Phân lập và sàng lọc vi sinh vật Enzyme bẻ ngắn mạch Polysaccharide từ bùn thải rong nâu trong quá trình sản xuất Fucoidan

Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết từ rong biển.... Theo các nhà khoa học Nga, polysaccharide tồn tại trong rong Nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong kiềm là acid

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thanh Vân -

Trưởng phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và TS Phạm Thu Thủy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp

đỡ tôi để tôi có đủ điều kiện thực hiện đồ án

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để tôi hoàn thành đồ án này

Nguyễn Thị Khánh Vy

Trang LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Đặc điểm chung về rong biển 4

1.2 Phân loại rong biển 4

1.3 Giới thiệu đặc điểm và sự phân bố của rong Nâu và rong Mơ (Sargassum) 5

1.4 Một số hợp chất polysaccharide từ rong Nâu 6

1.4.1 Fucoidan 6

1.4.2 Laminaran 9

1.4.3 Acid alginic 10

1.5 Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết từ rong biển 11

1.5.1 Hoạt tính sinh học của Fucoidan 11

1.5.2 Hoạt tính sinh học của Laminaran 14

1.5.3 Hoạt tính sinh học của acid alginic 14

1.6 Tình hình nghiên cứu về enzyme cắt mạch polysaccharide có nguồn gốc rong biển 15

1.6.1 Tình hình nghiên cứu fucoidanase 15

1.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme thuỷ phân laminaran 17

1.7 Một số ứng dụng của oligosaccharide từ rong biển 19

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Nguyên vật liệu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 22

2.2.2 Phương pháp lên men vi sinh vật 23

2.2.3 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 24

2.2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme 25

2.2.6 Định lượng protein theo phương pháp Lowry 27

2.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 28

2.2.7.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Fucoidan 28

2.2.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ 29

2.2.7.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 30

2.2.7.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc 31

2.2.7.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 32

2.2.8 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 33

2.2.8.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme 33

2.2.8.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 34

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 34

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1.Phân lập các chủng vi sinh vật từ bùn thải trong quá trình sản xuất fucoidan 35 3.2 Sàng lọc các chủng vi sinh vật theo định hướng sinh enzyme cắt mạch polysaccharide 36

3.3 Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu để chủng SW21 phát triển và sinh enzyme fucoidanase hoạt tính cao 38

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ fucoidan 38

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Nitơ 39

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 40

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc 41

3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và tổng hợp fucoidanase 42

3.4 Kết quả nghiên cứu điều kiện xúc tác của enzyme 44

3.4.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme 44

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 45

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

4.1 Kết luận 46

4.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC

Bảng 1.1: Một số loài rong Nâu có hàm lượng fucoidan cao 7

Bảng 1.2: Vi sinh vật biển và enzym của chúng 16

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan 21

Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ bùn thải rong Nâu 35

Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharite 36

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ fucoidan lên sự sinh tổng hợp fucoidanase của chủng SW21 38

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự phát triển và sinh tổng hợp fucoidanase của chủng SW21 39

Hình 1.1: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus .8

Hình 1.2: Cấu trúc laminaran 9

Hình 1.3: Cấu trúc acid alginic 10

Hình 1.4: Sản phẩm MODIFILAN và FUCGASTRO 20

Hình 2.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase 23

Hình 2.2: Đường chuẩn fucose 26

Hình 2.3: Đường chuẩn lowry 27

Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển và khả năng sinh enzyme fucoidanase của chủng SW21 40

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc lên khả năng sinh enzyme của chủng SW21 41

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trìnhsinh trưởng và tổng hợp fucoidanase 42

Hình 3.4: pH tối ưu của fucoidanase chiết từ chủng SW21 44

Hình 3.5: Nhiệt độ tối ưu để enzyme fucoidanase từ chủng SW21 hoạt động 45

Sơ đồ 2.1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi khuẩn 24

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ fucoidan thích hợp 28

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nguồn nitơ thích hợp 29

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy thích hợp 30

Sơ đồ 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ nuôi cấy lắc thích hợp 31

Sơ đồ 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp 32

Sơ đồ 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tínhcủa enzyme 33

Sơ đồ 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ lênhoạt tính enzyme 34

DNA Deoxyribonucleic acid

FDA Food and Drug Administration

HCMV Human cytomegalo virus

HGF Human Hepatocyte Growth Factor

HIV Human immunodeficiency virus

MỞ ĐẦU Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong Nâu là một trong

số các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất Rong Nâu chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao Đó là các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose,…); 17 acid amin; các acid béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự

do nguy hiểm; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu; alginat là chất giải độc thiên nhiên; polyuronan có hoạt tính kháng u não [48]; laminaran có tác dụng rất tích cực trong việc hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến mạch máu tim, chất kháng ung thư, chất bảo vệ phóng xạ, kháng đông lạnh, chất kích thích hạt giống nảy mầm, tăng trưởng cây trồng [3] và fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư

Trong rong Nâu, hàm lượng polysaccharid chiếm khoảng từ 40-80% khối lượng rong khô, là những chất có giá trị nhất và có ứng dụng hết sức rộng rãi nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng Theo các nhà khoa học Nga, polysaccharide tồn tại trong rong Nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong kiềm là acid alginic, đã được nghiên cứu từ những năm 30 của thế kỷ trước và được

sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và

mỹ phẩm; nhóm tan trong nước bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan là những chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá mới được nghiên cứu sử dụng trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây Đặc biệt là fucoidan được tìm thấy trong vách tế bào rong Nâu là chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá: Hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ, hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch, hoạt tính kháng virus, trị bệnh dạ dày, bệnh về da [5] Ngoài ra fucoidan còn được sử dụng để điều trị các bệnh dị ứng, lão hóa, viêm khớp, suyễn, đái tháo đường, tăng nhãn áp, huyết áp cao, cholesterol cao, bệnh tim, viêm gan C, HIV, bệnh gan, loét dạ dày, đột quỵ, tuyến giáp, thiên đầu thống

Nước ta có bờ biển dài hơn 3.200 km trải dài từ Bắc xuống Nam, bao bọc toàn bộ phía Đông và phía Nam với diện tích mặt nước biển hơn 1.000.000 km2,

được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong Nâu rất đa dạng và phong

phú, trong đó rong Mơ (Sargassum) đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng

khai thác ước tính đạt trên 10.000 tấn khô/năm Mặc dù vậy cho đến nay các nghiên cứu trong nước về chế biến rong Nâu mới chỉ quan tâm đến việc tách chiết các thành phần đơn lẻ alginat, iodine, manitol, kích thích tố sinh trưởng cây trồng và gần đây là laminaran nhưng đều ở một trình độ chưa cao, hiệu quả kinh tế còn thấp Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn

Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của các polysaccharide rong Nâu lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu thì việc xác định cấu trúc hóa học của chúng là điều kiện tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trên thế giới Các phương pháp sử dụng lý hóa trước khi phân tích được sử dụng hiện tại (thủy phân đề-sulfat hóa, đề actyl hóa) thường đòi hỏi điều kiện acid hoặc kiềm mạnh ở nhiệt độ cao, do đó có thể làm thay đổi cấu trúc của polysaccharide và làm mất hoạt tính sinh học quý của chúng [7][8][9][10] Do đó enzyme là công cụ hữu hiệu nhất để thực hiện các phân tích này Nguồn phân lập vi sinh vật bẻ ngắn mạch polysaccharide là những nơi có sự hiện diện của nguồn cơ chất như rong biển, hoặc môi trường xung quanh rong biển sinh sống như nước biển, bùn biển [37]

Hiện nay Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã chiết xuất thành công fucoidan và đã đưa vào sản xuất ở quy mô pilot Rong Nâu được dùng

để chiết xuất fucoidan, phần còn lại là các polysaccharide khác như alginate, lamninaran và một lượng nhỏ fucoidan nằm trong bả thải, thải xuống hầm cống Bã thải để lâu ngày, bị hệ vi sinh vật trong hầm phân hủy Đây chính là nguồn phân lập

vi sinh vật bẻ ngắn mạch polysaccharide rất tốt vì nơi nào có sự hiện diện của cơ chất thì nơi đó có khả năng tồn tại các vi sinh vật tiêu thụ nó

Xuất phát từ những lý do nêu trên tôi quyết định chọn đề tài : “Phân lập và sàng

lọc vi sinh vật sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide từ bùn thải của pilot sản xuất Fucoidan”

Nội dung luận văn bao gồm:

 Phân lập vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide rong Nâu

 Sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh enzyme hoạt tính cao

 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để vi khuẩn sinh enzyme hoạt tính cao

 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung về rong biển

Rong biển hay tảo biển là thực vật thủy sinh, chúng có thể là đơn bào, đa bào, sống thành quần thể, sống ở biển hoặc vùng nước lợ ven biển Rong biển có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt

Rong biển Việt Nam rất phong phú và đa dạng, theo các kết quả nghiên cứu thì hiện nay nước ta có khoảng 794 loài, phân bố ở miền Bắc 310 loài, miền Nam

484 loài, 156 loài tìm thấy ở cả hai miền Nguồn rong biển mọc tự nhiên chủ yếu là rong Nâu, trữ lượng khoảng 10000 tấn khô/năm, miền Trung và miền Nam là nơi có trữ lượng rong Nâu lớn và chất lượng cao Sản lượng hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó có 20% do rong biển tổng hợp nên

Rong biển cung cấp đầy đủ các khoáng chất đặc biệt là các nguyên tố vi lượng, các acid amin cần thiết cho cơ thể, các loại vitamin, các carbohydrat đặc trưng và các chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể đồng thời có khả năng phòng và trị bệnh Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng và ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới

1.2 Phân loại rong biển

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia làm 9 ngành sau đây:

1) Ngành rong Lục (Chlorophyta)

2) Ngành rong Nâu (Phaeophyta)

3) Ngành rong Đỏ (Rhodophyta)

4) Ngành rong Trần (Englenophyta)

5) Ngành rong Giáp (Pyrophyta)

6) Ngành rong Khuê (Bacillareonphyta)

7) Ngành rong Kim (Chrysophyta)

8) Ngành rong Vàng (Xantophyta)

