Đánh giá tính gây miễn dịch của Vacxin cúm A H5N1 hấp thụ tá chất MF - 59 và Chitosan trên súc vật thí nghiệm

Hiện nay, năng lực sản xuất vacxin phòng cúm trên thế giới chỉ đáp ứng 10% dân số khi đại dịch cúm xảy ra và chưa xác định được loại vacxin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các viru

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CAIV : Cold-adapted Attenuated Influenza Vaccine

(Vacxin virus cúm sống, nhược độc, thích ứng lạnh)

HA : Hemagglutinin

HA test : Hemagglutinin Assay test

(Phản ứng ngưng kết hồng cầu)

HAU : Hemagglutinin Unit

(Đơn vị kháng nguyên Hemagglutinin)

HI test : Hemagglutinin Inhibition test

(Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu)

HIU : Hemagglutinin Inhibition Unit

(Đơn vị hiệu giá kháng thể kháng hemagglutinin)

MDCK : Mardin-Darby Canine Kedney

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Số người nhiễm virus H5N1 và số tử vong từ năm 2003.(Số liệu tính đến 5-3-2008)

Bảng 1.2: Bộ gen của virus cúm A và các polypeptid tương ứng

Bảng 1.3: Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin

Bảng 1.4: Một số vacxin cúm A/H5N1 trên thế giới (cập nhật 17/10/2006)Bảng 3.1: Tỷ lệ chuột đáp ứng miễn dịch sau 10 ngày của các nhóm vacxin cúm A/H5N1

Bảng 3.2: Tỷ lệ chuột đáp ứng miễn dịch sau 20 ngày của các nhóm vacxin cúm A/H5N1

Bảng 3.3: Tỷ lệ chuột đáp ứng miễn dịch sau 30 ngày của các nhóm vacxin cúm A/H5N1

Bảng 3.4: Bảng biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của nhóm 1 – Nhóm vacxin cúm A/H5N1 không hấp phụ tá chất theo thời gian

Bảng 3.5: Biến thiên đáp ứng miễn dịch của nhóm 2 – Nhóm vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất MF-59 theo thời gian

Bảng 3.6: Biến thiên đáp ứng miễn dịch của nhóm 3 – Nhóm vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất chitosan theo thời gian

Bảng 3.7: Biến thiên đáp ứng miễn dịch của 3 nhóm vacxin cúm A/H5N1 theo thời gian

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Cấu tạo của virut cúm A/H5N1

Hình 1.2: Các đường lây nhiễm cúm A/H5N1 trên người

Hình 1.3: Thành phần vacxin bất hoạt

Hình 2.2: Kết quả phản ứng xác định hiệu giá kháng thể

Hình 2.1: Chuột nhắt trắng Swiss làm thí nghiệm

Hình 2.2: Quy trình tiêm miễn dịch và lấy máu

Hình 3.1: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của nhóm 1-Nhóm vacxin không hấp phụ tá chất theo thời gian

Hình 3.2: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch Nhóm 2-Nhóm vacxin hấp phụ tá chất MF-59

Hình 3.3: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của Nhóm 3-nhóm vacxin hấp phụ tá chất chitosan

Hình 3.4: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của 3 nhóm vacxin

theo thời gian

LỜI MỞ ĐẦU

Trong thế kỷ 20, loài người đã trải qua những đại dịch cúm nghiêm trọng

do virut cúm A gây ra: Cúm Tây Ban Nha 1918-1919, cúm châu Á 1957-1958, cúm Hồng Kông 1968-1969 Dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 đã giết chết khoảng 20-50 triệu người trên toàn thế giới Dịch cúm năm 1957 và 1968, chỉ riêng ở Mỹ giết chết 0.5-1 triệu người

Đại dịch cúm xảy ra tác động không nhỏ đến nền kinh tế cũng như các hoạt động xã hội, sức khỏe, tính mạng của người dân Vì virut cúm có tỷ lệ đột biến cao và kháng nguyên bề mặt luôn có xu hướng thay đổi, nên Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo: Thời gian tới có thể virut cúm gia cầm H5N1 biến thành chủng mới có độc lực cao, lây nhiễm từ người sang người và trở thành hiểm họa của nhân loại Việc nghiên cứu phát triển vacxin và thuốc kháng virut là hai biện pháp hữu hiệu nhất để giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong cho tất

cả các quốc gia

Hiện nay, năng lực sản xuất vacxin phòng cúm trên thế giới chỉ đáp ứng 10% dân số khi đại dịch cúm xảy ra và chưa xác định được loại vacxin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các virut cúm A và các biến thể Mục tiêu nghiên cứu hiện nay là sản xuất được vacxin cúm có hiệu giá cao, kinh tế và đảm bảo an toàn khi sử dụng Vì vậy, việc thử nghiệm xác định công thức vacxin khác nhau, các cách hấp phụ tá chất vacxin khác nhau đang được tiến hành tích cực

Cùng với các nước châu Á khác, Việt Nam cũng là một trong những nước

bị đại dịch cúm gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người trong những năm gần đây

