Nghiên cứu đa dạng di truyền chim yến (Aerodramus spp.) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử Cytochrome b của DNA ty thể

terraereginae được sử dụng làm nhóm ngoại...36 Hình 3.6: Mạng lưới haplotype của các phân loài chim yến...40 Hình 3.7: Biểu đồ phân bố haplotype chim yến Aerodramus fuciphagus trong ng

HUỲNH TRUNG VIÊN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

CHIM YẾN (AERODRAMUS SPP.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN

CHỈ THỊ PHÂN TỬ CYTOCHROME B CỦA DNA TY THỂ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: ThS NGUYỄN THỊ ANH THƢ

Nha Trang, 07/2013



LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang, em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô giáo và cán bộ thuộc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã truyền những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong các năm học vừa qua

Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa và TS Đặng Thúy Bình đã tạo điều kiện cho em tham gia thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Anh Thư đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Đồng thời xin được gửi lời cám ơn đến chị Phan Thị Huyền Trân, sinh viên lớp 50CNSH đã tạo điều kiện cho em được tham gia rèn luyện các kỹ năng thao tác trong phòng thí nghiệm đối với nghiên cứu đa dạng di truyền ở chim yến, nghiên cứu của chị đồng thời cũng là tiền đề, tạo điều kiện cho em hoàn thành được nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn Công ty Yến Sào đã giúp đỡ cơ sở vật chất, tạo điều kiện cho em thu mẫu và kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành đề tài này đúng thời hạn Cuối cùng em xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Mặc dù đã có nhiều cố gắng hoàn thiện đề tài của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp quý báu của quý thầy cô

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHIM YẾN 4

1.1.1 Hệ thống phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm hình thái 6

1.1.3 Vị trí địa lý và phân bố 8

1.1.4 Tập tính và hành vi của chim yến 9

1.1.5 Các đặc điểm có thể định danh bằng hình thái 10

1.1.6 Vấn đề bảo tồn đa dạng chim yến hiện nay 11

1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13

1.2.1 Lông chim 13

1.2.2 Tổng quan về hệ gen ty thể (mtDNA) 14

1.2.3 Đặc điểm của hệ gen ty thể 18

1.2.4 Cytochrome b (Cytb) 19

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CHIM YẾN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 21

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới 21

1.3.2 Các nghiên cứu ở trong nước 24

1.4 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đa dạng di truyền chim yến (Aerodramus spp.)

27

2.2.2 Giải thích quy trình thực hiện 28

2.2.3 Thực hiện phản ứng PCR 29

2.2.4 Điện di trên gel agarose 32

2.2.5 Giải trình tự DNA 32

2.2.6 Xử lý số liệu và xây dựng cây phát sinh loài 34

2.2.7 Xây dựng mạng lưới haplotype 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN CHIM YẾN 38

3.1.1 Kiểm tra DNA tổng số 38

3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR 39

3.1.3 Giải trình tự Cytb mtDNA của chim yến 40

3.1.4 Xử lý kết quả giải trình tự 40

3.1.5 Kết quả xây dựng cây phát sinh loài 40

3.1.6 Đa dạng haplotype và xây dựng mạng lưới haplotype 46

3.1.7 Thảo luận 52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 59

4.1 KẾT LUẬN 59

4.2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC VIẾT TẮT

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

bp: Base pair

Cytb: Cytochrome b

Cytb FW1: Mồi xuôi (forward primer)

Cytb RV2: Mồi ngƣợc (reverse primer)

DNA: Deoxyribonucleic acid

MP: thuật toán Maximum Parsimony

ML: thuật toán Maximum Likehood

mtDNA: Mitochondrial DNA – hệ gen ty thể

mRNA: RNA thông tin (Messenger RNA)

NCBI: National Center for Biotechnology Information NJ: thuật toán Neighbor-Joining

SB: đệm Sodium Borate

PCR: Polymerase Chain Reaction

RNA: Ribonucleic acid

Ta: Annealing temperature (nhiệt độ lai)

Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số đặc điểm của các loài Aerodramus maximus, Aerodramus

brevirostris và Aerodramus fuciphagus ……… …… ……….08

Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu yến cùng khu vực lấy mẫu được sử dụng trong nghiên

cứu……….……… 26

Bảng 3.1: Các giá trị phân tích Cytb mtDNA chim yến Aerodramus

spp… ……… ……….…38

Bảng 3.2: Các thông số và kết quả của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến

hóa (best-fit-model) giữa chim yến Việt Nam với chim yến của thế giới……… ……… ……….29

Bảng 3.3: Giá trị khác biệt trung bình (%) của các mẫu yến tại các khu vực địa lý khác

nhau……… ……… ……….….39

Bảng phụ lục 1: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của

chim yến A fuciphagus thu tại các đảo A2 và A6, Khánh Hòa, Việt Nam

Bảng phụ lục 2: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của

chim yến A fuciphagus thu tại 155 Thống Nhất, Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam

Bảng phụ lục 3: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của

chim yến A fuciphagus thu tại Trảng Bom, Đồng Nai, Việt Nam

Bảng phụ lục 4: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của

chim yến A fuciphagus thu tại Kiên Giang, Việt Nam

Bảng phụ lục 5: Giá trị tương đồng (%) của các haplotype trình tự Cytb mtDNA của

chim yến A fuciphagus thu tại Côn Đảo, Việt Nam

Bảng phụ lục 6: Bảng thể hiện chi tiết thành phần, vị trí địa lý của các mẫu trong

mạng lưới haplotype

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Một số loài đại diện của các họ Apodidae (Aerodramus fuciphagus),

Hemiprocnidae (Hemiprocne coronata), Trochilidae (Archilochus alexandri) 04

Hình 1.2: Chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) 06

Hình 1.3: Phân bố của các loài yến Aerodramus fuciphagus, Aerodramus maximus, Collocalia spp tại các khu vực địa lý khác nhau 07

Hình 1.4: Cấu tạo lông chim 10

Hình 1.5: Hệ gen ty thể ở gia cầm và động vật có vú và Xenopus 13

Hình 1.6: Cấu trúc của protein cytochrome b 14

Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu chim yến trong nghiên cứu 19

Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 24

Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng tách chiết từ mẫu lông và mô cơ chim yến Côn Đảo 31

Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ mẫu lông yến Côn Đảo 32

Hình 3.3: Giao diện sử dụng phần mềm Sequencher trong quá trình xử lý trình tự thô 33

Hình 3.4: Cây phát sính loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus fuciphagus thu tại Việt Nam 34

Hình 3.5: Cây phát sinh loài dựa trên gen Cytb mtDNA của chim yến Aerodramus ficiphagus thu tại Việt Nam A terraereginae được sử dụng làm nhóm ngoại 36

Hình 3.6: Mạng lưới haplotype của các phân loài chim yến 40

Hình 3.7: Biểu đồ phân bố haplotype chim yến Aerodramus fuciphagus trong nghiên cứu theo khu vực địa lý 43

MỞ ĐẦU

Tổ yến (hay yến sào) hiện nay là một trong những loại thực phẩm, dược phẩm

có nguồn gốc từ động vật có giá trị cao nhất thế giới Từ hơn 400 năm trước, người Trung Hoa đã biết sử dụng tổ yến như một loại thực phẩm cao cấp (Hobbs, 2004)

