Đánh giá khả năng áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic

LỜI CẢM ƠN Sau hơn 3 tháng nghiên cứu làm đề tài “Đánh giá khả năng áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic” đến nay đã được hoàn thành.. Hiện nay có

LÊ THỊ DUNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG PHẢN ỨNG FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG

OXY HÓA CỦA ACID PHYTIC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GVHD : TS HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

o0o

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 3 tháng nghiên cứu làm đề tài “Đánh giá khả năng áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic” đến nay đã được hoàn thành Để hoàn thành đợt thực tập này ngoài nỗ lực của bản thân em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía quý thầy cô, gia đình và bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong thầy cô, cán bộ trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt kiến thức quý báu và tận tình giải đáp thắc mắc của em trong quá trình học tập và làm đề tài

Đặc biệt em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS.Huỳnh Nguyễn Duy Bảo là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Xin cảm ơn các cán bộ các phòng thí nghiệm: Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Chế biến, Hóa sinh-Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị khóa trước đã động viên góp ý giúp em hoàn thành đề tài này

Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Dung

MỤC LỤC

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4

1.1.Giới thiệu về acid phytic 4

1.1.1 Định nghĩa 4

1.1.2 Cấu trúc 4

1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng PA trong tự nhiên 7

1.2.Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa 8

1.2.1 Gốc tự do 8

1.2.2 Các chất chống oxy hóa 17

1.3.Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết từ thực vật 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic 25

2.2.2 Các phương pháp phân tích 28

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 33

3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 34

3.3.Hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH 36

3.4.Hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích dựa vào khả năng khử H2O2 37

3.5.Hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo phương pháp Ferric Thyocinate 39

3.6 Tương quan giữa khả năng khử DPPH và hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 41

3.7.Tương quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid bằng mô hình phản ứng

Fenton tron hệ lipid/myoglobin/H2O2 với khả năng khử H2O2 của PA 42

3.8.Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa của PA bằng phương pháp FTC và hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 43

3.9.Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 vớihệ lipid/FeCl2/H2O2 45

3.10 Tương quan giữa khả năng khử DPPH và hoạt tính chống oxy hóa phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/ FeCl2/H2O2 của PA 46

3.11.Tương quan giữa khả năng khử gốc H2O2 và hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 47

3.12 Tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa của PA bằng phương pháp FTC và hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 50

1 Kết luận 50

2 Đề xuất ý kiến 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của acid phytic……… 5

Hình 1.2 Cấu tạo lập thể của acid phytic ………5

Hình 1.3 Phức phytate trong tự nhiên ……… 6

Hình 1.4: Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxi hóa ……….21

Hình 1.5 : Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian ……… 22

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa phương pháp đánh giá hoạt tínhchống oxy bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin//H 2 O 2 ……… 26

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic ……… 28

Hình 2.3 Đường chuẩn DPPH ………29

Hình 3.1 Hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic phân tích dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H 2 O 2 ……… 33

Hình 3.2 Khả năng chống oxy hóa lipid của PA hệ lipid/FeCl 2 /H 2 O 2……… 35

Hình 3.3.1 Khả năng khử gốc tự do DPPH của PA ……….36

Hình 3.3.2: Thí nghiệm khử gốc tự do DPPH ……… 37

Hình 3.4 Khả năng khử H 2 O 2 của PA ………38

Hình 3.5 Khả năng chống oxy hóa Lipid của PA bằng phương pháp FTC…… 39

Hình 3.6 Tương quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/ H 2 O 2 với khả năng khử gốc tự do DPPH của PA ……… 41

Hình 3.7 Tương quan hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/ myoglobin /H 2 O 2 với khả năng khử H 2 O 2 ……… 42

Hình 3.8 Tương quan hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/ myoglobin /H 2 O 2 với phương pháp FTC ……… 44

Hình 3.9 Đồ thị tương quan hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin /H 2 O 2 với hệ lipid/myoglobin//H 2 O 2 …45 Hình 3.10 Đồ thị tương quan hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/ FeCl 2 /H 2 O 2 /H 2 O 2 và phương pháp khử gốc tự do DPPH ………46

Hình 3.11 Đồ thị tương quan hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo môhình Fenton trong hệ hệ lipid/ FeCl 2 /H 2 O 2 và phương pháp khử gốc hydroperoxyde ……….47 Hình 3.12 Đồ thị tương quan hoạt tính chống oxy hóa của PA phân tích theo mô hình Fenton trong hệ lipid/ FeCl 2 /H 2 O 2 và phương pháp Ferric Thyocinate… 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tóm tắt các đặc điểm các phương pháp đo 24

hoạt tính kháng oxy hóa 24

Bảng 1 Khả năng khử gốc tự do DPPH của PA 53

Bảng 2: Khả năng khử hydroperoxide của PA 53

Bảng 3 : Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của PA trong hệ lipid/ FeCl2/ H2O2 54

Bảng 4 : Bảng kết quả hoạt tính chống oxy hóa của PA trong hệ lipid/Myoglobin/H2O2 54