Viện Vacxin đã phát triển thành công vacxin cúm A/H5N1 sản xuất trên trứng

gà có phôi, sử dụng tá chất Al(OH)3 1mg/ml, hiệu quả bảo vệ chưa cao ở nồng

độ kháng nguyên 7 mg HA/liều Để tìm một loại tá chất thích hợp hơn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Đánh giá tính gây miễn dịch của vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất

MF-59 và chitosan trên súc vật thí nghiệm”

Nội dung nghiên cứu:

Nghiên cứu, so sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch của các nhóm vacxin cúm A/H5N1 trên chuột nhắt trắng Swiss:

- Vacxin cúm A/H5N1 không hấp phụ tá chất

- Vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất MF-59

- Vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ Chitosan

PHẦN I: TỔNG QUAN

I.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUT CÚM

I.1.1 Đặc điểm chung [17, 23]

Năm 1933, loại virut được xem là tác nhân gây bệnh cúm đã được xác định

và phân lập bởi Sir Christopher Andrewers, Wilson Smith, Sir Patrick Laidlaw Virut cúm thuộc họ Orthomyxoviridea, được chia làm 3 type khác nhau: type A, B và C Chỉ có virut cúm type A mới được chia thành các phân type bởi sự biến đổi thường xuyên của các kháng nguyên Các phân type virut cúm

A khác nhau ở hai vị trí kháng nguyên bề mặt Hemagglutinin (HA) và Neuramicnidase (NA) Hiện nay người ta phát hiện 16 type kháng nguyên HA (H1-H16) và 9 type kháng nguyên NA (N1-N9)

Từ năm 1959, các virut phân nhóm H5, H7, H9 đã vượt qua ranh giới loài

để gây bệnh cho người Virut H5N1 gây thể bệnh nặng với tỷ lệ cao 1997,

2003 và các vụ dịch vẫn đang xảy ra bắt đầu từ giữa năm 2003 đến nay.[2]

Bảng 1.1: Số người nhiễm virus H5N1 và số tử vong từ năm 2003

I.1.2 Cấu trúc và đặc điểm sinh học [11, 17, 22, 23]

Virut cúm có hình cầu hoặc hình trứng, đường kính trung bình 70-120 nm,

có thể có dạng hình sợi với chiều dài lên đến 1000 nm hay dài hơn phụ thuộc vào điều kiện tăng sinh và số lượng virut xâm nhập

Lớp vỏ có lipoprotein có nguồn gốc từ tế bào bội nhiễm Trên vỏ có những điểm chồi lên có bản chất là các glycoprotein: Hemagglutinin (H) và Neuraminidase (N) Mỗi gai dài từ 8-10 nm, cách nhau 8 nm, có khoảng 500 gai H và 100 gai N phủ trên bề mặt virion Những kháng nguyên bề mặt này liên quan đến khả năng gây nhiễm trên vật chủ và tạo ra chủng virut mới Kháng nguyên H liên quan tới quá trình bám dính của virut vào tế bào Kháng nguyên N hỗ trợ cho virut trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ

Ngoài ra trên bề mặt lớp vỏ còn có các kênh ion chức năng vận chuyển H+ Nằm ngay dưới vỏ lipoprotein là các matrix protein sắp xếp thành khuôn và chứa bên trong là các ribonucleoprotein và một lượng nhỏ các protein phi cấu trúc

Virut cúm A/H5N1 là type virut có kháng nguyên bề mặt là Hemagglutinin type 5 và Neuraminidase type 1

Vật liệu di truyền của virut cúm là RNA mạch đơn âm, sợi đối mã tồn tại ở dạng các phân đoạn RNA độc lập, có kích thước khác nhau và mã hóa cho các protein khác nhau Mỗi phân đoạn RNA của virut được bao quanh bởi nhiều đơn phân Nucleoprotein và gắn với một phức RNA- polymerase Bộ gen gồm

8 đoạn RNA mạch đơn, xoắn âm, được phân loại theo chức năng của protein được quy định bởi các đoạn gen

Hình 1.1 Cấu tạo của virut cúm A/H5N1

Bảng 1.2: Bộ gen của virus cúm A và các polypeptid tương ứng [23]

Polypeptide Phân

2 2341 Polymerase Pb2 Là tiểu đơn vị xúc tác của

polymerase (RNA transcriptase)

3 2233 Polymerase Pa Là tiểu đơn vị của

polymerase (RNA transcriptase), tham gia tổng hợp RNA

4 1778 Hemagglutinin HA Gắn kết virut vào thụ thể của

tế bào (làm đông máu)

5 1565 Nucleoprotein NP Bao quanh các gen của virut,

là thành phần của phức phiên mã, vận chuyển RNA giữa nhân và tế bào

8 890 Non structural

protein

NS2 Vận chuyển RNA ra khỏi

nhân

I.1.3 Tính chất kháng nguyên [11]

I.1.3.1 Kháng nguyên virut cúm

Hemagglutinin và Neuraminidase là hai kháng nguyên quan trọng nhất quyết định độc tính của virut cúm

Hemagglutinin (HA)

HA là một glycoprotein, dạng hình nấm, nhô ra từ màng lipid của virut, phía ngoài có tán hình cầu HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu Đây là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định đến độc tính của virut cúm nhờ khả năng nhận biết và gắn vào thụ thể của tế bào chủ

Kháng nguyên này phụ thuộc:

- Dạng phân tử của sialic acid (SA) trên thụ thể của tế bào vật chủ: acetylneuraminic acid và N-glycolyl neuraminic acid

N Kiểu liên kết giữa HA và phân tử đường galactose của sialic acid trên thụ thể tế bào vật chủ: liên kết
-2,6 Gal-SA hay liên kết
-2,3 Gal-SA

HA virut cúm ở chim có ái lực liên kết
-2,3 Gal-SA; có nhiều ở các tế bào biểu mô của ruột

HA virut cúm người có ái lực liên kết
-2,6 Gal-SA; có ở các tế bào biểu

mô khí quản

Neuraminidase

Neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình cây trên bề mặt vỏ của virut cúm NA có 2 phần: phần phía ngoài gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng, phần còn lại là vùng kỵ nước gắn vào màng virut

NA có chức năng phân cắt sialic acid bằng cắt các liên kết glycoside nối nhóm keto với D-glactose hoặc D-glactosamine của acid sialic Phản ứng này cho phép virut vượt qua lớp niêm dịch để tới được các tế bào biểu mô của đường

hô hấp trong quá trình nhiễm trùng Đồng thời việc loại bỏ acid sialic của phân

tử NA giúp các virion mới được tổng hợp phóng thích ra ngoài tế bào và gia tăng khả năng gây nhiễm trùng Trong 9 phân type NA, cho đến nay chỉ có N1,

N2 được xác định liên quan đến các vụ dịch ở người

I.1.3.2 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm

Đáp ứng miễn dịch chống virut cúm chủ yếu là đáp ứng miễn dịch dịch thể, khoảng 1-2 tuần sau lần tiêm thứ nhất, kháng thể HA và NA bắt đầu xuất hiện trong dịch thể, cao nhất vào tuần thứ 3-4 Nếu bị tái nhiễm, đáp ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn Nếu kháng thể kháng HA quyết định kháng nguyên

thể virut cúm có thể tồn tại hàng tháng sau khi được chủng ngừa nhưng hàm lượng kháng thể bắt đầu giảm dần

Sự hiện diện của kháng thể kháng HA ở độ pha loãng 1/40 trở lên tương ứng với khả năng đủ đáp ứng miễn dịch (đối với người lớn tuổi là 1/80).[2]

I.1.4 Khả năng thay đổi cấu trúc kháng nguyên của virus cúm nguy cơ bệnh dịch mới [2]

Virut cúm có khả năng đột biến cao và kháng nguyên bề mặt luôn có xu hướng thay đổi Chỉ cần những đột biến nhỏ cũng dẫn đến sự biến đổi kháng nguyên tạo ra chủng cúm mới Khi đột biến gene xảy ra, kháng nguyên bề mặt được thay thế bằng một kháng nguyên hoàn toàn mới Toàn bộ cộng đồng chưa kịp có đáp ứng miễn dịch đối với phân type virut cúm mới đó

Ví dụ:

Dịch cúm châu Á (1957-1958): ngày 5/1958 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ghi nhận phân type kháng nguyên mới H2N2 thay thế cho phân type H1N1 đã lưu hành trên người gần 4 thập kỷ qua Đến 1968-1969 dịch cúm Hồng Kông xảy ra giữa tháng 7/1968 đã ghi nhận phân type mới H3N2 làm tử vong hàng triệu người.[2]

Heo là vật chủ trung gian có cả hai loại thụ thể
-2,3 SA và
-2,6

Gal-SA Do đó heo có thể trở thành vật thể trung gian gây lây nhiễm virut cúm ở chim và người Điều này dẫn đến sự tái sắp xếp gene xảy ra giữa hai virut khác nhau hình thành loại virut mới mang gene tái sắp xếp, có thể gây bệnh trên người

HA có 16 phân type, trong đó H1, H2, H3 liên quan đến đại dịch cúm ở người, gần đây các type H7, H9 được xác định có khả năng gây bệnh trên người, đặc biệt là H5

Hình 1.2: Các đường lây nhiễm cúm A/H5N1 trên người

Sự biến đổi kháng nguyên virut cúm bao gồm hai dạng [11, 22, 24]

• Sự trôi kháng nguyên (antigenic drift)

Nó xảy ra ở tất cả các type virut cúm Sự trôi kháng nguyên là sự biến đổi

từ từ kháng nguyên HA và NA trong cùng một phân type do sự tích lũy dần các đột biến điểm dẫn đến sự biến đổi trình tự amino acid và làm thay đổi vị trí kháng nguyên của phân tử Kết quả hình thành nhiều kiểu kháng nguyên H

và N khác nhau được ghi nhận bằng các ký hiệu H1, H2, H3 v.v và N1, N2, N3, v.v Vì vậy để ký hiệu mỗi loại virut ta dùng một nhóm gồm hai ký hiệu một từ H và một từ N như: H1N1, H1N2, H2N2, H5N1 Điều đáng lưu ý là kết quả của biến đổi trôi dạt dẫn đến sự ra đời của chủng virut cúm mới mà kháng thể đối với các chủng virut trước nó không nhận ra được

• Sự trượt kháng nguyên (antigenic shift)

Sự trượt kháng nguyên là sự biến đổi hoàn toàn 1 hay cả 2 kháng nguyên

bề mặt xảy ra khi gene mã hóa cho phân type này đuợc thay thế bằng gene mã hóa của phân type khác Khi virut cúm nhiễm từ loài này sang loài khác, hoặc

do trộn lẫn sẽ xảy ra sự tái tổ hợp gene của virut cúm ở các loài khác nhau Ví dụ: virut cúm A ở người và virut cúm A ở gia cầm, khi xảy ra tái tổ hợp sẽ hình thành một phân type virut cúm mới có khả năng lây nhiễm cao và lây trực tiếp từ người sang người Đó là nguy cơ cho một đại dịch toàn cầu sẽ xảy ra

Sự trượt kháng nguyên chỉ xảy ra ở virut cúm A vì nó có khả năng gây bệnh trên nhiều loại vật chủ khác nhau Các đại dịch cúm châu Á 1957 (H2N2), cúm Hồng Kông 1968 (H3N2) là do virut cúm A trải qua sự trượt kháng nguyên gây nên

Chủng virut cúm gia cầm H5N1 có khả năng gây ra dịch cúm ở người thông qua hai cơ chế:

- C ơ chế xâm nhiễm: Virut cúm gia cầm H5N1 và virut cúm ở người cùng xâm

nhập vào tế bào trung gian (heo) Ở đó, chúng tái sắp xếp các gene tạo một dạng virut cúm gia cầm H5 mới có thể lây nhiễm từ người sang người

- C ơ chế đột biến: Virut cúm gia cầm H5N1 có thể đột biến trực tiếp thành

virut cúm có khả năng lây nhiễm từ người sang người Virut H5N1 đang lưu hành hiện thời được xem là chủng "mới" về mặt kháng nguyên, chúng có khả năng phát sinh bệnh với mức độ cao ở người và có thể lây nhiễm một cách có

hệ thống ở động vật Những đặc điểm này có liên quan đến khả năng tăng cường khả năng phát sinh bệnh

I.1.5 Tổng quan vacxin cúm A/H5N1

I.1.5.1 Các dạng vacxin cúm mùa [3, 23]

• Vacxin bất hoạt ( vacxin chết)

Vacxin chết được bất hoạt bằng formalin Các chủng thường được nghiên cứu trên trứng gà có phôi hoặc tế bào thận khỉ

Hầu hết các loại vacxin cúm hiện nay trên thế giới là vacxin bất hoạt 3 thành phần (kí hiệu TIV) gồm hai chủng cúm A là H1N1, H3N2 và một chủng virut cúm B Mỗi liều vacxin chứa 15 µg kháng nguyên mỗi chủng virut thành phần.[25]

TIV gồm các loại: vacxin toàn thân, vacxin tiểu phần và vacxin kháng nguyên tinh chế

- Vacxin toàn phần virut (Whole cell vacxin) là vacxin thế hệ thứ nhất, sản xuất 1958, bất hoạt virut nguyên vẹn, hiệu quả bảo vệ 75-90%

- Vacxin tiểu phần virut là vacxin thế hệ thứ hai (1968), cũng được sản xuất như vacxin toàn thân nhưng các tiểu phần virut như: kháng nguyên bề mặt, nuclecapsid, các protein được tách bằng chất tẩy (trước đây là ether)

- Vacxin thế hệ thứ ba (1976) là vacxin kháng nguyên tinh chế được sản xuất từ HA, NA tinh chế, các thành phần khác của virut bị loại bỏ

Để tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch, hiện nay người ta thêm các tá chất trong công thức sản xuất vacxin cúm: MF-59, hợp chất nhôm Đây là hai loại

tá chất duy nhất được cấp phép sử dụng cho vacxin cúm ở Mỹ và Châu Âu

Vacxin thế hệ Vacxin thế hệ Vacxin thế hệ

Hình 1.3: Thành phần vacxin bất hoạt

• Vacxin sống (vacxin giảm độc lực)

Vacxin sống nhược độc thích ứng lạnh (kí hiệu CAIV) là vacxin dạng phun, miễn dịch bằng đường mũi, được sản xuất từ chủng virut có đặc tính thích ứng lạnh do đột biến Chủng mới sao chép thuận lợi ở 250C nhưng trong

cơ thể người (nhiệt độ 35-370C) virut sẽ bị nhược độc Vacxin CAIV hiệu quả cao, miễn dịch liều đơn 0.5 ml và chỉ sử dụng cho người từ 5-49 tuổi CAIV được sử dụng ở liên bang Xô Viết cũ trong nhiều năm và tại Mỹ năm 2003 cũng được cấp phép sử dụng

Những nghiên cứu hiện nay đang tập trung nghiên cứu và sản xuất vacxin DNA từ các mảnh gene của virut: gen HA, NA, NP, NS…Tuy nhiên vẫn chưa xác định được loại vacxin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các virut cúm

A

Bảng 1.3: Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin

Vacxin giảm

độc lực

Đơn giản, dễ sản xuất Giá thành rẻ, tương đối ổn định

Gây miễn dịch kéo dài Không cần tiêm nhiều lần

Có thể gây ra bệnh nhẹ,

có thể nhiễm virut Cần phải bảo quản lạnh

Cần nuôi tạo lượng virut lớn, có thể cần tá chất bổ trợ

Tính miễn dịch có thể không cao

Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần

Có thể bị nhiễm bệnh Vacxin DNA Gây ĐƯMD định hướng với

từng phần của virut Không trở lại thành virut để lây nhiễm, an toàn

Khả năng nhiễm virut sống rất thấp

Ổn định, dễ bảo quản

Nghiên cứu phức tạp hơn, chi phí cao

Cần chất bổ trợ Tính miễn dịch có thể không cao

Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần

I.1.5.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất vacxin cúm A/H5N1 hiện nay

a Tình hình sản xuất vacxin cúm trên thế giới [2, 13, 14]

Các loại vacxin cúm hiện nay đều phải thay đổi mỗi năm để phù hợp với các biến thể virut mới Do đó, vacxin cũng phải được phân phối đều đặn hàng năm Điều này là cần thiết vì cấu trúc bên ngoài của virut cúm biển đổi thường xuyên và gây ra những đợt bùng phát bệnh cúm mới Chính vì sự biến đổi thường xuyên này, virut cúm có thể trốn tránh kháng thể được tạo ra trong đợt tiêm chủng trước đó Đó cũng là lý do tại sao mỗi năm chúng ta phải đối mặt với nguy cơ mắc bệnh cúm Để phòng ngừa hiện tượng lây nhiễm, chúng ta cần được tiêm chủng đều đặn loại vacxin tương ứng với dòng virut đang hoành hành

Tổ chức Y tế thế giới đang khuyến cáo các nước lựa chọn sản xuất các loại vacxin cúm sau: vacxin bất hoạt trên trứng gà có phôi và nuôi cấy tế bào; vacxin sống trên trứng gà có phôi và nuôi cây tế bào; vacxin sống dạng phun

mù, hít qua mũi

Cũng như vacxin cúm thông thường, công nghệ sản xuất vacxin cúm A/H5N1 dạng tiêm bắp thuộc các loại sau: vacxin toàn thân tế bào virut, vacxin mảnh (tiểu phần) vỏ virut và kháng nguyên tinh chế (HA và NA) Tùy mức đầu tư trang thiết bị, trình độ công nghệ, dự kiến giá thành mà nhà sản xuất lựa chọn công nghệ phù hợp để sản xuất ra 1 trong 3 loại vacxin trên

Đa số các nước: Mỹ, Úc, Hungary, Pháp đang phát triển loại vacxin toàn thân tế bào vì dễ triển khai và bảo đảm có công hiệu cao trên người Một số nước đang nghiên cứu vacxin dạng phun nhằm giảm phản ứng phụ và tiện lợi cho người sử dụng

Theo tính toán của các chuyên gia, nếu cộng năng lực sản xuất của các nhà sản xuất vacxin cúm thông thường hiện nay lại cũng chỉ đáp ứng 350 triệu liều cho nhu cầu 6,5 tỷ người Rất nhiều nỗ lực đang được tiến hành ở Hoa kỳ và khắp thế giới để ứng phó với tình huống đại dịch cúm gia cầm sẽ xảy ra Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát bệnh dịch là nghiên cứu và sản xuất ra một loại vắc xin có hiệu lực cao

Bảng 1.4 Một số vacxin cúm A/H5N1 trên thế giới [20]

cấy

Tá chất

Liều (µl HA)

1 Baxter (Cộng

hòa Tiệp Khắc

H5N1 (A/VietNam/

1203/2004)

Bất hoạt Toàn thân Virut

Tế bào Vero

Trứng Al 1.7/5/15

3 CLS Limited

(Australia)

H5N1 (NIBRG-14)

Bất hoạt tiểu phần virut

Trứng Al3+ 30/45

4 Denka Seiken

(Nhật)

H5N1 (NIBRG-14)

Bất hoạt toàn thân virut

Bất hoạt toàn thân virut

Trứng Al 1.7/5/15

8.Kitasato

Institute (Nhật)

H5N1 (NIBRG-14)

Bất hoạt toàn thân virut

Trứng Al 1.7/5/15

9.MedImmune

(Mỹ)

H5N1 (A/VietNam/

1203/2004)

Sống nhược độc

Bất hoạt toàn thân virut

Tế bào

1203/2004)

Kháng nguyên tinh chế

NIBRG14)

1194/2004-Bất hoạt tiểu phần virut

Trứng Al 7.5/15/30

Các công nghệ sản xuất vacxin cúm A/H5N1 dự tuyển hiện nay [13]

• Công nghệ di truyền “ngược dòng” [14]

Công nghệ gen hiện đại đã tạo ra chủng sản xuất vacxin cúm A/H5N1 NIBRG-14 thích ứng lạnh trên tế bào phôi trứng gà NIBRG-14 là chủng virut tái tổ hợp, được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược bằng hai chủng virut: + Hai gen quyết định kháng nguyên: NA và HA được lấy từ chủng virut cúm A/Việt Nam/1194/2004 (H5N1) Vùng quyết định độc tính thuộc gen H5 gồm 12 bazơ mã hóa cho 4 acid amin mang tính kiềm đã bị cắt bỏ để làm mất tính độc

+ Sáu gen còn lại lấy từ chủng A/PR/8/34 (H1N1) nên vacxin có thể có tác dụng miễn dịch chéo với cúm thông thường

• Công nghệ nuôi cấy tế bào

Virut cúm là loại virut tăng sinh theo kiểu nảy chồi (giống virut dại), nên việc nuôi cấy virut này rất khó thu được số lượng lớn kháng nguyên Đây chính là nguyên nhân tạo giá thành cao của loại vacxin này Phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi vẫn tỏ ra hiệu quả đối với chủng NIBRG-14 khi so với các phương pháp nuôi cấy trên dòng tế bào khác (VERO, MDPK, PER.C6

và cả chính tế bào màng niệu đệm phôi gà)

• Công nghệ tách lọc

Việc thu virut từ môi trường nuôi cấy bao gồm cả công đoạn phá vỡ tế bào

là những thách thức không nhỏ cho các nhà nghiên cứu hiện nay Nhiều thiết

bị mới đã được sử dụng cho mục đích này như ly tâm lạnh siêu tốc, lọc chéo hay ly tâm liên tục Tuy nhiên, các thiết bị này rất đắt và việc làm chủ từng loại đòi hỏi trình độ cao về kiến thức và tay nghề của các chuyên viên trong lĩnh vực sản xuất vacxin

• Công nghệ tinh chế

Có nhiều phương pháp tinh chế trong sản xuất vacxin virut nói chung như phương pháp hóa học, vật lý, enzyme Với vacxin cúm A /H5N1 bất hoạt toàn thân tế bào có thể sử dụng các thiết bị ly tâm (siêu tốc, phân vùng và liên tục)

Để làm vacxin chỉ có thành phần HA-NA tăng độ an toàn thì phải sử dụng các phương pháp sắc ký (ái lực, cột hoặc lỏng cao áp)

• Công nghệ hấp phụ

Tá chất hấp phụ phổ biến hiện nay là Al(OH)3 và AlPO4 với hàm lượng giảm xuống thấp nhất tới 0,31mg/ml tương thích hàm lượng 62 µg/liều Bằng công thức hấp phụ ấy vacxin sẽ có giá thành thấp mà ít phản ứng phụ, đặc biệt công hiệu bảo vệ trên người khá cao (78%) Ngoài ra, nhiều nơi đang nghiên

cứu sử dụng các tá chất như MF59 – hỗn dịch dầu + nước hay chitosan loại tan

có độ deacetyl trên 94%

b Tình hình sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người tại Việt Nam

Công nghệ sản xuất vacxin cúm thông thường đã có từ 60 năm nay ở các nước phát triển thuộc châu Âu và Bắc Mỹ, giá luôn ở mức cao nên ít phổ cập tại các nước đang phát triển Trước hiểm hoạ mới, WHO kêu gọi các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam sớm phát triển công nghệ sản xuất để chủ động đối phó với đại dịch Tại Việt Nam chưa có công nghệ sản xuất vacxin cúm cho người Các nhà sản xuất trong nước hiện đang ở giai đoạn nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người ở quy mô phòng thí nghiệm với các phương pháp khác nhau.[4]

- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, từ giữa năm 2004 phát triển kỹ thuật sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người trên tế bào thận khỉ tiên phát, hiện nay viện đã sử dụng chủng NIBRG-14 Vacxin do viện sản xuất đã được nghiệm thu dưới dạng đề tài cấp nhà nước vào đầu 2007, đang thử nghiệm lâm sàng.[1]

- Viện Pasteur TPHCM nghiên cứu phát triển các dạng vacxin nuôi cấy trên

tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14.[1]

- Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế-Nha Trang nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người trên trứng gà có phôi từ chủng NIBRG-14.[5]

I.2 TỔNG QUAN VỀ TÁ CHẤT

I.2.1 Vai trò tá chất miễn dịch [3, 10, 12, 24]

Tá chất đã được sử dụng trong nhiều thập niên để cải thiện đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên vacxin Tá chất vacxin làm tăng độ mạnh, tăng tốc độ, kéo dài đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Thuận lợi của tá chất bao gồm: nâng cao đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên yếu, làm giảm lượng kháng nguyên cần thiết cho đáp ứng miễn dịch thành công, giảm số lần tiêm nhắc lại, cải thiện đáp ứng miễn dịch ở người già, trẻ em và những người suy giảm hệ miễn dịch.[12]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: chất lượng, cường độ đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên vacxin có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Chúng bao gồm: loại và liều lượng tiêm vacxin, thời gian đáp ứng miễn dịch và thời gian tiêm nhắc lại, con đường gây đáp ứng miễn dịch, và độ tuổi, sức khỏe của

người tiêm vacxin.[10]

nhau có thể có tác động sâu sắc không chỉ đến độ lớn đáp ứng miễn dịch mà còn liên quan đến chất lượng của đáp ứng miễn dịch Việc nghiên cứu tá chất vacxin đang phát triển nhanh chóng chống lại các bệnh truyền nhiễm, dị ứng, ung thư nhờ công nghệ trong các lĩnh vực: Hóa sinh phân tích, công nghệ tái

tổ hợp, tinh sạch protein và kết hợp với sự hiểu biết rõ hơn về những cơ chế đáp ứng miễn dịch, miễn dịch học bệnh lý.[12]

Để đánh giá chất lượng vacxin/tá chất người ta đánh giá tính tương thích của tá chất với các thành phần có mặt trong vacxin, không có sự giải hấp phụ trong suốt thời gian bảo quản, những phản ứng phụ do tá chất gây ra Trước đây, những tá chất đã được nghiên cứu nhưng không được chấp nhận để tiêm chủng do sự liên quan đến tính an toàn, tính độc, những tác dụng phụ của tá chất Do đó những lợi ích của một tá chất vacxin phải được cân đối để chống lại nguy cơ của bất kỳ phản ứng đối lập nào cố hữu với nó Tuy nhiên đối với nhóm bệnh nhân ung thư, bệnh nguy hiểm, một số vacxin có thể sử dụng tá chất với một lượng độc có thể chấp nhận được Sự đánh giá an toàn cuối cùng của tá chất phải được nghiên cứu trên những cuộc thử nghiệm lâm sàng.[12] Một số tá chất đã được cấp phép sử dụng cho vacxin tiêm cho súc vật: tá chất Freund là một trong tá chất có đáp ứng miễn dịch mạnh nhất nhưng không phù hợp sử dụng cho con người Mới đây tá chất MF-59 đã được cấp giấy phép sử dụng tại các nước Châu Âu Trong những cuộc thử nghiệm lâm sàng trên quy mô lớn, nhiều tá chất mới đã được phát triển: Lipid monophosphoryl A, DETOXTM (vách tế bào Mycobacteria), nội độc tố được tinh sạch từ dòng Salmonella…

I.2.2 Cơ chế hoạt động của tá chất [3]

Cơ chế hoạt động của tá chất cho đến nay vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng Những hiểu biết về sinh học phân tử và tế bào của các cơ chế làm tăng miễn dịch của tá chất đang được nghiên cứu rộng rãi để thiết kế các loại vacxin thế

hệ mới, khắc phục các nhược điểm của vacxin cũ

Kháng nguyên là nhân tố thụ động, trong khi đó tá chất được xem là nhân tố chủ động điều hòa hoạt động trung gian giữa hệ thống miễn dịch của vật chủ

và vacxin

Tá chất hoạt động theo cơ chế sau:

- Giới thiệu kháng nguyên vào vị trí thích hợp trong cơ thể

- Giữ và giải phóng kháng nguyên một cách từ từ khỏi vị trí tiêm ban đầu

- Tuyển mộ và hoạt hóa các tế bào trình diện kháng nguyên và các tế bào lympho

- Hoạt hóa bổ thể và làm tăng sự tổng hợp, tiết và gắn các chất điều hòa miễn dịch do tế bào tiết ra (cytokines)

- Biểu lộ và phóng thích các quyết định kháng nguyên đã được trình diện trên tế bào APCs cho tế bào T gây độc, tế bào TCD4 nhưng bị hạn chế bởi phức hợp hòa hợp tổ chức lớp I (MHC I) và phức hợp hòa hợp tổ chức lớp II (MHC II)

- Chọn lọc và điều hòa miễn dịch dịch thể hay miễn dịch qua trung gian tế bào, thể hiện qua quá trình xử lý kháng nguyên, trình diện kháng nguyên, kích thích tiết ra các cytokines

- Điều hòa sản xuất kháng thể, chất lượng kháng thể, loại kháng thể, tính đặc hiệu, ái lực của kháng thể

- Gây độc lâm sàng các mô và cơ quan

- Làm gia tăng mẫn cảm cao độ, đưa đến việc viêm khớp tự miễn

- Phản ứng chéo với kháng nguyên của người như là màng bể cầu thận hay

bao thần kinh, gây ra viêm thận hay viêm màng não

- Tăng nhạy cảm với tuberculin hoặc các kháng nguyên thử nghiệm trong

da khác

- Ngăn chặn miễn dịch

- Gây ung thư

- Gây quái thai

- Gây đẻ non

- Reo rắc các vector sống trong vật chủ gây bệnh, phát tán các vector vào

môi trường và những người khác

I.2.4 Hệ tá chất dùng trong thí nghiệm

I.2.4.1 Tá chất chitosan [6, 8, 16]

