Đánh giá khả năng áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ************** NGUYỄN THỊ THÚY MỸ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG PHẢN ỨNG FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA BHT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

**************

NGUYỄN THỊ THÚY MỸ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG PHẢN ỨNG

FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH

CHỐNG OXY HÓA CỦA BHT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

**************

NGUYỄN THỊ THÚY MỸ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG PHẢN ỨNG

FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH

CHỐNG OXY HÓA CỦA BHT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GVHD: TS HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 3 tháng nghiên cứu làm đề tài “Đánh giá khả năng áp dụng

phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT” đến nay

đã được hoàn thành Để hoàn thành đợt thực tập này ngoài nổ lực của bản thân em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía quý thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt kiến thức quý báu và tận tình giải đáp thắc mắc của em trong quá trình học tập và làm đề tài

Đặc biệt em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tạo điều kiện cho

em hoàn thành đề tài này

Xin cảm ơn các cán bộ các phòng thí nghiệm: Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Chế biến, phòng Hóa sinh-Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị khóa trước đã động viên góp ý giúp em hoàn thành đề tài này

Nha Trang, ngày tháng năm 2013

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thúy Mỹ

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ix

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Phụ gia chống oxy hóa BHT (Butylat hydroxyltoluen) 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và tên gọi 3

1.1.2 Tính chất – đặc điểm 4

1.1.3 Cơ chế chống oxy hóa 4

1.1.4 Chức năng và lợi ích 5

1.1.5 Ứng dụng 5

1.1.6 Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của chất chống oxy hóa BHT 6

1.1.7 Ưu điểm của BHT 6

1.2 Tổng quan về phụ gia chống oxy hóa 7

1.2.1 Vai trò của chất chống oxy hóa 7

1.2.2 Cơ chế chống oxy hóa 8

1.2.3 Phân loại chất chống oxy hóa 9

1.3 Tổng quan về gốc tự do và quá trình oxy hóa 14

1.3.1 Tổng quan về gốc tự do 14

1.3.1.1 Nguồn gốc hình thành các gốc tự do 15

1.3.1.2 Một số gốc tự do thường gặp 16

1.3.1.3 Tác hại của gốc tự do đến thực phẩm và sức khỏe con người 16

1.3.2 Quá trình oxy hóa lipid 19

1.4 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 21

1.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử

gốc tự do DPPH 21

1.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử 22

1.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 23

1.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide 24

1.4.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 25

1.4.6 Phương pháp ORAC 25

1.4.7 Phương pháp TRAP 26

1.4.8 Phương pháp FRAP 27

1.4.9 Phương pháp FTC 27

1.4.10 Phương pháp TEAC 28

1.4.11 Phương pháp tổng năng lực khử 28

1.4.12 Phương pháp TAC (Determination of Total Antioxidant Capacity) 28 1.4.13 Phương pháp DMPD (N, N-dimethyl-p-phenylene diamindihydrochloride) 29

1.4.14 Phương pháp Phospho molybdenum 29

1.4.15 Khảo nghiệm Conjugated diene 29

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT 31

2.2.2 Đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/ FeCl2/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT 33

2.2.3 Các phương pháp phân tích 35

2.2.3.1 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH 35

2.2.3.2 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử 36

2.2.3.3 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide 36

2.2.3.4 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT bằng mô

2.2.3.5 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT bằng mô

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng

3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng

3.3 Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH 42 3.4 Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào tổng năng lực khử 44 3.5 Hoạt tính chống oxy hóa của BHT được phân tích dựa vào khả năng khử

3.6 Tương quan giữa khả năng khử DPPH và hoạt tính chống oxy hóa của

3.7 Tương quan giữa tổng năng lực khử và hoạt tính chống oxy hóa của BHT

3.8 Tương quan giữa khả năng khử hydroperoxide và hoạt tính chống oxy hóa

3.9 Tương quan giữa khả năng khử DPPH và hoạt tính chống oxy hóa của

3.10 Tương quan giữa tổng năng lực khử và hoạt tính chống oxy hóa của BHT

3.11 Tương quan giữa khả năng khử hydroperoxide và hoạt tính chống oxy hóa

của BHT phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 51

3.12 Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích theo mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 và trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54

