)

Từ nhu cầu tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh, tìm ra cách phòng và điều trị

bệnh cho thủy cung Vinpearl, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Xác định các tác nhân

gây bệnh trên cá cảnh biển tại thủy cung Vinpearl Bước đầu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của một số thực vật trên tác nhân gây bệnh cho cá” nhằm

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CẢNH BIỂN

1.1.1 Đa dạng sinh học cá biển

Theo FishBase (http://www.fishbase.org) - trang Cơ sở dữ liệu loài cá toàn cầu, mỗi năm có khoảng 250 loài cá được phát hiện và tính đến tháng 12/2012 đã có 32.400 loài được mô tả, trong đó có hơn 58% là cá nước mặn Hầu hết các loài cá biển thường sống ở những vùng biển gần bờ hoặc thềm lục địa (chiếm 78%), chỉ có khoảng 13% sống ở các đại dương và 7% sống dưới vùng nước biển sâu (Cohen, 1970)

Việt Nam thuộc vùng có khí hậu nhiệt đới, với đường bờ biển dài 3.260 km

và vùng đặc quyền kinh tế rộng trên 1 triệu km2

cùng những vùng biển có các rạn san hô lớn như Hải Vân - Sơn Trà, Cù Lao Chàm, vịnh Nha Trang, Ninh Hải, Cà

Ná, quần đảo Trường Sa, Hoàng Sa, Hà Tiên đã mang trong mình nguồn tài nguyên sinh vật biển khá phong phú (Nguyễn Thị Thu Hương, 2006) Theo Vũ Cẩm Lương (2008), tổng số loài sinh vật biển đã biết ở Việt Nam có khoảng 11.000 loài, trong đó cá biển có đến 2.458 loài, trong đó có 130 loài có giá trị kinh tế

Khảo sát của Viện Hải dương học Nha Trang (Nguyễn Hữu Phụng và cs.,

2001) cho biết cá cảnh biển rạn san hô ở vùng biển Nha Trang đa dạng bậc nhất ở

nước ta với 398 loài Theo nghiên cứu của Nguyễn Nhật Thi và Nguyễn Văn Quân (2004), quần đảo Trường Sa ngoài khơi tỉnh Khánh Hòa cũng là nơi có nhiều rạn san hô với 219 loài cá thuộc 44 họ, trong đó có 159 loài đặc hữu Các loài cá quí hiếm như: mao tiên, bàng chài, họ cá thia đang rất được ưa chuộng ở các nước Philippines, Indonesia, Nhật Bản, Úc, đều có ở Việt Nam (Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Văn Long, 1994)

1.1.2 Giá trị kinh tế của cá cảnh biển

Mỗi năm, thế giới tiêu thụ khoảng 35 triệu cá cảnh biển, doanh thu đạt được

từ 200 - 330 triệu USD (Larkin và Degner, 2001; Chapman và cs., 2007) và đã cung cấp được hàng nghìn việc làm cho những người dân ở các nước đang phát triển Giá

trị thương mại của các loài cá cảnh biển phụ thuộc nhiều vào màu sắc và họa tiết trên cá, cá càng có màu sắc sặc sỡ và sống động thì càng được ưa chuộng trên thị trường (Ramamoorthy và cs., 2010) Theo thống kê, ước tính khoảng 1,5 – 2 triệu người trên khắp thế giới đang sở hữu những hồ cá cảnh biển cho riêng mình (Green, 2003), chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ đã chiếm hơn 33% với gần 600 nghìn hộ dân có bể

Vào đầu thập niên 1980, giá trị xuất khẩu cá cảnh biển hằng năm của 40 quốc gia đạt từ 24 - 40 triệu USD (Wood, 1985)

Đến những năm 1990, ngành xuất khẩu cá cảnh biển tiếp tục được mở rộng

và tăng trưởng nhanh (Bảng 1.1) Sản lượng xuất khẩu cá cảnh biển của hơn 45 quốc gia trên thế giới ước tính khoảng từ 14 - 30 triệu cá thể, đạt doanh thu giá trị bán buôn lên đến 44 triệu USD và giá trị bán lẻ gần 300 triệu USD (Wood, 2001)

Bảng 1.1 Tổng số cá cảnh biển giao dịch trên toàn cầu trong những năm 1990

Năm 1991 1992 1993 1994 1995

Tổng số cá thể

cá cảnh biển 530.612 639.070 541.063 467.715 550.028 Năm 1996 1997 1998 1999 2000

Tổng số cá thể

cá cảnh biển 812.661 629.847 1.326.953 1.383.106 1.695.4141

Theo tài liệu thu thập được của Cơ sở dữ liệu thủy cung toàn cầu GMAD (Global Marine Aquarium Database), tổng cộng 1.471 loài cá cảnh biển đang được giao dịch trên toàn cầu Số liệu thống kê trong khoảng thời gian từ năm 1997 đến

2002 cho thấy Philippines, Indonesia, quốc đảo Solomon, Sri Lanka, Australia, Fiji, Maldives và Palau là các quốc gia xuất khẩu cá cảnh biển lớn, cung cấp hơn 99% tổng số cá cảnh biển trên thế giới; trong khi đó Hoa Kỳ, Vương quốc Anh, Hà Lan, Đài Loan, Nhật Bản, Hồng Kông, Pháp và Đức là các quốc gia nhập khẩu quan trọng khi chiếm gần 99% tổng sản lượng cá cảnh biển xuất khẩu trên thị trường (Bảng 1.2) (Wabnitz và cs., 2003)

Cũng theo thống kê từ năm 1997 - 2002, một số loài cá cảnh biển được ưa

chuộng nhất trên thị trường bao gồm: cá hề (Amphiprion ocellaris), cá trinh nữ xanh (Chrysiptera cyanea), cá rô đá (Dascyllus aruanus), cá thia lá mạ (Chromis viridis),

cá thia đồng tiền ba chấm (Dascyllus trimaculatus), cá đuôi gai vàng (Zebrasoma

flavescens), cá mào gà vện (Salarias fasciatus),…

Bảng 1.2 Các nước xuất khẩu và nhập khẩu cá cảnh biển chính trên thế giới

Nước xuất

khẩu

Tổng số cá xuất khẩu Tỷ lệ (%)

Nước nhập khẩu

Tổng số cá nhập khẩu Tỷ lệ (%) Philippines 1.523.854 43 Hoa Kỳ 3.054.273 60

Indonesia 943.059 26 Vương quốc

Trong những năm gần đây, Việt Nam cũng bắt đầu nghề đánh bắt và kinh doanh cá cảnh biển Từ nguồn cá cảnh tại các tỉnh miền Trung và miền Nam, cá được xuất khẩu sang một số nước như Nga, Nhật Bản, Hồng Kông, Singapores, Hoa

Kỳ và các nước châu Âu, ước tính hằng năm đem lại doanh thu khoảng 400.000 USD, chiếm khoảng 10% trong tổng doanh thu xuất khẩu cá cảnh của nước ta

Lợi nhuận thu được từ việc kinh doanh cá cảnh biển rất lớn: trong khi 1 tấn

cá dùng cho thực phẩm chỉ trị giá khoảng 6.000 USD thì 1 tấn cá cảnh biển lên đến 496.000 USD khi xuất khẩu Các loài cá cảnh biển có giá trị xuất khẩu cao là cá hoàng đế (50 - 100 USD/con), cá ngựa (30 - 40 USD/con) và một số loài trong nhóm cá rồng biển có giá đến 10.000 đôla Hồng Kông (Trinh Mai, 2009)

Không chỉ cung cấp cho xuất khẩu, cá cảnh biển còn là mặt hàng giải trí đang rất được ưa chuộng tại thị trường nội địa, nhất là Thành phố Hồ Chí Minh - một trung tâm kinh tế dịch vụ lớn nhất của Việt Nam cùng các thủy cung lớn đã và đang được thiết lập Với thu nhập ngày càng tăng, nhu cầu giải trí của người dân do

đó cũng ngày càng được nâng cao, vì vậy thị trường cá cảnh biển cũng đang phát triển nhanh chóng (Nguyễn Minh Đức, 2013)

Chi phí cho việc thiết lập, chăm sóc và duy trí các bể cá cảnh biển là khá cáo; mặt khác, hàng năm, để đáp ứng nhu cầu, thị hiếu của du khách, các thủy cung thường chi những khoản tiền không nhỏ để thu mua cá cảnh với số lượng lớn nhằm làm mới và thay thế các thế hệ cá đã già Hầu hết các loại sinh vật biển nói chung và

cá cảnh biển nói riêng hiện nay đều được đánh bắt từ tự nhiên (Chapman và cs , 2007) Vì chưa có nguồn cá sinh sản nhân tạo hay nhập khẩu nhiều, giá trị kinh tế của cá cảnh biển ngày càng tăng

1.1.3 Một số bệnh thường gặp trên cá cảnh biển

1.1.3.1 Điều kiện phát sinh bệnh trên cá cảnh biển

Động vật thủy sản nói chung và cá cảnh biển nói riêng là những sinh vật sống trong nước, do đó chúng rất nhạy cảm và có mối quan hệ chặt chẽ với tất cả những yếu tố vô sinh và hữu sinh tồn tại trong môi trường nước Vì vậy, sự xuất hiện bệnh trên cá sẽ là kết quả tương tác giữa tác nhân gây bệnh, sức đề kháng của vật chủ và môi trường

Snieszko (1973) đã mô tả 3 mối tương quan nói trên bằng 3 vòng tròn giao nhau (Hình 1.1) Theo đó, bệnh chỉ xảy ra khi có sự tương tác qua lại của cả 3 yếu

tố cơ bản: vật chủ, môi trường và tác nhân gây bệnh Để cá sống và phát triển tốt thì ngoài môi trường sống thuận lợi không tồn tại các tác nhân gây bệnh thì đồng thời bản thân cá cũng phải có khả năng thích ứng với môi trường Nếu môi trường sống xảy ra theo chiều hướng không có lợi, những cá thể nào có khả năng thích ứng sẽ duy trì được sự sống, những cá thể không thích nghi được sẽ bị mắc bệnh và chết

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các yếu tố gây bệnh cho động vật thủy sản

Bệnh xuất hiện (Disease)

Vật chủ (H)

Tác nhân gây bệnh (P)

Môi trường sống (E)

b Môi trường sống (Enviroment - E)

Đối với động vật thủy sản, chất lượng môi trường sống là chất lượng nước, bao gồm hàm lượng oxy hòa tan (DO), pH, dòng chảy, nhiệt độ, độ mặn, độ kiềm tổng số, độ cứng tổng số, độ đục, các khí CO2, NH3, H2S, NO2, kim loại nặng, thuốc trừ sâu,… đều có khả năng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cá, tỷ lệ sống sót và khả năng sinh sản của cá (Herdick, 1998)

i Nhiệt độ: Cá thuộc nhóm động vật biến nhiệt (động vật máu lạnh) nên

nhiệt độ cơ thể của chúng phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ môi trường nước Mỗi loài

cá có một khoảng nhiệt độ tối thiểu và tối đa của riêng mình và nếu nhiệt độ môi trường vượt ra ngoài khoảng giới hạn cho phép đó một cách đột ngột thì sức khỏe

cá sẽ bị ảnh hưởng hoặc thậm chí có thể dẫn đến chết hàng loạt (Becker và Fujihara, 1978; FishDoc site, 2009)

ii Độ mặn: Nước biển có độ mặn trong khoảng từ 30 - 35‰ Nếu độ

mặn trong nước tăng hoặc giảm đột ngột vượt quá giới hạn thích nghi của cá thì sẽ làm rối loạn cơ chế trên khiến cá bị sốc hoặc thậm chí có thể chết

Như theo nghiên cứu của Trần Văn Phước và cs (2012), cá Khoang cổ đỏ

(Amphiprion frenatus) được nuôi ở các độ mặn khác nhau từ 15‰ đến 40‰, cá đạt

tỷ lệ sống cao (≥ 92%) và có tốc độ tăng trưởng gần như nhau; nhưng trong quá trình nuôi nếu giảm xuống dưới 15‰ sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe cá

iii pH: Tuy phạm vi thích ứng độ pH của cá tương đối rộng, khoảng từ

7,5 – 9,0 là tối ưu khi pH của nước biển dao động từ 8,0 – 8,3 (Charles và Raabe, 2011) nhưng nếu pH xuống thấp hơn 4 hoặc tăng cao hơn 11 thì sẽ có thể làm cá sốc và chết (Bùi Quang Tề, 2006)

iv Hàm lượng oxy hòa tan trong nước: Cá là động vật sống trong

nước nên hàm lượng oxy hòa tan rất cần thiết cho đời sống của chúng Nhu cầu oxy hòa tan trong nước tối thiểu của cá là 3mg/l, nếu oxy hòa tan thấp hơn mức gây chết kéo dài sẽ làm cá bị sốc, ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ sống, tăng trưởng và phát dục của chúng (Bùi Quang Tề, 2006) Ví dụ, theo nghiên cứu của Tookwinas và cs (1986),

cá chẽm (cá vược) nuôi lồng ở Songkhla, Thái Lan đã chết khi lượng oxy hòa tan vào ban đêm giảm xuống còn 1,3 mg/l do môi trường nước bị nhiễm bẩn

Vì vậy, bất kỳ sự biến động nào của các yếu tố môi trường trong tự nhiên hoặc trong nuôi trồng cũng đều có thể khiến các hoạt động sống bình thường của cá

bị rối loạn, làm cơ thể mất đi sự cân bằng dẫn đến khả năng thích nghi với môi trường giảm hoặc tạo điều kiện thuận lợi để các tác nhân gây bệnh phát triển và tấn công vào các cá thể cá (Trung tâm giống thủy đặc sản, 2012)

Theo đó, sự hiểu biết và cách thức quản lý tốt môi trường sẽ là chìa khóa để nuôi trồng thành công động vật thủy sản nói chung và cá cảnh biển nói riêng (Warren, 1983)

c Tác nhân gây bệnh (Pathogen-P)

Tác nhân gây bệnh là các yếu tố hữu sinh gây bệnh cho động vật thuỷ sản, được chia thành 3 nhóm chính:

- Nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm: virus, vi khuẩn, nấm

- Nhóm tác nhân gây bệnh ký sinh: giun sán, giáp xác, nhuyễn thể, nguyên sinh động vật, đỉa cá,

- Nhóm địch hại: côn trùng, cá dữ, thực vật, rong tảo độc,

Tùy theo sức đề kháng của vật chủ và độc tính của các tác nhân gây bệnh

mà thời gian ủ và phát bệnh sẽ khác nhau ở từng loài, như có thể dao động từ 2 - 3

ngày đối với bệnh Columnaris (Becker và Fujihara, 1978) hoặc thậm chí kéo dài đến nhiều tháng đối với bệnh thận cá hồi (Bacterial Kidney Disease) do vi khuẩn

Renibacterium salmoninarum gây ra (Fryer và Sanders, 1981)

d Mối tương quan giữa 3 yếu tố vật chủ (H), môi trường sống (E) và tác nhân gây bệnh (P)

Trong trường hợp hội đủ cả 3 yếu tố trên thì động vật thủy sản nói chung và

cá cảnh biển nói riêng mới có thể mắc bệnh, nếu thiếu 1 trong 3 nhân tố trên thì cá

sẽ không bị mắc bệnh

Nếu cá có mang mầm bệnh nhưng môi trường nuôi thuận lợi cho cá và bản thân cá có sức đề kháng với mầm bệnh, thì bệnh có thể sẽ không phát sinh được (Hình 1.2)

Hình 1.2 Mối tương quan giữa vật chủ, yếu tố môi trường, tác nhân gây bệnh

và khả năng hình thành bệnh [1]

Vì vậy, khi xem xét nguyên nhân gây bệnh cho cá không nên chỉ xem xét

và kiểm tra 1 yếu tố đơn độc mà phải kiểm tra cả 3 yếu tố: vật chủ, môi trường và tác nhân gây bệnh Đồng thời, khi đưa ra các biện pháp phòng và trị bệnh cũng phải quan tâm đến cả 3 nhân tố trên Ví dụ, cần tạo môi trường tốt cho cá sinh trưởng và phát triển là một biện pháp phòng bệnh Tiêu diệt các tác nhân gây bệnh sẽ giúp ngăn chặn được bệnh không phát triển được Mặt khác, nên chọn những cá thể cá khỏe, có sức đề kháng tốt với những bệnh thường gặp (Bùi Quang Tề, 2006)

Vật chủ

Tác

nhân

Môi trường

Bệnh không xuất hiện Bệnh ở mức độ nhẹ Bệnh trở nên

nghiêm trọng

1.1.3.2 Những bệnh thường gặp trên cá biển

a Bệnh do vi khuẩn

Bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá biển rất đa dạng về tác nhân bao gồm 5 nhóm chính (Sindermann, 1990):

- Nhóm vi khuẩn Gram âm: Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas,

Pasteurella gây xuất huyết và nhiễm trùng huyết trên cá; được xem là tác nhân quan

trọng và chính yếu nhất

- Nhóm vi khuẩn Gram dương: Steptococcus spp và Renibacterium

salmoninarum gây nhiễm trùng cục bộ hoặc toàn thân cá

- Vi khuẩn Mycobacterium và Nocardia

- Vi khuẩn kỵ khí (Eubacterium) gây nhiễm trùng toàn thân

- Myxobacteria (Flexibacter) gây thối vây và mang, loét da

Một số bệnh thường gặp trên cá biển do vi khuẩn gây ra:

i Bệnh thối vây (Fin Rot)

Bệnh do 3 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm là Aeromonas,

Pseudomonas và Vibrio gây ra Bệnh thường xảy ra khi chất lượng nước trong bể

nuôi bị ô nhiễm (Bullock và Snieszko, 1975; Ziskowski và Murchelano, 1975; Minchew và Yarbrough, 1977)

Cá bị nhiễm bệnh sẽ có các biểu hiện như: bơi chậm, đầu vây xuất hiện những đốm hoại tử nhỏ, chán ăn, phân cá có hiện tượng tạo thành sợi Bệnh tiến triển tương đối chậm; nhưng nếu không điều trị kịp thời, vây và đuôi cá sẽ cụt dần khiến cá bơi lội khó khăn, bỏ ăn, phần thân viêm tấy, phù nề; sau khoảng từ 5 - 7 ngày cá sẽ chết

ii Bệnh lao cá (Fish tuberculosis)

Bệnh do vi khuẩn Mycobacterium bacteria gây ra, chủng vi khuẩn này

có vùng phân bố rất rộng, chúng có mặt trong môi trường nước mặn lẫn nước ngọt

Cá bị nhiễm vi khuẩn này trong giai đoạn đầu rất khó phát hiện vì bệnh

không gây ra các dấu hiệu đặc trưng bên ngoài Cá có thể ủ bệnh trong nhiều năm

trước khi bị phát bệnh và chết với các triệu chứng: da viêm và lở loét, vây sờn, mắt

sưng, bỏ ăn, đờ đẫn, cơ thể sưng phù dẫn đến biến dạng

iii Bệnh loét da (Skin ulcer)

Bệnh do nhiều chủng vi khuẩn gây ra như Aeromonas, Pseudomonas,

Vibrio và Mycobacterium xâm nhập vào cơ thể cá thông qua các vết thương hoặc

những tổn thương trên da với các biểu hiện: cá bỏ ăn, xuất hiện các vết loét da hai

bên sườn, phát triển dần vào các khối cơ của cá, nếu không xử lý đúng và kịp thời

vết loét có thể phá huỷ vùng mép mang, hàm dưới và vùng bụng làm chết cá

iv Bệnh do chủng Vibrio gây ra (Vibriosis)

Bệnh Vibriosis được phát hiện trên cả cá nước mặn và cá nước lợ; tương

tự như bệnh thối vây, bệnh này cũng thường xảy ra khi môi trường nước bị ô nhiễm

(Rødsaether và cs., 1977) Nhiều bệnh trên các loài thủy sản nước mặn do một số

loài thuộc Vibrio gây ra như: V anguillarum, V ordalii, V harveyi, V fischeri, V

alginolyticus,…đã được nghiên cứu Bệnh thường gây ra các triệu chứng đặc trưng

như bỏ ăn, xuất huyết da, dần dần sẽ hình thành các vết loét trên da và ăn sâu vào cơ

Hình c Bệnh loét da [4] Hình d Bệnh Vibriosis [5] Hình 1.3 Một số bệnh phổ biến do vi khuẩn gây ra trên cá biển

b Bệnh do ký sinh trùng

i Bệnh đốm trắng (Marine Ich) (Noga, 2000)

Bệnh đốm trắng do một loại động vật đơn bào có lông mao là

Cryptocaryon irritans gây ra Loài ký sinh trùng này có khả năng lây nhiễm rất cao

và thường gây tử vong cho cá trong vòng từ 3 đến 5 ngày

Biểu hiện bệnh: Vào thời kỳ đầu, ngoài sự xuất hiện của các đốm trắng, vây bị sờn; cá còn tăng tiết nhớt do hay chà sát cơ thể vào các vật xung quanh nhằm loại bỏ sinh trùng ra khỏi da Vào giai đoạn sau, cá bỏ ăn, lờ đờ và thường nằm dưới đáy hồ; khi ký sinh trùng xâm nhập vào sâu bên trong cơ thể phá hủy các tế bào mang màu sắc làm cá bị mất màu Khi đó, cá sẽ dễ bị vi khuẩn và vi nấm cơ hội xâm nhập vào và gây bệnh thông qua các vết thương khiến cá chết nhanh hơn

ii Bệnh đốm đen (Black Ich)

Bệnh do một hay hay nhiều chi của lớp giun dẹp (Turbellarian) gây ra,

với 2 chi Paravortex và Piscinquilinus subcutaneous được biết đến là nguyên nhân

chính (Syromiatnikova, 1949) Theo nghiên cứu của Justine và cs (2009), bệnh thường lây lan giữa các cá thể cá cùng thuộc một loài với nhau

Các loài giun dẹp này sẽ tấn công vào da và mang của cá Một khi chúng bắt đầu ăn sâu vào cơ thể cá sẽ làm xuất hiện những điểm chấm đen như hạt muối trên da và màng vây Các vết lở loét này có thể gây nhiễm trùng dẫn đến viêm và xuất huyết trên da, gây nhiễm trùng thứ cấp do các vi sinh vật cơ hội tấn công

iii Bệnh lở loét do nhiễm Uronema marinum (Terry, 2007)

Uronema marinum là ký sinh trùng đơn bào có tiêm mao, được tìm thấy

thường xuyên trên cá bị suy yếu Đặc biệt, sau khi được vận chuyển trong thời gian tương đối dài (24 - 48 giờ), môi trường sẽ tích tụ nhiều chất thải, pH và hàm lượng oxy hòa tan bị giảm đáng kể, cá suy yếu dần và trở thành vật chủ lý tưởng để

Uronema marinum xâm nhập và gây bệnh

Khi xâm nhập vào cơ thể cá, Uronema marinum sẽ tấn công vào cơ và

các cơ quan nội tạng, phá hủy tế bào hồng cầu và các tế bào khác Trong giai đoạn đầu của bệnh, cá trở nên khó chịu, thở nặng nề và hay chà sát vào đáy bể Khi bệnh tiến triển, vảy cá sẽ bị bong ra và các vết tụ máu dần xuất hiện dưới da Đến giai đoạn cuối, các vết tụ máu sẽ phát triển thành các vết loét sâu và làm chết cá

Theo nghiên cứu của Klinger và Floyd (1996), Saprolegniasis,

Branchiomycosis và Ichthyophonus hoferi là ba loài nấm thường gây bệnh trên cá

biển Tuy thuộc các loài nấm khác nhau nhưng chúng đều gây ra một số triệu chứng tiêu biểu như: xuất hiện dạng bông tủa từ trắng đến xám trên da và vây; vùng mà

nấm bám đó sẽ ngày càng lan rộng ra trên khắp cơ thể cá Ngoài ra, nấm còn xâm nhập vào sâu cơ thể, phá hủy các bộ phận chức năng như thận, gan và não

d Bệnh do virus

i Bệnh Lymphocystis

Bệnh do virus Lymphocystis gây ra đã nhiễm trên hơn 140 loài cá nước mặn và cá nước ngọt (Essbauer và Ahne, 2001) Virus này thường xâm nhập vào cơ thể cá thông qua các vết thương hở trên da, vây và mang Và thường chỉ lây nhiễm giữa các cá thể cá cùng loài hoặc có quan hệ loài gần gũi

Virus Lymphocystis thường hiếm gây chết cá mà cá chỉ chết khi bị các tác nhân thứ cấp như nấm và vi khuẩn cơ hội xâm nhập Khi cá bị nhiễm virus thì trên da, vây và mang sẽ xuất hiện các khối u lớn do các tế bào bất thường hình thành có màu trắng - xám (Hình 1.5); ngoài ra, các khối u đó cũng được tìm thấy trong cơ và khoang cơ thể cá

Hình 1.5 Các khối u trên cá do virus Lymphocystis gây ra [7-8]

ii Bệnh hoại tử tuyến tụy

Bệnh do virus Birnavirus (Infectious Pancreatic Necrosis Virus - IPNV) gây ra Đối với cá nước mặn, virus này gây bệnh ở tỷ lệ thấp, nhưng hậu quả mà virus gây ra không hề nhỏ trong điều kiện nuôi Theo khảo sát trên 30.000 cá biển ngoài tự nhiên thu từ Scotland thì chỉ có khoảng 0,15% tổng số cá là dương tính với IPNV (Wallace và cs., 2005)

Khi bị nhiễm virus, cá có các biểu hiện như: chán ăn, tối sẫm màu ở phần sau cơ thể (đuôi), đầu sưng, bụng phình to, dị hình và xuất huyết ở các vây Nếu mổ

cá sẽ thấy tụy, dạ dày, thực quản bị xuất huyết và lở loét Sau một thời gian cá sẽ trở nên mất phương hướng, hôn mê và chết

Hình 1.6 Bệnh hoại tử tuyến tụy do virus IPNV gây ra trên cá hồi [9]

kém hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh và cs., 2005) Theo

nghiên cứu của Aoki và cs (1985), 111/139 chủng Vibrio anguillarum (chiếm gần

80% tổng số chủng phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm) có hiện tượng kháng mạnh với tetracycline Một nghiên cứu khác của Austin và Al-Zahrani (1988) cho thấy hệ vi khuẩn đường ruột phân lập từ những cá thể cá hồi chưa từng được điều trị

bằng kháng sinh lại có khả năng kháng lại một số loại kháng sinh thử nghiệm Do

đó, hiện tượng kháng kháng sinh của vi sinh vật đã trở thành một vấn đề mang tính cảnh báo toàn cầu (Austin, 1993)

Vì vậy, để giải quyết vấn đề trên, các nhà khoa học đã từng bước tìm ra những loại kháng sinh mới bắt nguồn từ các sinh vật đơn bào, nấm, tảo và các loài thực vật bậc cao (Sridevi và cs., 2011) Trong số đó, thực vật được xem như là một đối tượng đóng vai trò quan trọng khi tạo ra được một lượng lớn các hợp chất hữu

cơ như những chất chuyển hóa thứ cấp, có hoạt tính sinh học, có khả năng hoạt động như một tác nhân kháng khuẩn và diệt khuẩn (Evans và cs., 1986); đồng thời còn làm giảm bớt áp lực chọn lọc cho tình hình kháng thuốc của vi khuẩn đang ngày càng phát triển (Lewis và Ausubel, 2006)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các hợp chất chiết xuất từ thực vật trong và ngoài nước

1.2.3.1 Trên thế giới

Việc sử dụng các hợp chất chiết xuất từ thực vật trong phòng và trị bệnh cho người đã được nghiên cứu và sử dụng từ rất lâu Đến những năm gần đây, nhiều nước trên thế giới, nhất là những quốc gia có ngành nuôi trồng thủy sản tương đối phát triển như: Ấn Độ, Trung Quốc, Thổ Nhĩ kỳ, Malaysia,… cũng đã quan tâm nghiên cứu và sử dụng thực vật để điều trị bệnh trên động vật thủy sản

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt khuẩn của tỏi Năm 1944, Cavallito và Bailey (1950) đã phân tích được hợp chất Allicin từ tỏi có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn, tiêu diệt nhiều ký sinh trùng và nấm độc Năm 1959, Horak và Santavi đã chiết xuất được

Cannabiriolic từ Cannabinnacea với nồng độ 10 - 15µg/ml có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gram (+), vi khuẩn gây bệnh lao ở người Tại Thái Lan, Direkbusarakom và

cs (1997) đã thử nghiệm hai loài thực vật gồm ổi (Psidium guajava) và mướp đắng

(Momordica charatina) có khả năng ức chế được một số chủng vi khuẩn Vibrio spp

Tiếp đó, Rahman và cs (2009) đã tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn đối

với 3 chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens và

Edwardsiella tarda phân lập từ cá Thái bạc (Barbonymus gonionotus) của tỏi

(Allium sativum), nghệ (Curcuma longa L.) và bồng bồng hay còn gọi là bàng biển (C gigentia)

Ở Ấn Độ, Velmurugan và Citarasu (2003) đã nghiên cứu khả năng kháng

khuẩn của các dịch chiết từ một số loại thực vật như lá cây cà ri (Murraya koenigii), phá cố chỉ (Psoralea corylifolia) và u sung cây gỗ sồi (Quercus infectoria) đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Vibrio harveyi phân lập từ tôm trắng Ấn Độ (Fenneropenaeus indicus) bị bệnh

1.2.3.2 Tại Việt Nam

Với diện tích tự nhiên trên 331.212 km2 trải dài từ 8O30’ - 22O22’ vĩ độ Bắc

và 102O10’- 109O20’ kinh độ Đông từ Trung Quốc ở phía Bắc đến vịnh Thái Lan ở phía Nam, cùng với nền khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm đã tạo nên cho Việt Nam một sự đa dạng sinh học rất cao Theo thống kê của Viện Dược liệu Việt Nam, khoảng 4.000/13.000 loài thực vật hạt kín đã được sử dụng làm thuốc để chữa bệnh cho con người theo kinh nghiệm dân gian Từ giữa thế kỷ XIV, đại sư Tuệ Tĩnh (thời Trần) đã sử dụng tỏi, hẹ, tô mộc, hạt cải, trầu không,… để trị một số bệnh viêm nhiễm Các công trình nghiên cứu vào năm 1956 của GS Phạm Văn Ngữ trên

500 loài thực vật và nghiên cứu vào năm 1959 của Nguyễn Văn Hường và cộng sự trên 1.000 cây thuốc đã cho thấy tiềm năng kháng khuẩn của thực vật là rất lớn

Một số công trình nghiên cứu về các loại thực vật trong phòng và trị bệnh cho động vật nói chung và thủy sản nói riêng đã được tiến hành Bùi Quang Tề và

cộng tác viên (2004) đã nghiên cứu chế tạo thành công chế phẩm từ tỏi (Allium

sativum) và sài đất (Weledia calendukacea) có khả năng kháng trên 6 chủng vi

khuẩn: Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus, Aeromonas

hydrophila, Edwardsiella tarda và Hafnia alvei hay gây bệnh cho tôm cá nước ngọt

và nước mặn

Đoàn Chí Thanh và cộng sự đã thử nghiệm dịch chiết từ tỏi, lá xoan, lá

cộng sản, lá bỏng trên vi khuẩn Aeromonas spp phân lập từ cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus) bị bệnh đốm đỏ Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Phước

và cs (2007b) cho thấy hợp chất chiết xuất từ lá trầu có khả năng tiêu diệt và ức chế

các loài nấm thuộc họ Lagenladium, chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila và

Vibrio spp

Trong 2 năm trở lại đây đây, vào mùa mưa, Thủy cung Vinpearl thường xảy

ra tình trạng cá cảnh trong các hồ nuôi chết đột ngột không rõ nguyên nhân Cá bệnh thường xung huyết trên thân từ nhẹ đến nặng (Hình 1.8), mắt đục (Hình 1.9)

và nội tạng bị xuất huyết (Hình 1.10), cùng với các biểu hiện như: biếng ăn, bơi lờ

đờ, hô hấp nhanh Ở các cá thể có kích thước nhỏ chỉ biểu hiện biếng ăn, bơi lờ đờ nhưng lại không có bất kỳ các dấu hiệu nào khác

Hình 1.7 Cá bị xung huyết trên thân

Hình 1.8 Cá bị đục mắt

Hình 1.9 Bóng hơi (trái) và thành ruột (phải) bị xuất huyết

Tuy các tài liệu nghiên cứu về cá cảnh biển khá nhiều nhưng hầu hết chỉ tập trung vào giá trị kinh tế và kỹ thuật đánh bắt, chăm sóc hoặc chỉ có các tài liệu nghiên cứu bệnh trên động vật thủy sản nói chung mà vẫn chưa có tài liệu khoa học nào đề cập đến bệnh trên cá cảnh biển Vì vậy, tìm ra các nguyên nhân gây bệnh và các biện pháp phòng bệnh trên cá cảnh biển là một vấn đề cấp thiết hiện nay

Từ đó xác định mục tiêu của đề tài là xác định các tác nhân gây bệnh trên cá cảnh biển Vinpearl nhằm đề ra phương pháp điều trị và phòng bệnh thích hợp; cũng như xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết một số loại thực vật nhằm mở ra một hướng phòng và trị bệnh mới thay thế cho kháng sinh

- Nhận mẫu cá cảnh biển bệnh từ Thủy cung Vinpearl

- Kiểm tra các chỉ tiêu: ký sinh trùng, nấm và vi khuẩn trên cá bệnh

- Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa, độc lực và định danh chủng vi khuẩn có khả năng gây bệnh

- Xác định tác nhân gây bệnh

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô từ một số loài thực vật tác động lên các chủng vi khuẩn phân lập được

2 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ 20/2/2013 đến 15/6/2013

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối tượng chính

Cá cảnh biển bệnh thu nhận từ Thủy cung Vinpearl thuộc Khu công viên giải trí Vinpearl Land, thành phố Nha Trang, Khánh Hòa

2.2.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định

Chủng vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 đang được lưu giữ tại Phòng

thí nghiệm Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

Hai chủng vi khuẩn Vibrio là TNX–X1 và YR–X2 phân lập được trên cá

ngựa bệnh từ đề tài “Phân lập và xác định khả năng gây bệnh lở loét của vi khuẩn

Vibrio trên cá ngựa (Hippocampus spp.) tại các trại nuôi trong khu vực thành phố

Dụng cụ sử dụng để cảm nhiễm: bể thí nghiệm, sục khí, kim tiêm,…

Dụng cụ thu dịch ép thực vật: máy xay, cốc đựng, giấy lọc, máy ly tâm,…

2.3.2 Môi trường và hóa chất

Môi trường:

 Môi trường phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm và nuôi cấy thông thường như: NA (Nutrient Agar), môi trường tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water), môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose), môi trường kiểm nấm SDA (Sabouraud Dextrose Agar) và môi trường test kháng sinh MHA (Mueller Hinton Agar) (Himedia - Ấn Độ)

 Môi trường dùng cho các phản ứng sinh hóa: môi trường KIA (Kligler Iron Agar), thanh thử oxidase (Merk – Đức) và Kit API-20E (BioMérieux – Pháp)

Hóa chất:

 Hóa chất xác định các chỉ tiêu môi trường: các bộ test kiểm NO2

-,

NH3/NH4+ và Cl (Sera test kit - Đức)

 Hóa chất dùng nhuộm Gram: thuốc nhuộm tím tinh thể, dung dịch Lugol, ethanol 96% và thuốc nhuộm hồng Fuchsin

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Mẫu cá cảnh biển bệnh Quan sát các dấu hiệu bệnh lý Kiểm tra các chỉ tiêu

Ký sinh trùng Vi khuẩn Nấm Phân lập vi khuẩn trên môi trường NA bổ sung 3% NaCl và TCBS

Chọn khuẩn lạc ưu thế Nuôi cấy thuần trên môi trường TCBS Giữ giống trong môi trường thạch nghiêng NA có bổ sung 3% NaCl

Xác định hình thái và kiểm tra Bảo quản giống trong Glycerol ở -70O

C các đặc tính sinh lý, sinh hóa

Tiến hành xác định độc lực của vi khuẩn và định danh vi khuẩn gây bệnh

Xác định chỉ số LD50

Lập kháng sinh đồ

Thử nghiệm trên dịch chiết thô của một số loại thực vật

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các tác nhân gây bệnh tổng quát

2.4.2 Phương pháp thu mẫu và phân lập các tác nhân gây bệnh

Tổng số 20 cá thể cá cảnh biển từ 3 đợt nhận mẫu vào khoảng tháng 2/2013 được vận chuyển từ Khu du lịch Vinpearl đến Phòng thí nghiệm Vi sinh, trường Đại học Nha Trang trong các túi nylon có bơm ôxy với trạng thái lờ đờ cùng biểu hiện xung huyết nhẹ đến nặng trên thân Các thông số về nguồn cá, kỹ thuật nuôi, quản

lý hồ nuôi và chế độ chăm sóc cũng như những dấu hiệu lâm sàng được ghi nhận cụ thể từ người cung cấp cá

Cá bệnh nhận về được đặt lên khay sạch, quan sát và ghi nhận lại tất cả các biểu hiện bên ngoài như: trạng thái, màu sắc, da, vây, mắt,… Sau đó, các mẫu cá bệnh sẽ được kiểm tra lần lượt các chỉ tiêu về ký sinh trùng, nấm và vi khuẩn

2.4.2.1 Kiểm tra ký sinh trùng

Cá bệnh được kiểm tra ký sinh trùng dựa theo mô tả của Noga (2010) Ngoại ký sinh được kiểm tra bằng cách sử dụng mũi dao đã tiệt trùng thu lớp nhớt trên thân cá chà lên bề mặt lam kính sạch và đem quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40X; mặt khác thu nhận vây lưng, vây đuôi và vây bụng cho vào đĩa petri sạch có chứa sẵn nước muối sinh lý rồi quan sát dưới kính hiển vi soi nổi Sau khi đã tiến hành phân lập vi khuẩn trong nội tạng, thận, gan, ruột, dạ dày và mang cá sẽ được thu nhận và cho vào nước muối sinh lý để kiểm tra hệ nội ký sinh

Phương pháp định danh dựa vào đặc điểm hình thái và cấu tạo ký sinh trùng theo phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá của Hà Ký (1992) và Đỗ Thị Hòa và cs (2008)

2.4.2.2 Kiểm tra nấm

Dùng tăm bông vô trùng tiến hành lấy mẫu trên toàn bộ bề mặt ngoài của cá

và trang đều lên môi trường SDA có bổ sung Chloramphenicol (0,05 g/l) để hạn chế tạp khuẩn, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 - 5 ngày để kiểm tra sự phát triển của nấm Quan sát các khuẩn lạc nấm mốc và nấm men (nếu có) Sau đó, đem soi kính hiển vi

để quan sát hình thái

2.4.2.3 Phương pháp phân lập, xác định hình thái và các đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

a Phân lập vi khuẩn

Dùng que cấy vô trùng lấy mẫu tại những vết xung huyết trên thân cấy lên môi trường NA có bổ sung 3% NaCl và môi trường TCBS, ủ trong tủ ấm 28O

C trong 24 ± 2h nhằm phân lập nguồn vi khuẩn tại vị trí tổn thương

Trước khi phân lập hệ nội vi khuẩn, rửa sạch cá trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng hoặc cồn 70% và lau sạch nhằm loại bỏ hệ ngoại vi khuẩn có thể gây sai sót trong thí nghiệm Sau đó, dùng dao, panh và kéo đã tiệt trùng giải phẫu

cá Quan sát và ghi lại các dấu hiệu bệnh bên trong Dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm trong gan và thận cấy ria tương tự như phân lập hệ vi khuẩn ngoài thân Sau 24h ± 2h, quan sát màu sắc, hình thái, kích thước khuẩn lạc và tiếp tục tiến hành làm thuần cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần

Hình 2.2 Hình ảnh giải phẫu cá và các vị trí nội quan

(http://www.biologyjunction.com/perch_dissection2.htm)

Các chủng vi khuẩn thuần sau khi phân lập được sẽ tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa; mặt khác sẽ được lưu trữ ở -70OC trong glycerol để tiếp tục các thí nghiệm khác tiếp theo hoặc phục vụ cho các nghiên cứu sau này

Dạ dày

Thận Gan

Mang

Lá lách Ruột Tim

Bóng hơi

b Xác định hình thái, các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn

Dựa vào kết quả phân lập vi khuẩn, tiến hành xác định hình thái và tính chất bắt màu bằng phương pháp nhuộm Gram

Đồng thời, các đặc điểm sinh lý (khả năng phát triển ở các nồng độ NaCl khác nhau: 0%, 3%, 5%, 6%, 8%, 10%; trong các mức nhiệt độ: 4OC, 42OC và khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí, khả năng di động) và sinh hóa (khả năng lên men các loại đường: gồm lactose, glucose, sucrose, sinh H2S, sinh hơi, oxidase,…) được xác định sơ bộ nhằm phân nhóm vi khuẩn

2.4.3 Thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn và định danh chủng vi khuẩn đích gây bệnh

Các chủng vi khuẩn được chọn ngẫu nhiên trong các nhóm vi khuẩn phân lập được từ cá cảnh biển bệnh với nhiều hình thái trên môi trường TCBS, đặc điểm sinh lý và sinh hóa khác nhau Các chủng vi khuẩn được chọn sẽ đem nuôi tăng sinh trên môi trường thạch nghiêng NA (có bổ sung 3% NaCl) trong 24 ± 2h ở 28O

C Trước khi tiêm cảm nhiễm, chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn bằng cách dùng que cấy lấy khuẩn lạc cho vào dung dịch 1% NaCl đã tiệt trùng để pha loãng dịch vi khuẩn sao cho độ đục đạt mức McF là 0,5 (được đo bằng máy Densimat – Bio Mérieux, Pháp) sẽ tương đương khoảng 2,5×108 CFU/ml (đã được kiểm chứng tổng

số vi khuẩn bằng phương pháp đếm đĩa)

Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh, Viện CNSH&MT, trường Đại học Nha Trang trong hệ thống 4 bể kính có thể tích 10 lít Trước khi cảm nhiễm, nước biển sau khi lấy về trong các thùng lớn 60 lít sẽ được khử trùng bằng Chlorine (nồng độ 30ppm), đồng thời các bể nuôi cũng phải được khử trùng bằng Chlorine và rửa lại bằng nước sạch Sau đó cho nước vào bể khoảng

8 lít/bể, lắp hệ thống sục khí liên tục trong 3 ngày để loại bỏ hết Chlorine còn sót lại (vì dư lượng của Chlorine có thể gây độc cho cá nên sau khi đã kiểm tra với bộ kit

Cl chuyên dụng, nếu nhận thấy Chlorine vẫn còn tồn tại trong nước thì cần trung hòa với Natri thiosulfate)

Cá được chọn tiến hành cảm nhiễm vi khuẩn là cá Khoang cổ đỏ (Tomato

clownfish - Amphiprion frenatus) (Hình 2.3) có trọng lượng khoảng 1,2 – 1,4g/con,

khỏe mạnh được nuôi tại Viện Hải dương học Nha Trang Cá có màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt và không có các tổn thương bên ngoài Cá được bố trí và chia ngẫu nhiên 20 con/bể và để cá thích nghi khoảng 5 ngày cho quen dần với môi trường nước thí nghiệm Các nghiệm thức gồm: (1) lô đối chứng, tiêm dung dịch 1% NaCl vô trùng; (2 - 5) tiêm vi khuẩn ở nồng độ pha loãng khác nhau Mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần Lưu ý, trước khi gây cảm nhiễm, lấy ngẫu nhiên 4 con cá từ 4 bể để kiểm tra ký sinh trùng và phân lập vi khuẩn từ khoang bụng để xác định cá hoàn toàn không bị nhiễm bất cứ tác nhân nào trước cảm nhiễm

Tiến hành tiêm vào khoang bụng của mỗi con cá 0,05ml dung dịch huyền phù vi khuẩn (Hình 2.3) với các nồng độ pha loãng khác nhau từ 2.5x108 đến

106 CFU/ml Theo dõi liên tục biểu hiện của cá trong khoảng 10 ngày; trong quá trình nuôi, nước trong bể được thay 20% mỗi ngày bằng nước biển đã xử lý và được kiểm tra lại các thông số như: nhiệt độ, pH, NO2-, NH3/NH4+ nhằm đảm bảo không ảnh hưởng đến sức sống của cá Những con cá có dấu hiệu lờ đờ hoặc vừa mới chết trong khoảng 1 - 2h sẽ được thu nhận và tái kiểm tra hình thái khuẩn lạc vi khuẩn trên TCBS Sau đó, xác định giá trị LD50 dựa trên tỷ lệ cá chếttheo phương pháp của Wardlaw (1985)

Sau khi xác định được chủng vi khuẩn đích gây bệnh, tính nhạy cảm với O129 (2,4-diamino-6,7-di-isopropyl-pteridine phosphate) và hoạt tính hemolysis (làm tan máu) trên môi trường NA bổ sung 5% máu cừu, ủ ở 24 ± 2h, 28oC của vi khuẩn sẽ được xác định

Thông qua các đặc tính sinh lý, sinh hóa đã xác định ở bước sàng lọc sơ bộ; kết hợp với sử dụng Kit API-20E (Bio Mérieux, Pháp) (Phụ lục 1) để định danh vi khuẩn mục tiêu bằng phần mềm của kit API-20E (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

và phần mềm ABIS trực tuyến (http://www.tgw1916.net/bacteria_logare.html)

về hình thái khuẩn lạc và màu sắc trên môi trường TCBS

Các khuẩn lạc sau khi nuôi cấy và kiểm tra sẽ được pha thành dịch huyền phù với chỉ số McF là 0,5 Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn, cấy trang đều lên bề mặt của đĩa thạch MHA (Himedia, Ấn Độ) với bề dày thạch theo tiêu chuẩn 20 ± 1mm, lặp lại thao tác từ 2 - 3 lần Sau 15 phút, 8 khoanh giấy được tẩm trước với 8 loại kháng sinh lần lượt là Tetracycline (TE/30µg), Chloramphenicol (C/30µg), Amoxicilin (AMC/25µg), Cefadroxil (CD/30µg), Doxycyclin (D/30µg), Rifampicin (RA/5µg), Cefalexin (CL/30µg) và Cefixime (CFM/5µg) cùng khoanh giấy tẩm dung dịch 1% NaCl (đối chứng) được đặt lên mặt thạch đã được cấy dịch vi khuẩn sao cho phải tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch và đem ủ ở 28O

C trong 24h ± 2h Mỗi chủng vi khuẩn được lặp lại thí nghiệm 3 lần

Dòng vi khuẩn E coli ATCC 25922 được sử dụng làm chủng tham chiếu

Đường kính vòng vô khuẩn bao gồm đường kính của khoanh giấy kháng sinh được đo bằng thước với đơn vị là mm Dựa vào chuẩn đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của The Clinical and Laboratory Standards Institute (2007)

(CLSI - Tiêu chuẩn cơ sở lâm sàng và phòng thí nghiệm) để xác định dòng vi khuẩn mục tiêu kháng, nhạy hay trung gian với kháng sinh thử nghiệm (Phụ lục 2)

2.4.5 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thực vật

2.4.5.1 Chiết xuất dịch chiết thô từ thực vật

Đối với các loại thực vật: trầu không, trà xanh, ổi, trứng cá, cộng sản (cỏ lào), bạc hà, lô hội, húng quế và diếp cá sử dụng bộ phận lá nên sẽ chọn những lá bánh tẻ, tươi, không có dấu hiệu bệnh Sau đó rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt

độ phòng, xay thật nhuyễn bằng máy xay, vắt lấy dịch ép và ly tâm ở 7.000 vòng trong 5 phút Dịch nổi thu được được bảo quản nơi thoáng mát ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành thí nghiệm không quá 60 phút

Đối với tỏi, nghệ vàng, nghệ xanh và nghệ đen sử dụng bộ phận củ nên sẽ chọn những củ chắc và đều Bỏ vỏ, rửa sạch để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng Tương tự với cách xử lý các loại lá trên, củ cũng được đem xay nhuyễn, vắt lấy dịch

ép và ly tâm để thu dịch ép thô

2.4.5.2 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn

Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thực vật trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nôi,

1998 Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào dịch huyền phù vi khuẩn đã chuẩn bị trước với chỉ số McF 0,5 cấy trang đều trên bề mặt thạch MHA (với bề dày thạch 20

± 1mm) đã được đục 5 lỗ với đường kính 5mm/lỗ trước đó, để khô tự nhiên Sau khoảng 2 phút, nhỏ vào mỗi lỗ tương ứng với tên thực vật đã đánh dấu khoảng 40µl dịch chiết thô thực vật Với lỗ trung tâm nhỏ vào nước muối sinh lý vô trùng để làm đối chứng Đem ủ trong tủ ấm ở 37O

C với chủng E.coli ATCC 25922 và 28OC với các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm cá cảnh biển tại Vinpearl, đồng thời

với 2 chủng Vibrio TNX-X1 và YR-X2 gây bệnh trên cá ngựa (được phân lập xác

định độc tính tại phòng thí nghiệm CNSH – Viện CNSH&MT) Xác định đường kính vòng tròn kháng khuẩn sau 24 ± 2h Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên các mẫu thực vật tại 3 thời điểm (ngày) khác nhau