Chitosan là một polysaccharide gồm các chuỗi glucosamine và N- acetyl glucosamine đồng trùng hợp, liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucoside Chitosan thu được bằng cách khử một phần acetyl của chitin có nguồn gốc từ

vỏ động vật giáp xác, vi nấm, vi sinh vật…Khi hòa tan nhóm amine nhận proton và chuyển mang điện tích dương

Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột màu trắng ngà, không mùi, không vị Tính chất của chitosan thay đổi phụ thuộc vào độ deacetyl hóa, pH, nồng độ ion, trọng lượng phân tử Chitosan có khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel và độ nhớt cao của dung dịch được xem như là một con đường để kiểm soát sự giải phóng kháng nguyên Nhờ những đặc tính đó, gần đây người ta đã chứng minh rằng: chitosan có khả năng hoạt động làm cải thiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể nhờ khả năng thúc đẩy sự hấp thu đối với các loại vacxin đưa vào cơ thể qua niêm mạc mũi, và mở rộng sự liên kết của các tế bào nội mô cho quá trình vận chuyển vacxin Illum và cộng sự là những người đầu tiên chứng minh chitosan có khả năng thúc đẩy sự hấp thu qua màng những phân

tử nhỏ, peptid, protein, vacxin toàn thân virut bất hoạt, kháng nguyên lipid,

kháng nguyên glycoprotein (Illium et al, 2001 Adv Drug Dell V ^ev

51(1-3):81-96)

Bản thân chitosan một mình không tạo được đáp ứng miễn dịch dịch thể qua đường mũi hoặc đường tiêm Gill và cộng sự cho thấy rằng: vacxin ho gà chứa các thành phần kháng nguyên FHA và độc tố ho gà (PT) hoặc chỉ chứa FHA được gắn vào chitosan và đưa vào cơ thể qua đường mũi sẽ tạo được mức IgG đáp ứng ngang bằng khi đưa kháng nguyên vào qua đường phúc mạc IgA rất cao trong nước rửa mũi nhưng qua đường tiêm mức IgA không xác định được Đối với vacxin cúm gắn chitosan được dùng qua đường mũi cũng thu được kết quả tương tự khi so sánh với vacxin dùng qua đường tiêm dưới da Trong một nghiên cứu khác, vacxin cúm hấp phụ chitosan tạo ra lượng kháng thể đáng kể trong chuột, có ở cả huyết thanh và lượng IgG sinh

ra Do đó chitosan có tiềm năng ứng dụng mở rộng cho vacxin DNA dùng qua đường niêm mạc.(Ill et al, 2001)

Chitosan và các dẫn xuất được sử dụng làm tá chất độ deacetyl hóa phải đạt 75% trở lên Chitosan sử dụng làm tá chất dưới các dạng vật lý: dung dịch, dạng bột, dạng đặc biệt hay các hạt nhỏ được tạo ra nhờ các liên kết chéo hoặc

sử dụng các phức hợp đại phân tử mang điện tích trái dấu

Chế phẩm vacxin hấp phụ tá chất chitosan có thể đưa vào cơ thể bằng nhiều đường khác nhau cả đường miễn dịch cổ điển (tiêm dưới da, tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch) và niêm mạc Hiện nay chitosan sử dụng làm tá chất cho vacxin sử dụng bằng xịt qua đường mũi đang nghiên cứu và ứng dụng phổ biến

I.2.4.2 Hệ tá chất MF-59

MF-59 là hệ nhũ tương dầu trong nước, bao gồm: dầu squalene, chất hoạt

động bề mặt (Tween 80), Span 85 Hệ tá chất MF-59 được phát triển và sản xuất bởi Chiron, được sử dụng cho vacxin cúm ở Châu Âu trong dịch cúm 2004-2005, hơn một triệu liều đã được phân phối và vacxin được chứng minh

là an toàn, có hiệu quả đáp ứng miễn dịch với vacxin cúm Nhà sản xuất Vacxin, Chiron đã và đang sử dụng MF-59 trong vacxin cúm, gọi là FluadTM Công ty Novatis (Chiron) đã được cấp bằng chứng nhận (ED 0399843) với tá chất MF-59 và hơn 120 triệu liều vacxin đã được sử dụng cho dịch cúm mùa 2006-2007 ở châu Âu.[10, 24]

Những nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh: MF-59 cải thiện bảo vệ chống lại virut cúm và làm giảm đáng kể sự lây nhiễm virut trong phổi của chuột MF-59 có tác động khả năng ĐƯMD vacxin cúm ở người già, những người

ốm kinh niên và có thể tác động diện rộng đối với những dòng virut không có trong vacxin Nó đã được chứng minh có khả năng sinh kháng thể và đáp ứng miễn dịch tế bào T mạnh hơn so với tá chất nhôm

Hình 1.4 Sự kết hợp MF-59 với kháng nguyên

Theo Stephenson và cộng sự (2003), Nicholson và cộng sự (2004) MF-59 cho phép duy trì kháng thể và kháng nguyên tăng cường đáp ứng miễn dịch mạnh hơn so với vacxin không có tá chất MF-59 cũng tăng cường kháng