1 Kết luận 54

2 Đề xuất ý kiến 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2 Cơ chế chống oxy hóa của chất chống oxy hóa 8

Hình 1.3 Phân loại chất chống oxy hóa 9

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của vitamin C 10

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của vitamin E 10

Hình 1.6 Cấu tạo BHA 13

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của TBHQ 14

Hình 1.8 Nguồn gốc hình thành các gốc tự do 15

Hình 1.9 Tác hại của quá trình tự oxy hóa chất béo đến thực phẩm 17

Hình 1.10 Quá trình gây hại của gốc tự do 19

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH 22

Hình 1.12 Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 26

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 32

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT 34

Hình 2.3 Đường chuẩn DPPH 35

Hình 3.1 Hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 40

Hình 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa lipid của BHT phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 41

Hình 3.3 Khả năng khử gốc tự do DPPH của BHT 43

Hình 3.4 Tổng năng lực khử của BHT 44

Hình 3.5 Khả năng khử H2O2 của BHT 45

Hình 3.6 Tương quan giữa khả năng khử DPPH và hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 46

Hình 3.7 Tương quan giữa tổng năng lực khử và hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 47

Hình 3.8 Tương quan giữa khả năng khử hydroperoxide và hoạt tính chống oxy hóa

Hình 3.9 Tương quan giữa khả năng khử DPPH và hoạt tính chống oxy hóa của

Hình 3.10 Tương quan giữa tổng năng lực khử và hoạt tính chống oxy hóa của

Hình 3.11 Tương quan giữa khả năng khử hydroperoxide và hoạt tính chống oxy hóa của

Hình 3.12 Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa của BHT phân tích theo mô hình phản

Bảng 5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid của BHT bằng mô hình Fenton

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

TBHQ : Tertbutyl hydroquinone

DPPH : 1,1-diphenyl1-2pycrylhydrazy

TBARS : Thiobarbituric acid

UV-VIS: Ultraviolet visible

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

MDA : Malonyl dialdehyde

LỜI NÓI ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong vấn đề sức khỏe hiện nay, người ta nói đến nhiều tác hại của hiện tượng oxy hoá và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khỏe Các nhà khoa học đã chứng minh rất nhiều về tác hại của gốc tự do Nó chính là tác nhân gây ra nhiều bệnh như bệnh về đường tim mạch, các bệnh về gan, đục thủy tinh thể, lão hóa, ung thư,… Về mặt hóa học, gốc tự do rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học với các hợp chất như protein, lipid, carbohydrate, AND,… trong cơ thể Gốc

tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid, những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxygen Điều này dẫn đến

sự rối loạn và mất cân bằng của các quá trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây nên các bệnh

Cuộc sống ngày càng đi lên, nhu cầu về sử dụng thực phẩm ngày càng cao cùng với yêu cầu về chất lượng sản phẩm cũng ngày càng cao Thực trạng hiện nay, vấn đề oxy hóa lipid là vấn đề rất quan trọng trong việc bảo quản thực phẩm, nó gây ra rất nhiều tác hại như làm giảm màu, mùi, cấu trúc, giá trị dinh dưỡng và sinh độc tố Điều này rất hay xảy ra đối với các sản phẩm có nhiều chất béo Để giải quyết vấn đề này cũng như đáp ứng được yêu cầu của khách hàng thì trong công nghệ chế biến và bảo quản cần hạn chế những quá trình oxy hóa gây ra ảnh hưởng đến thực phẩm Hiện nay có rất nhiều chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ tự nhiên và tổng hợp Mỗi phụ gia có khả năng chống oxy hóa khác nhau, có ưu và nhược khác nhau nên việc đánh giá khả năng chống oxy hóa và sử dụng chúng hợp lý là vấn đề quan trọng Hiện nay có rất nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa đang được sử

dụng phổ biến như phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử, khả năng khử hydroperoxide… Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phản ánh hoạt tính chống oxy hóa gián tiếp Một số nghiên cứu cũng đã áp dụng

mô hình Fenton để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một số chất, tuy nhiên phương pháp này vẫn chưa được áp dụng rộng rãi do chưa đủ thông tin