9) Ngành rong Lam (Cynophyta)

Trong đó, ba ngành rong có giá trị kinh tế cao là rong Đỏ, rong Nâu và rong Lục Rong Đỏ và rong Nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp và đời sống Đối với rong Lục thì

loại tảo clorella được xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, đang

được nghiên cứu phục vụ cho đời sống con người [4]

1.3 Giới thiệu đặc điểm và sự phân bố của rong Nâu và rong Mơ (Sargassum)

Rong Nâu là tên gọi chung của các loài rong thuộc ngành Pheophyta, ngành này chỉ có một lớp Phaeophycea, gồm 265 chi và khoảng 1500 – 2000 loài, phần

lớn sống ở biển, chỉ có một số loài sống ở nước ngọt

Rong Nâu có cấu tạo nhiều tế bào dạng mảng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành dạng cây có gốc, rễ, thân, lá Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa và ở gốc các lóng

Rong Nâu sống bám vào các vật thể khác nhờ bàn bám, do đó rong Nâu thường sống ở các vùng biển đá hoặc nơi có các vật bám khác như chân đập, cầu cảng, san hô… Rong Nâu tại các vùng ôn đới, hàn đới có kích thước cá thể lớn, số lượng cá thể nhiều, số loài ít Còn ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, rong Nâu có kích thước cá thể nhỏ, số lượng loài phong phú

Rong Nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil,

Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha Trong đó, bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới

Sản lượng rong Nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria Nhật Bản khoảng 51.000

tấn với 3 chi Laminaria, Udaria, Cladosiphon; Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile

khoảng 27.000 tấn

Rong Mơ Sargassum là một giống Tảo lớn thuộc họ rong Mơ Sargassaceae

của ngành rong Nâu sống trôi nổi trong nước.Ở Việt Nam, các loài rong Mơ thuộc

chi Sargassum, họ Sargassaceae, bộ Fucales, ngành rong Nâu là nguồn lợi rong

biển tự nhiên lớn nhất, chúng phân bố khá phổ biến ở ven biển và hải đảo phía Nam Việt Nam (từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên)

Đây là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn, dài 6-8m, sản lượng 12kg rong tươi/m2, hình dạng rất giống thực vật bậc cao Chúng có khả năng phân bố rộng, mọc trên các bờ biển đá, san hô chết…thích hợp từ khoảng phía trên mực triều thấp cho đến vài ba mét sâu Sản lượng trung bình từ 2000-4000g/m2, có nơi đến 7000g/m2 như ở Hòn Chồng, Nha Trang [4]

1.4 Một số hợp chất polysaccharide từ rong Nâu

1.4.1 Fucoidan

Fucoidan là một polysaccharide sulphate được Kylin mô tả đầu tiên vào năm

1913 từ loài rong Nâu Laminaria digitata và ông điều chế được chúng vào năm

1915 với tên gọi là Fucoidin [11] Sau gần 100 năm kể từ khi Kyllin phát hiện ra, fucoidan được mô tả là một polysaccharide sulphat hóa dị hợp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% đến 60% [24][25], sulphat chiếm từ 17,7% đến 32,9% [24][41], ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose và acid uronic Các liên kết glycosit là liên kết (1-3), (1-2) hoặc (1-4) và các liên kết này có thế là liên kết mạch thẳng hoặc mạch nhánh Vị trí nhóm sulphat có thể ở ba vị trí đó là C2, C3 và C4 Những năm sau này fucoidan không chỉ được tìm thấy ở các loài rong Nâu mà còn được tìm thấy ở một số loài động vật thân mềm biển như Dưa chuột biển, Cầu gai biển tuy nhiên đáng kể nhất vẫn là fucoidan chứa trong rong Nâu với hàm lượng lên tới 6,5% trọng lượng khô,

chủ yếu thuộc Bộ Laminariles và Bộ Fucales của lớp Phaeophyceae Một số loài

rong chứa fucoidan được chỉ ra trên (bảng 1.1)

Bảng 1.1: Một số loài rong Nâu có hàm lượng fucoidan cao

1 Order Ectocarpales Adenocystis utricularis

2 Order Chordariales Cladosiphon okamuranus (Okinawamozuku)

Ascophyllum nodosum Fucus distichus L Fucus evanescens C.Ag

Fucus vesiculosus Hizikia fusiformic (Hijiki) Pelvetia wrightii

Pelvetia canaliculata (Dene and Thur) Sargassum fulvellum

Sargassum stenophyllum Sargassum kjellmanianum Sargassum ringgoldiamum Sargassum fusiforme Sargassum siliquastrum Sargassum thunbergii (Umitoranoo)

3 Order Fucales

Undaria pinnatifida (Wakame) Kjellmaniella crassifolia Ecklonia kurome

Chorda filum Laminaria japonica Laminaria cichorioides miyabe Laminaria saccharina (L.) Lam Laminaria religiosa

Lessonia flavicans

4 Order Laminariles

Nemacystus decipiens (Itomozuku)