Tổ yến chủ yếu được khai thác từ loài yến cho tổ ăn được (Edible-nest Swiftlet)

hay còn gọi là chim yến tổ trắng (danh pháp khoa học: Aerodramus fuciphagus) và chim yến tổ đen (danh pháp khoa học: Aerodramus maximus) (Gausset, 2004) Tổ yến

được cho là rất giàu chất dinh dưỡng, do đó có thể mang lại lợi ích về sức khỏe cho người sử dụng như hỗ trợ tiêu hóa, làm giảm bệnh hen suyễn, tăng khả năng tập trung, tăng cường miễn dịch (Hobbs, 2004)

Hầu hết tổ yến được xây trong thời kì sinh sản của chim yến Thời gian xây tổ kéo dài khoảng 35 ngày Tổ có dạng hình bát, được gắn trên thành hang đá Cấu trúc của tổ yến gồm nhiều phiến mỏng được hình thành từ các sợi tơ (vốn là nước bọt của chim yến) đan xen vào nhau Tổ yến chứa một lượng lớn canxi, sắt, kali và magie (Marcone, 2005)

Hiện nay Hong Kong và Mỹ là các nước nhập khẩu tổ yến lớn nhất thế giới Tại Hong Kong, một bát súp tổ yến có giá từ 30 – 100USD (Hobbs, 2004; Park, 2005) Giá

tổ yến trắng có thể lên đến 2000USD/kg và tổ yến đỏ (huyết yến) có thể lên đến 10.000USD/kg Tổ yến đỏ mặc dù có thể bị làm giả từ tổ yến trắng, bằng cách sử dụng hóa chất màu, tuy nhiên hiện nay đã có phương pháp để phân biệt được tổ yến đỏ thật

và giả Tổ yến đỏ từ tự nhiên thường được tìm thấy trong các hang động đá vôi tại một

số đảo ở Thái Lan (Marcone, 2005)

Trước đây, tổ yến được thu hoạch từ các hang động, chủ yếu là các hang động

đá vôi lớn Kể từ sau thập niên 90, nhu cầu về tổ yến ngày càng tăng cao Sự xuất hiện của các nhà nuôi chim yến đã góp phần giải quyết nguồn cung cấp tổ yến Các nhà nuôi

chim yến có thể tìm thấy được ở những khu đô thị gần biển vì chim yến có xu hướng sống thành đàn ở những khu vực này Việc nuôi chim yến trong nhà từ đó trở thành một ngành công nghiệp đặc biệt, khởi nguồn từ các khu phố ở Sumatra, Indonesia Từ

đó, tổ yến chủ yếu được xuất khẩu đến thị trường Hong Kong – điểm tập trung giao dịch chủ yếu loại mặt hàng tổ yến, mặc dù đa số nhu cầu tiêu dùng lại có nguồn gốc từ Trung Quốc (Hobbs, 2004) Tuy nhiên, nhu cầu tổ yến từ thiên nhiên vẫn tạo nên một

áp lực nặng lên ngành công nghiệp khai thác tổ yến, dẫn đến sự suy giảm nguồn lợi tổ yến trong những thập kỷ trước tại nhiều quốc gia (Francis, 1987)

Như vậy, việc khai thác tổ yến có nguồn gốc từ thiên nhiên và việc nuôi chim yến tại các khu nhà nuôi đã phát sinh ra một số vấn đề như ảnh hưởng đến nguồn lợi tổ chim yến, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của quần thể chim yến Ngoài ra việc tạo nhà nuôi chim yến còn có khả năng thu hút những loài yến vốn không phải bản

xứ đến sinh sống, ảnh hưởng đến sự phân bố quần thể chim yến tại khu vực có nhà nuôi chim yến Thực tế này đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn một cách hợp lý và kịp thời để nguồn tài nguyên tổ yến tránh bị khai thác quá mức Đồng thời vạch ra phương hướng bảo vệ quần thể loài chim yến tự nhiên trong tương lai

Hiện nay những nghiên cứu về chim yến ở Việt Nam hầu hết chỉ được thực hiện

ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và dữ liệu liên quan đến phân loại, mô tả hình thái và

giá trị kinh tế của loài chim yến tố trắng (Aerodramus fuciphagus) (Nguyen và cs.,

2002), ấp nở chim yến nhân tạo, nuôi chim trong nhà để lấy tổ, di đàn và nhân đàn chim yến (Nguyễn Quang Phách, 1993) Các nghiên cứu liên quan đến phát sinh loài

và đa dạng di truyền quần thể của chim yến ở Việt Nam còn nhiều hạn chế

Việc phân tích mối quan hệ phát sinh loài dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng, màu sắc, hành vi tập tính, khả năng định vị bằng tiếng vang, ) chưa thể cung cấp được kết quả chính xác, đặc biệt đối với các loài có quan hệ gần gũi, hoặc giữa các

phân loài vì chúng có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau Vì vậy việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định chính xác mối quan hệ phát sinh loài là điều rất cần thiết (Lee và cs., 1996)

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền

chim yến (Aerodramus spp.) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử Cytochrome b của

DNA ty thể” Đề tài bao gồm các mục tiêu sau:

- Thu mẫu yến ở khu vực Khánh Hòa (yến đảo và yến nhà), Kiên Giang (yến nhà), Trảng Bom – Đồng Nai (yến nhà), Côn Đảo (yến đảo)

- Tách chiết DNA từ lông và mô cơ của chim yến

- PCR khuếch đại một phần của đoạn gen mtDNA, sử dụng marker Cytb

- Giải trình tự gen Cytb mtDNA

- Xây dựng cây phát sinh loài, mạng lưới haplotype của các quần thể chim yến tại các khu vực địa lý khác nhau, so sánh với các trình tự chim yến của thế giới được tải về từ GenBank

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHIM YẾN

Chim yến (Aerodramus spp.) thuộc bộ Apodiformes, trong đó bao gồm họ yến

Apodidae, họ yến mào Hemiprocnidae và họ chim ruồi Trochilidae (Joe, 1981) Mặc

dù có nhiều nét tương đồng dẫn đến sự gần gũi giữa họ yến Apodidae và họ chim ruồi Trochilidae, tuy nhiên một số nhà khoa học cho rằng nhưng họ chim ruồi Trochilidae

có thể là họ hàng gần gũi hơn với họ chim tước, do đó Trochilidae còn có thể xếp vào

bộ sẻ Passeriformes (Jean, 1968)

Hình 1.1: Một số loài đại diện của các họ Apodidae (Aerodramus fuciphagus), Hemiprocnidae (Hemiprocne coronata),

Trochilidae (Archilochus alexandri) (theo thứ tự từ trái sang phải)

(Nguồn: http://en.wikipedia.org)

Họ Yến (Apodidae) là một họ chim có bề ngoài rất giống với các loài chim nhạn (họ Hirundinidae) nhưng thực ra chúng không có quan hệ họ hàng gần với những loài chim trong họ này Sự giống nhau giữa yến và nhạn là do tiến hóa hội tụ phản ảnh kiểu sinh sống tương tự dựa trên việc bắt các côn trùng làm thức ăn trong khi đang bay (Thomassen và cs., 2005) Họ yến được chia thành 2 phân họ là Apodinae và Cypseloidinae Phân họ Apodinae bao gồm 79 loài khác nhau, được chia thành 3 tông:

Collocaliini (28 loài), Chaeturini (24 loài) và Aponidi (27 loài), trong khi phân họ

Cypseloidinae bao gồm 13 loài khác nhau Như vậy trong họ yến có tất 19 giống, 92 loài (Alaine, 2004)

Việc phân loại yến nói chung là phức tạp, với ranh giới giữa các chi và loài còn

nhiều tranh cãi, đặc biệt là ở tông Collocalini Phân tích hành vi và kiểu phát ra âm

thanh bị thất bại do tiến hóa song song, trong khi các phân tích về các đặc điểm hình thái và các chuỗi DNA khác nhau đã sinh ra các kết quả chưa rõ ràng và thậm chí có phần mâu thuẫn (Thomassen và cs., 2005)

Hiện nay nhiều nhà khoa học đã nhất trí xếp các loài chim yến có thể dò tìm đường trong bóng tối, sống và làm tổ ở nơi có cường độ ánh sáng mờ tối đến tối vào

giống Aerodramus Giống này có nhiều loài, trong đó một số loài có chung đặc điểm là

cho tổ ăn được (Medway, 1977)

1.1.1 Hệ thống phân loại

Hệ thống phân loại của chim yến tổ trắng (chim yến hàng) Aerodramus

fuciphagus (http://www.itis.gov, Taxonomic Serial No.: 554970):

- Giống: Aerodramus (Oberholser, 1906)

- Loài: Aerodramus fuciphagus (Thunberg, 1812)

Do sự phân bố địa lý khác nhau trong quá trình tiến hóa tự nhiên, loài chim yến

tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) đã xuất hiện một số biến dị nhỏ, do đó chúng lại được chia thành một số phân loài: Aerodramus fuciphagus fuciphagus (A f

fuciphagus) phân bố ở Indonesia; Aerodramus fuciphagus amechanus (A f

amechanus) phân bố ở Malaysia; Aerodramus fuciphagus germani (A f germani) phân

bố ở Việt Nam, tên gọi là yến hông xám hay yến hàng Ngoài ra chim yến sống trong

chùa Wat Chong Lom tại tỉnh Samut Sakhon – Thái Lan cũng là phân loài A f

germani (Nguyen và cs., 2002)

Theo các nghiên cứu mới nhất của Price và cs về việc tách chiết DNA từ cơ,

máu và giải trình tự của 38 loài thuộc các phân loài yến trong đó có giống Aerodramus cho thấy sự sai khác di truyền (genetic divergence) của 2 phân loài A f vestitus và A f

germani xấp xỉ 1,8%, còn trong cùng một phân loài thì sai khác ít hơn khoảng 0,5%

Do đó có thể kết luận đây là nhóm chim khó phân loại nhất (Price và cs., 2004)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Chim yến (Aerodramus spp.) là giống chim hầu như không có nhiều nét đặc biệt

so với các giống chim khác Kích thước chim yến đa dạng từ mức trung bình cho đến nhỏ Đặc điểm chung của chúng là kích thước nhỏ, cánh rộng có dạng hình lưỡi hái và phần đuôi chẻ ra rộng Màu sắc của chim yến có thể là nâu đen, đen bóng Phần đầu trơn, hầu như không nhận diên được phần cổ, mắt khá to và đen Miệng chim yến có hình dạng đặc biệt: ngắn, vòm miệng rộng thích hợp cho việc bắt các loại côn trùng có cánh khi chúng đang bay (Nguyen và cs., 2002)

Chân chim yến có cấu tạo ngắn, gồm 3

ngón hướng về phía trước và 1 ngón hướng về

phía sau như các loài chim thông thường khác

Các loài chim yến khác nhau sẽ có đặc điểm

về lớp lông khác nhau, đây cũng chính là đặc

điểm để nhận diện giữa các loài yến khác

Chim yến cũng là loài chim sống trên không nhiều (có thể ở liên tục trên không đến 40 tiếng) Thậm chí là ăn, ngủ và giao phối khi đang bay Con đực và con cái có hình dáng tương tự nhau Khi giao phối, đầu tiên con đực sẽ thực hiện các động tác bay lượn trên không để hấp dẫn con cái, sau đó việc giao phối được thực hiện ngay tại trên không (Nguyen và cs., 2002)

Đối với loài chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus), kích thước của chúng

vào khoảng 12cm (chiều dài thân), đôi cánh khỏe, sải cánh dài 12 – 15cm, phần đuôi nhọn và chẻ ra theo hình chữ V Trọng lượng cơ thể đa dạng, tùy theo cá thể, nơi sống Trung bình từ 9 – 18g Hiện các dữ liệu trên thế giới về trọng lượng của loài

Aerodramus fuciphagus chỉ nằm ở phân loài A f vestitus và A f fuciphagus, đối với

phân loài A f amechanus thì các thông tin về trọng lượng hầu như chưa được nghiên

cứu (Nguyen và cs., 2002)

Hình 1.2: Chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus)

(Nguồn : http://en.wikipedia.org )

Cơ thể chúng có màu nâu sậm với phần lông màu xanh bóng chuyển dần sang màu nâu ở mặt trên và dưới của cơ thể Tiếng hót ríu rít và cao, đặc biệt chúng có khả năng định vị bằng tiếng vang, sử dụng âm thanh có tần số 2 – 8kHz Âm thanh chúng phát ra tai người có thể nghe được (tiếng cạch – cạch) Âm này bị dội lại trong môi trường có nhiều vách đá, nhờ đó chúng có thể định vị và bay được hoàn toàn trong bóng tối (Nguyen và cs., 2002; Price và cs., 2004)

1.1.3 Vị trí địa lý và phân bố

Hầu hết các loài yến trong giống Aerodramus phân bố ở các vùng nhiệt đới thuộc khu vực Ấn Độ Dương – Thái Bình Dương và không di cư Loài Aerodramus

fuciphagus phân bố ở phía đông, từ các quần đảo Andaman và Nicobar ở Ấn Độ

Dương đến Đông Nam Á và các quần đảo Lesser Sunda (Glenister, 1971)

Hình 1.3: Phân bố của các loài yến Aerodramus fuciphagus, Aerodramus maximus, Collocalia spp tại các khu vực địa lý

khác nhau

(Nguồn: http://www.padcogroup.com/eco-park.html)

Theo hình trên có thể thấy loài yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus phân bố tại

các quốc gia: Việt Nam (từ khu vực miền trung đến miền nam), Cambodia, Malaysia,

Singapore và Indonesia Loài chim yến tổ đen Aerodramus maximus phân bố trong

phạm vi hẹp hơn: Malaysia và một phần của lãnh thổ Indonesia Riêng giống

Collocalia lại có phạm vi phân bố rộng hơn cả, bao gồm phần lãnh thổ của Malaysia,

Indonesia, Philippines

Theo một số tài liệu khác, loài yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus được cho là

sinh sống nhiều từ vĩ độ 10o Nam đến 20o Bắc và kinh độ 95o đến 115o Đông, chủ yếu tập trung ở vùng Đông Nam Á, nhiều nhất ở Indonesia (Kalimantan, Sumatera, Java, Bali ) tiếp đến là Thái Lan, Malaysia, Việt Nam… Ở Indonesia chủ yếu là phân loài

Aerodramus fuciphagus, ngoài ra còn có A f micans, A f vestitus Thái Lan có cả

phân loài A f germani và loài Aerodramus maximus, đã được khai thác tổ để bán từ thế kỉ 18 Malaysia có cả 2 phân loài A f amechanus và A f germani (phân bố ở vùng Peninsula), và loài Aerodramus maximus Philippines chỉ thấy phân loài A f germani Singapore: có phân loài A f germani nhưng rất ít Ngoài ra, Campuchia, Myanmar, Lào, Brunei cũng thấy có phân bố loài yến Aerodramus fuciphagus Ở Việt Nam theo tài liệu của CITES cho biết có cả A f fuciphagus và A f germani (Nguyen và cs.,

2002)

1.1.4 Tập tính và hành vi của chim yến

Các nghiên cứu về hoạt động của chim yến Aerodramus fuciphagus cho thấy

chúng hoạt động chủ yếu vào ban ngày Thời gian chúng rời hang và về hang trở lại vào khoảng 12 tiếng (rời hang khoảng 5:28 – 5:36 sáng và về hang lúc 16:55 – 17:15 cùng ngày) Tuy nhiên thời gian này giao động tùy thuộc theo chu kì chiếu sáng và các hoạt động của chim yến tại các thời điểm khác nhau (mùa sinh sản, thời điểm bình thường) Vào mùa sinh sản, chúng rời hang 1 lần/ngày khi ghép đôi và làm tổ, 2

lần/ngày khi vào thời kì đẻ và ấp trứng, 4 – 5 lần/ngày khi vào thời kì nuôi và chăm sóc con (Đinh Thị Phương Anh, 2011)

Các giác quan (mắt, mũi và tai) của chim yến rất tốt, do đó chúng có thể nhận biết được kẻ thù và nguy hiểm ở môi trường xung quanh Hầu hết chim yến sống theo bầy đàn, tuy nhiên cũng có một số cá thể thích sống đơn lẻ, những cá thể này thường khó khăn trong việc đưa về nuôi tại nhà nuôi (Nguyen và cs., 2002; Nguyễn Quang Phách và cs., 1999)

Chim yến sống thành từng cặp, chung thủy với bạn tình và trung thành với nơi sống Đường bay về tổ khá ổn định Vị trí làm tổ của chúng thường cao khoảng 500m

so với mặt biển Tuy nhiên, chim yến khá nhạy cảm với các yếu tố từ môi trường như ánh sáng, độ ẩm và nhiệt độ Nếu các yếu tố này không phù hợp với điều kiện sống, chúng sẽ di chuyển đến địa điểm khác và không quay lại vị trí cũ (Nguyễn Khoa Diệu Thu và cs., 2009)

1.1.5 Các đặc điểm có thể định danh bằng hình thái

Loài chim yến tổ đen (Aerodramus maximus) được cho là loài dễ định danh hơn

cả, vì chúng có những đặc điểm riêng biệt trên bộ lông, đặc biệt là phần lông chân và

phần lông ở trên mí mắt có màu nhạt hơn Đối với loài chim yến tổ trắng (Aerodramus

fuciphagus) thì việc định danh trở nên khó khăn hơn rất nhiều Một số đặc điểm có thể

sử dụng để định danh loài chim yến tổ trắng là: kích thước, phần lông chân, màu sắc của lông tơ, màu của phần lông đuôi gần hậu môn và hình dạng, màu sắc của tổ (Nguyen và cs., 2002)

Bảng 1.1: Một số đặc điểm của các loài Aerodramus maximus, Aerodramus

brevirostris và Aerodramus fuciphagus (Medway, 1966; Nguyen và cs., 2002; Sims, 1961)

Đặc điểm A maximus A brevirostris A fuciphagus

Kích thước Lớn (Chiều dài

cánh: 122 –

Lớn (Chiều dài cánh: 115 –

Trung bình (Chiều dài cánh:

136mm, hầu hết các phân loài đều dài hơn 125mm)

146mm, hầu hết các phân loài đều dài hơn 123mm)

110 – 125mm)

Đuôi

Đuôi chẻ nhưng hơi nông (khoảng 2 – 3mm)

Đuôi chẻ quan sát rõ (khoảng 7 – 10mm)

Đuôi chẻ mức vừa phải (Khoảng 6 – 8mm) Hậu môn

Màu lông đa dạng tùy loài/phân loài, thường là các mức độ khác nhau của màu đen, không có màu trắng

Đa dạng, thường nhạt màu hơn lông đuôi Lông tơ ở lưng

Chủ yếu là màu đen, một ít màu trắng có thể thấy

ở đầu sợi lông

Trắng (không có tạp chất)

Theo bảng trên có thể thấy rất khó để phân biệt được chim yến tổ trắng

Aerodramus fuciphagus với loài Aerodramus brevirostris, thậm chí là không thể phân

biệt khi quan sát chúng trực tiếp trong tổ hoặc ngay trên tay Các loài chim yến tổ đen

thì có phần đuôi chẻ ra không nhiều, trong khi loài Aerodramus brevirostris lại có vết

chẻ khá sâu, kích thước của cả 2 loài này đều lớn hơn chim yến tổ trắng Ngoài ra, dựa vào những đặc điểm trên cũng cho thấy rất khó để phân biệt được các phân loài trong

loài Aerodramus fuciphagus (Nguyen và cs., 2002)

1.1.6 Vấn đề bảo tồn đa dạng chim yến hiện nay

Theo Lim và Cranbrook (2002), hiện đang có hai luồng ý kiến trái ngược nhau trong việc bảo tồn các loài chim yến Luồng ý kiến thứ nhất ủng hộ việc nuôi chim yến,

trong khi luồng ý kiến còn lại thì phản đối rất mạnh mẽ (Lim & Cranbrook, 2002) Luồng ý kiến phản đối việc nuôi chim yến cho rằng, việc ủng hộ nuôi chim yến sẽ làm mất đi ý thức bảo vệ đa dạng tự nhiên của con người đối với quần thể sinh vật tự nhiên tại các khu vực đảo có chim yến sinh sống, trong khi việc bảo vệ này đặc biệt có ý nghĩa đối với các khu vực đảo đá vôi ở Đông Nam Á, nơi được biết đến là đa dạng sinh

học về các loài thực vật, động vật, điển hình như sự có mặt của loài dơi Cheiromeles

torquatus (Clements và cs., 2006) Đối với luồng ý kiến ủng hộ việc nuôi chim yến, lý

do được đưa ra là vì việc nuôi chim yến không hề loại bỏ tác động của con người đến quần thể yến tự nhiên, ngược lại còn thúc đẩy việc can thiệp vào bảo vệ chim yến trong

tự nhiên, vì khi đó quần thể chim yến trong tự nhiên sẽ chính là nguồn giống dự trữ cho việc nuôi chim yến Do đó sẽ luôn có một lượng lớn chim yến được duy trì, việc này còn có ý nghĩa trong việc giảm thiểu nguy cơ giao phối cận huyết trong các quần thể chim yến (Aowphol và cs., 2008)

Tuy nhiên, vấn đề hiện nay là cần phải có những nghiên cứu quan sát cụ thể đến quần thể chim yến đảo để có thể đưa ra những quyết định can thiệp cho phù hợp, nhất

là khi ngày càng có những nghiên cứu cho thấy sự sụt giảm về số lượng cũng như quần

thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus (Chantler & Driessens, 1995; Lau &