để đánh giá độ tin cậy của phương pháp Do vậy, nghiên cứu này đã thực hiện đánh giá khả năng áp dụng mô hình Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của BHT nhằm góp phần đánh giá độ tin cậy của phương pháp để từng bước chuẩn hóa và đưa vào áp dụng rộng rãi Và việc nghiên cứu này được thực hiện đối với chất chống oxy hóa BHT vì nó cớ ưu điểm nổi bật như sau: khả năng khử gốc tự do mạnh, độ tinh khiết cao, hoạt tính cao, bền, giá thấp nhưng hiệu quả cao

2 Nội dung thực hiện đề tài

Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 và trong hệ lipid/FeCl2/ H2O2

- Phân tích mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa đánh giá theo

mô hình Fenton với khả năng khử DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử

H2O2 của BHT

Trong quá trình nghiên cứu nhờ sự hướng dẫn tận tình của thầy Huỳnh Nguyễn Duy Bảo đến nay em đã cơ bản hoàn thành đề tài của mình Tuy nhiên, với kiến thức còn hạn chế và kinh nghiệm còn ít nên nội dung đề tài không thể tránh khỏi thiếu sót Em rất mong được sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để bài luận được hoàn chỉnh hơn

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Phụ gia chống oxy hóa BHT (Butylat hydroxyltoluen)

1.1.1 Công thức cấu tạo và tên gọi

- Công thức: C6H2(OH)(CH3)[C(CH3)3]2

Hình 1.1 Cấu tạo của BHT

- Tên hóa học: BHT còn được gọi là 2,6-bis (1,1- methylphenol; 2,6-di-tert-butyl-p-cresol; 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol BHT được tạo thành phản ứng của para-cresol (4-methylphenol) với isobutylene (2-methylpropene) xúc tác bởi acid sulfuric, có công thức phân tử

dimethylethyl)-4-là C15H24O

CH3)3C)2CH3C6H2OHCH3(C6H4)OH((CH3)3C)2CH3C6H2OHCH3(C6H4)OH + 2CH2=C(CH3)2 → H3)3C)2CH3C6H2OH

Ngoài ra còn có tên thương mại: Caon-3, EMBANOX BHT, còn được gọi là butylhydroxyltoluen

1.1.2 Tính chất – đặc điểm

BHT có khối lượng phân tử là 220.39, là một chất tan trong mỡ (tan trong chất béo), là hợp chất hữu cơ chủ yếu được sử dụng như một chất chống oxy hóa phụ gia thực phẩm cũng như một chất phụ gia chống oxy hóa trong

mỹ phẩm, dược phẩm

BHT ở dạng sử dụng là tinh thể màu vàng hoặc màu trắng, không vị, không mùi hay có mùi đặc trưng khó chịu của vòng thơm, cũng bị tổn thất dưới tác động của nhiệt (sấy, ) Tan kém trong nước, tan vô hạn trong etanol,

sự có mặt của sắt trong một số sản phẩm thực phẩm hay bao bì, BHT có thể tạo ra hợp chất có màu vàng

BHT có tính chất tương tự như BHA nhưng có tính bền nhiệt hơn Tuy nhiên, BHT có tác dụng chống oxy hóa kém hơn BHA vì cấu trúc không gian của BHT cồng kềnh hơn BHA (do trong phân tử của BHT có 2 nhóm tert-butyl xung quanh nhóm – OH)

1.1.3 Cơ chế chống oxy hóa

Nó hoạt động như một chất ngăn chặn quá trình oxy hóa, một quá trình không bão hòa trong đó các hợp chất hữu cơ bị tấn công bởi oxy trong khí quyển BHT chống oxy hóa xúc tác phản ứng bằng cách chuyển đổi các gốc

tự do peroxy trong liên kết hydroperoxides Điều này tác động đến chức năng chống oxy hóa bằng cách nó sẽ quyên góp một nguyên tử hydro:

R là ankyl hoặc aryl, và nơi ArOH là phenolic của BHT hoặc có liên quan đến chất chống oxy hóa Người ta thấy rằng BHT liên kết với hai gốc tự

do peroxyl Ngoài ra, nó còn là chất thuộc nhóm chất chống oxy hóa có hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong sản phẩm có nhiều chất béo Do đó có tác dụng bảo quản thực phẩm, ngăn ngừa sự hư hỏng và ôi khét của hương liệu Ngoài ra nó còn có tác dụng ổn định và nhũ hóa cho shortening Sử dụng đơn

lẻ một mình hoặc kết hợp với BHA, acid citric, sử dụng trong shortening, dầu thực vật, thực vật