Đặc biệt fucoidan không được tìm thấy ở động thực vật trên cạn Fucoidan từ các nguồn chiết khác nhau thì có cấu trúc khác nhau Hơn thế nữa, cùng một nguồn fucoidan nhưng phương pháp tách chiết khác nhau sẽ thu được fucoidan có thành phần khác nhau Vì vậy, đối với từng loại nguyên liệu khác nhau để chiết được fucoidan có hiệu suất cao sẽ có phương pháp chiết đặc biệt để chiết chúng Do đó, cho đến nay mới chỉ có duy nhất một loại fucoidan được bán trên thị trường đó là

fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus

Hình 1.1: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus

Laminaran thường được chiết xuất từ rong Nâu (Pheophyceae), và đặc biệt là

Fucales hoặc Laminariales

Laminaran được hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết -13 và một ít liên kết -16, gốc đường cuối mạch của một số phân tử

có thể có các gốc manitol (M-series) hay vẫn là glucose (G-series)

Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của các liên kết -13 và -16 cũng như cách thức nối của các liên kết này trong chuỗi glucan [32]

Hình 1.2: Cấu trúc laminaran

1.4.3 Acid alginic

Alginic là thành phần rất quan trọng trong rong Nâu, nó chính là thành phần làm cho rong Nâu có ý nghĩa về mặt kinh tế Hàm lượng alginic trong các loài rong Nâu khoảng 2 – 4% so với rong tươi và 13 – 15% so với rong khô, hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống Hàm lượng alginic của rong biến đổi theo thời gian sinh trưởng trong năm Hàm lượng tăng dần vào đầu tháng 1, tăng cao vào các tháng 3, 4 cũng là thời gian rong phát triển hình thành các phao bơi và thỏi sinh sản, sau đó hàm lượng giảm dần khi rong già và tàn lụi [4]

Acid alginic là một polysaccharide mạch thẳng được tạo thành từ hai monome

là acid -D-manuronic (ký hiệu là M) và acid -L-gluronic (ký hiệu là G) được nối với nhau qua liên kết glycozit (1-4).Trong phân tử acid alginic các gốc acid này có thể liên kết với nhau tạo thành các kiểu block: G-block, M-block, MG-block Sự sắp xếp các block-M và block-G trong mạch polyme không theo quy luật mà phụ thuộc vào từng loài rong và chu trình sinh trưởng của chúng [31]

Hình 1.3: Cấu trúc acid alginic

Acid alginic không tan trong nước nhưng có khả năng hấp thụ một lượng nước rất lớn, trương nở và tạo thành dạng bột nhão Ngược lại, alginat natri, các muối K+, NH4

+

, (CH2OH)3NH+ của acid alginic lại tan nhiều trong nước và tạo thành dung dịch có độ nhớt cao Alginate là một sản phẩm tự nhiên nên nó có thể bị tiêu hóa bởi một số loại vi sinh vật hoặc các enzyme thủy phân được phân lập từ đất, biển và các loài nhuyễn thể [1]

1.5 Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết từ rong biển

1.5.1 Hoạt tính sinh học của Fucoidan

 Hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ (Anticoagulant và

Antithrombotic)

Fucoidan có các hoạt tính sinh học hết sức đa dạng, tuy nhiên hoạt tính chống đông tụ của nó được nghiên cứu sâu nhất.Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính chống đông tụ của fucoidan có thể có mối quan hệ với vị trí của nhóm sulphat, trọng lượng phân tử và thành phần đường Fucoidan có chứa nhóm sulphat cao hơn thường có hoạt tính chống đông tụ cao hơn so với fucoidan không có nhóm

sulphat (E kurome, H fusiforme, etc.) [16]

 Hoạt tính kháng u

Năm 1937, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã chiết các hợp chất trong rong Nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến acid, đem thử hoạt tính kháng ung thư và họ cho rằng hai phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình khoảng

13500 Da và 19000 Da có hoạt tính kháng ung thư Các fucoidan này tương tác trực tiếp với tế bào ung thư và tiêu diệt những tế bào ung thư này [47]

Theo các nhà khoa học, fucoidan có tác dụng chữa ung thư theo các cơ chế sau: 1) Fucoidan thúc đẩy các tế bào ung thư tự phá hủy Điều này có nghĩa là DNA trong tế bào ung thư bị bẻ gãy bởi các enzym trong tế bào làm cho các tế bào ung thư không có khả năng sinh sản, không hình thành khối u [14]

2) Fucoidan tăng cường hệ miễn dịch nên fucoidan phục hồi lại các tế bào, tăng cường bảo vệ tế bào bình thường, cảnh giác tế bào lạ [26]

 Hoạt tính kháng virus

Trong những năm gần đây người ta đã chứng minh được rằng polysaccharide sulphat (bao gồm fucoidan) biểu hiện hoạt tính kháng vi rút cả invivo và invitro

Fucoidan của Laminaria japonica có các chức năng kháng loại vi rút RNA và DNA

Vai trò của Sulphat thì cần thiết cho hoạt tính kháng virut Hơn nữa, fucoidan còn

có các hoạt tính ức chế chống lại sự sao chép vỏ ngoài một số vi rút quan trọng như HIV và HCMV [33]

 Hoạt tính kháng khuẩn

Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương

và vi khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não một biến chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra Fucoidan cũng được xem là một hợp chất điều trị HIV Fucoidan tăng khả năng sản xuất các dạng interferon kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để đề phòng nhiễm trùng và bệnh tật [21]

 Tăng cường tính miễn dịch

Fucoidan kích thích sự sản xuất tế bào miễn dịch giúp cho cơ thể có khả năng chống lại vi khuẩn, vi rút, kí sinh trùng và ngay cả tế bào ung thư Các tế bào diệt tự nhiên là các tế bào làm nhiệm vụ đầu tiên bảo vệ hệ miễn dịch cho cơ thể con người Fucoidan chứa các đường đặc biệt làm sản sinh các tế bào diệt tự nhiên chống tất cả các bệnh Khi những người sức khỏe yếu sử dụng fucoidan làm tăng số

tế bào diệt tự nhiên giúp cơ thể có khả năng tự bảo vệ [12]

 Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu

Các nhà nghiên cứu đã công bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong biển tác động dương tính lên phản ứng insulin và đường huyết trong các động vật thí nghiệm Việc đưa thêm các polysacharide này dẫn đến giảm một cách đột ngột cân bằng hấp thụ đường Điều này giả thiết rằng các hợp chất polysaccharide giống fucoidan làm chậm việc truyền glucose vào máu từ ruột, nhờ vậy giúp giữ mức đường máu ổn định và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức [28]

 Bảo vệ dạ dày

Fucoidan với liều lượng thích hợp có tác dụng cải thiện hoạt động của dạ dày Fucoidan ngăn chặn sự gắn của một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày

Helicobacteria pylori lên tế bào

Theo một số nghiên cứu của người Nhật ở Tokyo, việc bổ sung fucoidan thích hợp có tác dụng cải thiện hoạt động của đường dẫn dạ dày-ruột non Hơn nữa các nhà khoa học mới đây đã công bố rằng fucoidan ngăn chặn sự gắn của

Helicobacteria pylori (một loại vi khuẩn gây loét dạ dày) lên tế bào tạo thành lớp

lót dạ dày Họ đã phỏng đoán rằng hợp chất fucoidan này có thể bao phủ bề mặt vi khuẩn làm cho chúng khó bám vào các tế bào dạ dày [28]

Trong năm 1995, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng fucoidan giúp đẩy mạnh việc tạo ra fibronectin, một glycoprotein có phân tử lượng lớn có vai trò quan trọng trong việc giữ các khớp được bôi trơn và linh động Nghiên cứu phát hiện ra

sự có mặt của fucoidan đã góp phần cho việc sản xuất bình thường chất này, việc bổ sung fucoidan có thể có tác dụng hữu ích trong việc tái tạo sụn cho các khớp đau

 Trị bệnh gan

Fucoidan làm tăng đáng kể việc sản xuất HGF là một cytokin rất đặc biệt, nó không chỉ kích thích việc tái tạo tế bào gan mà đồng thời còn tăng cường việc sản xuất các tế bào da, tế bào cơ tim, sụn [22]

Đến nay sản phẩm fucoidan đã có mặt trên thế giới và được dùng làm thuốc

hỗ trợ sức khoẻ và điều trị nhiều loại bệnh Ở nước ta chưa có sản phẩm fucoidan trên thị trường Do vậy việc nghiên cứu fucoidan trong rong Nâu Việt Nam là việc làm rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học cũng như thực tiễn cao

1.5.2 Hoạt tính sinh học của Laminaran

Laminaran là thực phẩm chức năng có giá trị dược lý được FDA chấp thuận trong việc chống đông máu, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu và kích thích miễn dịch bẩm sinh [43].Gần đây các nhà khoa học nghiên cứu và phát hiện thấy chất laminaran trong rong biển có thể hỗ trợ, không để tế bào miễn dịch ‘’tử vong’’, từ đó có tác dụng bảo vệ hệ thống miễn dịch không bị tổn thương dưới tác động của tia bức xạ Khả năng chống tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên nhiên này đem lại niềm hy vọng cho những người đang dung tia phóng xạ chữa trị các khối u gây ung thư trong cơ thể [49] Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng sức đề kháng với nhiễm trùng [44] và thúc đẩy sữa chữa vết thương [42]

Laminaran với những đặc tính của một alpha – amylase gây ra kích hoạt các enzyme có mặt trong quá trình tăng trưởng ở thực vật và sự kích thích của hoạt động phân giải protein của các tế bào được xử lý Nên hiện nay laminaran được nghiên cứu để sử dụng như là một chất thúc đẩy hạt giống nảy mầm và tăng tốc độ tăng trưởng cây trồng

1.5.3 Hoạt tính sinh học của acid alginic

Alginat có hoạt tính tẩy xạ, khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng đường tiêu hóa, có thể dung alginate Na để đưa ra ngoài cơ thể Alginat có khả năng này vì tạo được kết tủa bền với strontium do đó ngăn được sự hấp thụ strontium vào máu và được thải ra ngoài Việc dùng alginate Na làm chất tẩy phóng xạ không ảnh hưởng đến quá trình trao đổi Ca và khả năng phát triển bình thường của cơ thể [50]

Ngoài ra aginat Na còn có khả năng chống đông tụ máu

1.6 Tình hình nghiên cứu về enzyme cắt mạch polysaccharide có nguồn gốc

rong biển

1.6.1 Tình hình nghiên cứu fucoidanase

Những năm trước đây, mặc dù hầu như chưa biết gì về sinh tổng hợp fucan sunphat hóa, nhưng người ta đã có những hiểu biết về cách phân lập cách phân lập các loại enzyme có khả năng thủy phân các polysaccharide này từ một số loài vi sinh vật biển

Vi sinh vật biển là những nguồn chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học nhiều triển vọng, bao gồm các enzyme quý hiếm Một số vi sinh vật biển có khả năng bẻ ngắn các polysaccharide không tan trong nước như chitin và agar cũng như các polysaccharide thành tế bào của rong biển và các sinh vật khác Khi bị phân hủy rong sẽ trở thành đối tượng tấn công của các vi sinh vật mà có hệ enzyme có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide thành tế bào rong về mono- và oligosaccharide Các saccharide này được sử dụng như nguồn dinh dưỡng của các vi sinh vật Vì vậy những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu nghiên cứu về vi sinh vật biển sinh enzyme phân cắt Fucoidan Một số kết quả đã được công bố tuy nhiên các kết quả này vẫn chỉ ở mức quy mô phòng thí nghiệm, chưa được đưa ra thị trường Dưới đây là một số kết quả tổng hợp trên thế giới (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Vi sinh vật biển và enzym của chúng [28].

Enzym ST

T Họ Giống Loài Chủng Nguồn PL Loại pHotp Totp (o

C) Fucoidanase 6,0 40

1 Vibrionacace Vibrio n.s N-5 Cát biển

fucosulfatase 7,5 n.s n.s n.s Nước biển ven bờ Endosulfated

5 Sphingomonaceae Sphingomonas Sphingomonas

Fucoidanase (endotyp) n.s n.s

Hiện nay có 2 loại enzyme tác động lên fucoidan là fucoidanase (EC3.2.1.44)

và α-L-fucoisidase (EC.3.2.1.51) Nếu như hoạt tính của α-L-fucoisidase được mô

tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn cuối của một phân tử polysaccharide, thì việc xác định hoạt tính của fucoidanase phân giải fucoidan là không dễ dàng Fucoidanase có thể bẻ gãy các liên kết glusosit bên trong phân tử polsaccharide làm giảm nhanh chóng trọng lượng phân tử (endo-fucoidanase) hoặc

ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số phân tử oligosaccharide làm cho trọng lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase) [18][38]

Một trong những trở ngại trong việc làm sạch fucoidanase là chưa có phép thử đơn giản nào để có thể nhận biết và định lượng loại enzyme này Một số phương pháp đã được sử dụng bao gồm, sự giảm độ nhớt [20], tăng đường khử [45], kết tủa với albumin [27], sắc ký rây phân tử [13] Do đó, cho đến nay mới chỉ có 2 enzyme fucoidanase được làm sạch tới trạng thái đồng nhất [15]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme thuỷ phân laminaran

R Saravanan và cộng sự (2007) đã phân lập và tinh sạch enzyme ngoại bào

(1,3)--D-glucanase từ nấm Trichoderma reesei (3929), một dòng nấm do viện

Công nghệ vi sinh vật Chandigarh, Ấn Độ (Institute of Microbial Technolygy Chandigarh) cung cấp Dịch nuôi cấy được tinh sạch qua các bước: tủa bằng (NH4)2SO4, thẩm tách và thử hoạt tính enzyme dựa trên lượng đường glucose tạo thành Trọng lượng phân tử enzyme được xác định bằng phương pháp điện di trên gel SDS là khoảng 52 đến 62 kDa [34]

Năm 1988, B Tangarone và cộng sự đã nghiên cứu tinh sạch và xác định đặc

tính của enzyme endo-(1,3)--D-glucanase thu được từ nấm Trichoderma

longibrachiatum Nhóm tác giả đã nuôi cấy Trichoderma longibrachiatum trong

môi trường chứa nguồn carbon duy nhất là D-glucose, sau đó tiến hành tinh sạch enzyme từ dịch nuôi cấy Enzyme thu được có khả năng thủy phân laminaran thành các phân tử glucose, ditose, tritose, tetratose, pentose và các oligo có trọng lượng phân tử lớn hơn Nói chung, loại enzyme này chỉ cắt những phân tử glucan có chứa liên kết -1,3 Khoảng pH và nhiệt độ tối ưu của enzyme thu được là 4,8 và 55oC

Trọng lượng phân tử của enzyme được xác định bằng phương pháp điện di trên gel SDS 12,5% và kết quả cho thấy trọng lượng phân tử của enzyme là khoảng 70 kDa Giá trị Km và Vmax đối với cơ chất laminaran lần lượt là 0,16% và 3,170 μmol/phút/mg [6]

Một loại endo-(1,3)--D-glucanase do vi khuẩn Arthrobacter sp sản sinh ra

đã được Zhongcun Pang và các cộng sự (2004) tinh sạch qua các bước: tủa bằng (NH4)2SO4, sắc ký trao đổi anion và sắc ký lọc gel Enzyme tinh sạch được có trọng lượng phân tử khoảng 32.500 Da (bằng phương pháp điện di trên gel SDS) Enzyme tinh sạch có pH tối ưu khoảng 6,5 và khoảng pH hoạt động là từ 5 đến 8 Nhiệt độ tối ưu là 55oC Hằng số Michaelis Km đối với laminaran là 0,16 mg/ml [46]

Theo M.S Pesenseva và các cộng sự, tính đặc hiệu và phương thức cắt mạch của enzyme laminaranase là công cụ quan trọng để nghiên cứu cấu trúc của laminaran có nguồn gốc từ những loài rong khác nhau Ngoài ra, quá trình chuyển hóa laminaran bằng enzyme còn tạo ra các chất mới có hoạt tính sinh học (13); (16)--D-glucan Laminaranase là enzyme cắt liên kết -1,3 của laminaran bằng hai cơ chế Exo-laminaranase (EC 3.2.1.58) cắt lần lượt các liên kết từ sau ra trước của phân tử laminaran, kết quả là tạo thành các sản phẩm thủy phân đơn giản nhất: các phân tử D-glucose; trong khi đó endo-laminaranase (3.2.1.39) lại thủy phân các liên kết bên trong mạch laminaran và giải phóng sản phẩm là các oligo-laminaran Theo nhóm tác giả này, đã có hai enzyme laminaranase đã xác định được trình tự

amino axit, đó là enzyme từ trứng hải sâm Strongylocentrotus purpuratus và (13)--D-glucanase từ một loài hai mảnh vỏ Spisula sachalinensis Hai đối tượng

endo-này thuộc nhóm động vật biển không xương sống, có kích thước và trữ lượng lớn và là nguồn enzyme laminaranase đầy hứa hẹn

Ngoài ra, có hai dạng enzyme laminaranase được phân lập từ gan Littorina

kurila (một loài động vật thân mềm) Cả hai loại enzyme này đều đặc hiệu đối với

liên kết -1,3 trong các phân tử glucan Cả hai enzyme đều có tỷ lệ thủy phân laminaran và translam (một sản phẩm chuyển hóa của laminaran bằng enzyme) cao hơn so với các glucan khác (như yeast glucan, lichenan, zymosan, pachiman

.v.v…) Một số đặc tính quan trọng chính của hai loại enzyme này cũng đã được nghiên cứu

Một trong hai enzyme có trọng lượng phân tử được xác định bằng phương pháp điện di trên gel SDS là khoảng 36 kDa Sản phẩm của quá trình thủy phân laminaran được phân tích bằng máy MALDI-TOF MS, kết quả cho thấy chúng là các oligosaccharide và glucose Dựa trên những kết quả này, nhóm tác gỉa đã khẳng

định enzyme laminaranase phân lập từ gan Littorina kurila thuộc loại

endo-endo-1,3--D-glucanase (EC 3.2.1.39) Loại enzyme chiếm một lượng nhỏ còn lại có sản phẩm phản ứng thủy phân laminaran là các phân tử glucose, vì vậy rất có thể đây là một exo-1,3--D- glucanase (EC 3.2.1.58)

1.7 Một số ứng dụng của oligosaccharide từ rong biển

Các sản phẩm hữu cơ từ rong biển ngày nay được sử dụng hết sức rộng rãi trong các ngành như: thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp dệt, nông nghiệp, công nghệ sinh học và nghiên cứu khoa học

Các polysaccharide từ rong biển được coi là những hợp chất hữu cơ không thể thay thế trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khi được sử dụng như là chất tạo đông, làm đặc, chất ổn nhũ và chất ổn định Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo rong quan trọng như agar, alginat, carrageenan, furcellazan… dùng cho thực phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác

Các oligosaccharide có tác dụng kháng nấm bệnh, ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư, tế bào HIV nhiều hợp chất hữu cơ trong rong biển có tác dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây trồng nên đã được sản xuất thành phân bón hữu cơ [4]

Ngày nay, fucoidan được sử dụng như là thuốc chống ung thư hiệu quả Ở Nhật Bản, người ta đã sản xuất viên nang fucoidan oligosaccharide Viên nang fucoidan này có tác dụng như là chất ức chế di căn u mới sinh và chống nấm

Trên thị trường Châu Âu đã xuất hiện MODIFILAN Đây là sản phẩm của các nhà khoa học Nga sản xuất, do nhu cầu bức bách của việc khắc phục các hậu quả

của tai nạn nhà máy điện nguyên tử Chemobyl để làm thuốc có tác dụng chống ung thư

Công ty cổ phần Fucoidan Việt Nam đã sản xuất ra Fucogastro, viên nang chứa 100 mg fucoidan 80%, chiết xuất từ rong Nâu Việt Nam có công dụng: Tăng cường sức khoẻ, nâng cao khả năng miễn dịch, ngăn ngừa sự hình thành khối u, hỗ trợ điều trị viêm loét và ung thư dạ dày, tá tràng

Hình 1.4: Sản phẩm MODIFILAN và FUCGASTRO

Ngoài ra còn có một số sản phẩm như: Fucoidan của QINGDAO YIJIA

HUAYI IMPORT AND EXPORT CO.,LTD được sử dụng để phục hồi khả năng

kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virus, điều trị ung thư, tim mạch; Fucoidan