Bảng 5.1 : Kết quả đo của phương pháp FTC 55

Bảng 5.2: Bảng tính toán GTTB 56

Bảng 5.3: Bảng tính hoạt động chống oxy hóa (%) 56

DPPH: 1,1-diphenyl1-2pycrylhydrazy TBARS: Thiobarbituric acid

UV-VIS: Ultraviolet visible

EPA: Acid Eicosapentaneoic

Cuộc sống ngày càng đi lên, nhu cầu về sử dụng thực phẩm ngày càng cao cùng với yêu cầu về chất lượng sản phẩm cũng ngày càng cao Thực trạng hiện nay, vấn đề oxy hóa lipid là vấn đề rất quan trọng trong việc bảo quản thực phẩm, nó gây ra rất nhiều tác hại như làm giảm màu, mùi, cấu trúc, giá trị dinh dưỡng và sinh độc tố Điều này rất hay xảy ra đối với các sản phẩm có nhiều chất béo Để giải quyết vấn đề này cũng như đáp ứng được yêu cầu của khách hàng thì trong công nghệ chế biến và bảo quản cần hạn chế những quá trình oxy hóa gây ra ảnh hưởng đến thực phẩm Hiện nay có rất nhiều chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ tự nhiên và tổng hợp Mỗi phụ gia có khả năng chống oxy hóa khác nhau, có ưu và nhược khác nhau nên việc đánh giá khả năng chống oxy hóa và sử dụng chúng hợp lý là vấn đề quan trọng Hiện nay có rất nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa đang được sử dụng phổ biến như phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử, khả năng khử hydroperoxide… Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phản ánh hoạt tính chống oxy hóa gián tiếp Theo một số nghiên cứu cũng đã áp dụng mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/ H2O2 và hệ lipid/FeCl2/H2O2

để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một số chất, tuy nhiên mô hình này chưa được ứng dụng rộng rãi, còn nhiều vấn đề chưa rõ ràng Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá khả năng áp dụng mô hình Fenton để phân tích hoạt tính

chống oxy hóa nhằm khẳng định tính hiệu quả của phương pháp để đưa vào

áp dụng rộng rãi và chuẩn hóa phương pháp

Cây lương thực là các loại cây trồng mà sản phẩm dùng làm lương thực cho người, nguồn cung cấp chính về năng lượng và chất bột cacbohydrat Hạt ngũ cốc và cây họ đậu là nguồn thực phẩm tiêu thụ chính của dân số thế

giới Nguồn thực phẩm này rất giàu acid phytic (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-

hexadihydrogenphosphate), là thành phần dự trữ photpho trong hạt Acid phytic tồn tại trong hạt thường ở dạng phức hợp muối phytate của kali, magie, canxi nên có thể chứa các ion kim loại khác như canxi (Ca), sắt (Fe) và kẽm( Zn) Ở pH sinh lý, acid phytic ở dạng đa ion tích điện âm gây ảnh hưởng đến các ion tích điện dương Khi thức ăn được hấp thu chúng sẽ kết hợp với các kim loại khoáng quan trọng, cạnh tranh với sự hấp thụ trong thành ruột non tạo nên sự thiếu sắt và kẽm trong cơ thể con người Acid phytic trong thức ăn thực vật (ngũ cốc, các loại hạt, đậu ) liên kết với các khoáng chất (đặc biệt là sắt và kẽm), vì vậy mà cơ thể không thể hấp thụ các chất dinh dưỡng Nó cũng được biết rằng dư thừa sắt gây bệnh, do đó, thực tế là acid phytic ngăn ngừa một số hấp thụ chất sắt thực sự có thể là một điều tốt Acid phytic là một chất chống oxy hóa (như vitamin C) Nó được cho là một trong những lý do lý do tại sao một chế độ ăn nhiều chất xơ là lành mạnh Theo N Rukma Reddy, tác giả của phytates Thực phẩm , phytate có khả năng tiềm năng để hạ thấp lượng đường trong máu, làm giảm cholesterol và các triacylglycerol, và làm giảm nguy cơ ung thư và bệnh tim

Vì vậy nghiên cứu ảnh hưởng của acid phytic đang được đánh giá toàn diện nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến sức khỏe con người, dinh dưỡng động vật, quản lý dinh dưỡng sản phẩm nông nghiệp Nghiên cứu này

đã đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic

Nội dung thực hiện đề tài

+ Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic áp dụng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 và trong hệ lipid/FeCl2/

H2O2

+ Phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH, phương pháp Ferric Thyocinate và khả năng khử H2O2 của acid phytic

+ Phân tích mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa đánh giá theo

mô hình Fenton với khả năng khử DPPH, phương pháp Ferric Thyocinate và khả năng khử H2O2 của acid phytic

1.1.2 Cấu trúc

Cấu trúc của acid phytic được tìm ra bằng phương pháp phân tích X- ray (Blank và cộng sự, 1971) và 31P-NMR ( Johnson và Tate, 1969) Johnson và Tate đề nghị rằng nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí đối xứng qua trục, còn các nhóm photphat còn lại nằm ở vị trí bất đối xứng Ngược lại, theo Blank và cộng sự, (1971) thì kết luận rằng các nhóm photphat 1,3,4,5 và 6 nằm ở vị trí đối xứng qua trục, còn nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí bất đối xứng Đối với

dữ liệu của Costello và cộng sự, (1976) thì ủng hộ thông tin của Johnson và Tate, (1969) đã đề nghị

Acid phytic có công thức tổng quát của là C6H8O24P6, tồn tại ở hai dạng cấu trúc lập thể khác nhau, cấu trúc đối xứng và bất đối xứng

Hình 1.1 Cấu trúc của acid phytic

Inositol hay còn gọi là hexahydroxyclohexan, có 9 dạng đồng phân lập thể giống với cấu trúc của glucose Inositol là thành phần của nhiều photphoglycerid tế bào Vì inositol có mặt trong mô cơ nên còn được gọi là Meso- hay my- oinositol, là một đồng phân rất quan trọng