Nó được sử dụng phổ biến trong quá trình sản xuất nhựa, cao su tự nhiên

và tổng hợp, ở đây nó hoạt động tốt như một chất ổn định Nó được dùng trong dầu bôi trơn, xăng, dầu thực phẩm và các sản phẩm thức ăn chăn nuôi

 Sản xuất nhựa polymer: Nhựa yêu cầu chất chống oxy hóa này cố định polymer trong quá trình xử lý và bảo vệ nó trong suốt tuổi thọ của sản phẩm Bản thân nó đã được chứng minh có hiệu quả với sự đa dạng của polymer Và được xác nhận là an toàn và được chấp thuận trong bao gói thực phẩm Gần đây, tất cả nhựa polymer yêu cầu phải bổ sung chất chống oxy hóa

để duy trì được tính chất cần thiết Việc lựa chọn chất chống oxy hóa phụ thuộc vào cấu hình của polymer

 Sản xuất cao su: BHT được sử dụng trong sản phẩm cao su trắng và

có màu sáng vì nó không nhuộm màu, không màu sắc Còn các chất chống oxy hóa nhuộm màu chỉ sử dụng trong sản xuất lốp xe và sản phẩm màu đen khác

 Xăng, dầu và các loại dầu thực phẩm

- Dầu bôi trơn: BHT được sử dụng hiệu quả với 0.1%-1% theo trọng lượng

- Dầu máy biến áp

- Dầu thủy lực và sáp paraffin: Sử dụng BHT để tăng cường khả năng chống lại quá trình oxy hóa

- Mỡ công nghiệp, dầu thực phẩm: BHT ngăn cản sự phát triển của hiện tượng ôi hóa

- Hỗn hợp dầu diesel sinh học: Ngăn chặn sự ôi hóa trong hỗn hợp này với hàm lượng ít hơn 0.1%

 Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi: Các sản phẩm thực phẩm bao gồm mỡ và dầu chứa nhiều liên kết chưa no nên dễ bị oxy hóa, mất đi sự hấp dẫn và giảm giá trị cảm quan Và nó cũng được sử dụng hiệu quả trong thức

ăn chăn nuôi như bột cá…Nó giữ được hương thơm, mùi vị, vitamin, màu sắc bằng cách ngăn chặn sự oxy hóa lipid

Ngoài ra nó được sử dụng thành công trong việc giảm thiểu sự thay đổi

độ nhớt của hỗn hợp sáp paraffin và ethylene vinyl acetate copolymer để tạo

ra chất kết dính và lớp phủ ngoài nóng chảy

1.1.6 Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của chất chống oxy hóa BHT

 Hợp chất của các chất béo (trong thức ăn chăn nuôi)

 Các điều kiện bảo quản (nhiệt, ánh sáng, bề mặt, bao bì)

 Liều dùng của chất chống oxy hóa

 Nồng độ của chất chống oxy hóa

 Thành phần của chất chống oxy hóa

 Thời điểm sử dụng BHT

1.1.7 Ưu điểm của BHT

 Độ tinh khiết cao

 Có khả năng phân tán tốt trong các nguyên liệu thô

 Dễ dàng xử lý với các chất ức chế kết dính

 Hoạt tính cao

 Lâu bền

 Giá thấp nhưng hiệu quả cao

 Không có hại cho sức khỏe

1.2 Tổng quan về phụ gia chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là một phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách cho điện tử để khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng Chúng cũng làm giảm tác dụng của các quá trình oxy hóa nguy hiểm bằng các liên kết với các phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt của chúng Bất kỳ chất nào ngăn ngừa hay làm chậm sự oxy hóa đều được gọi

là chất chống oxy hóa

1.2.1 Vai trò của chất chống oxy hóa

Trong quá trình chế biến cũng như bảo quản thực phẩm thường xảy ra hàng loạt các phản ứng oxy hóa, làm biến đổi phẩm chất và giá trị của thực phẩm Cụ thể làm giảm giá trị cảm quan của thực phẩm do quá trình oxy hóa làm biến đổi màu sắc theo chiều hướng xấu, đồng thời tạo ra các sản phẩm thứ cấp gây mùi khó chịu cho thực phẩm Sản phẩm oxy hóa thường làm vô hoạt enzyme đặc biệt đặc biệt là enzyme tiêu hóa Sản phẩm oxy hóa lipid có khả năng phản ứng cao với protein tạo hợp chất bền vững, không tan trong nước cũng như trong dung môi hữu cơ và cũng không bị thủy phân

