Phân lập và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến quá trình tổng hợp β-caroten của tảo Dunaliella sp. trên ruộng muối tỉnh Khánh Hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ---oOo--- PHẠM TÀI MINH PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN QUÁ TRÌ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

-oOo -

PHẠM TÀI MINH

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP ββββ-caroten CỦA

TẢO Dunaliella sp TRÊN RUỘNG MUỐI

TỈNH KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn:

ThS NGUYỄN THỊ HẢI THANH ThS LÊ PHƯƠNG CHUNG

NHA TRANG – 7/2013

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, em luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ rất tận tình của thầy cô hướng dẫn, nhân dịp này, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

ThS Nguyễn Thị Hải Thanh người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình em nghiên cứu, hoàn thành đề tài, đồng cảm ơn ThS Lê Phương Chung, người đồng hướng dẫn em rất nhiệt tình và tâm huyết

Em xin chân thành cảm ơn các anh,chị cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện giúp đỡ em rất tận tình về máy móc, thiết bị trong suốt quá trình làm đồ án

Qua đây, em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện CHSH & MT, các thầy giáo, cô giáo bộ môn đã chỉ dẫn, giảng dạy em trong suốt 4 năm học qua và đã tạo những điều kiện thuận lợi

để em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Nha Trang, tháng 6 năm 2013

PHẠM TÀI MINH

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về β-caroten 2

1.1.1 Cấu trúc 3

1.1.2 Tính chất vật lý và quang phổ 4

1.1.3 Tính chất hóa học 5

1.1.4 Hoạt tính sinh học và khả năng hấp thụ 6

1.2 Tổng quan về tảo Dunaliella .10

1.2.1 Nguồn gốc 10

1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc tế bào .10

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp β-caroten của Dunaliella 19

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về quá trình tăng tổng hợp β-caroten của tảo Dunaliella 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 26

2.4.2 Phân lập tảo Dunaliella .27

2.4.3 Xác định hàm lượng β-caroten 30

2.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến quá trình tăng tổng hợp β-caroten của tảo Dunaliella sp .31

iii

2.4.5 Xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Phân lập tảo Dunaliella sp 36

3.1.1 Phân bố của tảo Dunaliella trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa .36

3.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái, vị trí phân loại của tảo Dunaliella 38

3.2 Tuyển chọn tảo Dunaliella có khả năng sinh beta caroten cao 41

3.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến quá trình sinh tổng hợp β-caroten của chủng NT6 42

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43

3.3.2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng: 46

3.3.3 Ảnh hưởng của yếu tố độ mặn 50

3.3.4 Ảnh hưởng của yếu tố hàm lượng KNO3 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

1 Kết luận 59

2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 DANH MỤC BẢNG PHỤ LỤC KẾT QUẢ

ngày nuôi trong môi trường J/l 8.8%, 7500lux, mật độ ban đầu

5x103 tb/ml 41 Bảng 3.3 Giá trị hàm lương β-caroten (mg/lít) của chủng NT6 trong

nghiệm thức ánh sáng 43 Bảng 3.4 Giá trị hàm lương β-caroten (pg/tb) của chủng NT6 trong

nghiệm thức nhiệt độ .45 Bảng 3.5 Giá trị hàm lương β-caroten (mg\lít) của chủng NT6 trong

nghiệm thức ánh sáng .47 Bảng 3.6 Hàm lượng β-caroten (pg\tb) của chủng NT6 của ngày nuôi thứ

7, 8 và 9 trong nghiệm thức ánh sáng 49 Bảng 3.7 Giá trị hàm lượng β-caroten (mg/lít) của chủng NT6 trong

nghiệm thức độ mặn 51 Bảng 3.8 Giá trị hàm lượng β-caroten (pg\tb) của chủng NT6 trong

nghiệm thức độ mặn trong 3 ngày 7, 8 và 9 của 6 mẫu 0.5M,

1M, 1.5M, 2M, 3M, 4M 52 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng KNO3 đến hàm lượng β-caroten

(mg/lít) của chủng NT6 55 Bảng 3.10 Bảng giá trị giá trị hàm lượng β-caroten(pg\tb) biến thiên theo sự

thay đổi của giá trị dinh dưỡng KNO3 57

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của 1 đơn vị isoprene 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của β-caroten 3

Hình 1.3 Phổ hấp thụ của lycopene (—), γ-caroten (- - -), β-caroten (-.-.-) và α-caroten ( ) trong ete dầu hỏa 5

Hình 1.4 Phổ hấp thụ của hai dạng đồng phân trans- và cis-β-caroten trong ete dầu hỏa 5

Hình 1.5 Hình thái các loài tảo thuộc chi Dunaliella 11

Hình 1.6 Sinh trưởng của Dunaliella salina trong môi trường có nồng độ NaCl từ 0.17M đến 4.0 M NaCl .12

Hình 1.7 Tế bào Dunaliella maritime 15

Hình 1.8 Tế bào Dunaliella salina 15

Hình 1.9 Tế bào Dunaliella primolecta 16

Hình 1.10 Tế bào Dunaliella tertiolecta 16

Hình 1.11 Bốn loài D parva, D salina, D viridis and D pseudosalina sinh trưởng trong NaCl 4.0 M (A), Bể muối ở Gave-Khooni Salt Marsh, Iran có mặt D salina màu đỏ cam (B), hình dạng của D salina sinh trưởng trong NaCl 4 M (C) và hình dạng của D salina sinh trưởng trong NaCl 2M(D) 22

Hình 2.1 Sơ đồ tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 27

Hình 2.2 Phân lập tảo Dunaliella bằng phương pháp pha loãng mẫu 30

Hình 2.3 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến sự tăng tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp .32

Hình 2.4 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của ánh sáng đến đến sự tăng tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp .33

Hình 2.5 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của độ mặn đến đến sự tăng tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp .34

Hình 2.6 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng KNO3 đến đến sự tăng tích lũy β- caroten của tảo Dunaliella sp .35

Hình 3.1 Quá trình phân lập tảo Dunaliella 38

vi

Hình 3.2 Hình thái chủng NT6 (A) và kích thước tế bào chủng NT6 (B)

trên kính hiển vi quang học (100X); mũi tên màu vàng chỉ điểm

mắt (eyespot) 40

Hình 3.3 Hình thái chủng ND25 (A) và kích thước tế bào chủng ND25

(B) trên kính hiển vi quang học (100X); mũi tên màu cam chỉ

thể lạp xếp vòng 41 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng beta caroten (mg/L)

của chủng NT6 44 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng β-caroten (pg/tb) của

chủng NT6 .45 Hình 3.6 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến hàm lượng β-caroten

(mg/lít) của chủng NT6 48 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn giá trị hàm lượng β-caroten(mg\l) của tảo NT6

ở điều kiện ánh sáng 14 klux 48 Hình 3.8 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến hàm lượng β-caroten

(pg/tb) của chủng NT6 50 Hình 3.9 Ảnh hưởng của độ mặn đến hàm lượng β-caroten (mg/l)

của chủng NT6 52 Hình 3.10 Ảnh hưởng của độ mặn đến hàm lượng β-caroten (pg/tb) của

chủng NT6 53 Hình 3.11 Màu sắc của tảo NT6 khi nuôi ở các độ mặn khác nhau Các

mẫu lần lượt theo thứ tự 12,5%(2,14N), 20%(3,41N),

25%(4,27N), 30%(5,12N) 54 Hình 3.12 Hình thái của NT6 khi nuôi ở độ mặn 25% dưới kính hiển vi

quang học (100x) 54 Hình 3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng KNO3 đến hàm lượng β-caroten

(mg/lít) của chủng NT6 .56 Hình 3.12 Ảnh hưởng của hàm lượng KNO3 đến hàm lượng β-caroten

(pg/tb) của chủng NT6 57

vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ER Endoplasmic Reticulum(lưới nội chất)

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

EFAs Essential fatty acids(acid béo thiết yếu)

KLUX 1klux = 1000 lux

CĐAS Cường độ ánh sáng

1

MỞ ĐẦU

Vi tảo là những vi sinh vật xuất hiện sớm trên trái đất, trải qua hàng trăm tỷ năm tiến hóa, chúng được xem là sinh vật có cấu trúc hình thái đa dạng nhất sự phân bố và nơi sống của vi tảo rất đa dạng, chúng có thể sống trong các và phát triển ở các vùng ẩm ướt, thủy vực cho tới các vùng băng tuyết hay sa mạc nóng bức [7]

Chúng có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được, chỉ quan sát được dưới kính hiển vi với độ phóng đại thích hợp Chúng có chứa ít nhất một loại sắc tố chlorophyll Chlorophyll là một cấu thành quan trọng của các sinh vật phù du, tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ một vai trò quan trọng trong việc duy trì phát triển hệ sinh thái Hàng năm

có đến 200 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo thành trên toàn thế giới.Trong số đó

170 - 180 tỉ tấn là do tảo tạo thành Vi tảo chiếm 1/3 sinh khối của thực vật trên trái đất, nó cung cấp 40% - 50 % lượng oxy trong khí quyển hay là lượng oxy trong quá trình hô hấp của sinh vật [7]

Mặt khác ngày nay vi tảo được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống như dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và thức ăn cho động vật, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy hải sản Vi tảo là nguồn phân bón sinh học, năng lượng sạch, nguồn hóa chất trong công nghiệp và dược phẩm, xử

lý môi trường β-caroten, protein, polysaccharide, acid béo không no như: gamma linolenic acid, eicosapentaenoic acid, vitamine docosahexaenoic acid là những hợp chất có trong thành phần cấu tạo của vi tảo đã được con người khai thác và sử dụng [7] Do có nhiều ưu thế so với thực vật bậc cao như vòng đời ngắn, năng suất cao, hiệu số sử dụng ánh sáng cao, công nghệ sản xuất đơn giản, thích hợp với quy mô sản xuất công nghiệp, ngày nay ngành công nghiệp sản xuất vi tảo đã không ngừng phát triển và đạt được những thành tựu đáng kể [7]

2

Dunaliella là một trong số những loài có khả năng tổng hợp

β-caroten để bảo vệ tế bào tránh khỏi các tác nhân từ môi trường bên ngoài tác động như nồng độ ánh sáng cao, độ mặn cao Hàm lượng β-caroten

trong Dunaliella có thể chiếm tới 14% khối lượng khô[12] β-caroten có

nhiều công dụng như: là chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên, là tác nhân làm tăng màu sắc cho thịt cá hồi và lòng đỏ trứng gà cũng như tăng thể trạng và khả năng sinh sản ở gia súc nuôi nhốt β-caroten còn được coi

là chất kích thích sinh trưởng ngăn ngừa ung thư và làm sáng mắt Theo

thống kê năm 1997 giống tảo Dunaliella được nuôi trồng nhiều nhất tại Úc

với sản lượng khoảng 40 tấn/ năm và chúng được ứng dụng chủ yếu để sản xuất thuốc, thức ăn, mỹ phẩm cho con người và động vật [9]

Chủng tảo Dunaliella ở Việt Nam rất đa dạng, nhiều loài đặc hữu,

hứa hẹn sẽ là nguồn tiềm năng sản xuất β-caroten trong thời gian tới Tuy

nhiên hiện nay công nghệ nuôi Dunaliella để thu nguồn β-caroten vẫn đang

là thách thức đối với các nhà khoa học của Việt Nam

Xuất phát từ lý do trên mà chúng tôi tiến hành hiện đề tài “Phân lập

và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến quá trình

tổng hợp β-caroten của tảo Dunaliella sp trên ruộng muối tỉnh Khánh

Hòa ”

Mục tiêu của đề tài :

1: Phân lập tảo Dunaliella sp

2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường bao gồm: nhiệt độ, cường độ ánh sáng, độ mặn, hàm lượng KNO3 đến quá trình tổng

hợp β-caroten của tảo Dunaliella sp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về β-caroten

3

1.1.1 Cấu trúc

β-caroten là hợp chất thuộc nhóm carotenoid Carotenoid là dạng sắc

tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn Hiện nay người ta đã tìm được 600 loại caroten, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophylls và caroten [8] Caroten thuộc nhóm tetraterpen (phân tử chứa 40 nguyên tử C) được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprenne:

CH2 = C – CH = CH2

| CH3 Hình 1.1 Cấu trúc của 1 đơn vị isoprene Các xanthophyll thường có màu vàng và trong phân tử có chứa oxi ví

dụ như: lutein và zeaxanthin

Các caroten có màu đỏ đến da cam, là những hydrocarbon (C40H58)

có 1 mạch ngang 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 nối đôi liên hợp, chúng khác nhau ở các đầu chuỗi ví dụ như: α-caroten,β-caroten và lycopene…[8]

Có 4 loại caroten quan trọng là α-caroten, β-caroten, γ-caroten và lycopen, trong đó β-caroten là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên và được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất β-caroten có cấu tạo đối xứng với 2 vòng β-ionone nên khi thủy phân cho 2 phân tử vitamin A, còn các caroten khác khi thủy phân chỉ cho 1 vitamin A Cấu trúc của β-caroten được thể hiện trong hình 1.2 [8]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của β-caroten

Quang phổ hấp thụ của caroten trong các dung môi ở các vùng cực tím có cực đại hấp thụ như sau (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Quang phổ hấp thụ của một số carotens điển hình [23]

caroten

Acetone 424 448 476 429 452 478 439 461 491 448 474 505 Chloroform 433 457 484 435 461 485 446 475 509 458 484 518 Ethanol 423 444 473 425 450 478 440 460 489 446 472 503 Hexane, Petroleum ether 422 445 473 425 450 477 437 462 494 444 470 502

5

Hình 1.3 Phổ hấp thụ của lycopene (—), γ-caroten (- - -), β-caroten

(-.-.-) và α-caroten ( ) trong ete dầu hỏa

Hình 1.4 Phổ hấp thụ của hai dạng đồng phân trans- và cis-β-caroten

trong ete dầu hỏa

1.1.3 Tính chất hóa học

β-caroten là một dẫn xuất isopen chưa bão hòa, bền trong môi trường

kiềm và không bền môi trường Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp β-caroten

có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp

xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ

β-caroten nhạy cảm với oxy, sự đồng phân hóa xảy ra dưới sự ảnh

hưởng bởi ánh sáng, nhiệt độ, và oxy Vì vậy phải giữ ở điều kiện tránh ánh

A [20]

Hoạt tính sinh học của β-caroten phụ thuộc vào tính chất vật lý của

nó trong thực phẩm Chế độ ăn uống cùng với thực vật và chất béo sẽ làm tăng khả năng hấp thụ Trong dạ dày, β-caroten có xu hướng tổng hợp cùng với lipid ở dạng viên nhỏ, sau đó được chuyển vào ruột non Chỉ 1/3 β-caroten trong chế độ ăn uống được hấp thụ vào ruột, và 1 nửa của chúng được chuyển đổi thành retinol Phần còn lại được lưu trữ trong chất béo dự trữ

của cơ thể [22]

Tính độc của β-caroten cũng được quan tâm nhiều, đối với các sản phẩm tự nhiên do có thêm một số các đồng phân khác nên không gây độc tính dù sử dụng ở nồng độ cao, trong khi đó thì β-caroten tổng hợp hóa học lại chỉ bao gồm toàn cấu hình trans nên gây độc khi sử dụng với liều lượng cao Vì vậy, xu hướng hiện nay chủ yếu tập trung vào sản xuất β-caroten theo con đường sinh tổng hợp tự nhiên [22]

Đối với β-caroten khi ở dạng tiền vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố

da chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại Người ta khuyên nên dùng bổ sung β-caroten trước khi làm việc lâu dài dưới ánh nắng mặt trời

Cơ chế chống oxy hóa:

Trong cơ thể, caroten nói chung và β-caroten nói riêng có khả năng triệt tiêu các gốc tự do, dập tắt các chuỗi phản ứng dây chuyền Nhờ có hệ thống liên hợp, nó vô hiệu hóa phân tử oxi bị kích hoạt Một phân tử β-caroten có thể hấp thụ năng lượng của oxy nguyên tử rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại [20]

O2 + β-caroten→ β-caroten* + β-caroten* → β-caroten + Q(vô hại)

Lợi ích sức khỏe

β-caroten là một nguồn provitamin A phong phú trong thức ăn để giúp phòng ngừa thiếu vitamin A Vitamin A đóng vai trò quan trọng trong nhiều bộ phận của cơ thể, như hệ thống miễn dịch, thị giác, cơ quan sinh sản, … β- caroten đã được công nhận là hợp chất chống ung thư [20]

Dựa trên các nghiên cứu, người ta đã kết luận rằng cùng với vitamin

C, E, đồng, mangan, β-caroten có vai trò quyết định đến sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do (các chất tự do kém bền và hoạt động mạnh, có khả năng kết hợp với các phân tử khác, đặc biệt là lipid và gây nên phản ứng

Đặc biệt, β-caroten không độc đối với cơ thể khi sử dụng ở liều lượng cao và kéo dài, trong khi nếu ta sử dụng vitamin A kéo dài và với liều cao thì sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan Nguyên nhân chính là do cơ thể chuyển hóa β-caroten thành vitamin A khi có nhu cầu Chỉ 1/6 lượng β-caroten chuyển thành vitamin A [23]

β-caroten có hai đồng phân trans- và cis-β-caroten, trong đó, caroten có thể chuyển thành dạng cis-β-caroten Dạng đồng phân trans β-caroten con người có thể hấp thụ và sử dụng được Hiện tại thì các nghiên cứu chỉ ra rằng khi sử dụng β-caroten tổng hợp β-caroten tự nhiên( có cả cis và trans) thì tốt hơn là sử dụng β-caroten tổng hợp theo con đường hóa học chỉ chứa dạng trans [23]

trans-β-c Ứng dụng và sản xuất thương mại của β-caroten

Ngày nay, tác dụng phụ của chất hóa học trong thức ăn và sản xuất nông nghiệp là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học Màu nhân tạo, hàn the và chất bảo quản trong quy trình sản xuất thực phẩm, sự phân hủy của chất bảo vệ thực vật tích tụ trong cơ thể sẽ gây ra bệnh ung thư và nhiều căn bệnh nguy hiểm khác Từ lý do này, chất chống oxy hóa từ nguồn tự

9

nhiên là nhu cầu rất lớn trong thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm caroten có nhiều đóng góp trong các lĩnh vực này

β-Về màu thực phẩm: β-caroten có nguồn gốc tự nhiên đã được sử

dụng rộng rãi trong thực phẩm và nước giả khát, chúng được cho là an toàn hơn các màu nhân tạo khác Những sắc tố này có thể được tổng hợp hoặc chiết xuất từ những nguồn tự nhiên Chúng được sử dụng là những chất tạo màu tự nhiên cho thực phẩm như cam, kẹo, bơ, pho mát và nước mắm Và

xa hơn nữa, chúng có thể được sử dụng như là chất chống oxy hóa để kéo dài tuổi thọ của sản phẩm

Về bổ sung dinh dưỡng : β-caroten được coi như là chất có hoạt tính

như provitamin A Nó được bổ sung vào thực phẩm để làm tăng giá trị dinh dưỡng trong các sản phẩm đặc biệt như sữa, nước uống tăng lực và nước trái cây β-caroten có thể được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để làm tăng chất lượng của trứng và sữa

Về thành phần dược phẩm : β-caroten tinh khiết được sử rộng rãi

trong các sản phẩm dược phẩm như các vitamin dạng viên Nó còn là thành phần kết hợp trong các loại thuốc chống chống ung thư và hỗ trợ điều trị ung thư [8]

-

Tảo lục Lớp (Class) Chlorophyceae Wille, 1884 – Tảo lục

Bộ (Order)Volcocales Oltmanns, 1904

Họ (Family) Dunaliellaceae T.Christensen, 1967 Chi (Genus) Dunaliella E.C Teodoresco, 1904 Loài (Species) Dunaliella sp Teodoresco, 1905

1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc tế bào

a Đặc điểm hình thái

Đầu thế kỷ 18, các nhà khoa học cho rằng Dunaliella giống với

Haematococcus, nhưng nửa sau thế kỷ 19, họ tìm ra rằng chi này khác biệt

với Haematococcus và đặt tên mới là Dunaliella [12] Cho đến nay, 28 loài

Dunaliella đã được công nhận (Hình 1.5) Chúng bao gồm năm loài (từ

mẫu 1-5 ở Hình 1.5) sống trong nước ngọt và hiếm khi xuất hiện, trong khi

đó 23 loài trong số này (từ mẫu 6-28 ở Hình 1.5) có mặt trong môi trường mặn [12]

11

Hình 1.5 Hình thái các loài tảo thuộc chi Dunaliella

1 D acidophila; 2 D flagellata; 3 D lateralis; 4 D obliqua; 5 D

paupera, 6 D maritima, 7 D polymorpha, 8 D primolecta, 9 D quartolecta, 10 D tertiolecta, 11 D parva, 12 D.pseudosalina, 13 D salina, 14 D baas-beckingii, 15 D bioculata, 16 D carpatica, 17 D gracili, 18 D granulata, 19 D media, 20 D minuta, 21 D minutissima,

22 D ruineniana, 23 D.terricola, 24 D viridis, 25 D asymmetrica, 26

D jacobae, 27 D peircei, 28 D turcomanica Scalebar: 10 µm [12]

b Cấu trúc tế bào

12

Dunaiella là một loại tảo xanh dị hợp thuộc Ngành Chlorophyta, họ

Polyblepharidaceae [12][27] Mặc dù tế bào không có thành, các loài của chi này vẫn có thể sinh trưởng trong môi trường có độ mặn thay đổi từ

0.5M đến 5.5M NaCl [39][29] Trong điều kiện bị stress, loài Dunaliella có

thể tích lũy một lượng đáng kể các hợp chất có giá trị, như carotenoid [35][26], glycerol [26] vitamin và protein Tế bào Dunaiella có thể thích ứng với phạm vi rộng của nồng độ muối vì chúng có khả năng thay đổi nồng độ glycerol nội bào Trong thực tế, sự tích lũy glycerol trong loại tảo này bị ảnh hưởng bởi nồng độ muối của môi trường [38]

Hình 1.6 Sinh trưởng của Dunaliella salina trong môi trường có nồng độ

NaCl từ 0.17M đến 4.0 M NaCl [26]

Dunaliella là các loài vi tảo đơn bào có hình dạng tế bào thay đổi từ

elip, hình trứng, hình trụ, hình quả lê, và hình thoi đến gần như hình cầu

Có kích thước 5,0-29,0µm chiều dài x 2,5 – 21,0 µm chiều rộng Các tế bào của một loài nhất định có thể thay đổi hình dạng khi điều kiện môi trường thay đổi, thường trở thành hình cầu trong các điều kiện bất lợi Kích thước

13

tế bào cũng có thể khác nhau tùy theo điều kiện sinh trưởng và cường độ ánh sáng [10] Tế bào có 2 roi đều nhau, và thường chuyển động đồng thời Hai lông roi được gắn trên đầu Cấu trúc của lông roi rất phức tạp Lông roi

có thể gốc Hai thể gốc gần nhau ở hướng 1/7 giờ và mang vi ống gốc lông roi Các góc được hình thành giữa hai sợ lông roi thường từ 90-130o và dường như không đổi chiều Chúng được kết nối với nhau bởi một ngoại biên và 2 sợi tơ ở gần tâm Cũng có thể có thêm 2 thể gốc không kết nối với lông roi Hệ thống vi ống gốc lông roi chéo chữ thập và ở dạng X-2-X-

2 Lục lạp đơn chiếm hầu hết thể bào Nó có dạng chén, đĩa, hoặc dạng chuông và có vùng đậm đặc có chứa nhân tinh bột hay nhân protein (pyrenoid) Trong lục lạp có các thể đặc biệt gọi là hạt tạo bột (pyrenoid),

là những thể protein hình cầu hay có góc, xung quanh tập trung các hạt tinh

bột hay hydrat cacbon là chất dự trữ chính của Dunaliella Lục lạp đôi khi

được rạch thành nhiều thùy Các cụm thylacoid được cho là có liên quan đến sự sinh trưởng của tế bào trong điều kiện ánh sáng mạnh và nồng độ muối cao Hạt tinh bột thường bao quanh pyrenoid, nhưng cũng có thể

được tìm thấy tại các nơi khác của lục lạp Ở một số loài (D salina, D

parva) thể lạp cũng có thể tích lũy một số lượng lớn β-caroten trong các

giọt dầu ở khoảng trong màng thylacoid, vì vậy tế bào thường có màu cam

đỏ hơn là màu xanh Hạt β-caroten của D salina chỉ có các giọt mỡ trung

tính, hơn một nửa trong số đó là β-caroten Phần lớn các dạng màu đỏ sẽ mất màu trong điều kiện ánh sáng yếu [35]

Điểm mắt (stigma) thường phân bố ở phần trước ngoại biên trong thể lục lạp Ở một số loài điểm mắt hầu như rất khó quan sát dưới kính hiển vi quang học Nó bao gồm một hay hai hàng giọt lipid, có nhiều ở tế bào già

Có thể các giọt có hình lục giác Ở Dunaliella chúng liên kết chặt chẽ với

các thylakoid [12] Thể nhân (nucleus) thường bị che khuất bởi một số lượng lớn các hạt Nó chiếm hầu hết phần trước của tế bào và được bao

14

quanh bởi các thùy trước của thể lạp Nghiên cứu siêu cấu trúc cho thấy nó

có một vỏ có lỗ (porous envelope) và một hạch nhân đơn, lồi được bao quanh bởi các cấu trúc chromatin Có thể quan sát thấy cấu trúc ty thể ở nhiều phần khác nhau của tế bào Số lượng và kích thước ty thể thay đổi rất lớn giữa các tế bào ở những giai đoạn sinh trưởng khác nhau Tế bào có từ 2-4 thể Golgi, mỗi thể có 10-15 cisternae Mạng lưới nội chất (ER) thường nằm phía dưới màng sinh chất Trong suốt thời kỳ bị stress do muối cao,

ER tăng về số lượng, ER đóng vai trò như một bể nhân tạo chứa vật chất màng khi các thành phần chính của tế bào co lại Không bào rất đa dạng, có chứa một số thành phần tế bào và các túi, bọng, các hạt hay vật chất khác của tế bào chất Các giọt lipid lớn hoặc là không bào chứa các giọt lipid nhỏ hơn có thể tìm thấy ở nhiều nơi trong tế bào Các thể cyst sinh sản vô tính có thể được tạo thành khi điều kiện sống trở nên khắc nghiệt, ví dụ môi trường bị khô hạn quá mức, hoặc bị pha loãng quá mức Sinh sản hữu tính bằng đẳng giao (isogamy), với phương thức tiếp hợp giao tử giống như

cách thức của nguyên sinh động vật (Chlamydomonas) Trong cùng một

loài, các giao tử có cùng kích thước và đặc điểm cấu trúc giống như tế bào

sinh dưỡng Một số loài Dunaliella đồng tản, trong khi đó D.salina dị tản

Hợp tử thường có màu xanh hay màu đỏ và được bao bọc bởi một thành nhẵn và dày Sau giai đoạn nghỉ, nhân của nó bắt đầu phân chia tạo thành nhiều hơn 32 tế bào, chúng sẽ được giải phóng khi thành của tế bào mẹ bị

vỡ Giảm phân xảy ra trong suốt quá trình nảy mầm của hợp tử

Hình dạng tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi mức độ thay đổi của điều kiện sinh trưởng Những thay đổi rõ rệt có thể xảy ra giữa pha logarit và pha cân bằng Nồng độ muối, cường độ ánh sáng và nhiệt độ sẽ có ảnh hưởng lên cấu trúc của thylacoid, pyrenoid và mạng lưới nội chất Trước

đây, Dunaliella và một số loài có roi không có thành tế bào được phân loại

vào họ Polyblepharidaceae trong bộ Volvocales Tuy nhiên sau này những

15

nghiên cứu chi tiết hơn trên nhiều loài có roi màu xanh đã dẫn đến việc

phân loại lại các chi này vào taxon khác Dunaliella được phân thành một chi riêng của họ Chlorophyceae Mặc dù thiếu thành cứng, Dunaliella cũng

mang nhiều đặc điểm chung với họ Chlamydomonadales [12]

Hình 1.7 : Tế bào Dunaliella maritime

Hình 1.8 : Tế bào Dunaliella salina

Tên loài : Dunaliella maritime

Masjuk 1973[41]

Chiều dài : 7 - 12µm Roi : 2 roi, dài từ 1,5 - 2 lần chiều dài

tế bào Lục lạp : vàng xanh

Tên loài : Dunaliella salina Teodoresco 1905[41]

Chiều dài : 16 – 24 µm Roi : 2 roi, dài từ 1,5 - 2 lần chiều dài

tế bào Lục lạp : xanh

Dunaliella đặc biệt giàu chất dinh dưỡng và khoáng chất chống oxi

hóa, đặc biệt là Selen (Se) và Magie Se là một chất chống oxy hoá mạnh nhằm hỗ trợ trong cai nghiện và tăng cường miễn dịch Magie rất quan trọng trong chuyển hóa tế bào, sản xuất năng lượng và chức năng của cơ bắp và dây thần kinh [40]

Tên loài : Dunaliella primolecta

Butcher 1959[41]

Chiều dài : 5 – 7 µm Roi : 2 roi, dài từ 1,5 - 2 lần chiều dài

tế bào Lục lạp : vàng xanh

Tên loài : Dunaliella tertiolecta

Butcher 1959[41]

Chiều dài : 9 – 11µm Roi : 2 roi, dài từ 1,5 - 2 lần chiều dài

tế bào Lục lạp : vàng xanh

17

Vitamin

Dunaliella chứa một loạt các chất dinh dưỡng bao gồm cả vitamin

E, cobalamin (vitamin B12) và provitamin A.Vitamin A đóng vai trò thiết yếu cho thị lực, sự tăng trưởng, sinh sản và sự điều khiển hệ thống miễn dịch Nó cũng giúp duy trì sức khỏe của da và niêm mạc Cobalamin là cần thiết cho sự chuyển hóa năng lượng, chức năng miễn dịch và chức năng thần kinh.[40]

Các axit béo thiết yếu (EFAs)

Dunaliella chứa EFAs với hàm lượng cao giúp làm giảm mức

cholesterol và chất béo trong máu, ngăn ngừa bệnh tim, giảm viêm trong viêm khớp, cải thiện chức năng miễn dịch và não, hỗ trợ sức khỏe sinh sản

và kinh nguyệt Những chất béo, bao gồm cả Omega 3, Omega 6, axit linoleic và alpha linoleic axit là rất cần thiết cho việc hấp thu các caroten, vitamin E và chất béo, chất dinh dưỡng hòa tan khác [40]

Amino axit

Dunaliella có chứa hàm lượng axit amin cao Axit amin là những vật

liệu xây dựng cơ bản của chất sống, cần thiết cho sự tổng hợp của cơ bắp,

da và mô liên kết, hormon, các enzyme và chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitter) [40]

Spirulina

(/100g)

Cà rốt (/100g) Protein 7,4 g 57 g 1,0g

Chlorophyll 2210 mg 1000 mg Chưa biết

Bảng 1.3: So sánh khoáng chất trong các loại thực phẩm xanh [40]

Lá xanh barley (Green barley)

Lá xanh barley (Green barley)

Lưu huỳnh 2185 <2000 <2000 <2000 <2000

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp β-caroten của Dunaliella

Dunaliella có lợi thế là có khả năng phát triển trong môi trường nồng

độ muối cao nên có thể nuôi cấy trong những hệ thống nuôi mở cũng như

hệ thống nuôi cấy khép kín Ngoài ra để Dunaliella có khả năng tổng hợp

được β-caroten trong các hệ thống nuôi nhân tạo thì ta phải điều chỉnh cân

bằng các yếu tố thích hợp ảnh hưởng đến quá trình tăng tổng hợp β-caroten của tảo

Ánh sáng

Dunaliella là một vi tảo quang tự dưỡng bắt buộc, ánh sáng là nguồn

năng lượng duy nhất cho sự chuyển hóa của nó [20] Ngoài tự nhiên thì nguồn ánh sáng cung cấp duy nhất là ánh sáng mặt trời, còn trong các hệ thống nuôi cấy kín thì ánh sáng có thể cung cấp bằng cách sử dụng ánh sáng trắng đèn huỳnh quang hoặc ánh sáng mặt trời Như vậy với nguồn ánh sáng là đèn huỳnh quang thì cần phải có một lượng ánh sáng đủ lớn để quá trình tăng tổng hợp β-caroten được diễn ra [37]

Nhiệt độ:

Dunaliella có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 0- 45oC

Trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng Dunaliella từ

25-35oC[14] Nhiệt độ lớn hơn 40oC thường gây chết Đây có thể là vấn đề

chính trong việc nuôi Dunaliella ngoài trời, đặc biệt là ở những vùng nắng

nóng Trong hệ thống nuôi cấy khép kín thì nhiệt độ luôn luôn được điều

20

chỉnh cho phù hợp với mục đích của người nuôi Dưới ảnh hưởng của cường độ ánh sáng cao các giọt β-caroten trong tế bào vi tảo như là một màng chắn giúp bảo vệ tế bào vi tảo tránh khỏi ảnh hưởng của các cường

độ ánh sáng cao Như vậy với cường độ ánh sáng cao sẽ cảm ứng tế bào vi

tảo sản sinh ra lượng β-caroten cao hơn

Độ mặn

Dunaliella là các loài có khả năng sinh trưởng và phát triển ở phổ

muối rộng từ 0,5M – 5,5M [39][29] Quá trình tăng tổng hợp β-caroten của

tảo Dunaliella thường được diễn ra trong môi trường có nồng độ NaCl cao

hơn 10% Trong quá trình nuôi nhân tạo thì ta cần phải điều chỉnh và theo dõi nồng độ NaCl cho phù hợp với quá trình nuôi để tăng tổng hợp β-caroten Dưới sự tác động của yếu tố độ mặn cao các giọt β-caroten và giọt lipit trong tế bào vi tảo giúp ngăn ngừa sự mất nước trong tế bào chính vì vậy mà vi tảo có khả năng phát triển trong điều kiện độ mặn cao Dưới ảnh

hưởng của độ mặn cao sẽ cảm ứng sự sinh β-caroten của vi tảo.[19]

Hàm lượng KNO 3

Trong điều kiện nuôi nhân tạo với cường độ ánh sáng cao, liên tục cùng với độ mặn thích hợp và nhiệt độ thuận lợi thì quá trình tăng tích lũy β-caroten đã xảy ra nhưng để đạt được hiệu quả tối ưu thì điều kiện thiếu Nitơ là một trong những yếu tố rất quan trọng Thiếu dinh dưỡng trong quá trình nuôi sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ phát triển của tảo nhưng lại có vai trò thúc đẩy quá trình tăng tổng hợp β-caroten trong tế bào Tuy nhiên nếu như kéo dài thời gian thiếu hàm lượng KNO3 trong thời gian nuôi cấy thì sẽ dẫn đến tỷ lệ chết của tế bào cao như vậy lượng β-caroten thu được trong một đơn vị thể tích sẽ giảm [21]

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về quá trình tăng tổng hợp β-caroten của

tảo Dunaliella

a Tình hình nghiên cứu trên thế giới

21

Dunaliella đã được chứng minh là loài tảo có khả năng tích lũy

caroten với lượng lớn trong các giọt dầu ở khoảng gian bào giữa các thylacoid trong lục lạp β-caroten cho thấy khả năng hấp thụ cực đại trong ete dầu hỏa ở bước sóng 453nm và 481nm Các chủng giàu β-caroten thường phân bố ở những nơi có chứa >10% muối, và chiếm ưu thế ở nơi có nồng độ muối bão hòa [38] Màu đỏ cam của các hồ nước mặn dưới điều

kiện chiếu sáng mạnh thường là màu β-caroten của Dunaliella Trong điều kiện sinh trưởng bình thường (1-2M NaCl) Dunaliella thường có màu

xanh, và chỉ chứa 0.3% β-caroten, tương tự như các loài thực vật và tảo khác Tuy nhiên, nếu bị sốc mạnh hàm lượng β-caroten được tích lũy có thể lên tới trên 14% khối lượng khô, là mức hàm lượng cao nhất so với bất kỳ loài tảo và thực vật nào đã được biết Mức độ tổng hợp β-caroten còn phụ thuộc vào các thông số sinh trưởng sinh lý, cụ thể là cường độ ánh sáng, nồng độ muối, nhiệt độ, và thiếu dinh dưỡng [35] Các stress môi trường càng mạnh càng làm chậm tốc độ tăng trưởng của tảo, và làm tăng hàm lượng beta caroten tích lũy Tuy nhiên, nếu các stress này xảy ra cùng một lúc, sẽ làm giảm số lượng tế bào/đơn vị thể tích, ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào Vì vậy, theo một nhóm tác giả, việc điều chỉnh cường độ ánh sáng và độ mặn có thể là chiến lược tốt nhất để đạt được mức tích lũy β-

caroten tối ưu Chủng D.salina của Iran có màu xanh khi sinh trưởng trong

môi trường NaCl 1-2M, trong khi đó nó có mầu cam khi sinh trưởng trong môi trường NaCl 4M Sự tích lũy caroten là nguyên nhân chính gây nên sự

đổi màu từ màu xanh sang màu cam của D.salina tại NaCl 4M

22

Hình 1.11: Bốn loài D parva, D salina, D viridis and D

pseudosalina sinh trưởng trong NaCl 4.0 M (A), Bể muối ở Gave-Khooni

Salt Marsh, Iran có mặt D salina màu đỏ cam (B), hình dạng của D salina sinh trưởng trong NaCl 4 M (C) và hình dạng của D salina sinh trưởng

trong NaCl 2M(D)

Bảng 1.4 : Hàm lượng caroten (Car.), hàm lượng chlorophyll (Chl.)

tỷ sô carotenoid/chlorophyll và màu sắc của tảo Dunaliella salina nuôi

trong môi trường có độ mặn khác nhau NaCl (M) trong một tuần [26]

Mầu sắc tảo Car/Chl Chl

µg/ml

Car µg/ml Nồng độ NaCl (M)

23

Có một vài lý do về sự tăng tổng hợp β-caroten đã được đề xuất và

và được điều tra như sau:

1 Lưu trữ cacbon: β-caroten được lưu trữ và tích lũy như một sản phẩm của quá trình quang hợp khi mà tốc độ sinh trưởng của tế bào bị hạn

chế Các tế bào Dunaliella không sử dụng hoặc chuyển hóa β-caroten trong

điều kiện bóng tối hoặc với sự có mặt của CO2 nhưng trong điều kiện ánh sáng bình thường

2 β-caroten bảo vệ tế bào chống lại các chất gây tổn thương tới chất diệp lục Giả thuyết này được phân tích bằng hình ảnh vi điện tử của tế bào

Dunaliella giàu caroten cho thấy có khoảng cách lớn giũa các giọt

β-caroten và chất diệp lục nằm trong thylacoid

3 Hiệu quả hấp thụ: β-caroten chống lại sự tổn thương do các bức xạ cường độ cao Trong điều kiện tăng trưởng bị hạn chế thì β-caroten hoạt động như một màn hình hấp thụ các bức xạ dư thừa Giả thuyết này được

chấp nhận thông qua quan sát tế bào tảo Dunaliella salina giàu β-caroten

cho thấy nó có khả năng bảo vệ tối đa chống lại các bức xạ cao với với ánh sáng màu xanh và bảo vệ tối thiểu với chiếu xạ ánh sáng màu đỏ Như vậy

chức năng của β-caroten trong tế bào tảo Dunaliella salina là bảo vệ tế bào

chống lại các tác hại của bức xạ cường độ ánh sáng cao bằng cách hấp thụ ánh sáng màu xanh và vùng quang phổ của nó

Quá trình làm tăng tích lũy β-caroten của Dunaliella salina gồm hai giai đoạn Giai đoạn thứ nhất là nuôi cấy Dunaliella salina trong một thể

tích nhỏ để đạt được tốc độ sinh trưởng tối ưu sau đó mới chuyển sang giai đoạn hai, trong giai đoạn này tảo được chuyển sang nuôi cấy với thể tích lớn hơn và tiến hành pha loãng bằng cách nuôi trong môi trường thiếu nitrat hoặc nuôi trong bình có nồng độ muối cao hơn 1/3 lần so với khoảng

có cảm ứng β-caroten Việc tối ưu hóa lại mật độ tế bào cho thấy khả năng

24

sản xuất β-caroten đạt hiệu quả cao hơn, và lượng tế bào đạt hiệu quả khoảng 0,7 – 0,9 x 106 tế bào\ml [26]

Nghiên cứu gần đây của cho thấy có một cách tiếp cận khác về khả

năng sinh β-caroten của tế bào tảo Trong quá trình phát triển của tảo

Dunaliella bardawil nếu cho tiếp xúc với nhiệt độ thấp khoảng 10-15oC thì tảo có khả năng tạo ra đồng phân 9-cis của β-caroten.[24]

b Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta hiện nay các công trình nghiên cứu trên đối tượng và vi

tảo Dunaliella chưa thực sự nhiều và đầy đủ Các công trình nghiên cứu

trong chủ yếu được thực hiện bởi Đặng Đình Kim, Đặng Diễm Hồng và cộng sự thực hiện, mở đầu cho hướng nghiên cứu trên đối tượng vi tảo

Dunaliella đó là công trình nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và hàm lượng

sắc tố của hai loài tảo thuộc chi Dunaliella và phần 2 là nghiên cứu các tác

động của mật độ ban đầu[2], pH và nồng độ muối NaCl khác nhau Tiếp theo các thành công của nghiên cứu đó thì nhóm nghiên cứu đã thự hiện

hang loạt các đề tài liên quan tới đôi tượng là vi tảo Dunaliella như nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và quang hợp của hai loài tảo Dunaliella

salina và Dunaliella bardawil, (1995), Ảnh hưởng của sốc muối NaCl lên

sinh trưởng, hoạt tính quang hợp và hàm lượng sắc tố của vi tảo Dunaliella

salina(1996), tác động của điều kiện đói đạm lên hoạt động của chu trình

xanthophyll và sự tích lũy β-caroten của vi tảo Dunaliella salina(1998)

[4],tác động của cường độ ánh sáng cao lên hoạt động của chu trình

xanthophyll và sự tích luỹ β-caroten của vi tảo Dunaliella

salina(1998)[4],Nghiên cứu tính đa dạng của một số loài Dunaliella

(Chlorophyta) bằng kỹ thuật RAPD-PCR (2000) Nhưng các công trình

nay hiện nay không thấy có đóng góp nhiều trong thực tế cũng như ứng dụng trong công nghiêp

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

25

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi tảo Dunaliella trên các ruộng muối ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 4/2012 đến tháng 4/2013

Địa điểm lấy mẫu: các ruộng muối bậc 1,2,3 và các kênh dẫn nước, kênh xả nước thuộc các xã Ninh Thủy và Ninh Diêm

Địa điểm thực tập: Trường Đại Học Nha Trang

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

a Hóa chất

Môi trường Johnson [19]

Bảng 2.1 Thành phần môi trường

Thêm vào 980 ml nước

Điều chỉnh pH tới 7.5 với HCl

b Thiết bị nghiên cứu

- Máy đo cường độ ánh sáng

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu

Đề tài sử dụng cách tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phương pháp phân lập và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường tới quá

27

trình tăng tổng hợp β-caroten theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ tiếp cận các vấn đề nghiên cứu

2.4.2 Phân lập tảo Dunaliella

Chủng tảo Dunaliella sử dụng trong nghiên cứu được thu thập và

phân lập từ các ruộng muối của 2 xã Ninh Thủy và Ninh Diêm

Quy trình phân lập

Lấy mẫu tảo ở các ruộng muối bậc 1,2,3, các kênh dẫn nước,kênh xả nước

Kiểm tra các điều kiện( nhiệt độ, pH, độ mặn) Lọc mẫu (lọc qua bông lọc, ly tâm mẫu…)

Quan sát sự có mặt của tảo Dunaliella trong các mẫu bằng kính hiển

vi Nuôi bằng cách bổ sung môi trường Johnson 8,8% NaCl vào mẫu

Soi mẫu Tiến hành phân lập mẫu

Phân lập được chủng tảo Dunaliella thuần

Phân

lập

Thu mẫu, phân lập vi tảo Dunaliella sp có trên các ruộng muối

bằng

- Phương pháp pha loãng mẫu

- Phương pháp cấy trên đĩa thạch

Sử dụng môi trường trường Jonhson 8,8% NaCl

28

Thu mẫu: là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu bất kì vi sinh

vật nào Mẫu được thu từ các ruộng muối và các kênh dẫn, xả nước của các

xã Ninh Thủy, Ninh Diêm, mẫu được đựng trong các chai nhựa sạch đã chuẩn bị trước Mẫu tảo sau khi thu, tiến hành kiểm tra các điều kiện như

pH, độ mặn,cường độ ánh sáng nơi thu mẫu Ta sử dụng một số dụng cụ để kiểm tra các thông số trên như sau:

- Sử dụng nhiệt kế thủy ngân chia vạch (0–100oC) để xác định chính xác nhiệt độ của môi trường nơi thu mẫu

- Sử dụng giấy đo pH để đo pH của địa điểm thu mẫu

- Sử dụng khúc xạ kế để đo độ mặn của nguồn nước Do môi trường

có độ mặn tương đối cao nên cần phải pha loãng mẫu nước khoảng 10 lần trước khi đo, sau đó nhỏ 1-2 giọt nước trong mẫu nước cần xác định độ mặn lên mặt kính, rồi đưa kính ra nơi sáng quan sát và kết quả được hiển thị qua ống nhòm ngay sau đó

- Sử dụng máy đo cường độ quang xác định cường độ ánh sáng Đưa

bộ phận cảm ứng ánh sáng ra nơi cần đo cường độ ánh sáng Thông số cường độ ánh sáng sẽ hiển thị trên màn hình

Tăng sinh: Các mẫu sau khi được lấy về sẽ được lọc bằng lưới lọc

sinh vật Làm các tiêu bản giọt ép để quan sát sự có mặt củatảo Dunaliella Các mẫu có sựu hiện diện của Dunaliella sẽ được làm giàu bằng cách bổ

sung vào môi trường Johnson 8,8% và bắt đầu sục khí ngay để các tế bào tảo Dunaliela phát triển Sau một thời gian, khi thấy dung dịch dần có màu xanh đặc trưng của tảo thì ta lại làm tiêu bản giọt ép và quan sát mẫu 1 lần nữa trước khi đem mẫu đi phân lập Mẫu tảo được đem đi phân lập bằng 2 phương pháp đó là sử dụng phương pháp pha loãng mẫu và phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch

Dựa vào hình thái, màu sắc để chọn mẫu tảo mong muốn Quá trình phân lập được lặp lại nhiều lần cho đến khi xác định được loài thuần khiết

29

dựa vào quan sát trên kính hiển vi và một số tính chất khác Sau đó được cấy chuyền vào các bình thủy tinh kích thước lớn để thu được một dòng tảo thuần

Phân lập tảo Dunaliella

Năm 2007 trường đại học Murdoch đã đưa ra 3 phương pháp phân lập giống tảo: phương pháp pha loãng, phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch, phương pháp nhặt tế bào bằng micropipette Ở Việt Nam theo

TS Hoàng Thị Bích Mai thì ngoài 3 phương pháp trên thì bà còn đề cập tới

phương pháp lọc bằng các màng lọc với kích cỡ khác lỗ màng nhau [9]

a Phương pháp pha loãng mẫu

- Chuẩn bị các ống nghiệm sạch có dung tích bằng nhau được khử trùng và đậy kín bằng nút bông bên trên được bọc bằng giấy bạc, mỗi ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Jonhson 8,8% NaCl và có dán nhẵn ghi hệ

số pha loãng

- Dùng pipet có dung tích 1ml, hút 1ml dung dịch tảo mẫu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối đưa sang ống nghiêm đầu tiên có hệ số pha loãng

là 10-1 và dùng pipet hút lên xả xống nhiều lần để trộn đều mẫu

- Sau đó lấy 1ml từ ống nghiệm 10-1 đưa sang ống nghiệm 10-2 và làm tương tự như ống nghiệm 1 Cứ làm lần lượt như thế với các ống nghiệm tiếp theo ta lần lượt được các ống mẫu với các hệ số pha loãng là

10-3,10-4,10-5,10-6,10-7

30

Hình 2.2 Phân lập tảo Dunaliella bằng phương pháp pha loãng mẫu

b, Phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch

- Môi trường thạch là môi trường Johnson 8,8% NaCl có bổ sung 2% agar sau đó được đun sôi cho tan hết agar

- Đổ thạch vào các đĩa pettri khoảng 10-15ml/đĩa sau đó mở nắp để nguội tự nhiên

- Đậy nắp đĩa thạch lại sau đó khử trùng bằng đèn UV trong tủ cấy vô trùng khoảng 10 phút các đĩa thạch sau khi được đổ

- Dùng pipet 1ml hút đúng 1ml mẫu tảo cho vào các đĩa thạch rồi sau

đó sử dụng que cấy chang để chang mẫu sao cho thật đều trên các đĩa thạch

- Sau thời gian là 2-3 tuần tiến hành quan sát các khuẩn lạc màu xanh, sau đó soi dưới kính hiển vi để xác định chính xác khuẩn lạc của tảo

Dunaliella Sử dụng que cấy tròn lấy khuẩn lạc Dunaliella và đưa vào các

ống nghiệm có chứa môi trường nuôi để nuôi tăng sinh

- Lặp lại các thao tác thí nghiệm tới khi thu được khuẩn lạc thuần

2.4.3 Xác định hàm lượng β-caroten

31

Hàm lượng β-caroten được xác định theo phương pháp của Shaih et

al, 1992 [26] được mô tả theo các bước như sau:

- Sử dụng pipet 1ml hút đúng 1ml tảo nuôi cho và các ống eppendorf

- Ly tâm mẫu ở 1000 vòng trong thời gian là 5 phút sau đó loại bỏ phần dịch, giũ lại phần tảo phía dưới

- Cho thêm 3ml hỗn hợp dung dịch Hexan-Ethanol tỷ lệ 2:1(v\v) sau

đó thêm vào 2ml nước cất rồi thêm tiếp 4ml Hexan

- Mang hỗn hợp trên đi ly tâm ở 1000 vòng trong thời gian 5 phút

- Hút phần dịch nổi phía trên và đo OD ở bước sóng 450nm

Công thức xác định hàm lượng β-caroten như sau :

[β-caroten]mg/l = A450 x 25,2

[β-caroten]mg/l [β-caroten]pg/tế bào =

mật độ tế bào[triệu tế bào\ml]

2.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến quá

trình tăng tổng hợp β-caroten của tảo Dunaliella sp

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

+ Mật độ tế bào vi tảo: 2x105 [26]

+ Cường độ chiếu sáng: 7500 lux[43]

+ Thời gian chiếu sáng: 24/24h

+ Sục khí liên tục

+ Sử dụng môi trường Johnson 8,8 %

+ Thể tích nuôi: 500ml

+ Nhiệt độ : 22oC, 28oC và nhiệt độ phòng

32

Hình 2.3 Thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến sự tăng tích lũy

β- caroten của tảo Dunaliella sp

b Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng

Điều kiện thí nghiệm:

+ Mật độ tế bào vi tảo: 2x105

+ Nhiệt độ: được lựa chọn từ nghiệm thức nhiệt độ

+ Sục khí liên tục

+ Thời gian chiếu sáng: 24/24h

+ Sử dụng môi trường Johnson 8,8 %

+ Thể tích nuôi: 500ml

+Cường độ chiếu sáng: 10 klux, 10,5 klux, 11 klux, 11,5 klux, 12 klux, 12,5 klux, 13 klux, 13,5 klux, 14 klux

Tảo giống

Nhân sinh khối

Lần lặp

1

Lần lặp

2

Lần lặp

3

Đo hàm lượng β-caroten

Lựa chọn được nhiệt độ thích hợp