Hình 1.2 Cấu tạo lập thể của acid phytic

Acid phytic có ái lực mạnh với các cation đa hóa trị và các protein tích điện dương vì nó tồn tại dưới dạng phân tử tích điện âm mạnh trong phổ pH rộng Chính vì vậy mà acid phytic liên kết với các ion Mg2+, Ca2+, protein tạo thành dạng phytate trong tự nhiên

Hình 1.3 Phức phytate trong tự nhiên

Cấu trúc hóa học của acid phytic rất ổn định, hàm lượng phosphate cao

do đó tích điện âm và có khả năng tồn tại trong phổ pH rộng

1.1.2.1 Vai trò của acid phytic

- Ảnh hưởng của acid phytic đối với con người và vật nuôi

Hiện nay, các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng chế độ ăn uống chứa nhiều acid phytic có nhiều đặc tính có lợi cho hiệu ứng chống ung thư, chống oxy hóa và chống quá trình vôi hóa Một số nghiên cứu cũng chỉ ra việc ăn nhiều ngũ cốc có hàm lượng acid phytic cao sẽ làm giảm sự hấp thụ các chất khoáng hay các nguyên tố vi lượng qua đường ruột của cơ thể con người và vật nuôi Nhưng chính khả năng làm giảm sự hấp thu các chất khoáng mà acid phytic là một chất ức chế khả năng sinh ung thư đại tràng, ruột, sỏi thận Một

số nghiên cứu đã chứng minh rằng tác động làm giảm dinh dưỡng của axit phytic có thể được biểu hiện khi trong chế độ ăn có chứa một số lượng lớn axit phytic tiêu thụ kết hợp với thành phần oligos Ngoài ra, khả năng liên kết với các ion kim loại hóa trị cao sẽ làm giảm sự lão hóa cơ thể do ức chế được

sự hình thành gốc tự do Do đó, acid phytic còn được nghiên cứu như là một thực phẩm chất năng

Mức độ tiêu thụ phytate ở người có sự khác biệt mạnh mẽ giữa các nước, các độ tuổi, giới tính… Những khác biệt này bắt nguồn từ sự khác biệt trong các loại thực phẩm tiêu thụ, chế biến khác nhau và chuẩn bị các phương pháp Các cuộc ăn uống điển hình cung cấp từ 1-1,5g acid phytic mỗi ngày Tại các nước đang phát triển, lượng tiêu thụ phytate hàng ngày của cơ thể có

thể lên đến 2g Vì vậy, việc cân đối nhu cầu sử dụng các loại thức ăn giúp cơ thể phát triển khỏe mạnh là điều cần thiết

- Acid phytic đối với cây trồng

Acid phytic là nguồn dự trữ photpho chính trong cơ thể thực vật nên có vai trò rõ nhất là giúp bảo quản hạt giống ít bị hư hỏng, là nơi dự trữ inositol, photphate, K, Mg, Ca, Mn, Fe và Zn cho mầm cây Những hợp chất dự trữ này được giải phóng cho cây mầm đang phát triển bởi hoạt động của những phytase Vai trò thứ hai là nó điều khiển lượng photphate vô cơ cả ở hạt đang phát triển và cây mầm

1.1.2.2 Chức năng chống oxy hóa của acid phytic

Acid phytic là một chất chống oxy hóa tự nhiên Nhờ khả năng liên kết mạnh mẽ với sắt, acid phytic ngăn chặn các phản ứng oxy hóa xúc tác bởi sắt Trong các giống cây trồng acid phytic giúp làm giảm quá trình oxy hóa của các thành phần của nó Trong chế độ ăn của con người có chứa thành phần acid phytic có thể làm giảm nguy cơ ung thư đại tràng và một số bệnh viêm đường ruột khác cũng như kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm Ngoài ra acid phytic có trong thức ăn sẽ liên kết với các ion kim loại khơi mào cho phản ứng oxy hóa lipid, ức chế sự peroxy hóa lipid và hư hỏng oxy hóa đồng thời, chẳng hạn như sự đổi màu, sự thối rữa Nó cũng được sử dụng như một chất chống oxy hóa trong nhiều ứng dụng công nghiệp khác như ức chế sự ăn mòn kim loại

1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng PA trong tự nhiên

Acid phytic được tìm thấy đầu tiên như là các muối của các ion dương hóa trị 1 và 2 (như muối kali, magiê trong gạo và muối canxi, magiê trong đậu nành, trong những vùng riêng rẽ của các loại hạt ngũ cốc, cây họ đậu) Nó tích lũy trong các loại ngũ cốc, các loại đậu trong suốt quá trình chín của hạt, cùng với các cơ chất dự trữ khác như tinh bột và chất béo Trong các hạt ngũ cốc và hạt đậu acid phytic tích lũy trong các hạt nhỏ alơron và các tinh thể hình cầu tách biệt (Reddy và cộng sự, 1989)

Nội nhũ của phôi lúa mì và lúa thì hầu như không có phytate Nó dường như tập trung trong mầm và các lớp hạt alơron của các tế bào phôi

Ferguson và Bollard (1976) đã tìm ra rằng 99% phytat trong đậu là nằm trong các lớp tế bào mầm

Lượng phytate lớn nhất ở ngũ cốc được tìm thấy là ở ngô (0.33-2.22) và ở các loại đậu là ở đậu dolique (5.92-9.15), (Reddy và cộng sự, 1989)

1.2 Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa

1.2.1 Gốc tự do

1.2.1.1 Khái niệm về gốc tự do

Trong hóa học, gốc tự do được khái niệm là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi Gốc tự do có thể tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các gốc tự

do thường rất ngắn (khoảng một phần triệu đến một phần nghìn giây) Các electron này có năng lượng cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng polymer hóa… Các gốc tự do hình thành khi có sự đứt nối đồng ly các liên kết cộng hóa trị Quá trình hình thành gốc tự do cần năng lượng Quá trình phản ứng oxy hóa khử một điện tử cũng tạo thành gốc tự do Ví dụ như phản ứng Fenton tạo gốc tự do HO• từ H2O2 dưới sự xúc tác của ion sắt là một ví dụ điển hình của phản ứng oxy hóa khử một điện tử

Fe2+ + H2O2  Fe3++ *OH + OH – (1.1)

Fe3+ + H2O2 → Fe2+ + *HO2 + H+ (1.2) 1.2.1.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể Các gốc tự do trong cơ thể sinh vật có 2 nguồn gốc, đó là nguồn nội sinh

và nguồn ngoại sinh Gốc tự do có nguồn nội sinh là các gốc tự do được chính

cơ thể tạo ra Gốc tự do có nguồn ngoại sinh được hình thành trong cơ thể do các yếu tố ngoại lai như ô nhiễm môi trường, tác động của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời, thuốc lá, rượu, thuốc chữa bệnh

- Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh

Gốc tự do được hình thành trong cơ thể do những quá trình chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào, quá trình trao đổi chất của tế bào Ti thể là nguồn tạo ra nhiều các gốc tự do nội bào Trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp tế bào một số điện tử bị rò rỉ khỏi chuỗi dẫn đến hậu quả là chúng tương tác với phân tử oxy để hình thành gốc superoxid Khoảng 2-5% oxy

sử dụng cho sự trao đổi chất hiếu khí trong ti thể bị chuyển thành gốc tự do

có nhóm oxy hoạt động (reactive oxygen species: ROS) Các gốc tự do khác được hình thành trong cơ thể như là vũ khí sinh học chống lại virus, vi khuẩn, tế bào ung thư,

- Các enzym oxy hoá

Nhiều hệ thống enzym có thể tạo ra các gốc tự do bao gồm: Xanthin oxidase (được hoạt hoá trong thiếu máu cục bộ/tưới máu lại) prostaglandin synthase, NADPH oxidase, nitric oxide synthase (NOS), lipoxydase, aldehyd oxidase, và amino acid oxidase Enzym myeloperoxidase được tạo ra do sự hoạt hoá bởi bạch cầu trung tính, sử dụng hydrogen peroxid để oxy hóa ion Cl- thành hợp chất HOCl có khả năng oxy hóa mạnh

- Bùng phát hô hấp

Bùng phát hô hấp (respiratory burst) là thuật ngữ được dùng để mô tả những tế bào bạch cầu sử dụng một lượng lớn oxy trong suốt quá trình thực bào, 70-90% oxy tiêu thụ được dùng để tạo superoxid Màng tế bào bạch cầu

đa nhân có enzym NADPH oxidase tồn tại ở thể bất hoạt Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bao kín để làm nhiệm vụ thực bào Lúc này enxym NADPH oxidase ở màng bạch cầu sẽ được hoạt hóa Việc hoạt hóa này khởi động cho sự bùng phát hô hấp tại màng tế bào, NADPH oxidase xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do superoxid từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ Tuy nhiên, một phần các gốc tự do sẽ thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm Như vậy trong các hội chứng viêm đã hình thành các gốc tự do dưới xúc tác của enzym NADPH oxidase

- Ion kim loại chuyển tiếp

Ion sắt và đồng đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành gốc tự

do Các ion kim loại này tham gia trong phản ứng Haber-Weiss tạo ra OH· từ O2·⁻ và H2O2 (phản ứng 1.1 và 1.2) Phản ứng này làm tăng thêm

sự oxy hóa những phân tử không phải là enzym như epinephrin và glutathion hình thành O2 ·⁻ và H2O2 từ OH· Bên cạnh đó, ion sắt và đồng còn gây nguy hiểm cho tế bào do khả năng oxy hóa và peroxid hóa lipid Chúng phân hủy lipid hydroperoxid thành peroxyl và alkoxyl, các gốc này tham gia vào phản ứng dây chuyền peroxid hóa lipid gây nguy hiểm cho tế bào Ion đồng là nhân tố quan trọng gây ra sự oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL)

- Thuốc

Nhiều loại thuốc chữa bệnh có thể tạo ra nhiều gốc tự do khi có sự

hiện diện của oxy Những loại thuốc này gồm có kháng sinh có nhóm quinoid, thuốc chống ung thư như bleomycin, anthracyclin (adriamycin) và loại thuốc cản trở sự phát triển tế bào có hoạt động của chất tiền oxy hoá Những gốc là dẫn xuất của penicillamin, phenylbutazon, acid fenamic và aminosalicylat, hợp chất của sulphasalazin có thể ức chế protease, làm giảm acid ascorbic và làm tăng nhanh sự peroxid hóa lipid

- Sự bức xạ

Xạ trị làm tổn thương mô mà nguyên nhân là do các gốc tự do Bức xạ điện từ (tia X, tia gamma) và những bức xạ hạt (electron, photon, neutron, alpha và hạt beta) tạo ra những gốc tự do nguyên thủy bằng việc chuyển năng lượng của chúng cho thành phần của tế bào như nước Những gốc này có thể phản ứng với oxy hòa tan trong dịch tế bào để hình thành ROS