Chính vì vậy phải sử dụng những phụ gia có tác dụng ngăn ngừa hoặc kiềm chế các quá trình oxy hóa để đảm bảo chất lượng sản phẩm Các chất chống oxy hóa được dùng trong thực phẩm phải đảm bảo các yêu cầu sau:

 Tăng cường khả năng ổn định về chất lượng thực phẩm, hạn chế hoặc loại bỏ các quá trình oxy hóa

 Bảo tồn các giá trị dinh dưỡng cơ bản của thực phẩm

 Các giá trị cảm quan của thực phẩm phải được giữ nguyên

 Quá trình sử dụng những chất này phải tiện lợi, chi phí thấp

1.2.2 Cơ chế chống oxy hóa

Gọi AH là chất chống oxy hóa chất béo Phản ứng chống oxy hóa chất béo xảy ra theo sơ đồ sau:

Hình 1.2 Cơ chế chống oxy hóa của chất chống oxy hóa

1.2.3 Phân loại chất chống oxy hóa

Hình 1.3 Phân loại chất chống oxy hóa

Ngoài ra còn có một số chất hỗ trợ chống oxy hóa như:

Chất hỗ trợ chống oxy hóa chất béo được thêm vào để tăng cường hiệu quả chống oxy hóa cụ thể như sau:

 Tạo môi trường acide ổn định để chống oxy hóa chất béo

 Loại bỏ hoạt tính các ion kim loại (tạo phức vô hại)

 Loại bỏ oxy (oxy hóa ascorbic)

 Phục hồi chống oxy hóa

a Chất chống oxy hóa tự nhiên

 Acid ascorbic (Vitamin C)

Công thức: C6H8O6

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của vitamin C

Vitamin C có hoạt chất chống oxy hóa khi nó làm giảm oxy hóa chất như hydrogen peroxide Ngoài ra, nó cũng sẽ làm giảm các ion kim loại tạo ra các gốc tự do thông qua các phản ứng fenton

 Tocopherol (Vitamin E)

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của vitamin E

Tất cả đều có vòng chromanol, với nhóm hydroxyl có thể cung cấp nguyên tử hyđro để khử các gốc tự do và nhóm R (phần còn lại của phân tử)

sợ nước để cho phép thâm nhập vào các màng sinh học

 Nhóm polyphenol

Nhiều công trình lớn nghiên cứu tiền lâm sàng và xây dựng dữ liệu dịch tễ học cho thấy polyphenol thực vật có thể làm chậm sự lan triển của ung thư, giảm nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, hoặc loãng xương

 Nhóm carotene

Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài Thiên nhiên có đến khoảng 600 loại carotenoid khác nhau, trong đó có 50 loại carotenoid hiện diện trong thực phẩm Carotenoid khá quen thuộc với chúng

ta là β-caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A Βeta-caroten là một tenpin Nó là một trong hơn 600 loại carotenoid tồn tại nhiều trong tự nhiên Carotenoid là những chất có màu vàng cam, cam và hơi pha đỏ Nhưng ngoài những tác dụng như vitamin A nó không hề gây độc tính quá nhiều như vitamin A và điều đặc biệt là beta-caroten khử các gốc tự do tốt hơn vitamin

A, giảm nguy cơ của nhiều căn bệnh ung thư, giúp làm trẻ hóa làn da, giảm tử vong do bệnh tim mạch

 Peptide

Chúng cũng kích thích sản xuất collagen và làm tăng tác dụng của chất chống oxy hóa Trong cơ thể động vật và thực vật peptide làm nhiệm vụ bảo vệ cho cơ thể Loại peptide đầu tiên phải kể đến ở động vật có xương sống là các peptide kháng thể trong máu, chúng là những yếu tố nhận biết đắc lực các tác nhân vi khuẩn, virus và các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể và để loại trừ chúng ra khỏi cơ thể