Tongan Limu Moui của AHD INTERNATIONAL, LLC COMPANY trị tim mạch,

chống lão hoá, tăng cường miễn dịch, giảm cân…

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên vật liệu

Bùn thải từ pilot sản xuất fucoidan chiết xuất từ rong S mcclurei, Padina, S

polycystum Mẫu được thu từ cống thải của pilot sản xuất fucoidan, Viện Nghiên

cứu và Ứng dụng Công Nghệ Nha Trang

Ngoài ra chúng tôi sử dụng fucoidan chiết từ loài rong S mcclurei thuộc

ngành rong Nâu để nghiên cứu Đây là loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và thành phần đường fucose khá cao (50,51%) nên đã được chọn làm nguồn carbon để phân lập vi sinh vật, đồng thời là cơ chất để thử hoạt tính enzyme Bên cạnh đó chúng tôi

sử dụng fucoidan từ rong S polycystum, S microcystum và polymannuronic acid,

lamnianran chiết xuất từ rong polycystum để làm cơ chất cho các thử nghiệm hoạt tính enzyme nhằm so sánh các kết quả Tất cả các cơ chất được sử dụng trong nghiên cứu này do Phòng Hoá phân tích và Triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu

và Ứng dụng Công Nghệ Nha Trang cung cấp

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan [2]

Thành phần đường của Fucoidan SO3Na Acid

uronic Rong

S microcystum 28.9 6.94 11.27 9.83 30.35 12.72 26.69 21.20

S mcclurei 50.51 2.53 12.12 4.04 5.56 25.25 33.15 17.87

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật

- Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau

- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng

- Hút 1ml ở bình tam giác sau khi lắc đều vào ống nghiệm, thu được dịch mẫu pha loãng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều

- Từ ống nghiệm 10-1, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm

có độ pha loãng mẫu 10-2, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để

có số khuẩn lạc trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng Do hiếm khi biết trước được nồng độ vi sinh vật trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau) Tùy vào số lượng vi sinh vật nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thường

từ 10-3 – 10-8)

- Môi trường phân lập vi sinh vật được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa 10 – 15ml Dùng pipet man hút 0,1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên bề mặt thạch Sau 3 – 7 ngày ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC, vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch, ta tiến hành hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc

- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa petri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ẩm 30oC Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng vi sinh vật, tiến hành tinh sạch nhiều lần Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra

độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống

- Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch nghiêng để được giống thuần khiết Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC, thời gian tốt nhất là 1 tháng Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền định kì

để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật Trước khi sử dụng chủng thuần khiết cần được hoạt hóa

2.2.2 Phương pháp lên men vi sinh vật

Chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc ở 150 vòng/phút, nhiệt độ 28-300C, trong 24 giờ, trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan sạch như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan

Hình 2.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase

2.2.3 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật

Vi khuẩn được tuyển chọn sau khi lên men, tiến hành tách chiết enzyme từ vi khuẩn theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi khuẩn

Phần dịch nổi

Thử nghiệm hoạt tính

Môi trường lỏng

Li tâm 3.000 vòng/20 phút/4oC

Phần dịch nổi L1 Phần sinh khối tế bào

0,02M

Sau 24 giờ lên men, tiến hành ly tâm 3000 vòng/20 phút/4oC Thu hai phần

là phần dịch nổi và phần sinh khối tế bào

Phần dịch nổi được dùng để thử nghiệm hoạt tính enzyme fucoidanase ngoại bào

Phần sinh khối tế bào: Rửa 2 lần với đệm phosphat 0,02M, pH 7.2 để loại các thành phần đường, protein bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn Phá vỡ màng tế bào bằng máy siêu âm UZDN-2 Sau đó huyền phù với đệm phosphat 0,02 M, pH 7.2 tỉ

lệ 1:3 (m sinh khối vi khuẩn : v đệm) Đặt dung dịch huyền phù ở 4oC trong 2 – 4 giờ để chiết enzyme Tiến hành ly tâm 10.000 vòng/20 phút/4oC

Thu phần dịch nổi và sử dụng để thử hoạt tính fucoidanase như là dịch enzyme nội bào

2.2.4 Tủa enzyme bằng muối ammonium sulphate

1ml dịch chiết Ex được tủa bằng 0,516g ( NH4)2SO4 để ở 4oC qua đêm, li tâm

và thu nhận phần tủa, hòa tan tủa trong 1ml đệm phosphate 0,02M rồi thẩm trong 3 giờ để tách loại muối

2.2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme

Một hỗn hợp dung dịch gồm 300µl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn đều với 200µl cơ chất fucoidan , polymannuronic acid 2mg/ml, laminaran 1mg/ml (pha trong đệm phosphate 0.02M, pH 7.2) ủ 4 giờ ở 37oC

Hoạt tính enzyme cắt mạch polysaccharide được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo phương pháp Nelson-Somogyi [29]

Dưới tác dụng của enzyme thuỷ phân polysaccharide, các loại polysaccharide

bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O Tủa Cu2O tan trong thuốc thử