- Khói thuốc

Những chất oxy hóa trong khói thuốc đóng vai trò chính gây tổn thương đường hô hấp Những chất này làm giảm các chất chống oxy hóa trong tế bào

phổi in vivo bởi cơ chế liên quan đến stress oxy hóa Khói thuốc có một lượng

lớn những chất như aldehyd, epoxid, peroxid và những gốc oxy hóa khác mà chúng có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công phế nang Bên cạnh đó khói thuốc chứa các gốc tự do bền trong nhựa thuốc như semiquinon có dẫn xuất từ quinon và hydroquinon Sự vi xuất huyết là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm thấy ở mô phổi của những người hút thuốc Sắt trong thể này phản ứng với hydrogen peroxid hình thành gốc hydroxyl gây nguy hiểm cho tế bào Những người hút thuốc có số lượng bạch cầu trung tính cao hơn do đó góp phần nâng cao nồng độ của gốc tự do

- Những phân tử vô cơ

Việc hít vào những phân tử vô cơ như bụi (amiăng, thạch anh, silica) có thể dẫn đến tổn thương phổi mà nguyên nhân gián tiếp có thể là gốc tự do Việc hít các hạt amiăng gắn liền với nguy cơ tăng chứng xơ hóa phổi, u trung biểu mô, và ung thư biểu mô (do hít không khí ô nhiễm vào phổi) Những hạt silica cũng như hạt amiăng bị thực bào bởi các đại thực bào phổi Những tế bào này sau đó bị vỡ ra giải phóng protease và những hợp chất trung gian khác khởi phát quá trình viêm dẫn đến việc tăng các gốc tự do và ROS Hơn nữa các sợi amiăng có sắt và sắt có thể kích thích hình thành gốc tự do là

hydroxyl

- Những nguyên nhân khác

Các tác nhân ở môi trường như quang hóa, ô nhiễm không khí bởi khói bụi, thuốc trừ sâu, dung môi hữu cơ, chất gây mê, khói và nhóm hydrocacbon thơm cũng là nguyên nhân tạo ra các gốc tự do nguy hiểm cho tế bào

Như vậy, gốc tự do ngoại sinh được hình thành do các yếu tố ngoại lai như ô nhiễm môi trường, tác động của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời, thuốc

lá, uống rượu làm lượng các gốc tự do trong cơ thể gia tăng đột biến Do có hoạt tính sinh học mạnh nên các gốc tự do có thể thực hiện các phản ứng hóa học phá hủy hệ thống tế bào dẫn đến khả năng sinh bệnh ung thư, nhồi máu cơ tim, lão hóa

1.2.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể Khi tồn tại ở trong vòng kiểm soát, các gốc tự do rất cần thiết cho các hoạt động sống của cơ thể

- Vai trò của gốc tự do trong quá trình trao đổi chất và trong chuỗi hô hấp

tế bào

Hầu hết tất cả dạng sống đều cần đến gốc tự do cho các quá trình diễn

ra trong cơ thể ở mức độ vi mô Trong tế bào của sinh vật sống, hàng triệu các phản ứng hóa học diễn ra mỗi giây nhằm tạo năng lượng cung cấp cho hoạt động sống và tạo nên những chất cần thiết để xây dựng cơ thể Rất

nhiều phản ứng trong số đó là các phản ứng oxy hóa khử đòi hỏi sự di

chuyển của các điện tử từ phân tử này sang phân tử khác, đặc biệt là trong chuỗi hô hấp của tế bào Quá trình hô hấp ở tế bào nhằm tạo ra năng lượng cho các hoạt động sống là một chuỗi các phản ứng oxy hóa– khử và gốc tự do

là các sản phẩm trung gian được sinh ra trong quá trình này

- Vai trò của gốc tự do trong hệ thống miễn dịch

Cơ thể người rất dễ bị các vật lạ hoặc vi sinh vật từ môi trường bên ngoài xâm nhập Do đó, một hệ thống miễn dịch nhằm bảo vệ cơ thể khỏi các sinh vật lạ là rất cần thiết Đóng vai trò chính trong nhiệm vụ này là các tế bào lympho T và các gốc tự do, phần lớn là các ROS được tạo ra bởi sự hoạt hóa của các đại thực bào góp phần tiêu diệt các vi sinh vật có hại

Bên cạnh chức năng giúp tiêu diệt các vi sinh vật có hại, các gốc tự do còn góp phần quét dọn các tế bào già, chết trong cơ thể, tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi và phát triển Đồng thời, gốc tự do còn góp phần

tiêu diệt các tế bào bất thường như tế bào ung thư

Ngoài hai vai trò nói trên, gốc tự do còn tham gia vào nhiều quá trình

có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trò trong tín hiệu tế bào, là chất dẫn truyền thần kinh (NO) và cần thiết cho việc hình thành một số hormon như thyroxin

Tuy nhiên khi gốc tự do tồn tại với nồng độ cao ngoài sự kiểm soát của cơ thể thì gốc tự do lại gây bất lợi đối với cơ thể

1.2.1.4 Tác dụng có hại của gốc tự do

Khi con người khỏe mạnh, các gốc tự do sinh ra trong các hoạt động sống thoát ra khỏi các quá trình hoạt động bình thường của cơ thể sẽ bị trung hòa bởi hệ thống chống gốc tự do của cơ thể Số lượng gốc tự do trong cơ thể tăng nhanh trong các trường hợp sau đây:

- Ảnh hưởng bởi chất độc hóa học như thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ

- Các stress thể chất hay tâm lý như quá nóng, quá ồn, quá căng thẳng, quá lo âu

- Các bệnh nhiễm khuẩn: Bạch cầu bao quanh vi khuẩn, tăng chuyển hóa

và năng lượng để làm nhiệm vụ thực bào; các tổ chức hoạt động quá tải tạo ra những gốc tự do

- Viêm làm rối loạn chuyển hóa, tạo ra những gốc tự do

- Khi mô bị tổn thương, ion sắt thoát ra tạo phản ứng Fenton hình thành gốc tự do

- Tái tưới máu sau khi thiếu máu cục bộ (nghẽn động mạch, tĩnh mạch, mạch tim bằng cơn đau thắt hoặc nhồi máu cơ tim), oxy tới mô ào ạt làm tăng sự oxy hóa, tăng gốc tự do

 Stress oxy hóa

Stress oxy hóa (oxidative stress) là kết quả của sự hình thành gốc tự

do vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể Điều này xảy ra khi các chất chống oxy hóa có nồng độ quá thấp, không đủ

để trung hòa các gốc tự do Kết quả các gốc tự do sẽ tấn công các phân tử lipid, protein, acid nucleic của tế bào dẫn đến tổn thương cục bộ và kết quả cuối cùng là gây sự hoạt động bất thường của cơ quan Lipid là phân tử sinh học dễ bị gốc tự do tấn công nhất Stress oxy hóa dẫn đến hậu quả là phát sinh nhiều loại bệnh của tuổi già như Parkinson, Alzheimer và một số bệnh

về thần kinh khác; xơ vữa động mạch,bệnh đái tháo đường, bệnh phổi, bệnh ung thư, viêm khớp, thoái hóa võng mạc, đục thủy tinh thể, suy giảm hệ thống miễn dịch

 Quá trình peroxid hóa lipid

Sự oxy hóa được biết đến nhiều nhất là ảnh hưởng của các gốc tự do và ROS đến sự peroxid hóa lipid Màng tế bào giàu acid béo chưa bão hòa nên

bị tấn công bởi tác nhân oxy hóa, quá trình này gọi là sự peroxid hóa lipid Đây là tiến trình mà các gốc tự do lấy điện tử từ lipid trong màng tế bào và nó đặc biệt nguy hiểm do tiến trình này là một phản ứng dây chuyền Phản ứng giữa gốc tự do và lipid bao gồm 3 giai đoạn:

do lipid sẽ tiếp tục phản ứng với oxygen trong cơ thể tạo gốc tự do lipid peroxyl (ROO•) Gốc ROO• sẽ hình thành hợp chất lipid hydroperoxid (ROOH) bằng các lấy đi một nguyên tử hydrogen từ một acid béo không

no kế cận nó trong giai đoạn thứ hai gọi là giai đoạn lan truyền Giai đoạn kết thúc xảy ra khi 2 gốc tự do kết hợp với nhau tạo thành phân tử trung hòa hoặc tác dụng với chất chống oxy hóa như vitamin E để tạo thành sản phẩm lipid alcohol và gốc tocopherol.Những acid béo không no (của màng tế bào) bị ảnh hưởng đặc biệt trong giai đoạn khởi đầu và lan truyền của phản ứng dây chuyền Cơ chế phá hủy màng tế bào bằng việc peroxyd hóa các acid béo chưa bão hòa đã được nghiên cứu nhiều invitro Hậu quả nghiêm trọng của việc oxy hoá màng tế bào dẫn đến sự gia tăng tính lỏng lẻo, làm tổn thương tính toàn vẹn của màng và bất hoạt những thụ quan và enzym có ở trên màng dẫn đến việc tạo ra các sai sót trong nhận biết tín hiệu tế bào và trong các phản ứng miễn dịch của cơ thể Khi màng tế bào mất chức năng sinh học, tế bào sẽ bị chết kéo theo sự thoái hóa mô Quá trình peroxyd hóa màng tế bào còn xảy ra khi cơ thể thiếu oxy, chuỗi hô hấp tế bào không tạo thành ATP để bơm Ca

2+

ra ngoài màng tế bào Khi nồng độ Ca2+trong tế bào tăng sẽ hoạt hóa các protease, protease sẽ hoạt hóa xanthin oxidase làm tăng nhanh các gốc tự do phá huỷ màng tế bào

Việc làm hư hại lipid thường được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển tiếp làm ảnh hưởng đến tính linh động của màng dẫn đến một số bệnh như đái tháo đường, bệnh trên hệ tim mạch

 Làm hư hỏng protein

Những nghiên cứu gần đây cho thấy protein là phần chính của tế bào bị gốc tự do hydroxyl tấn công Kết quả của sự tấn công này là tạo thành sản phẩm hydroperoxid trên protein:

PrH + X• → Pr• + XH (H2O) (1.3)

Pr• + O2 → PrOO• (1.4) PrOO• + H+

→ PrOOH (1.5) PrOO• + PrH → PrOOH+ Pr (1.6) PrOO + gốc tự do → POOH (1.7)

So với các ROS thì protein bị peroxid hóa có thời gian tồn tại dài hơn

do đó chúng có thể khuyếch tán trong tế bào và mô trong thời gian dài vì thế chúng có thể phản ứng với các phân tử protein khác và khơi mào cho phản ứng dây chuyền (phản ứng 1.6) Protein hydroperoxid có thể khơi mào cho nhiều phản ứng nguy hiểm cho tế bào như oxy hóa lipid, phản ứng với methionin, bất hoạt glutathion reductase và liên kết chéo với ADN

Các protein bị hư hại bởi gốc tự do dẫn đến sự rối loạn chức năng của nhiều cơ quan trong cơ thể Ví dụ, sự hư hại các protein collagen ở da, gây tổn hại da; hay các enzym (bản chất là protein) khi bị tổn hại sẽ không hoạt động hiệu quả để xúc tác các phản ứng sinh hóa trong cơ thể Các enzym sẽ không được sửa chữa phục hồi vì nồng độ các gốc tự do cao, tình trạng này dần dần làm cơ thể lão hóa nhanh hơn và có thể tạo ung thư

 Sự phá huỷ ADN

Các gốc tự do dễ dàng tấn công ADN thông qua việc tấn công vào nhóm đường deoxyribose và base nitơ của nhóm purin và pirimidin hình thành thể đột biến Đột biến gen do tác động của gốc tự do ở mức độ thấp trong các mô khỏe mạnh vì trong cơ thể khỏe mạnh có các enzym sửa sai thường xuyên loại

bỏ những điểm hư hỏng trên ADN Sản phẩm của đột biến gen do gốc tự do gây ra được tìm thấy nhiều trong mô ung thư

Như vậy, gốc tự do ảnh hưởng đến đoạn ADN ở vị trí đặc biệt nào đó hoặc đến một đoạn gen làm cho gen đó thoát khỏi hệ thống sửa chữa trước khi

sự sao chép xuất hiện dẫn đến đột biến gen Đồng thời, các tổn thương do gốc

tự do gây ra cũng làm cho ADN sao mã không chính xác làm cho tế bào ung thư được hình thành hoặc làm kiệt quệ năng lượng của tế bào dẫn đến hoại tử mô

 Quá trình lão hóa

Lão hóa là một quá trình phức tạp trong đó các tổn hại do oxy hóa đóng vai trò rất quan trọng Denham Harman (1956), lần đầu tiên đề xuất ra thuyết lão hoá bởi các gốc tự do Hiện tại nó được xem như là một thuyết quan trọng

về sự lão hoá: Tích tuổi - già hóa là hậu quả tổng hợp của tất cả các tổn thương xuất hiện và phát triển trong các tế bào, tổ chức cơ quan do gốc tự do gây ra Các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào tạo ra các gốc tự do hoạt động,

các gốc này nhanh chóng phản ứng với các phân tử quanh nó là nguyên nhân chính gây xáo trộn hoạt động của các ty lạp thể, bám vào các ADN gây đột biến bên trong các tế bào Vì thế, các gốc tự do là nguyên nhân của sự tự hủy hoại và lão hóa ở cấp tế bào Các phân tử collagen bị các gốc tự do gắn vào làm cho cấu trúc căn bản của collagen bị xáo trộn Collagen là loại protein phổ biến nhất trong cơ thể giúp duy trì sự toàn vẹn của chất nền, gân

cơ, dây chằng, sụn khớp… Collagen cũng hỗ trợ cho cấu trúc da và thành mạch máu Các tế bào của mô liên kết chịu trách nhiệm tổng hợp và trùng tu collagen cũng bị hư hại nên da mất dần tính đàn hồi nên các vết nhăn xuất hiện Do mô liên kết là cái nền chung cho phần lớn các loại mô trong cơ thể nên ảnh hưởng của các gốc tự do trong sự lão hóa của cơ thể là rất lớn

Như vậy, lão hóa là quá trình tích tụ những sai lệch do gốc tự do gây ra, làm cho mô ở người lớn tuổi không còn mềm mại Đây chính là nguyên nhân gây nên các bệnh mãn tính như tim mạch, tiểu đường, ung thư Các chất chống oxy hóa như vitamin C, vitamin E ngăn các gốc tự do tấn công các đại phân tử, làm chậm quá trình lão hoá

1.2.2 Các chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại

và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Chất chống oxy hóa có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc tự do mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản ứng dây chuyền được khơi mào bởi các gốc tự do Chất chống oxy hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzym xúc tác cho các quá trình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể

Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguổn gốc, cấu trúc của chất chống oxy hóa Một trong những cách đó là dựa trên bản chất enzym hoặc không enzym của chất chống oxy hóa

Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguổn gốc, cấu trúc của chất chống oxy hóa

Các chất chống oxi hóa được dùng trong thực phẩm phải đảm bảo các yêu cầu sau:

+ Tăng khả năng ổn định về chất lượng thực phẩm Hạn chế hoặc loại

bỏ các quá trình oxy hóa

+ Bảo tồn các giá trị dinh dưỡng cơ bản của thực phẩm

+ Các giá trị cảm quan của thực phẩm phải được giữ nguyên

+ Quá trình sử dụng những chất này phải tiện lợi, chi phí thấp

Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc, cấu trúc của chất chống oxy hóa.Các chất chống oxy hóa thường dùng trong thực phẩm ( phân theo nguồn gốc):

1.2.2.1 Chất chống oxy hóa tự nhiên

trong thực phẩm và được chấp nhận cho sử dụng ở nhiều nước trên thế giới.Vitamin E được tìm thấy trong ngũ cốc, hạt dầu, và cũng được tìm thấy trong rau,sữa và bơ

Phân loại

Trong số các tocopherol được tìm thấy trong tự nhiên, các loại α, β, γ

và δ-tocopherol là các loại phổ biến nhất và tất cả đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa

Cơ chế, chức năng:

Chống oxy hóa, chống lại tác dụng của các gốc tự do Những gốc tự

do này được tạo thành từ những quá trình chuyển hóa bình thường hay dưới tác động của những nhân tố xung quanh

Vitamin E có khả năng ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách nhường một nguyên tử hydro của gốc phenol cho gốc lipoperoxide (LOO) để biến gốc tự do này thành hydroperoxide (LOOH)

1.2.2.2 Chất chống oxy hóa tổng hợp Các chất chống oxy hóa tổng hợp phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Không độc

- Có hoạt tính chống oxy hóa cao ở nồng độ thấp

- Có thể tập trung được trên bề mặt pha dầu

- Bền trong các điều kiện kỹ thuật của quá trình chế biến thực phẩm

Các chất chống oxy hóa tổng hợp thường được sử dụng là: BHT (butylated hydroxytoluen), BHA (butylate hydroxyanisole), tocopherol tổng hợp, TBHQ (terbutyl hydroquinone), dodecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate,

 BHT (butylated hydroxytoluen)

Còn được gọi là 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene;

methyl-di-tertbutylphenol; 2,6-di-tert-butyl-para-cresol BHT được tạo thành phản

ứng của p-cresol (4-methylphenol) với isobutylen (2-methylpropene) xúc tác bởi acid sulfuric

Công tức phân tử: C15H24O

Bột màu trắng

BHT ngăn ngừa oxy hóa chất béo Nó được sử dụng để bảo quản thực phẩm có mùi, màu sắc và hương vị

 BHA (butylate hydroxyanisole)

BHA là một hỗn hợp của các đồng phân hydroxyanisole và 2-tert-butyl-4-hydroxyanisole

3-tert-butyl-4-Công thức phân tử: C11H16O2

Màu trắng hoặc hơi vàng

Mùi thơm đặc trưng

BHA thường được sử dụng để giữ chất béo khỏi bị ôi

BHA được tìm thấy trong bơ, thịt, ngũ cốc, kẹo cao su, đồ nướng, thực phẩm snack, khoai tây khử nước và bia Nó cũng được tìm thấy trong thức

ăn động vật, bao bì thực phẩm, mỹ phẩm, sản phẩm cao su và các sản phẩm đầu khí

 TBHQ (tertbutyl hydroquinone)

TBHQ là một chất chống oxy hóa được dùng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, cao su, đặc biệt là trong bảo quản các loại dầu và chất béo Nó còn được sử dụng như một chất ổn định để hạn chế sự trùng hợp tự động của các peoxit hữu cơ

 Các chất hỗ trợ chống oxy hóa

Những chất có khả năng tăng cường hoạt tính chống oxy hóa gọi là chất hỗ trợ chống oxy hóa Các chất này có thể cô lập hay loại bỏ các ion kim loại nặng, giúp ngăn chặn quá trình oxy hóa chất béo hoặc chúng có thể hoạt động như các tác nhân khử giúp khôi phục hoạt tính của các chất chống oxy hóa

Các chất hỗ trợ chống oxy hóa thường dung trong thực phẩm bao gồm: + Leucithin

+ Phương pháp DPPH (Scavenging ability towards DPPH radicals): Khả năng khử gốc tự do DPPH

+ Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity): xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động

+ Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): Khả năng chống oxi hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

+ Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): lực chống oxi hóa bằng phương pháp khử sắt

+ Phương pháp reducing power: lực chống oxy hóa bằng phương pháp khử Fe

+ Phương pháp FTC: (ferric thiocyanat ):

+ Phương pháp Conjugated Diene: khảo sát nối đôi liên hợp

 Phương pháp TEAC:

Cation ABTS+ sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm Khi cho chất chống oxi hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxi hóa sẽ khử ion này thành ABTS Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxi hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox [6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid] Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối

[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6- Phương pháp DPPH:

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H), có màu vàng Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa

Hình 1.4: Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxi hóa

 Phương pháp ORAC:

Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxi hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxy Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxi hóa cần xác định hoạt tính Khi fluorescein bị oxi hóa, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất oxi hóa vào Khi có mặt chất chống oxi hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu

Ưu điểm của phương pháp ORAC là xác định được có hoặc không có

sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxi hóa Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxi hóa

có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều

Hình 1.5 : Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian

 Phương pháp TRAP:

Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxi hóa Quá trình oxi hóa này được

2,2’-đo đạt thông qua hàm lượng oxi tiêu thụ bằng một điện cực Khi có mặt chất chống oxi hóa trong môi trường plasma, quá trình oxi hóa sẽ xảy ra chậm hơn Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng

 Phương pháp (FRAP):

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxi hóa có trong nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene)

Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxi hóa, các chất chống oxi hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ Kết quả tính toán là mmol Fe2+/ g chất khô Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng

đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện tử là cao Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxi hóa có thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP

 Phân tích lipid:

Phương pháp này đánh giá sự khác biệt trong tốc độ oxi hóa acid linoleic bởi gốc ABAP trong mối quan hệ với chất chuẩn là tocopherol Trước và trong suốt quá trình xảy ra phản ứng, nhiệt độ của hỗn hợp[70 µL of linoleic acid (2,3 mmol/L)]; 100 mL đệm phosphate 0,05M (Natri phosphate hòa tan trong nước; 2.88 g SDS; pH 7.4)} được điều chỉnh và duy trì ở 40oC Lấy 2µl của dung dịch này cho vào 0,01 ml ABAP(0,04M) Sau 2-5 phút phản ứng, lấy 0,02 ml dịch trích ly cho vào hỗn hợp này Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở 236nm Xây dựng đường chuẩn

Thị Việt Hoa et al., 2007) Sử dụng ethanol để hiệu chỉnh máy quang phổ về

vạch 0

 Tổng năng lực khử:

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxi hoá trong việc khử phức

K3Fe(CN)6 thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành

K3[Fe(CN)6] (xanh Pruss) Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxi hóa có trong nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690nm

 Conjugated Diene:

Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự peroxide hóa lipid của chất kháng oxy hóa

Bảng 1 Tóm tắt các đặc điểm các phương pháp đo

hoạt tính kháng oxy hóa

STT Phương

pháp

Đặc diểm phương pháp

Trang thiết

bị

Tính khả thi trong các hệ thống sinh