 Selen

Trước đây, trong dinh dưỡng người ta ít quan tâm tới selen Nó chỉ mới được biết tường tận vào những năm gần cuối thế kỷ 20 Có nhiều công trình nghiên cứu về selen mà đặc biệt nhất là vai trò khử các gốc tự do Selen ngoài tác dụng hoạt hóa vitamin E (giúp vitamin E “bẫy” các gốc tự do một cách rất hiệu quả), còn có mặt trong một số enzyme dọn sạch lipo-peroxide ngăn cản sự sản sinh các gốc tự do thứ cấp

 Các alkaloid

Công dụng của alkaloid rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại alkaloid Tác dụng lên hệ thần kinh, kích thích thần kinh trung ương, ức chế

thần kinh trung ương, kích thích thần kinh giao cảm, gây tê, tác dụng hạ huyết

áp, tác dụng chống ung thư, tác dụng diệt kí sinh trùng, diệt khuẩn, ngoài ra một vài alkaloid có khả năng chống oxy hóa rất cao Tuy người ta còn nói tới những chất chống lão hóa khác nhưng trong ăn uống thì 4 chất chống oxy hóa: beta-carotene, vitamin E, vitamin C, selen là quan trọng hơn cả Cùng với hoạt tính riêng của từng chất nên trong ăn uống nếu có được hỗn hợp cả 4 thứ này chúng sẽ có tác dụng tương hỗ bảo vệ nhau chống sự phá hủy, giúp tái tạo, khiến cho khả năng chống oxy hóa càng đạt hiệu quả cao

b Chất chống oxy hóa tổng hợp

Các chất chống oxy hóa tổng hợp phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Không độc

- Có hoạt tính chống oxy hóa cao ở nồng độ thấp

- Có thể tập trung được trên bề mặt pha dầu

- Bền trong các điều kiện kỹ thuật của quá trình chế biến thực phẩm Các chất chống oxy hóa tổng hợp thường được sử dụng là: BHT (butylated hydroxytoluen), BHA (butylate hydroxyanisole), tocopherol tổng hợp, TBHQ (terbutyl hydroquinone), dodecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate,

 BHT (butylated hydroxytoluen)

Còn được gọi là 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene;

methyl-di-tertbutylphenol; 2,6-di-tert-butyl-para-cresol BHT được tạo thành phản ứng

của p-cresol (4-methylphenol) với isobutylen (2-methylpropene) xúc tác bởi acid sulfuric

Công tức phân tử: C15H24O

Bột màu trắng

BHT ngăn ngừa oxy hóa chất béo Nó được sử dụng để bảo quản thực phẩm có mùi, màu sắc và hương vị

 BHA (butylate hydroxyanisole)

BHA là một hỗn hợp của các đồng phân hydroxyanisole và 2-tert-butyl-4-hydroxyanisole

Công thức phân tử: C11H16O2

Màu trắng hoặc hơi vàng

Mùi thơm đặc trưng

Cơ chế: Nó hoạt động như một chất ngăn chặn quá trình oxy hóa, một quá trình không bão hòa trong đó các hợp chất hữu cơ bị tấn công bởi oxy trong khí quyển BHA chống oxy hóa xúc tác phản ứng bằng cách chuyển đổi các gốc tự do peroxy trong liên kết hydroperoxides Điều này tác động đến chức năng chống oxy hóa bằng cách nó sẽ quyên góp một nguyên tử hydro

Hình 1.6 Cấu tạo BHA

 BHA (Butylat hydroanisol)

Cơ chế: Nó hoạt động như một chất ngăn chặn quá trình oxy hóa, một quá trình không bão hòa trong đó các hợp chất hữu cơ bị tấn công bởi oxy trong khí quyển BHA chống oxy hóa xúc tác phản ứng bằng cách chuyển đổi các gốc tự do peroxy trong liên kết hydroperoxides Điều này tác động đến chức năng chống oxy hóa bằng cách nó sẽ quyên góp một nguyên tử hydro

 TBHQ (Tert-butylhydroquinon)

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của TBHQ

Cơ chế thì giống các chất chống oxy hóa gốc phenol như BHA Chống oxy hóa hiệu quả nhất đối với loại dầu thực vật và dầu động vật

