Tách chiết, thu nhận và khảo sát một số tính chất của Amylase nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) nuôi tại vùng biển Khánh Hòa

Sau đó xác định hàm lượng protein của dịch chiết, xác định hoạt tính amylase, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại hóa trị II ở nồng độ 1mM và 5mM đến hoạt tính của amylase,



TRẦN THỊ THANH HỒNG

TÁCH CHIẾT, THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT

SỐ TÍNH CHẤT CỦA AMYLASE NỘI TẠNG

TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus) NUÔI TẠI

VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cán bộ hướng dẫn: TS ĐỖ VĂN NINH

Nha Trang, tháng 06 năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi học tập Các thầy cô khoa Công nghệ Thực Phẩm của trường Đại học Nha Trang đã cung cấp những kiến thức, những kỹ năng cần thiết giúp tôi thực hiện đồ án một cách hoàn chỉnh nhất

Các anh chị, thầy cô trực thuộc tại các phòng thí nghiệm của Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Phòng thí nghiệm Sắc Ký của Viện Công Nghệ Sinh Học

và Môi Trường, trường Đại học Nha Trang

Các anh chị cao học, các bạn làm cùng phòng đã tận tình hỗ trợ trong quá trình thực hiện đề tài

Thầy Đỗ Văn Ninh đã tận tình chỉ đạo đề tài một cách tốt nhất và thầy Đỗ Hữu Nam đã trực tiếp hướng dẫn một cách công tâm nhất

Cảm ơn mẹ, cha đã luôn động viên ủng hộ về tinh thần và cả vật chất để giúp tôi thực hiện đề tài một cách tốt nhất

Tháng 5 năm 2013

Trần Thị Thanh Hồng

TÓM TẮT LUẬN ÁN

Trần Thị Thanh Hồng, Đại học Nha Trang, tháng 5 năm 2013

“ Tách chiết, thu nhận và khảo sát một số tính chất của amylase nội tạng tôm

hùm xanh (Panulirus homarus) nuôi tại vùng biển Khánh Hòa”

Giáo viên hướng dẫn:

TS Đỗ Văn Ninh

Đề tài nhằm cung cấp những kiến thức nền cho những nghiên cứu liên quan đến enzyme tiêu hóa amylase trong tương lai nhằm đến vấn đề lớn là nâng cao năng suất cũng như chất lượng của tôm hùm trong nước

Đề tài tiến hành tách chiết enzyme từ nội tạng tôm hùm xanh bằng cách trích ly bằng đệm Tris-HCl 0,05M; pH=7, trích ly trong 40 phút với tỉ lệ 1:7 và kết tủa bằng cồn 960 trong một giờ với tỉ lệ 1:6 Sau đó xác định hàm lượng protein của dịch chiết, xác định hoạt tính amylase, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại hóa trị II ở nồng độ 1mM và 5mM đến hoạt tính của amylase, khảo sát độ bền nhiệt của amyalse

Kết quả thí nghiệm cho thấy: enzyme amylase hoạt động ở nhiệt độ tối ưu là 500C,

pH tối ưu là 6, ion kim loại hóa trị II ở nồng độ 1mM thì chỉ ion Ca2+ kích thích hoạt động của enzyme amylase còn các ion còn lại thì không và ở nồng độ 5mM thì mọi ion kim loại đều kìm hãm hoạt động của enzyme amylase, đối với thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của amylase thì hoạt tính amylase so với nhiệt độ tối ưu ở

600C giảm 21,44%; ở 700C giảm 86,89%; ở 800C giảm 93,32%; ở 900C giảm 97,1%

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vii

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3 Ý NGHĨA VỀ ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 4

2.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus) 4

2.1.1 Phân loại và hình thái 4

2.1.2 Đặc điểm phân bố 5

2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 6

2.1.4 Đặc điểm sinh sản 7

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 7

2.1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tôm hùm nuôi 8

2.2 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME 9

2.2.1 Định nghĩa 9

2.2.2 Cấu tạo phân tử 10

2.2.3 Phân loại enzyme 10

2.2.4 Tính chất hóa lý 11

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme 11

2.3 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME TIÊU HÓA 14

2.3.1 Đặc điểm chung của hệ enzyme tiêu hóa 14

2.3.2 Sự sinh sản của hệ enzyme tiêu hóa 15

2.4 SƠ LƯỢC VỀ AMYLASE 16

2.4.1 Giới thiệu 16

2.4.2 α-Amylase 16

2.4.3 β-Amylase 19

2.4.4 Glucoamylase (α-1,4glucan-gluhydrolase) 21

2.5 SƠ LƯỢC VỀ TINH BỘT 22

2.5.1 Giới thiệu 22

2.5.2 Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase 22

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZYME 22

2.6.1 Phương pháp trích ly và kết tủa bằng muối 23

2.6.2 Phương pháp trích ly và kết tủa bằng dung môi hữu cơ 23

2.6.3 Phương pháp sử dụng Ph 24

2.7 CÁC VẤN ĐỀ TRONG XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 25

2.7.1 Một số điểm cần lưu ý khi xác định hoạt tính enzyme 25

2.7.2 Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt tính enzyme 26

2.8 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE 26

2.8.1 Đo sự biến thiêng độ nhớt của dung dịch 26

2.8.2 Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng với iod 27

2.8.3 Đo lượng đường khử tạo thành 27

2.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ ENZYME TIÊU HÓA CỦA TÔM HÙM 28

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 31

3.2 VẬT LIỆU 31

3.3 HÓA CHẤT SỬ DỤNG 31

3.4 THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 31

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.6 QUY TRÌNH THU NHẬN ENZYME VÀ THUYẾT MINH QUY TRÌNH 33

3.6.1 Quá trình thu nhận enzyme 33

3.6.2 Thuyết minh quy trình 33

3.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN 38

3.8 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE 38

3.9 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE 38

3.9.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính amylase 38

3.9.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính amylase 39

3.9.3 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính amylase 40

3.9.4 Độ bền nhiệt của amylase 41

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

4.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 43

4.1.1 Đường chuẩn albumin 43

4.1.2 Đường chuẩn iod 44

4.2 HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG MẪU 45

4.3 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA AMYLASE 46

4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính amylase 46

4.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính amylase 48

4.3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại II đến hoạt tính amylase 49

4.3.4 Độ bền nhiệt của amylase 51

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

5.1 KẾT LUẬN 53

5.2 ĐỀ NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHẦN PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN S: cơ chất S

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) 4

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của α-amylase 17

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của β-amylase 20

Hình 2.4 Cấu trúc không gian của glucoamylase 21

Hình 2.5 Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase 23

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của tôm hùm xanh (Panulirus

homarus)

32

Hình 3.9 Tủa enzyme thu được sau ly tâm lần thứ hai

Hình 4.1 Đường chuẩn albumin

39

Hình 4.2 Thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin 46

Hình 4.3 Đường chuẩn iod 47

Hình 4.4 Thí nghiệm xác định hàm lượng protein trong mẫu 48

Hình 4.5 Thí nghiệm khảo xác ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề[29][30][31][32]

Thủy sản Việt Nam trong hơn 10 năm qua đã có những bước phát triển vượt bậc, trở thành một trong những nước có tốc độ phát triển thủy sản nhanh trên thế giới Trong

đó, ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam được coi là tiến bộ nhanh nhất, bất chấp sự khởi đầu muộn và hiện chiếm khoảng 1/3 tổng sản lượng thủy sản của cả nước, góp phần quan trọng trong việc nâng cao sản lượng và giá trị xuất khẩu Nhắc đến ngành nuôi trồng thủy sản thì không thể không nhắc đến nghề nuôi tôm hùm lồng, ở nước ta nghề nuôi tôm hùm bắt đầu từ năm 1992 đến nay nghề nuôi tôm hùm lồng đang phát triển mạnh, số lượng lồng tăng lên đáng kể từ 1000 lồng (1997) lên 25.000 lồng (2002) và 52.696 lồng (2007) [1], sản lượng tôm hùm lồng đạt 1,3 nghìn tấn tăng 22,7%(Tổng Cục Thống Kê (GSO), 2011) Trong các tỉnh có nghề nuôi tôm hùm lồng phát triển có Khánh Hòa, tính đến nay lượng lồng tôm hùm nuôi

ở Khánh Hòa chiếm 2/3 trong tổng số lượng lồng nuôi của cả nước với 19.191 lồng nuôi, sản lượng tôm hùm lồng đạt gần 1000 tấn/năm (Chi cục nuôi trồng thủy sản Khánh Hòa, 2012) Vì những tiềm năng lớn mà nghề nuôi tôm hùm lồng mang lại nên những nghiên cứu liên quan nhằm nâng cao năng suất, sản lượng tôm hùm cũng

vì thế mà lần lượt được tiến hành liên quang đén các vấn đề như về bệnh tôm hùm, tập tính của tôm hùm, điều kiện sống,… Tuy nhiên những nghiên cứu này mới chỉ đánh giá về các khía cạnh bên ngoài con tôm chưa thực sự đi sau vào những yếu tố khác bên trong con tôm Một trong các yếu tố quan trọng bên trong tôm hùm không thể không nhắc đến đó là hệ enzym tiêu hóa của tôm hùm, một số đề tài nghiên cứu

về hệ enzym tiêu hóa ở nước ngoài như Comparative study of α-amylase acivity in three Cyprinid species of different feeding habits from Southern Iraq (R.AI-Tameemi1, A.Aldubaikul1, N.A.Salman1) [27] và Digestive enzym activity and food ingesta in juvenile shrimp Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) as a function

of body weight (Julián Gamboa-delgadol, César Molina-povedal and Chantal Cahu) [28] đã một lần nữa khẳng định rằng nghiên cứu hệ enzym tiêu hóa là một bước

quan trọng tiến tới sự hiểu biết cơ chế tiêu hóa và sự thích nghi của sinh vật với môi trường dinh dưỡng Dựa trên tầm quan trọng của việc nghiên cứu hệ enzym tiêu hóa

chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “ Tách chiết, thu nhận và khảo sát mốt số

tính chất của amylase nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) nuôi tại vùng biển Khánh Hòa” Với tôm hùm xanh là một trong những đối tượng nuôi biển đang

phổ biến tại vùng biển Khánh Hòa và amylase là một trong số những enzym tiêu hóa quan trọng cần nghiên cứu

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu của đề tài

 Mục đích:Tách chiết và tính chất của amylase nội tạng tôm hùm xanh

(Panulirus homarus) nuôi tại vùng biển Khánh Hòa

 Nội dung nghiên cứu:

 Tách chiết amylase từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus)

 Xác định hàm lượng protein thu được trong dịch chiết

 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme amylase được tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh

- Khảo sát hoạt tính của amylase theo nhiệt độ

- Khảo sát hoạt tính của amylase theo pH

- Khảo sát hoạt tính của amylase khi có mặt các ion kim loại hóa trị

II

- Khảo sát độ bền nhiệt của amylase

1.3 Ý nghĩa của đề tài

 Ý nghĩa khoa học:

Các số liệu nghiên cứu của đề tài bổ sung cho sự hiểu biết về hệ enzym tiêu hóa

của tôm hùm xanh (Panulirus homarus)

 Ý nghĩa thực tiễn:

Đề tài cung cấp những số liệu về tính chất của amylase nội tạng tôm hùm xanh

(Panulirus homarus) cho các nghiên cứu mở rộng hơn trong tương lai

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm sinh học của tôm hùm xanh (Panulirus homarus)[2][3][4][5]

2.1.1 Phân loại và hình thái

Theo hệ thống phân loại của Geogre và Holthius (1965), tôm hùm xanh có vị trí phân loại như sau:

Ngành chân đốt: Arthropoda

Lớp giáp xác: Crustaceae

Bộ mười chân: Decapoda

Họ tôm hùm gai: Palinuridae

Giống: Panulirus

Loài: Panulirus homarus (Linnaeus, 1758)

Hình 2.1.Tôm hùm xanh (Panulirus homarus)

(nguồn http://ropme.org/program7.html )

Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) còn gọi là tôm hùm đá có chân ngắn Toàn

thân có màu xanh lá cây nhạt Kích thước cơ thể không lớn, cá thể lớn nhất bắt gặp khoảng 1,5kg, còn đa số khoảng 0,3-0,4kg Đôi râu dài khoảng 1,4-1,5 chiều dài cơ thể Năm đôi chân bò có những vòng ngang màu vàng nhạt Các đốt bụng có rãnh

ngang có dạng lượn sóng thành những vòng nhỏ có nhiều lông mịn Hai cặp gai ở phiến gốc râu 1 xếp cách đều nhau tạo thành hình vuông, giữa có nhiều gai nhỏ

2.1.2 Đặc điểm phân bố

Phân bố của tôm hùm được quyết định bởi tính di truyền và quá trình thích nghi của loài với các điều kiện tự nhiên, môi trường ở từng vùng biển Chu kỳ sống của tôm hùm trải qua nhiều lần thay đổi môi trường sống khác nhau, nghĩa là mỗi giai đoạn sống của chúng gắn với một điều kiện sinh thái nhất định và tạo nên quần thể ấu trùng riêng biệt

Giai đoạn ấu trùng Phyllosoma sống trôi nổi như những sinh vật phù du trên biển và

đại dương vì thế khả năng phát tán là rất lớn do tác dụng của sóng, gió, dòng chảy,… Hầu như trong suốt thời kỳ này chúng luôn di chuyển và phụ thuộc hoàn

toàn vào điều kiện thủy văn môi trường biển khơi Sau khi ấu trùng Phyllosoma trải qua 12 - 15 lần lột xác biến thái chúng chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng Puerulus

và bắt đầu đời sống định cư Ấu trùng Puerulus thường phân bố ở vùng gần dân cư, nguồn thức ăn khá phong phú Giai đoạn này ấu trùng Puerulus bơi chủ động hơn

chúng thích bám trên rong trên đá và các vật trong nước

Sau khoảng 4 lần lột xác và biến thái ấu Puerulus chuyển sang giai đoạn tôm con (Juveline) Màu sắc hình thái giống với tôm trưởng thành Chúng sống trong các

vịnh, vũng, đầm,… ven biển

Tôm hùm khi đạt tới kích cỡ trưởng thành có xu hướng di chuyển ra khỏi các đầm, vũng, vịnh,… để đến những vùng rạn sâu hơn Nơi những điều kiện sinh thái phù hợp với sự sinh trưởng và sinh sản của loài

Ở Việt Nam, dọc bờ biển từ Quảng Bình, Quảng Trị đến Ninh Thuận, Bình Thuận

có sự hình thành và phát triển của các kiểu dạng vũng, vịnh trên các đoạn bờ biển khác nhau, thích hợp cho quá trình sinh sống, nhập cư và di cư của tôm hùm con từ biển khơi vào vịnh, rồi từ vịnh trở lại biển khơi Tuy nhiên khác với giai đoạn ấu trùng, tôm hùm con sống đáy ổn định hơn và thường tập trung ở những vùng rạn trong các vịnh, vũng, đầm với độ sâu phân bố dao động từ 0,5 - 5,0 m Tập tính sống bầy đàn thể hiện rất rõ Chúng thường nấp trong các khe, kẽ đá, hoặc bám chắc

vào những hõm, lỗ nhỏ của đá ghềnh Vùng thềm lục địa miền Trung nước ta có nhiều đá ngầm, đá nổi , rạn đá, rạn san hô,… là nơi cư trú rất thích hợp cho tôm hùm trưởng thành Trong suốt thời kì này, tôm hùm thường sống trong các vùng rạn ngầm và rạn ghềnh có độ sâu từ 10 đến 50 mét, thường là các vùng rạn ven bờ và các hải đảo, nền đáy là đá tảng, san hô và cát bùn

2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Sinh trưởng của tôm hùm được xác định bằng sự gia tăng về chiều dài giáp đầu ngực hoặc khối lượng cơ thể Chu kỳ lột xác thể hiện mức độ sinh trưởng cá thể của loài, khi lột xác khối lượng cơ thể tăng lên rõ rệt Có nhiều yếu tố tác động trực tiếp hay gián tiếp đến chu kỳ lột xác của tôm hùm bao gồm nhiệt độ nước, ánh sáng,…

và các yếu tố nội tại của cơ thể bao gồm các hormone kích thích lột xác hay các hormone ức chế lột xác Ba yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến chu kỳ lột xác của tôm hùm là thức ăn, nhiệt độ nước và tính di truyền của loài, nhiều tác giả đã nhấn mạnh tầm quan trọng của thức ăn và việc quản lý chăm sóc là tác nhân làm tăng tần số lột xác đáng kể

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thúy (2004), trên tôm hùm bông (P

ornatus), nhóm tôm con có kích thước 15 - 20 mm CL (chiều dài giáp đầu ngực), ở

nhiệt độ bình thường (26 - 27oC) thì thời gian giữa 2 lần lột xác là 8 - 12 ngày nhưng khi nhiệt độ tăng cao và ổn định (29 - 30oC) thời gian lột xác giảm xuống khoảng một nửa, khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 20 -24oC thời gian giữa 2 lần lột xác kéo dài gấp 1 - 1,2 lần Thành phần dinh dưỡng của thức ăn có ý nghĩa rất quan trọng đối với sinh trưởng của tôm con, thức ăn giàu các axít amin không thay thế và các axít béo không no có tác dụng kích thích sinh trưởng tôm con rõ rệt Ngoài ra

độ mặn cũng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của tôm độ mặn thích hợp cho sự phát triển của tôm hùm con là 25 - 35‰

Đối với tôm hùm, ở cùng một nhóm chiều dài CL thì chu trình lột xác giữa các loài không có sự sai khác nhau một cách đáng kể, nhưng các nhóm kích thước khác nhau thì chu trình lột xác hoàn toàn khác nhau Ví dụ như với nhóm kích thước từ 8

- 13 mm (CL), thời gian giữa 2 lần lột xác khoảng 8 - 10 ngày, còn nhóm kích thước

63 - 68 mm (CL) thì chu kì lột xác khoảng 40 ngày ở cả 2 loài tôm hùm bông

(P.ornatus) và tôm hùm xanh (P homarus)

Qua mỗi lần lột xác thì tỉ lệ phần trăm khối lượng tăng, tỉ lệ chiều dài giáp đầu ngực của tôm giảm xuống, độ dài vỏ của cá thể tăng Nhìn chung thì tôm hùm có chu kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp xác khác, do vậy tốc độ tăng tưởng của chúng tương đối chậm

2.1.4 Đặc điểm sinh sản

Tôm hùm thuộc giống Panulirus nói chung, con tôm đực luôn có kích thước lớn

hơn con tôm cái khi đạt đến giai đoạn thành thục sinh dục và cá thể đực có đôi chân

bò dài hơn hẳn cá thể cái Quá trình cặp đôi giao vĩ chia làm 2 pha khá rõ rệt Pha trước giao vĩ kéo dài khoảng 5 - 13 giờ và pha giao vĩ kéo dài khoảng 3 - 12 giờ, tuy nhiên thời gian giao vĩ hoàn toàn khoảng 1 - 2 phút Sau khi giao vĩ xong, buồng trứng tiếp tục phát triển, con cái có xu hướng chuyển đến những vùng có rạn đá sâu, nhiều hang hóc để đẻ trứng Khi tôm hùm đẻ, trứng thụ tinh bám dính các nhánh trong chân bụng thứ nhất đến thứ tư của tôm mẹ, ở đây trứng phát triển qua các giai đoạn phôi khác nhau cho đến khi nở ra ấu trùng Từ lúc trứng nở đến giai đoạn “tôm

trắng” kéo dài khoảng 10 - 12 tháng Tôm hùm xanh loài (P homarus) sinh sản tập

trung vào tháng 4 và tháng 5 hàng năm

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Nguồn cung cấp năng lượng duy nhất cho tôm hùm sinh trưởng và phát triển là các loại thức ăn Song tùy theo loài và các giai đoạn phát triển mà phổ thức ăn của chúng thay đổi khác nhau Ngoài tự nhiên tôm hùm thường kiếm mồi vào ban đêm, thích mồi sống, ăn cả mồi chết, ngay cả thịt gia súc, gia cầm chết Nghiên cứu về phổ thức ăn của tôm hùm cho thấy, đây là loài thuộc nhóm giáp xác ăn thịt nhưng ít

đi kiếm ăn, trong dạ dày của chúng có tới 65 loài sinh vật làm thức ăn, chiếm ưu thế

là động vật thân mềm một mảnh vỏ và hai mảnh vỏ Tuy nhiên, khả năng đồng hóa thức ăn của tôm hùm tương đối thấp

Trong các thí nghiệm, tôm hùm con được cho ăn động vật thân mềm hai mảnh vỏ sinh trưởng nhanh hơn tôm hùm chỉ có ăn cá Nếu thiếu thức ăn hoặc thức ăn thiếu

canxi, chúng thường ăn thịt lẫn nhau, nhất là khi tôm lột xác Vì vậy, trong thức ăn cho tôm hùm nên có một lượng tôm, cua (khoảng 30%) Các nghiên cứu gần đây nhận thấy: tôm hùm được nuôi thành đàn thì tôm ăn mồi nhiều hơn khi nuôi riêng

lẻ, khi có chỗ ẩn nấp, tôm hùm con ăn nhiều hơn, sinh trưởng nhanh hơn Sự ăn mồi của tôm hùm cũng thay đổi theo chu kỳ lột xác Trước lột xác khoảng 2 ngày và sau lột xác 2 ngày, chúng hầu như ngừng ăn Sau thời gian nhịn đói, tôm ăn rất nhiều trong 4-5 ngày tiếp theo, sau đó chúng giảm ăn dần và trở lại mức bình thường

2.1.6 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tôm hùm nuôi

* Nhiệt độ nước

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng, quyết định sự phân của các giống

tôm hùm trong họ Palinuridae Hầu hết các loài thuộc giống Panulirus sống ở vùng

biển ấm, nhiệt độ dao động từ 20 - 300C, trung bình khoảng 250C

Ở vùng biển miền Trung Việt Nam, theo những số liệu điều tra cho thấy, nhiệt độ nước vùng phân bố tôm hùm bông nhỏ ngoài tự nhiên dao động từ 24 - 310C; còn ở tôm hùm trưởng thành dao động từ 26 - 290C vào mùa hè và khoảng 22 - 270C vào mùa đông Khi nhiệt độ nước thay đổi đột ngột, chẳng hạn như tăng 3 - 50C thì hầu như tôm hùm con bị chết, khi giảm nhiệt độ nước xuống 50C làm cho pha lột xác của tôm chậm lại và dừng lại hoàn toàn

* Độ mặn

Theo Võ Văn Nha (2008), những số liệu điều tra cho thấy vùng phân bố tôm hùm con ngoài tự nhiên có độ mặn dao động trong khoảng 33 - 34‰ Sự thay đổi đột ngột độ mặn (từ 5 - 15‰) sẽ làm hoạt động bắt mồi tôm con giảm từ 30 - 90%, khi nguồn nước có độ mặn thấp 20 - 25‰ kéo dài 3 - 5 ngày sẽ gây nên tình trạng chết

từ từ của tôm con Độ mặn vùng biển có tác động đến hoạt động bắt mồi, khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu,… từ đó hoặc kéo dài thời gian lột xác hoặc gây chết đối với tôm hùm con Ở khu vực miền Trung Việt Nam, tôm hùm trưởng thành sống ngoài khơi ở độ sâu dưới 10m nước, độ mặn dao động từ 30 - 35‰

* Thức ăn

Trong nuôi tôm hùm thương phẩm thức ăn chiếm tới 50 - 70% giá thành sản xuất Thức ăn phải đảm bảo giá trị dinh dưỡng và được tôm chấp nhận Để bảo đảm cho

sự phát triển bền vững của nghề nuôi tôm hùm thì thức ăn phải đáp ứng được các yêu cầu về dinh dưỡng, tính sẵn có, giá rẻ, dễ bảo quản Yêu cầu của người nuôi lúc này là tìm ra loại thức ăn, chế độ cho ăn phù hợp giúp tôm tăng trưởng nhanh, hệ số thức ăn thấp và ít tác động tiêu cực đến môi trường

* Chất lượng nước

Amonia chiếm từ 60 - 100% tổng lượng nitrogen mà giáp xác thải ra, lượng amonia tăng lên cùng với việc gia tăng lượng thức ăn, khối lượng cơ thể tôm và nhiệt độ nước Lượng amonia trong nước bị ảnh hưởng bởi mức protein có trong thức ăn, nhịp điệu ngày đêm, độ mặn, giai đoạn lột xác và hàm lượng lượng oxy hoà tan Khi ở nồng độ cao amonia gây độc hoặc ức chế tăng trưởng cho tôm và hàm lượng

amonia tổng số khi nuôi loài tôm hùm Jasus edwardsii nuôi trong hệ thống tuần

hoàn nước nên nhỏ hơn 0,5 mg/L, NH3-N không nên vượt quá 0,1 mg/L, NO2-N bằng hoặc nhỏ hơn 1 mg/L, NO3-N nhỏ hơn 100 mg/L, pH 7,8 - 8,2

* Hàm lượng oxy hoà tan

Hàm lượng oxy hoà tan rất quan trọng đối với thuỷ sinh vật nói chung và tôm hùm nói riêng Lượng oxy tôm tiêu thụ phụ thuộc vào giới tính của tôm, khối lượng cơ thể, giai đoạn lột xác, hoạt động bắt mồi, nhiệt độ nước và độ mặn, khi độ mặn và nhiệt độ nước cao thì hàm lượng oxy hoà tan thấp, các loại thức ăn dễ phân rã, thức

ăn thừa cũng làm tăng nhu cầu oxy hoá sinh học, tỷ lệ tiêu thụ oxy ban đêm cao hơn ban ngày Hàm lượng Oxy hòa tan trong nước vùng nuôi tôm hùm lồng trong khoảng 6,2 - 7,2(mg/lít)

2.2 Sơ lược về enzym[6]

tham gia xúc tác tất cả các phản ứng biến đổi trong tế bào và cơ thể sống Trong đó nhiều enzyme đóng vai trò điều hoà chủ đạo trong việc điều khiển sự phối hợp nhịp nhàng các phản ứng của quá trình trao đổi chất

- Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong các điều kiện bình thường ở ngoài cơ thể nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác nhau trong điều kiện hết sức bình thường

- Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hóa sẽ đình trệ, các hoạt động sống, sinh sản, phát triển của cơ thể sống không được bình thường

- Tóm lại, enzyme là protein xúc tác sinh học do tế bào sống snar xuất ra có tác dụng tăng tốc độ và hiệu xuất phản ứng hóa sinh mà sau phản ứng vẫn còn giữu nguyên khả năng xúc tác

2.2.2 Cấu tạo phân tử

- Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn ở nhiệt độ thường và có tính đặc

hiệu rất cao cho nên cấu tạo phân tử của enzyme rất tinh vi và phức tạp Enzyme có bản chất protein, phân tử lượng lớn thường là từ 6.000 đến 1.000.000 Datol

- Trung tâm hoạt động của enzyme

Mỗi hoạt động xúc tác của enzyme đều thông qua bộ phận đặc biệt của phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Trung tâm này gồm những nhóm hóa học, những liên kết peptit tiếp xúc trực tiếp với cơ chất Một phần hoặc toàn bộ phân

tử enzyme được coi là có khung cấu trúc thích hợp để duy trì hình dạng cần thiết đối với tính chất đặc hiệu và hiệu lực xúc tác Do vậy khi làm thay đổi hình dạng của chúng dẫn đến khả năng xúc tác bị thay đổi Trung tâm hoạt động của enzyme thường gồm những axit amin có nhóm hóa học có hoạt tính cao như serin (-OH), histidin (vòng inmidozol), cytein(-SH), lysin(-NH3), tryptophan (indol), glutamic (-COOH) Các gốc axit tạo nên trung tâm hoạt động không nhất thiết sắp xếp ở cạnh nhau trong cấu trúc bậc 1 nhưng cạnh nhau trong cấu trúc bậc 2, 3 và 4

2.2.3 Phân loại enzyme

Có nhiều cách phân loại enzym nhưng dựa vào thành phần cấu tạo thì có 2 loại:

2.2.4 Tính chất hóa lý[6][7]

- Khi hòa tan trong nước enzym cho một dung dịch keo với những tính chất đặc trưng như khuyết tán kém, áp suất thẩm thấu thấp, độ nhớt cao,…

- Enzym có tính lưỡng cực

- Mỗi enzym có một điểm đẳng điện, tại điểm này chúng có độ hòa tan thấp nhất

- Enzym không chịu được nhiệt độ cao, dễ bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác

- Enzym cũng bị phá hủy bởi các tác nhân phá hủy protein

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme[8][9][11]

Nếu cố định nồng độ enzym và thay đổi nồng độ cơ chất S thì người ta nhận thấy đầu tiên vận tốc phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất S Nhưng khi nồng độ S tiếp tục tăng thì đường biểu diễn uốn cong và với nồng độ S cao thì vận tốc phản ứng không tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận với giá trị cực đại Vmax Thời điểm này enzyme đã bão hòa cơ chất

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ, người ta nhận thấy xuất hiện hai kỳ riêng biệt tương ứng hai hiện tượng khác nhau:

+ Ở nhiệt độ thấp 0-400C vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng

+ Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzym), vận tốc phản ứng giảm xuống do sự biến tính của protein Đa số các enzym mất hoạt tính ở 80-1000C Khoảng nhiệt độ tối ưu là khoảng nhiệt độ mà tại đó enzym đạt hoạt tính cao nhất

Đa số các enzym có nguồn gốc động vật có nhiệt độ tối ưu vào khoảng 40-500C và các enzym có nguồn gốc thực vật khoảng 50-600C

- Ảnh hưởng của pH

Sự thay đổi pH gây nên:

+ Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptide của enzyme làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức enzyme-cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy chuỗi polypeptide của enzyme

+ Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự tạo thành phức enzyme-cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở dưới dạng ion

Như vậy hoạt tính của enzyme thay đổi theo pH của môi trường và người ta có xác định giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một enzyme Ngoài pH tối ưu vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng

- Ảnh hưởng của ion kim loại

+ Các ion kim loại có thể kìm hãm hay hoạt hóa enzyme Các ion kim loại nặng, ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng Tác dụng của

ion phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt quá ngưỡng nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme Giới hạn nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy ở cùng một nồng độ, cùng một điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion kim loại có thể

có tác dụng đối ngược nhau, trước đây còn gọi là tác dụng đối kháng giữa các ion Hiện tượng này xảy ra giữa các ion cùng hóa trị

+ Dưới tác dụng của ion kim loại có thể làm thay đổi pH thích hợp của enzyme Mặt khác tác dụng của ion kim loại có thể thay đổi tùy theo cơ chất, pH tác dụng của enzyme

+ Tác dụng hoạt hóa của ion kim loại cũng có tính đặc hiệu, mỗi ion kim loại thường hoạt hóa các enzyme xúc tác cho một kiểu phản ứng nhất định, tuy nhiên mức độ đặc hiệu thay đổi tùy ion

+ Các ion kim loại có thể liên kết trực tiếp với các gốc axid amin của phân tử enzyme hoặc thành phần cấu tạo của phân tử CoE

- Ảnh hưởng của các anion

Nhiều anion có tác dụng hoạt hóa enzyme, ví dụ kinh điển nhất là ảnh hưởng của anion Cl- đến hoạt độ của α-amylase của động vật Tác dụng hoạt hóa của ion Cl-lớn đến mức có thể xem là chất hoạt hóa tự nhiên của α-amylase Các ion hóa trị một khác như Br-, F-, NO3 cũng có tác dụng hoạt hóa α-amylase Một số anion khác như SO42-, PO43- có tác dụng hoạt hóa fumarate hydrate Khi có mặt các anion có thể làm thay đổi pH thích hợp của enzyme về phía kiềm

- Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Một số chất có thể làm tăng hoạt độ enzyme bằng cách gián tiếp hay trực tiếp Gọi

là gián tiếp nếu tác dụng hoạt hóa là do loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme Một số chất có tác dụng hoạt hóa trực tiếp như axid ascorbic, axid lipoic, glutation dạng khử có thể trực tiếp tham gia phản ứng kết hợp và loại thuận nghịch hydro nên chúng có thể hoạt hóa các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử Các chất hoạt hóa trực tiếp thường

tác dụng vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm biến đổi cấu hình phân tử enzyme theo hướng có lợi hoạt động xúc tác

- Ảnh hưởng của chất ức chế

Là chất làm giảm tốc độ xúc tác của enzyme Chất ức chế có thể gây ra quá trình ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế trên phức hợp enzym cơ chất

2.3 Sơ lược hệ enzyme tiêu hóa[10]

2.3.1 Đặc điểm chung của enzyme hệ tiêu hóa[23][26][36]

- Sự tiêu hóa thức ăn ở động vật là một chuỗi những quá trình hóa sinh học xảy ra ở miệng, dạ dày, ruột làm giảm kích thước phân tử và làm hòa tan các thành phần thức ăn bằng enzyme tiêu hóa

- Thực phẩm chủ yếu bao gồm thành phần chính là protein, cacbonhydrat, chất béo, muối khoáng và một lượng nhỏ các yếu tố khác Cơ chế chính xác của sự tiêu hóa rất phức tạp và enzyme tiêu hóa góp phần cần thiết vào trong quá trình này

- Một vài enzyme tiêu hóa:

+ Enzyme pepsin được tiết dưới dạng pepsinogen không hoạt động trong môi trường HCl, pepsinogen sẽ được hoạt hóa thành pepsin Pepsin tác động lên protein trong thức ăn tạo chuỗi peptit ngắn chứa khoảng 4-12 axit amin

+ Enzyme trypsin được bài tiết dưới dạng tiền enzyme trypsinogen, tiền enzyme này gặp enzyme enterokinase của ruột thì biến thành trypsin hoạt động Trypsin lại

+ Enzym lipase của tụy lá một enzyme tiêu hóa mỡ rất mạnh Tác dụng của lipase

là thủy phân mỡ thành một hỗn hợp glyxerit và axit béo

+ Enzyme amylase của tụy tác động lên tinh bột giống như enzyme ptyalin của nước bọt nhưng tác dụng của men amylase tụy mạnh hơn và enzyme này có thể tiêu hóa được tinh bột sống Cũng như ptyalin nước bọt, amylase tụy cần có nhiều ion

Cl- để phát huy tác dụng Độ pH tối thiểu cho enzyme này là 6,5-7 Một phần nhỏ amylase của tụy bài tiết ra được chuyển sang máu, làm cho máu cũng có một ác dụng là tiêu hóa được tinh bột

+ Enzyme mantase của tụy biến mantose thành glucose

+ Enzyme nuclease của tụy phân hủy các axit nucleic giải phóng những đoạn nucleotit đơn giản

2.3.2 Sự sinh sản của hệ enzyme tiêu hóa[18][19][20]

- Enzyme tiêu hóa được sản sinh ra bởi những tuyến khác nhau như tuyến nước bọt, tuyến trong dạ dày, tụy tạng và những tuyến ruột non

- Tuyến nước bọt ở động vật có vú tiết ra enzyme α-amylase giúp thủy phân tinh bột

- Enzyme được tiết ra từ trong dạ dày gồm có pepsin Từ tuyến tụy có enzyme trypsin, chymotripsin, amylase Trong ruột non thì có enzyme lipase, maltase, isomaltose, lactase,

2.4 Sơ lược về amylase[6][12][13][14][15]

2.4.1 Giới thiệu

- Amylase là một loại enzyme rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

- Exoamylase gôm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

+

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của α-amylase

- Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là một quá trình đa giai đoạn:

+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iod Các chất này

bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose một)

+ Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo và bị phân giải chậm đến maltotetrase và maltotriose và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm

thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,4-glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

- Thông thường trong khoảng thời gian ngắn 30-60 phút α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính đặc trưng của nó Vì vậy, người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay dịch hóa

- α-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên

tử gam Ca/mol nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác Đặc tính này

sẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Hg2+, Cu2+, Ag+ Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Sn2+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase

- Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2 Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0

- Độ bền nhiệt đối với tác dụng của acid cũng khác nhau α-amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH=3,6 và 00C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase

của vi khuẩn bị bất hoạt đến 50% trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi gần như giảm (Fenilxova, Rmoshinoi, 1989) Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH=5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được

pH từ 2,5-2,8 Ở 00C và pH=2,5 nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

- Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác dụng nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C (Kozmina, 1991)

- Trong dung dịch đệm pH=4,7 α-amylase của Asp.oryzac rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin của nó chỉ còn 22%-29%, hoạt lực đường hóa còn 27%-85% Ở 500C trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này

bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự)

2.4.3 β-Amylase

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của β-amylase

(nguồn http://mrc-Imb.cam.ac.vk/β-amylase)

- Xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glucogen, polysaccharide cùng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch

- β-Amylase không có khả năng thủy phân tinh bột sống mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột nên trong công nghệ sản xuất bia nó chỉ hoạt động ở giai đoạn đường hóa

do khả năng chịu nhiệt kém

- β-Amylase phân giải 100% amylase thành maltose, 54%-58% amylopectin thành maltose Quá trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng Mỗi nhánh ngoài cùng có từ 20-26 gốc glucose nên tạo thành được 10-12 phân tử maltose Khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6-glucoside cà được gọi là β-dextrin, β-dextrin cho màu tím với iod Độ nhớt của dung dịch giảm chậm Tác dụng của β-amylase lên tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau:

Tinh bột (glucogen) β-amylase Maltose (54%-58%) + β-dextrin (42%-46%)

- Nếu cho cả α-amylase và β-amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinh bột lại bị thủy phân tới 95%

- β-Amylase là một albumin, tâm xúc tác của nó có chứa các nhóm –SH và nhóm –COOH cùng với vòng imilazol của gốc hitstidin Khác với α-amylase, β-amylase không cần Ca làm bền cấu trúc

- β-Amylase bị ức chế mạnh bởi các kim loại nặng như Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, ozon

- β-Amylase rất dễ bị mất hoạt tính dưới tác dụng của aceton

- pH tối thích của β-amylase là 5,1-5,7 (tối ưu là 5,7), β-amylase chịu nhiệt kém, nhiệt độ thích hợp <550C, ở 700C β-amylase bị vô hoạt β-Amylase có nhiều trong hạt nảy mầm, không có trong vi khuẩn và nấm mốc

- Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH=3,5-5,5 Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất: glucoamylase từ A.niger là 6,5; từ A.awamoni là 7,5; từ R.delemar là 7,4 pH hoạt động tối thích của glucoamylase còn thay đổi tùy vào nhiệt độ và thời gian tác dụng Glucoamylase của R.delemar có hoạt lực cao nhất ở pH=4,7-5 và nhiệt độ là 550C-600C, nhưng khi giảm xuống 400C thì pH tối thích là 4,5 Chế phẩm glucoamylase từ Endomycopis có pH tối thích rất hẹp từ 5,4-5,6 thời gian tác dụng là 30 phút Nếu tăng thời gian lên thì pH tối thích mở rộng là 4,7-5,6

- So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton và không được bảo vệ bởi Ca

- Không bị ức chế bởi ion kim loại nặng

- Phân tử lượng của glucoamylase tách từ A.niger là 57000, từ A.awamori là 62000

2.5 Sơ lược về tinh bột[7]

2.5.1 Giới thiệu

- Tinh bột là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quang trọng tích lũy trong củ, quả, hạt (lúa: 60-80%, ngô: 65-75%, khoai tây: 12-20% )

- Tinh bột được tổng hợp ở thực vật gồm hai thành phần chủ yếu:

+ Amylose tan trong nước cho phản ứng màu xanh với iod

Amylose có cấu tạo hóa học là chuỗi dài không phân nhánh của các gốc glucose nối lại với nhau bằng liên kết α-1,4 glucozit Phân tử amylase có trọng lượng khoảng 20.000-50.000đvC, có dạng xoắn mỗi vòng chứa 6 phân tử glucose + Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đường đơn nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glucozit và α-1,6 glucozit Amylopectin cho màu tím đỏ với iod Trọng lượng phân tử thường là vài triệu đvC

α-D Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15α-D 25% amylase và 75α-D 85% amylopectin

2.5.2 Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase

Hình 2.5.Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase

(nguồn http://s4.zetaboards.com)

2.6 Các phương pháp tách chiết enzyme[10][16]

2.6.1 Phương pháp trích ly và kết tủa bằng muối

- Nguyên tắc: muối có nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh enzyme

và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme

- Trong công nghiệp người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate Nhược điểm của nó là tính ăn mòn rất cao Sau này người ta thay thế bằng sodium sulfate, muối này không gây hư hỏng thiết bị nhưng tính hòa tan của nó không tốt

- Nhiệt độ tiến hành tủa enzyme có thể là 35-400C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme người ta phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này lại với nhau Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trong những thí nghiệm cụ thể Khoảng tối

ưu nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng khoảng 20-80%

2.6.2 Phương pháp trích ly và kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ

- Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi tương tác của enzyme sẽ tăng lên

- Nguyên tắc: khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nước bao quanh enzyme Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi và một lượng lớn nước được đẩy đi Các phân tử nước sắp xếp rất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu cơ

- Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme có thể do các lực tĩnh điện, lực Vander Waals (giống như ở muối) Tương tác kỵ nước trong trường hợp này không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đó lượng dung môi sử dụng trong quá trình kết tủa là ít nhất

- Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và aceton

để kết tủa enzyme Khi tiến hành kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ thì cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc aceton, nên bắt buộc khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của

enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3-100C Tỷ lệ và nông độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch

- Nhược điểm: có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ Nguyên nhân là do khi hằng số điện môi giảm phân tử protein có thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng không hoạt động, trong khi các gốc kỵ nước lại tiếp xúc với dung môi Hiện tượng này xảy ra khi tủa ở nhiệt độ phòng, nếu thực hiện ở nhiệt độ 4-100C không thấy xuất hiện kết tinh enzyme

- Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính của enzyme Do đó dung dịch sau lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh

sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp (thời gian khuấy 5-10 phút trong lúc đó nhiệt độ không quá 50C)

2.6.3 Phương pháp sử dụng pH

- Protein là chất lưỡng cực chúng có cả nhóm axit và nhóm base Mức độ hòa tan của enzym phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng axit vì thế quá trình này được gọi là quá trình kết tủa axit Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ chứ không được thực hiện ở quy mô công nghiệp Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme Như vậy, thiết bị phản ứng càng lớn, khả năng làm thay đổi hoạt tính enzyme càng lớn, khi đó thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng kéo dài, enzyme càng dễ bị biến tính

2.7 Các vấn đề trong xác định hoạt tính enzyme[11]

2.7.1 Một số điểm cần lưu ý khi xác định hoạt tính enzyme

- Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp Đối với những enzyme lần đầu tiên được nghiên cứu, pH trung tính và

nhiệt độ từ 300C-370C có thể được lựa chọn để thử nghiệm Tuy vậy, có nhiều enzyme chỉ hoạt động ở một dải nhiệt độ và pH hẹp và không phụ thuộc vùng lựa chọn ban đầu khi đó cần có những điều chỉnh thích hợp để phát hiện và đo được hoạt độ của enzyme

- Bên cạnh pH và nhiệt độ, cũng cần lưu ý đến cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền như Ca2+, glycerol, albumin huyết thanh bò (BSA) hay một số chất khác

- Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, vì vậy phải dùng đệm hay một hệ thống đệm nào đó Nồng độ đệm thường dùng là 20-50mM Tuy vậy với các phân tử sinh axit, base thì phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn để tránh thay đổi pH trong quá trình phân tích Một số đệm có thể làm kết tủa một số yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+ vì vậy phải lựa chọn loại đệm thích hợp cho phân tích

- Trong phân tích hoạt độ enzyme, cơ chất, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng Với các phân tích đồng thời nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng của tất cả các mẫu phải được duy trì như nhau

- Phải luôn luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số

- Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp Trong một số trường hợp, cách làm ngừng phản ứng enzyme có thể làm biến đổi cơ chất hay sản phẩm cần đo Trong nhiều trường hợp khác, chất làm ngừng phản ứng có thể can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm phản ứng enzyme, ví dụ như chất làm ngừng phản ứng có cùng bước sóng hấp thụ ánh sáng cần đo với chất phản ứng, hay

ức chế tạo màu tiếp theo của phân tích

- Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bảo hòa enzyme nhưng không quá cao đến mức kìm hãm enzyme

- Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng

- Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao

- Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5-30 phút Trong mộ số trường hợp có thể kéo dài 24 giờ nếu hoạt tính của enzyme quá thấp Trong trường hợp đó cần phải cho thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm thuận lợi cho vi sinh vật phát triển

2.7.2 Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Các phản ứng do enzyme xúc tác có thể được khái quát và đơn giản hóa bằng phương trình phản ứng chung dưới đây:

E + S ES ES* E + P

Trong phương trình phản ứng trên: E là enzyme

S là cơ chất

ES là phức chất hình thành giữa enzyme và cơ chất

ES* là phức chất giữa enzyme và cơ chất trong

đó cơ chất đã được biến đổi thành dạng gần như sản phẩm của phản ứng

2.8 Các phương pháp xác định hoạt tính amylase[10]

2.8.1 Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch[20]

- Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch được đo bằng nhớt kế khi cho enzyme tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt dung dịch giảm dần

- Phương pháp đo độ nhớt của Davison Độ nhớt của dung dịch phụ thuộc vào kích thước phân tử của hệ phân tán Khi cắt phân tử tinh bột thành những dextrin làm độ

nhớt của dung dịch giảm Trong phương pháp này hoạt tính amylase được xác định

là lượng enzyme làm giảm 20% độ nhớt trong 60 phút hoặc 10% trong 19,2 phút hoặc 5% trong 8,4 phút Do đó nếu như 0,2ml dung dịch enzyme làm giảm độ nhớt ban đầu trong 20 phút thì dung dịch sẽ chứa 15 đơn vị amylase (60/(20*0,2)) trong 1ml

2.8.2 Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng màu với iod[6]

- Khi có amylase tác dụng thì các sản phẩm thủy phân của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod

2.8.3 Đo lượng đường khử tạo thành[6]

- Phương pháp này dựa vào quy tắc dưới tác dụng của amylase tinh bột bị thủy phân tạo ra dextrin và đường khử Vì vậy sự tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực của enzyme Để định lượng đường khử tạo thành có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp Nelson, Bernfeld, Luff-Schoorla cải tiến, Graxianof,…

- Nguyên tắc chung là lợi dụng tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khử tác dụng với các chất khác nhau hay phản ứng với dung dịch Cu2+ tạo thành kết tủa

Cu2O Hòa tan kết tủa Cu2O bằng các chất khác nhau và định lượng Cu để suy ra lượng đường khử

- Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme mà trong 30 phút ở 300C có thể phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương đương 1micromol glucose

2.9 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzym tiêu hóa của tôm hùm

Hiện nay trong nước vẫn chưa tiến hành một nghiên cứu nào về hệ enzyme tiêu hóa của tôm hùm Dưới đây là một số nghiên cứu liên quan trên thế giới:

- Các nhà nghiên cứu của F Galgani và F Nagayama (1987) đã tiến hành nghiên

cứu hệ protease tiêu hoá ở tôm hùm gai Nhật Bản Panulirus japonicus, cho thấy

tuyến tiêu hoá của chúng hoạt động ở pH tối ưu là 7.5 và nhiệt độ thích hợp là 60oC

Ủ dịch chiết hệ tiêu hoá tôm hùm gai ở 37 oC và pH 4 làm cho chúng bị bất hoạt không thuận nghịch sau 24 giờ

Trypsin, collagenase, leucin aminopeptidase và cả carboxypeptidases a và b đều

được tìm thấy trong tuyến tiêu hoá của tôm hùm gai Nhật Bản Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự hoạt động của chymotrypsin Trọng lượng phân tử của trypsin

và collagenase là 24,000

- Năm 1994, H Glass và J Stark cũng đã có những nghiên cứu về hoạt động tiêu

hoá protein ở tôm hùm Châu Âu Homarus gammarus (L), kết quả khi tiến hành

thuỷ phân casein với hai mẫu ly trích từ dạ dày và gan tuỵ của tôm hùm Châu Âu ở

pH khác nhau thì pH tối ưu cho hoạt động phân giải này là pH 2.3 và 5.8, tương ứng với từng mẫu dịch chiết Hai nhà khoa học cũng xác định dịch chiết từ gan tuỵ chứa endoprotease endoproteases - elastase (EC 3.4.21.36), trypsin (EC 3.4.21.4),

exoproteases - leucine aminopeptidase (EC 3.4.11.1), carboxypeptidases a (EC 3.4.17.1) và carboxypeptidase b (EC 3.4.17.2), không phát hiện thấy hoạt động của chymotrypsin (EC 3.4.21.1) Các protease axít (pH tối ưu là 2.3) không phân giải N-

acetyl phenylalanyl di-iodotyrosine (cơ chất đặc hiệu của pepsin) và cũng không hoạt động ở khi ức chế bởi chất kìm hãm đặc biệt của pepsin là pepstatin A

- A Zotos và K.D.A Taylor (1995) đã được nghiên cứu hoạt động phân giải protein

ở tôm hùm Na Uy (Nephrops norvegicus) với Quy trình ly trích cải tiến và tinh sạch

từng phần thu được 3 protease (gọi là protease I, II và III) từ đầu tôm hùm Na Uy bằng cách phối hợp kết tủa acetone rồi dùng sắc ký cột DEAE – Sepharose CL-6B Tác giả sử dụng casein làm cơ chất, kết quả nghiên cứu cho thấy protease III có hoạt tính tốt nhất ở pH 8.2, trong khi protease I và II có hoạt tính ở vùng pH quá rộng Protease III thể hiện đặc tính như một protease kiềm Zn – Serine bị ức chế mạnh hoạt tính bởi PMSF, chất ức chế trypsin đậu nành, Co2+, Mn2+ và 1-10 phenanthroline Protease I bị ức chế mạnh bởi p-benzoquinone, iodo-acetamide, kim loại nặng (Ag+, Cu2+) và 1-10 phenanthroline và vì vậy nên có tính chất như là protease Zn-thiol Protease II cũng bị kiềm hãm hoạt bởi các chất ức chế như protease I (nhưng phạm vi ít hơn) và cũng mang đặc tính như một protease thiol Trọng lượng phân tử được xác định là 22.5, 45 và 45.5 kDa đối với protease I, II và III, tương ứng

- M.V Laycock và cs (1989) đã tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính của hệ

proteinase cysteine tiêu hoá của tôm hùm Mỹ (Homarus americanus) Tác giả sử

dụng kết hợp sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và lọc gel để tinh sạch hệ enzyme này Proteinase cysteine chiếm tới 80% hoạt động phân giải protein trong khoang của gan tuỵ Các ion kim loại nặng Hg, Cu và Ag là chất ức chế hoạt động mạnh nhất Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của proteinase tôm hùm với cơ

chất là benzyloxycarbonlalanine p-nitrophenyl ester cũng đã được nghiên cứu

- Celis-Guerrero và đồng sự (2004) đã ước lượng hệ enzyme chịu trách nhiệm tiêu

hoá protein trong thức ăn và xác định đặc tính của chúng ở tôm hùm đỏ (Panulirus

interruptus) Những thành phần tương tự như proteases đã được tìm thấy trong dịch

dạ dày, tuyến gan tuỵ và dịch ruột Sử dụng cơ chất đặc biệt và chất ức chế, chúng tôi đã xác định được một vài isotrypsin và isochymotrypsin bằng sắc ký lọc gel Hoạt tính protease được nhận thấy ở pH = 3 và giảm khi sử dụng chất ức chế pepstatin A

- Năm 2008, E Perera, F.J Moyano và cs đã xác đính đặc tính của hệ enzyme tiêu

hoá chính ở tôm hùm gai Panulirus argus bằng cách sử dụng kết hợp các phương

pháp hoá sinh và điện di SDS – PAGE Kết quả hoạt tính của protease và amylase

được tìm thấy ở dịch vị trong khi esterase và lipase hoạt động mạnh hơn ở tuyến ruột Một enzyme hoạt tính giống trypsin hoạt động mạnh ở cả hai nơi này Tác giả cũng sử dụng các chất ức chế protease thường thấy đối với protease serin và metalloprotease để thử nghiệm Kết quả là serine protease được chứng thực bằng zymograms là có một số enzyme giống như isotrypsin (17 – 21 kDa) và một vài enzyme thì giống với isochymotrypsin (23–38 kDa) Amylase (38–47 kDa) đã xác định ở zymograms và một dải phức tạp isoenzymes esterases không đặc hiệu đã được tìm thấy ở tuyến tiêu hoá Nghiên cứu này cũng là cơ sở sinh hoá cho tập tính

ăn uống của P argus Sự phân bố và đặc tính của hệ enzyme cung cấp một số hiểu

biết về sự tiêu hoá thức ăn và là cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về sinh lý tiêu hoá của tôm hùm gai

- Ponnuswamy Vijayaraghavan và cộng sự (2011) đã ly trích hệ cysteine proteinase

từ gan tuỵ của tôm hùm Ấn Độ Panulirus homarus Các enzyme này được tinh sạch

bằng cách dùng ammonium sulphate làm tác nhân kết tủa, kết hợp với sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel Enzyme này hoạt động rất mạnh ở pH 8,0 và nhiệt độ ủ tối

ưu đã được tìm thấy là 600C Nó là một cysteine protease, cả β-Mercaptoethanol và dithiothritol đều ảnh hưởng đến hoạt tính của protease này Nghiên cứu được tiến hành để đánh giá trọng lượng phân tử của của protease biểu hiện Bốn protease được phân tách thành các band trên gel điện di SDS-PAGE từ 27 đến 45.5 kDa Band protease I và II (27 kDa, 29.5 kDa) thuộc nhóm cysteine và các band protein này bị xoá sạch khi thực hiện zymograpy trên gel đó với β-Mercaptoethanol và dithiothritol