Melville, 1994; Lim & Cranbrook, 2002; Sankaran, 2001) Thêm nữa, những yếu tố chưa thể lường trước của nền kinh tế có thể ảnh hưởng rất lớn đến việc nuôi chim yến Nếu vì một lý do nào đó, nghề nuôi chim yến thất bại thì hậu quả sẽ trút lên quần thể chim yến nhà Khi đó, áp lực sẽ được đặt lên quần thể chim yến trong tự nhiên Thực tế

đã cho thấy khi đại dịch cúm gia cầm tái phát và xuất hiện ở chim yến, đã có hơn 10.000 cá thể chim yến nuôi trong nhà tại Ninh Thuận bị tiêu diệt để dập tắt dịch bệnh (Tú, 2013) Việc tiêu diệt hơn 10.000 cá thể chỉ trong một thời gian rất ngắn đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến quần thể chim yến nhà Giả sử dịch bệnh không dừng lại ở đó

mà tiếp tục lan rộng ra các khu vực lân cận, bởi đặc tính bay xa kiếm mồi và nơi làm tổ của chim yến, thì sẽ có nhiều hơn nữa các cá thể nhiễm bệnh và gây đe dọa lớn đến số

lượng quần thể chim yến Do đó nếu chúng ta ủng hộ việc nuôi chim yến, nhưng lại ngăn cản sự trao đổi về mặt di truyền giữa các quần thể yến thì nếu có đại dịch xảy ra, đối với bất cứ quần thể nào cũng có thể gặp nguy hiểm và bị giảm sút mạnh về số lượng Ngược lại, nếu không có sự ngăn cách giữa các quần thể (chủ yếu do con người) thì các quần thể chim yến có thể mở rộng khu vực sinh sống, nếu đại dịch có xuất hiện tại một khu vực và gây nên sự tuyệt chủng tại khu vực đó thì chúng ta vẫn còn những khu vực khác, do chim yến đã mở rộng hơn về phạm vi sinh sống

Đối với quần thể chim yến đảo, việc khai thác cần được quản lý chặt chẽ để tránh tình trạng gây ra hiện tượng nút thắt cổ chai trong di truyền do số lượng cá thể trong quần thể bị sụt giảm nghiêm trọng

1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.2.1 Lông chim

Lông chim được tạo thành từ lớp biểu bì, có cấu tạo rất nhẹ, bền và có lực đàn hồi lớn Lông chim điển hình gồm 2 phần: phần gốc cắm vào da và thân lông Phần gốc cắm vào da có cấu tạo rỗng, không có phiến lông Phần thân lông thì cấu tạo đặc, thuôn nhỏ và có phiến lông ngoài và trong Gốc lông có 2 lỗ nhỏ là lỗ lông trên và lỗ lông dưới Bên trong gốc lông có một sợi hình chuông màu trắng là bấc lông Đây là di tích mạch máu nuôi lông khi lông đang phát triển Các sợi lông mảnh ở 2 bên thân lông được xếp sít vào nhau, tạo thành 2 phiến lông, phân thành các lông thứ cấp Các lông thứ cấp móc vào nhau, tạo thành cấu tạo vững chắc (Aowphol và cs., 2008)

Hình 1.4: Cấu tạo lông chim

(Nguồn: http://www.thuviensinhhoc.com)

Thành phần cấu tạo chủ yếu của lông là keratin Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hóa dần từ gốc đến ngọn Càng xa khỏi gốc thì mức độ keratin hóa càng mạnh, các tế bào bị mất dần DNA và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn Ở gốc lông còn chứa nhiều tế bào sống (Aowphol và cs., 2008).Đây cũng chính là yếu tố quyết định trong quá trình tách chiết DNA từ lông chim Phần gốc lông càng chứa nhiều tế bào sống thì quá trình tách chiết càng dễ hơn

Việc tách chiết DNA từ lông đã tạo điều kiện đơn giản hóa việc tách chiết DNA

từ gia cầm, đặc biệt là khi việc tách chiết DNA từ máu gặp nhiều khó khăn như phụ thuộc vào kích thước và tuổi của đối tượng lấy mẫu (Moiseyeva và cs., 2003)

1.2.2 Tổng quan về hệ gen ty thể (mtDNA)

Theo U.S National Library of Medicine, ty thể là những cấu trúc bên trong tế bào có nhiệm vụ chuyển đổi năng lượng từ thức ăn thành dạng năng lượng mà các tế bào có thể sử dụng được Mặc dù hầu hết DNA của cơ thể đều nằm trong các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, ty thể cũng có một lượng nhỏ DNA của riêng mình Vật liệu

di truyền này được biết đến như DNA ty thể (Mitochondrial DNA – mtDNA) Ở người, mtDNA có khoảng 16.500bp đại diện cho một phần nhỏ của tổng số DNA trong các tế bào (U.S National Library of Medicine, 2012)

MtDNA của động vật có dạng vòng, nhỏ (kích thước 15 – 20kb), bao gồm khoảng 37 gen mã hóa cho 22 tRNA, 2 rRNA và 13 mRNA Các mRNA chủ yếu mã hóa cho các protein tham gia vào việc vận chuyển điện tử và phosphoryl oxi hóa của ty thể Hệ gen ty thể được sắp xếp trật tự một cách hiệu quả: không có các đoạn intron, có các vùng đệm tại khung đọc hoặc trong một số trường hợp có thể là chồng chéo lên nhau Vùng điều khiển chính là vùng không mã hõa, chịu trách nhiệm quy định chuỗi nặng (H), chuỗi nhẹ (L) và sao chép nhân rộng chuỗi H (Kvist, 2000)

MtDNA khi được sử dụng như một chỉ thị phân tử sẽ có rất nhiều thuận lợi như chúng có tốc độ đột biến nhanh hơn hệ gen trong nhân (Brown và cs., 1982); có thể là

do việc sửa chữa không hiệu quả trong quá trình sao chép (Clayton, 1984) Các vùng khác nhau trên hệ gen ty thể phát triển với tốc độ khác nhau (Pesole và cs., 1992), cho phép chọn lọc các vùng phù hợp cho các nghiên cứu (Kvist, 2000)

Trình tự hoàn chỉnh đầu tiên của hệ gen ty thể từ gà được công bố bởi Desjardins và Morais năm 1990 (Desjardins & Morais, 1990) Theo đó, mtDNA của gà

có tính bảo tồn cao hơn so với với các động vật có xương sống khác Các gen mã hóa protein khá tương đồng với các gen đồng tính trạng ở động vật có vú và lưỡng cư, các gen này được dịch từ cùng một mã di truyền Tại vị trí thứ 3 của các codon, sự xuất hiện của guanine là rất hiếm (Quinn, 1997)

Hệ gen ty thể gia cầm mang những đặc trưng của hệ gen ty thể động vật có xương sống, gồm hai vùng là vùng mã hóa và vùng điều khiển (D-loop) Vùng không

mã hóa chiếm 7% của hệ gen ty thể, chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng (OH)

và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (PH và PL), khoảng 90% phần DNA không mã hóa của ty thể nằm trong vùng này Vùng mã hóa chứa 37 gen và

không có khoảng trống giữa các gen, mã hóa cho 13 polypeptide, 2 rRNA và 22 tRNA Trong đó, chuỗi nặng chứa 12 trong 13 gen mã hóa polypeptide (trừ một tiểu phần ND6 của phức hệ I là được phiên mã từ chuỗi nhẹ), 14 trong 22 gen tRNA và cả hai gen rRNA (12S và 16S) 13 chuỗi polypeptide được mã hóa bởi mtDNA là thành phần của phức hệ hô hấp của ty thể, trong đó có 7 tiểu phần (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5, 6) trong số

46 chuỗi polypeptide của phức hệ I (NADH dehydrogenase), 1 tiểu phần (cytochrome

b – Cytb) trong số 11 chuỗi polypeptide của phức hệ III (Phức hệ bc1), 3 tiểu phần (cytochrome oxydase – CO I, II, III) trong số 13 polypeptide của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) và 2 tiểu phần (ATPase 6 và 8) trong số 16 polypeptide của phức hệ V (ATP synthase) (Fernández-Moreno và cs., 2000) Tất cả các protein khác của ty thể bao gồm cả 4 tiểu đơn vị của phức hệ II (succinate dehydrogenase), tiểu đơn

vị DNA polymerase γ của ty thể, các thành phần của RNA polymerase của ty thể, yếu

tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều được mã hóa bởi DNA nhân (Sorenson & Fleischer, 1996)

Gen tRNA được xác định bởi một chuỗi amino acid Bên ngoài vòng tròn đại diện cho chuỗi nặng (H) và bên trong vòng tròn là chuỗi nhẹ (L) Chiều của quá trình phiên mã và chuỗi sao chép được hiển thị với các đầu mũi tên Khi không có đầu mũi tên được đánh dấu, gen được phiên mã từ chuỗi nặng (H) theo chiều kim đồng hồ Các vùng được sử dụng trong nghiên cứu được đánh dấu bằng màu xám đen tối (hình 1.6) (Desjardins & Morais, 1991; Mindell và cs., 1998)

Mặc dù tính năng của mtDNA đối với các loài động vật có xương sống hầu như

là giống nhau, tuy nhiên mtDNA của gia cầm vẫn có một số khác biệt đáng chú ý:

- Hệ gen ty thể của gia cầm có sự khác biệt so với các loài động vật có vú và lưỡng cư Gen ND5 (nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 5) được theo sau bởi cytochrome b, tRNAThr và tRNAPro, ND6 và tRNAGlu

theo chiều 5’→ 3’ của chuỗi nhẹ (Desjardins & Morais, 1990, 1991; Quinn & Wilson, 1993)

- Vùng sao chép của chuỗi nhẹ được tìm thấy giữa tRNACys và tRNAAsn ở một vài loài động vật có xương sống khác lại không xuất hiện ở hệ gen của gia cầm (Desjardins & Morais, 1990)

- Gen COI (cytochrome oxidase I) xuất hiện một khởi đầu khác thường: codon GTG (thay vì ATG), ngoài ra còn có bằng chứng về một tỷ lệ thấp của thymine tại những vị trí im lặng trong vùng mã hóa (Quinn, 1997)

- Nghiên cứu gần đây cũng đã tìm ra được một trật tự sắp xếp gen mới ở mtDNA gia cầm (loài thuộc các bộ Picidae, Cuculidae, Passeriformes và Falconiformes) Trật tự sắp xếp này có thể có nguồn gốc độc lập, vì nó được tìm thấy ở các đơn

vị phân loài khác nhau (Mindell và cs., 1998)

Hình 1.5: Hệ gen ty thể ở gia cầm (a, b), động vật có vú và Xenopus (c) (Kvist, 2000)

1.2.3 Đặc điểm của hệ gen ty thể

MtDNA có tốc độ đột biến nhanh hơn 5 – 10 lần so với hệ gen nhân do cơ chế sửa chữa DNA không hiệu quả, dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các

ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau Do đó, dựa vào tốc độ thay đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa, xác lập đồng hồ phân tử MtDNA có đặc điểm là đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ DNA ty thể thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ Thêm vào đó DNA ty thể tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào Các đặc điểm trên cùng với việc DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do

có cấu trúc dạng vòng (Ingman & Gyllensten, 2003) Do đó, việc sử dụng mtDNA làm dấu hiệu phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi (Gongora và cs., 2008; Moiseyeva và cs., 2003)

Đáng chú ý là trật tự sắp xếp của các gen trong phân tử DNA dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này được thể hiện rõ khi so sánh trình tự hệ gen

ty thể các đơn vị phân loài bậc bộ trở lên Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng được sử dụng như một dấu hiệu phân loại đối với các đơn vị phân loại bậc cao (Mindell và cs., 1998)

1.2.4 Cytochrome b (Cytb)

Cytb là một trong những cytochrome tham gia vào quá trình vận chuyển electron trong chuỗi hô hấp ty thể Cytb chứa 8 xoắn màng kết nối bởi vùng intramembrane hoặc extramembrane (hình 1.6) Cytb chỉ được mã hóa bởi DNA ty thể (Esposti và cs., 1993)

Hình 1.6: Cấu trúc của protein cytochrome b(Kvist, 2000)

Gen cytb được sử dụng rộng rãi nhất trong việc phát sinh loài vì nhiều lý do Mặc dù phát triển chậm ở những vị trí bảo tồn, tuy nhiên ở các vị trí im lặng, tốc độ tiến hóa lại rất nhanh (Irwin và cs., 1991) Việc sử dụng rộng rãi cytb trong các nghiên cứu đã dần hình thành nên một thước đo chung, khi mà các nghiên cứu có thể dễ dàng

so sánh với nhau khi cùng nghiên cứu về cytb Mức độ đa dạng của cytb được cho là

đủ mức ý nghĩa cho các nghiên cứu ở mức độ quần thể trong khi đối với mức độ bảo tồn, cytb cũng đủ mức ý nghĩa để làm rõ các mối quan hệ phát sinh loài Tuy nhiên, cytb nói chung vẫn tiến hóa chậm vì một số vùng trên gen này bảo tồn hơn những vùng khác do giới hạn về mặt chức năng (Meyer, 1994)

Cho đến nay, cytb là gen được sử dụng phổ biến nhất, cung cấp nguồn dữ liệu lớn nhất về các nghiên cứu trên gia cầm Mặc dù sử dụng cytb vẫn còn những hạn chế lớn, tuy nhiên theo Moore và DeFilippis cho rằng cytb vẫn là lựa chọn tốt nhất để giải quyết những câu hỏi liên quan đến lịch sử tiến hóa Sự sai khác di truyền thấp ở các

loài chim xét ở các đơn vị phân loài cao so với các loài động vật có xương sống khác càng tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng cytb làm chỉ thị phân tử (Mindell và cs., 1998)

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CHIM YẾN TRÊN

THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Việc xây dựng cây phát sinh loài có thể dựa trên những phân tích ở mức độ phân tử như trình tự một gen hoặc một họ gen Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể

mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc vùng DNA khác nhau Với những loài

có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (intron hoặc các vùng liên gen – đoạn chèn) thường hay được sử dụng Tuy nhiên, với các loài có quan hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA hay một protein

ty thể hoặc nhân thường được sử dụng Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao) Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs., 2008) Tuy nhiên, sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể sẽ giúp nâng cao độ phân giải và ý nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gia cầm được công bố lần đầu tiên năm 1990, việc nghiên cứu DNA ty thể chim được phát triển tương đối rộng rãi với hàng trăm trình tự được đăng kí trên GenBank Trình tự hệ gen ty thể đã được sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể chim trên thế giới Những dữ liệu này đã góp phần giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ di truyền giữa các loài chim

Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể được tiến hành trên một số loài thuộc Bộ Chim (Apodiformes):

- Irwin và cs (1991) sử dụng kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn DNA ty thể từ 100 loài động vật: động vật có vú, chim, lưỡng cư, cá và một số động vật không xương sống (Irwin và cs., 1991)

- Lee và cs (1996) đã xây dựng một cây phát sinh loài độc lập với những nghiên cứu khác bằng cách sử dụng chuỗi DNA ty thể cytochrome b từ chim yến và các loài cùng họ yến để kiểm tra độ tin cậy của những đặc điểm tập tính, hình thái, khả năng định vị bằng tiếng vang (Lee và cs., 1996)

- Phillip và cs (1994), đã tách chiết và khuếch đại chuỗi DNA từ lông cho trình tự DNA chất lượng cao Nghiên cứu nhằm sử dụng một đoạn trình tự DNA của gen DNA ty thể cytochrome b nơi có nhiều thay đổi và xây dựng cây phát sinh loài (Phillip và cs., 1994)

- Nguyen và cs (2002) công bố tài liệu về các nghiên cứu liên quan đến quần thể chim yến tổ đen và chim yến tổ trắng cùng một số nghiên cứu liên quan đến quần thể chim yến tại Việt Nam Nghiên cứu bao gồm nhiều nội dung như: phân tích các đặc điểm nhận diện các loài chim yến như hình thái, khả năng định vị bằng tiếng vang; Các đặc điểm về tiến hóa và phát triển của chim yến; Ngoài ra tài liệu này còn đề cập đến một số đặc điểm về sinh học của các loài chim yến (Nguyen và cs., 2002)

- Thomassen và cs (2005) xây dựng phát sinh loài chim yến bằng phân tích riêng biệt và kết hợp ba trình tự: ty thể 12S rRNA, beta-fibrinogen intron 7 (Fib 7) và Cytb của 6 loài chim yến lớn, 2 loài chim yến nhỏ và một nhóm của loài chim

ruồi Kết quả là loài Hydrochous gigas xếp gần gũi với nhánh Aerodramus và

các nhóm yến tạo thành nhánh đồng nhất (monophyletic group) (Thomassen và cs., 2005)

- Cũng trong năm 2005, Thomassen và cs đã công bố nghiên cứu về việc sử dụng tiếng vang (echolocate) của chim yến và khả năng phát ra âm thanh của các quần thể khác nhau giữa các loài có thể được dùng trong phát sinh loài Nghiên cứu đã kết hợp âm thanh phát ra của 8 loài chim yến và khả năng phát ra âm thanh của 27 loài yến nhỏ không có âm dội và yến lớn có âm dội Nghiên cứu dựa trên thuật toán Maximum parsimony (MP) và lập bản đồ đặc trưng để điều tra tín hiệu phát sinh loài và các mô hình tiến hóa của sự xướng âm chim yến Tuy nhiên, kết quả cuối cùng cho thấy khả năng phát ra âm thanh không được xem là thông tin phát sinh loài Việc lập bản đồ đặc điểm khả năng phát ra âm thanh dựa trên cây MP cho thấy mô hình phát sinh loài không phù hợp (Thomassen, 2005)

- Aowphol và cs (2008) nghiên cứu khảo sát mô hình về sự khác biệt di truyền trong hai gen mtDNA (Cytb và ND2) và 8 chỉ thị microsatellites (lặp lại trình tự

đơn giản) giữa và trong các quần đàn của loài Aerodramus fuciphagus từ đàn

nhân tạo được hình thành ở Thái Lan Nghiên cứu được thực hiện bằng cách lấy mẫu 10 đàn chim yến làm tổ trắng dọc theo bờ biển của Vịnh Thái Lan và biển Andaman ở Thái Lan trong thời gian từ năm 2003 – 2006 Sự đa dạng di truyền của mtDNA là rất thấp và giá trị PhiST và FST đáng kể đã được tìm thấy giữa các cặp của đàn Phân tích mối quan hệ haplotype không cho thấy cấu trúc di truyền qua phân phối mẫu Mức độ đa dạng di truyền cho các chỉ thị microsatellites là cao, nhưng giá trị FST là không đáng kể Việc thiếu sự khác biệt di truyền giữa các đàn chim yến nhà có thể là kết quả của di chuyển gen cao giữa các bầy đàn

và quy mô quần thể lớn Kết quả nghiên cứu cho rằng loài Aerodramus

fuciphagus sống nhân tạo gần đây đã thành lập đàn ở Thái Lan nên được xem là

thành viên của một quần thể giao phối ngẫu nhiên Mở ra hướng nghiên cứu mới

là xác định xem sự giao phối ngẫu nhiên này là ổn định hay chỉ là kết quả tạm thời của sự phát triển số lượng các đàn (Aowphol và cs., 2008)

1.3.2 Các nghiên cứu ở trong nước

Những nghiên cứu về di truyền quần thể loài chim yến (Aerodramus spp.) vẫn

còn hạn chế, tập trung chủ yếu vẫn là những nghiên cứu về hình thái, đặc điểm sinh học cũng như các vấn đề về khai thác và giá trị dinh dưỡng của tổ yến Một số nghiên cứu điển hình có thể liệt kê như sau:

- Nguyễn Quang Phách (1993) công bố nghiên cứu về cơ sở sinh học của việc

khai thác hợp lý, bảo vệ và phát triển nguồn lợi chim yến hàng (Collocalia

fuciphaga germani Oustalet) (Nguyễn Quang Phách, 1993)

- Nguyễn Khoa Diệu Thu và cs (2009) công bố nghiên cứu nuôi thử nghiệm chim yến trong nhà để lấy tổ tại bán đảo Phương Mai – Bình Định Kết quả thu được

một số đặc trưng sinh học phân loài chim yến Colloccalia fuciphaga germani

Phân tích di truyền quần thể chim Yến làm tổ ở đảo (tỉnh Bình Định) và trong

nhà tại tỉnh Bình Định và Khánh Hòa là các quần thể thuộc loài A fuciphagus

Tác giả kết luận: quần thể chim yến làm tổ trên đất liền ở tỉnh Bình Định và tỉnh Khánh Hòa không bắt nguồn từ quần thể chim yến làm tổ trên đảo thuộc tỉnh Bình Định (Nguyễn Khoa Diệu Thu và cs., 2009)

1.4 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Hiện nay những nghiên cứu về chim yến ở Việt Nam hầu hết chỉ được thực hiện

ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và dữ liệu liên quan đến phân loại, mô tả hình thái và

giá trị kinh tế của loài chim yến tố trắng (Aerodramus fuciphagus) (Nguyen và cs.,

2002); ấp nở chim yến nhân tạo, nuôi chim trong nhà để lấy tổ, di đàn và nhân đàn chim yến (Nguyễn Quang Phách, 1993) Các nghiên cứu liên quan đến phát sinh loài

và đa dạng di truyền quần thể của chim yến ở Việt Nam còn nhiều hạn chế

Việc phân tích các đặc điểm hình thái, từ đó định danh các loài chim yến đã tỏ

ra kém hiệu quả, vì đặc điểm hình thái có thể là tương đồng hoặc khó nhận giữa các

loài yến khác nhau Đặc biệt ở mức độ phân loài, việc định danh bằng hình thái càng trở nên khó khăn hơn Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong việc xác định mối quan hệ phát sinh loài và thậm chí định danh chim yến là điều rất cần thiết, vì chim yến sống ở Việt Nam thuộc phân loài nào còn là một câu hỏi bỏ ngỏ Do đó, nghiên cứu này nhằm xác định mối quan hệ phát sinh loài của các loài chim yến ở các khu vực lấy mẫu ở Việt Nam dựa trên gen Cytb mtDNA, phục vụ cho công tác bảo tồn, quy hoạch khai thác tài nguyên tổ chim yến

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU

Đối tượng nghiên cứu là loài chim yến cho tổ trắng ăn được Aerodramus

fuciphagus Mẫu chim yến được thu tại Nha Trang – Khánh Hòa (các đảo A2, A6 và

nhà nuôi tại 155 Thống Nhất, Nha Trang), Trảng Bom – Đồng Nai, Kiên Giang và Côn Đảo

Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu chim yến trong nghiên cứu

Mẫu chim yến được sử dụng gồm mẫu lông và mẫu cơ thịt từ chim yến non Mẫu sau khi thu trực tiếp từ chim yến được chuyển ngay vào túi nilon có mí ghép, sau

đó bảo quản lạnh ở -40o

C

Trong nghiên cứu này, mẫu yến được thu từ các khu vực như sau:

- Khánh hòa: mẫu lông và cơ chim yến nhà tại địa chỉ 155 Thống Nhất và mẫu chim yến đảo A2, A6, Nha Trang

- Trảng Bom: mẫu lông chim yến nhà

- Kiên Giang: mẫu lông chim yến nhà

- Côn Đảo: mẫu lông chim yến đảo

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đa dạng di truyền chim yến (Aerodramus spp.)

Mẫu chim yến

Tách chiết DNA tổng số

Khuếch đại gen Cytb mtDNA

Điện di gel agarose

Giải trình tự

Xử lý trình tự và xây dựng

cây tiến hóa

Sử dụng bộ kit Magazorb®

DNA Mini-Prep

Kit

Sử dụng mồi FW1 và RV2

400mA 80V

20 phút

2.2.2 Giải thích quy trình thực hiện

a Tách chiết DNA tổng số:

Đối với mẫu mô cơ: DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể chim yến con (thu mẫu trực tiếp từ công nhân của công ty Yến Sào Khánh Hòa, giữ mẫu trong đá băng, sau đó được bảo quản ở -70o

C) bằng dung dịch Chelex 10% Tiếp theo, dùng panh và kéo vô trùng cắt một mẩu nhỏ khoảng 0,2cm2 mẫu mô cơ rồi cho vào 300μl dung dịch Chelex 10% Toàn bộ mẫu phải nằm trong lớp chứa Chelex Sau đó ủ mẫu trên bể ủ nhiệt ở 95oC trong 5 – 6 giờ Lấy ra vortex kĩ hỗn hợp trong 30 giây, rồi ly tâm lạnh 5000 vòng/phút trong 5 phút Sau cùng hút dịch nổi huyền phù sang ống eppendorf mới, DNA thu được sẽ được bảo quản trong tủ đông -40oC

Đối với mẫu lông: DNA tổng số được tách chiết từ phần cuống lông, mô cơ thịt của từng cá thể chim yến bằng bộ kit Magazorb® DNA Mini-Prep Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

- Lấy từ 1 – 2 mẫu lông chim yến (phần gốc) cho vào ống eppendorf 1,5ml đã khử trùng Dùng kéo nhọn cắt thật nhỏ các lông chim và đẩy dồn phần mẫu xuống đáy của ống để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân sau này Sau đó thêm 20μl dung dịch protein K vào Đem vortex trong 15 giây Tiếp đến hút 200μl Lysis Buffer cho vào ống tube Vortex nhẹ đến khi hỗn hợp dung dịch mẫu, protein K và Lysis Buffer đồng nhất (khoảng 15 giây) Ủ ống mẫu trên block nhiệt trong 16 đến 24 giờ ở 56oC

- Thêm 500μl dung dịch Binding Buffer đã được vortex nhẹ cho vào ống mẫu Vortex nhẹ hỗn hợp cho đến khi thu được dịch đồng nhất (khoảng 15 giây) Thêm 20μl dung dịch MagaZorbTM trực tiếp vào dung dịch, vortex nhẹ trong 15 giây Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, vừa ủ vừa lật úp tube đảm bảo dung dịch được trộn đều Làm lắng các hạt MagaZorbTM bằng cách sử dụng một giá

từ (giá có gắn nam châm), khoảng 4 – 5 phút Lúc này các hạt MagaZorbTM đã

liên kết với DNA trong mẫu và cố định chúng lại Sau đó đảo ngược nam châm

- Thêm 100μl dung dịch đệm rửa giải vào tube Ủ tube trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, vừa ủ vừa lật ngược tube vài lần Làm lắng các hạt MagaZorbTM trên giá

từ Cẩn thận hút dịch nổi, tránh hút các hạt sang tube sạch mới Tube mới sẽ chứa DNA đã được tách chiết, thu được khoảng 100μl, sau đó bảo quản ở -20oC cho các phân tích tiếp theo

C – 65oC, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn; cuối cùng là giai đoạn kéo dài ở

68oC – 73oC, enzyme Taq polymerase được sử dụng để kéo dài sản phẩm bằng cách sử dụng các dNTP có trong môi trường về phía đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung Như vậy, số

lƣợng các bản DNA sao chép tăng lên gấp đôi ở mỗi chu kì Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân Theo lý thuyết, kết quả sau n chu kì của phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi

Thiết kế mồi cho phản ứng PCR: Trong nghiên cứu này, cặp mồi đƣợc sử dụng

có kí hiệu là FW1 – RV2 đƣợc thừa kế từ nghiên cứu của Phan Thị Huyền Trân và cs (2012), vốn thiết kế dựa trên tham khảo trong các nghiên cứu của Thomassen và cs (2003), Desjardins và cs (1990, 1991) Trong khi mồi xuôi (FW1) đƣợc giữ nguyên theo trình tự gốc tham khảo thì mồi ngƣợc (RV2) đƣợc thay đổi lại một số vị trí nucleotide cho phù hợp với nghiên cứu (Desjardins & Morais, 1990; Thomassen và cs., 2005)

Cytb mtDNA

Cytb FW1:

5’GGGGGATTCTCA GTAGAC AA3’

Tm: 53,5oC Trọng lƣợng phân tử:

6206,1g/mole nmole/OD260: 4,87 µg/OD260: 30,21

Cytb RV2 (theo tài liệu tham khảo): 5’TCTTTGGTT TAC AAACCA AT3’

Tm: 47,7oC Trọng lƣợng phân tử:

6066,0 g/mole nmole/OD260: 5,27 µg/OD260: 31,96 Cytb RV2 sau khi đã đƣợc thay đổi và đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này: 5’TCT TTG GTT TAC AAG ACC AAT3’

Tm: 53,1oC Trọng lƣợng phân tử:

6395,2 g/mole nmole/OD260: 4,97 µg/OD260: 31,80