1.3 Tổng quan về gốc tự do và quá trình oxy hóa

1.3.1 Tổng quan về gốc tự do

Trong hóa học, gốc tự do được khái niệm là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi Gốc tự do có thể tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các gốc tự do thường rất ngắn (khoảng một phần triệu đến một phần nghìn giây) Các electron này có năng lượng cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa…

Các gốc tự do hình thành khi có sự đứt nối đồng ly các liên kết cộng hóa trị Quá trình này cần năng lượng Quá trình phản ứng oxy hóa-khử một điện tử cũng tạo thành gốc tự do Ví dụ như phản ứng fenton tạo gốc tự do

oxy hóa khử một điện tử

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO* + HO

-Fe3+ + H2O2 H+ + HOO* + Fe2+

Về bản chất, gốc tự do là một electron độc thân Các gốc tự do rất không ổn định và nhạy cảm Chúng luôn có xu hướng tìm kiếm những electron khác để hình thành một cặp electron mới Các gốc tự do gây hại khi chúng kéo những electron từ các tế bào bình thường

1.3.1.1 Nguồn gốc hình thành các gốc tự do

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid, những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxygen Các gốc tự do

là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch… Do

đó, để tránh sự gây hại của gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống oxy hóa bổ sung như vitamin A, vitamin C, vitamin E, polyphenol,…

Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả

là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất phản ứng và gây ra nhiều tổn thương

Hình 1.8 Nguồn gốc hình thành các gốc tự do

1.3.1.2 Một số gốc tự do thường gặp

 Peroxyl radical (ROO*): Phản ứng và hình thành từ lipid, protein, DNA, đường… trong quá trình oxy hóa

 Organic hydroperoxide (ROOH): Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp

có thể sinh ra quá trình oxy hóa mạnh trong suốt trạng thái bệnh lý

năng phản ứng cao

1.3.1.3 Tác hại của gốc tự do đến thực phẩm và sức khỏe con người

a Tác hại của gốc tự do đến thực phẩm

Hình 1.9 Tác hại của quá trình tự oxy hóa chất béo đến thực phẩm

b Ảnh hưởng của các gốc tự do đối với cơ thể

Các gốc tự do có bản chất là một electron đơn độc, chúng không ổn định

và dễ dàng tham gia phản ứng Chúng tìm kiếm các electron khác từ các tế bào bình thường để hình thành một cặp electron mới Gốc tự do có thể sinh ra trong quá trình chuyển hóa của cơ thế, cũng có thể do xâm nhập từ bên ngoài vào Chúng làm phát sinh những phản ứng dây chuyền, gây ra nhiều bệnh tật

và tăng nhanh quá trình lão hóa cơ thể

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn biến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, rồi gốc tự do tấn công các ty lạp thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sanh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ Nếu không bị kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên

Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA Nó làm chất collagen, elastin mất tính đàn hồi, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những thay đổi trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già và sự chết của các sinh vật Ông ta cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng

Tuy nhiên không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại Đôi khi chúng cũng có một vài tác động hữu ích Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melanin cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt

Hình 1.10 Quá trình gây hại của gốc tự do 1.3.2 Quá trình oxy hóa lipid

Cơ chế phản ứng oxy hóa chất béo xảy ra phức tạp, có thể chia thành 3 giai đoạn là: Khởi tạo, lan truyền – tạo các sản phẩm trung gian và kết thúc phản ứng

- Khởi tạo

- Lan truyền - tạo các sản phẩm trung gian

- Kết thúc phản ứng

Sự oxy hóa chất béo chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: độ no của chất béo, ion kim loại, chất xúc tác sinh học, nhiệt độ, không khí, các chất chống oxy hóa chất béo, chất trợ chống oxy hóa chất béo… Để nắm rõ các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng oxy hóa chất béo cần tìm hiểu các vấn đề sau:

* Thành phần acid béo

Chất béo là hỗn hợp ester của các acide béo no và không no với glycerin Sự hiện diện của các nối đôi, các acide béo không no dễ bị oxy hóa hơn các chất béo no Phản ứng sẽ gia tăng khi tỉ lệ nối đôi càng cao

* Acide béo tự do

Acide béo tự do (FFA) bị oxy hóa rất nhanh so với các ester - glycerin Khi nghiên cứu chất béo hiện diện trong thực phẩm ở giai đoạn đầu tiên, hầu hết đều có sự hiện diện của các chất chống oxy hóa thiên nhiên Trong thí nghiệm nếu thêm vào 0,1% FFA thì hiệu quả chống oxy hóa của tocopherol giảm rõ rệt vì acide béo tự do có tác dụng xúc tác quá trình oxy hóa

* Nồng độ oxy

Tại áp suất cao (cung cấp oxy không hạn chế) tốc độ oxy hóa của

Thông thường thì sự oxy hóa chất béo gia tăng theo nhiệt độ Do

sự hòa tan của oxy phụ thuộc vào nhiệt độ vì vậy tác động của yếu tố oxy trong quá trình oxy hóa tại nhiệt độ cao là rất ít Ở nhiệt độ thấp từ - 27 đến

gia tăng đáng kể

* Độ ẩm

Tốc độ phản ứng oxy hóa chất béo phụ thuộc rất nhiều vào độ ẩm

1.4 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

1.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH

Đây là phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng

ức chế gốc tự do Phương pháp này được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định Do đó phương pháp này được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa Khả năng khử gốc tự do DPPH của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Fu và cộng sự (2002) [6]

Nguyên tắc:

DPPH là một gốc tự do, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi Sự làm giảm màu tím đặc trưng của DPPH là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền,

có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa BHT, nó sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH-H) do trung hòa gốc DPPH bằng cách cho

đi nguyên tử hydro, dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt Nghĩa là các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử Hoạt tính quét gốc tự do của chất chống oxy hóa tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH

Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH 1.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử

Tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Oyaizu (1985) [7]

Nguyên tắc:

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa của một chất Trong đó, chất khử (chất có hoạt tính oxy hóa)

X + K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6] Hay X + [Fe(CN)6]3+ [Fe(CN)6]4+

Phức hợp này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 700nm

(màu xanh)

Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành Do đó cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu khử càng cao

1.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl 2 /H 2 O 2

Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Bao và cộng sự (2010) [4]

Phản ứng trên được gọi là phản ứng Fenton do ông là người đầu tiên

đã mô tả quá trình này năm 1894 Phản ứng Fenton đã tiếp tục được nghiên cứu bởi nhiều tác giả sau này, các nghiên cứu này cho thấy ngoài phản ứng trên là phản ứng chính thì trong quá trình Fenton còn có xảy ra các phản ứng khác Tổng hợp lại bao gồm:

Những phản ứng trên chứng tỏ tác dụng của sắt đóng vai trò là chất

cơ (RH) tạo thành các gốc hữu cơ có khả năng phản ứng cao, từ đó sẽ phát triển tiếp tục theo kiểu dây chuỗi:

1.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide

Khả năng khử hydroperoxide của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Nabavi và cộng sự (2008) [5, 6]

Nguyên lý:

Khả năng khử hydroperoxide của BHT có thể là do nó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa Vì vậy khả năng khử hydroperoxide cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa một chất

H2O2 xuất hiện trong tự nhiên với hàm lượng thấp, có trong không khí, nước, cơ thể con người, thực vật, vi sinh vật, thực phẩm và nước uống

Nó được sử dụng rộng rãi như một chất tẩy trắng trong ngành công nghiệp

ước tính là 0.28 mg/kg/ngày Hydroperoxide thâm nhập vào cơ thể con người thông qua con đường hô hấp, mắt và da Trong cơ thể, hydroperoxide bị phân hủy tạo ra oxy và nước và điều này có thể tạo ra gốc tự do hydroxyl Mà gốc này có làm kích hoạt oxy hóa lipid, làm phá hoại cấu trúc ADN Vì vậy, bản thân

1.4.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H 2 O 2

Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Bao và cộng sự, 2010 [4]

Nguyên lý:

bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa

với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ giảm đi Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid của chất chống oxy hóa

1.4.6 Phương pháp ORAC

Phương pháp này đo các chất chống oxy hóa ức chế gốc peroxyl, phản ứng của các gốc chống oxy hóa với lipid trong thực phẩm và trong hệ thống sinh lý học Phương pháp này phát hiện các chất chống oxy hóa phân cực và kém phân cực bằng cách thay đổi dung môi

Nguyên lý: Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxyl Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt định Khi fluorescein bị oxy hóa , cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm

đi Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất chống oxy hóa vào Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu