* X ác định cấu trúc hoá học của các hợp chất tinh khiết phàn lập được bằng các phương pháp vật lý hiện đại.* Đánh giá hoạt tính chống sốt rét in vitro của các hợp chất sản phẩm phân lậ
Trang 2TS Lê Đình Công V iện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùn2
TS N guyễn Duy Sỹ V iện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùns
TS Trươns Văn Như V iện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng
TS Đoàn Hạnh Nhân V iện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùns
TS N ông Thi Tiến ơ • V iên Sốt rét, Ký sinh trùn? và Còn trùng • J '— '
c-H À N Ộ I - 2000
Trang 3GS TSKH Phan T ốn s Sơn ữ Trường Đại học Khoa học tự nhiên <_• .
Đại học Quốc 2ia Hà N ội
TS Lê Đình c ỏ n s Viện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùng
TS N guyễn Duy Sỹ Viện Sốt rét, Ký sinh trùn" và Côn trun'
TS Trưons Văn Như Viện Sốt rét, Ký sinh trùns và c ỏ n truní
TS Đoàn Hạnh Nhân Viện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùn'
TS N ông Thi Tiến V iện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng
4 C ác m ục tiê u của đề tà i
* Tìm ra một số loài cây thuốc của V iệt Nam có hoạt tính mạnh in vitro
chống ký sinh trùn? sốt rét.
* Phân lập từ các loài cây này một số sản phẩm thiên nhiên có hiệu lực
in vitro rõ rệt chống ký sinh trùng sốt rét và xác định cấu trúc hoá học
của chúng.
5 C ác n ội d u n g n g h iê n cứu chủ yếu của đề tà i
* Khảo sát sự đáp ứnơ in vitro của ký sinh trùns sốt rét P ỉasm odiu m
ỷ'alcipam m đôi với một sô cây thuốc V iệt Nam.
* Phàn lập tinh khiết một số sản phẩm thiên nhiên ch o kết quả dương
trong các thử n sh iệm tác dụns chống sốt rét in vitro.
>g
Ig
1
Trang 4* X ác định cấu trúc hoá học của các hợp chất tinh khiết phàn lập được bằng các phương pháp vật lý hiện đại.
* Đánh giá hoạt tính chống sốt rét in vitro của các hợp chất (sản phẩm)
phân lập được.
Các kết quả đạt được
Đã khảo sát in vitro về tác duns chống ký sinh trùn2 sốt rét Plasmoclium
f'alciparum - chủng nhậy cũ n s như chủns kháng với chloroquine - của
13 loài cây thuốc V iệt Nam , gồm phần lớn các cày thuốc được dùng trons y học dân gian của V iệt Nam để chữa sốt rét, theo phươns pháp
của s Thai thong, G H Beale và M Chutmonckonkul [T ra n s R Soc
Trop Mecl Hyg 77, 228 (1983)] Bốn trons sô các loài càv nàv đã thể
hiên rõ rệt hoat tính ch ôn2 sốt rét tronơ các thừ n sh iêm này, đó là các cây Thườn2 sơn (Dichroa fe b r ifu °a Lour., Saxifrasaceae), Cúc liên chi
dại (.Parthenium hysterophorus L., Asteraceae), Đ a đa (H arrisonia
p e iý o ra ta (Blanco) Merr., Simaroubaceae) và Khổ sâm (Croton tonkinensis G asnep., Euphorbiaceae).
Từ lá Khổ sâm (■Croton tonkinensis G asnep.) đã phân lập được một ditecpenoid mới thuộc kiểu ent-kauran Cấu trúc của chất này la 7 a -
hidroxi-18-axetoxi-£Aư-kaur-16-en-15-on đã được xác định chắc chắn bằng các phổ 'H và 13c N M R , DEPT, ‘H^H COSY, HM QC, HMBC,
N O E D Kết quả đánh giá tác dụng chốnơ sốt rét cho thấv hợp chất này
có hoạt tính rõ rệt in vitro chống các dòng nhậy cũn2 như d ò n s kháng
vói chloroquine của P ỉasm odiu m ỷalciparu m
N goài ra còn phân lập được hai sản phẩm thiên nhiên nữa có hoạt tính
chốnơ sốt rét in vitro rõ rệt từ cây Đ a đa (H arrìsonia p e r fo r a ĩa (Blanco) Merr.) và Khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.).
Đ ề tài đã có bốn công trình côn g bố ở trong và ngoài nước M ột luận án Thạc sĩ hoá học đã được hoàn thành trong khuôn khổ đề tài.
Trang 57 T in h h ìn h k in h p h í của để tà i
Tổng kinh phí được cấp: 60.000.000 đồng (chia làm hai năm 1998 và
1999, mỗi năm 30 triệu đ ổ n s)
Đã quyết toán xong toàn bộ.
Các khoản chi của đề tài đã được phán bổ như sau:
119 Nguyên liệu, hoá chất, dụns cụ 15.840.500 2 6 4 0
T òn g cộ n g 6 0 0 0 0 0 0 0 99.98 (tức 100)
Kinh phí của đề tài Đ ặc biệt Đại học Quốc gia Q G -98-05 là hết sức quý giá đối với đề tài, vì nhờ đó c ô n s trình nshiên cứu có ý n sh ĩa về khoa học và thực tiễn này đã được hoàn thành có chất lượn2
Về tình hình kinh phí của đề tài, có hai đặc điểm:
1) Chi phí cho v iệc sử hoạt tính chốns P ỉ a s m o d i u m ỷ a ỉ c i p a r u m rất cao, do cần đến các điều kiện và hoá chất đặc biệt (xem kinh phí cho m ột mẫu thử MIC và IC50 ở phần phụ lục, đề tài đã phải thử nhiều mảu như
3
Trang 62 H ead of the project
Prof Dr Sc Phan T ons Son
3 M ain participating scientists
Prof Dr Sc Phan T ons Son
A ss Prof Dr Van N s o c Huonek— V—
Dr Phan M inh Gian.c
C ollese of Natural ScienceVietnam National Um versity Hanoi (V N Ư )
C-C ollese of Natural Science Vietnam National U niversity, Hanoi (V N U )
VN U
VN U
E v a l u a t i o n o f t h e e f f e c t i n v i t r o a g a i n s t m a l a r u i ì p a r a s i t e :
Dr L e Đinh Cong Insntute o f M alanolos}7, Para5itolog\
and Entomolo£TV' ƠMPE)
Dr N s u y e n Duy Sv IMPE
4 O bjectives o f the project
* T o fmd som e V ietnam ese m edicinal plants havmơ sư on g eữ ects in
viti'o against malarial parasites.
* To ìsolate from these plants som e natural Products vvhich shov
remarkable anúm alanal activities in vitro and to determine theư
chemical sưucture.
4
Trang 75 M a in research contents o f the p ro je c t
* ỉn vitro study on the response o f the malarial parasite Pỉasm odiu m
ị'alcipanim to a number o f V ietnam ese medicinal plants.
* Isolation o f pure natural products from plants \vhich show positive
results in the in vitro tests for antimalarial efficacv.
* Determination o f the chem ical structure o f the isolated pure compunds
by m odem physical methods.
* Evaluation o f the antimalanal effects in vi tro o f the isolated
com pounds (products).
6 S tu d y resu lts
Thirteen V ietnam ese m edicinal plants, consistin s o f the sreater part of plants used in the V ietnam ese folk m edicine to treat malaria, vvere studied by the method o f s Thaithons, G H Beale and
M Chutmongkonkul [Trans R Soc Trop Med H v° 77 228 (1983)] on the efficacy in vitro against the chloroquine sensitive as well as the chloroquine resistant strains o f the malarial parasite Plasmodium
ỷaỉciparum Four o f them show ed clear antimalarial effects in these testr
nam ely D ich roa febrifu ga Lour (Saxiữ agaceae), Parthenium hvsterophorus L (A steraceae), H arrisonia perforata (Blanco) Merr
(Sim aroubaceae) and C roton tonkinensis Gagnep (Euphorbiaceae).
From the leaves o f Croton tonlcinensis Gasnep a new ể^r-kaurane type
diterpenoid was isolated Its structure has been unam bisuously established by 'H and 13c N M R , DEPT, ‘H-'H COSY, HMQC, HMBC,
N O ED spectra as 7a-hydroxy-18-acetoxy-ểf2f-kaur-16-en-15-one
Antimalarial evaluation o f this compound show ed a remarkable effect in
vitro on the chloroquine sensitive as w ell as the chloroquine resistant
Trang 8XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ N H IỆM KHOA CH Ủ TRÌ ĐỂ TÀI
CHỦ NHIỆM KHOA HOÁ HỌC
PGS TS NGUYỂN XUÂN TRUNG
XÁC NHẬN CỦA Cơ QUAN CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI
CiS TSKH PHAX TỐNG SƠN
6
Trang 99 9
11
111111
11 11
12121216
17
17
1717
18
19
19
20 20
2122
P H Ầ N C H ÍN H B Á O C Á O
Lời mở đầu
N ội dung và kết quả nghiên cứu
Phương pháp tiếp cận
H oat tính in v itr o c h ố n g k ý sin h trùng sốt rét
Plasmodium/alciparum của một số cây thuốc Việt Nam
Nguyên liệu
Mẫu thực vật
Chủns ký sinh trùnơ
Phương pháp nghiên cứu
Điểu ch ế phần chiết của mẫu thực vật
Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu nuôi và thử hoạt tính
Kết quả và nhận xét
Tóm tắt kết quả chính của mục 2.2
Phân lập và khảo sát cấu trúc hoạt chất
Phân lập và khảo sát cấu trúc hoạt chất từ lá khổ sâm
( C ro ĩo n to n k in e n s is G a g n ep , E u p h orb iaceae)
N guyên liệu thực vật
Phương pháp và thiết bị
Phân lập và khảo sát cấu trúc hoạt chất
Sự đáp úng in vitro của ký sinh trùng sớt rét Plasmodiiữĩi
/a lc ip a n ơ n đôi với 7a-hidroxi-1 S-axetoxi-^ư-kaur-16-erì-15-on
Phân lập các sản phẩm khác có hoạt tính chông
Trang 101 L Ờ I M ỏ Đ Ầ U
Vấn đề nghiên cứu các thuốc mới đê điều trị bệnh sốt rét có một tầm quan trọng đặc biệt Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (W orld Health Organisation, W H O ) ký sinh trùng sốt rét 2ây ra nhiều bệnh hoạn và tử vong hơn bất cứ tác nhân gây bệnh nơười nào khác đã được biết đến [1] Hiện nay ký sinh trùng sốt rét còn đang đe dọa khoảng một nửa dân số thế giới và ước tính có tới trên 20 0 triệu người mấc bệnh sốt rét kinh niên, và mỗi năm có khoảng 150 triệu ca bệnh mới [2] ơ Mệt Nam bệnh sốt rét một lần nữa lại trở thành một căn bệnh phổ biến Bệnh 2ây ra bởi ký sinh
trùns; Plasm odiu m /a lc ip a ru m chiếm 70 đến 80% các ca bệnh sốt rét Loài
ký sinh trùng này thể hiện tính đề khán2 ngày cà n s tăns đối với
chloroquine cũng như đối với các thuốc chống sốt rét mới và sự phối hợp các thuốc Vì vậy song song VỚI việc nghiên cứu các vacxin chòng sốt rét, rất cần tìm kiếm các tác nhân điều trị hoá học mới với cơ ch ế tác dụng mới Thực vật là nguồn cung cấp nhiều tác nhàn điều trị hoá học chống sốt
rét có hiệu quả cao, mà quinin (phân lập từ các loài C inclìona Rubiaceae)
và artemisinin (từ cây Thanh cao hoa vàng (.Artemisia a n n u a , Asteraceae) là
những thí du điển hình nhất Vì vây hướng nshiên cứu tìm kiếm các thuốc chống sốt rét m ói từ nguồn tài nsuvèn thực vật được siớ i khoa học quốc tế rất quan tâm [3,4].
Y học dân tộc của V iệt Nam sử dụns nhiều loài cây vào việc điều trị bệnh sốt rét [5,6] Trong nhữns năm gần đày nhiều cơ sở tập truns nghiên cứu chiết xuất artem isinin từ cây thanh cao hoa vàng V iệc nghiên cứu tìm kiếm các thuốc chống sốt rét mới từ các loài thực vật khác còn chưa được đẩy mạnh M ột vài nơi, như V iện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng, có thử thăm dò tác dụng của m ột vài cây được dùng chữa sốt rét, nhưng khống phân lập hoạt chất.
Đ ề tài này đã tiến hành khảo sát in vitro về tác dụng chông ký sinh trùng sốt rét P la sm o d iu m ỷalciparum của một sô loài cây thuốc V iệt Nam ,
bao gồm một phần khá lớn các loài đã được y học dân tộc của V iệt Nam sử dụng điều trị sốt rét; trên cơ sở các kết quả nhận được đã chọn ra loài cây thích hợp từ đó phân lập hoạt chất để khảo sát về các m ặt cấu trúc hoá học
và hoạt tính sinh học Đ ề tài đã đóng góp những kết quả nghiên cứu mới
8
Trang 11cho lĩnh vực nghiên cứu các chất thiên nhiên có hoạt tính chôn 2 ký sinh
trùng sốt rét từ nguồn thực vật V iệt Nam.
2.1 P hư ơng p h á p tiế p cận
Công trình nghiên cứu đã được tiên hành theo một phươns pháp tiếp cận hiện đại V iệc phân tách các hỗn hợp và phân lập các họp chất được thực hiện theo con đường "được hướns dẫn bời các phép thừ sinh học” (Bioassay-guided isolation o f Natural Products), với việc sử dụnơ các phương pháp phân tách hiện đại (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột sắc ký cột nhanh, sắc ký lỏnơ trunơ áp, sắc ký lỏnơ hiệu lực cao) V iệc khảo sát cấu trúc hóa học được thực hiện nhờ các phươns pháp vật lý hiện đại (phổ khối lượng, phổ hồng ngoại, phổ cộnơ hường từ hạt nhân proton và cacbon 13 một chiều và hai chiều).
V iệc thử hoạt tính chốnơ ký sinh trùnơ sốt rét đã được tiến hành một cách chuẩn xác vói sự tham gia và cộnơ tác chặt chẽ của V iện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng.
Chúng tôi đã xây dựns phương pháp chuns nshiên cứu các cây thuốc được dùng trons y học dân tộc cuả V iệt Nam để điều trị bệnh sốt rét được nêu ở Sơ đồ 1 (không có phần N sh iên cứu lâm sàng nêu trons sơ đồ) để áp dung trong khuôn khổ đề tài này.
9
Trang 12Sơ đồ 1: PHƯƠNG PH ÁP C H U N G N G H IÊ N c ứ u
các cây th u ố c d ù n g tro n g y học dàn tộc của V iệ t N a m
đê điểu t r ị bệnh sốt ré t
10
Trang 13N g u y ê n liệu
M ẫu thực vật
Đ ã tra cứu các tài liệu y dược học dân tộc của V iệt Nam về các cây đã được nhân dân sử dụng điều trị sốt rét1 để chọn ra các cây dùns cho nghiên cứu Mẫu thực vật đã được GS Vũ Văn Chuyên, Trườns: Đại học Dưọc, và
TS Trần N gọc Ninh, V iện Sinh thái và Tài nsuvẻn Sinh vặt Truns tàm Khoa học tự nhiên và C ôns n sh ệ quốc gia, giám định Đã dùns đúng bộ phận cây d ù n g làm thuốc để điều ch ế phần chiết.
Chúnẹ Ả.T sinh tnìno
Các ch ú n s ký sinh trùng sốt rét Plasmodium fa lc ip a ru m do Viện Sốt
rét, Ký sinh trùns và Côn trùns cu n s cấp, gồm:
Chủns nhậy với chloroquine của Thái Lan (T966),
Chủns kháng với chloroquine của Thái Lan (K I),
Chủns; kháns với chloroquine của V iệt iNam (F25).
P h ư ơ ĩ i g p h á p n g h i ê n c í a i
Điều c h ế p h ần chiết của mấu thực vật
Mẫu-thực vật sau khi diệt men được thái nhỏ? sấy khò ờ 4 5 ° c , rồi xay thành bột m ịn2 Lấy 50g bột nguyên liệu khô, đun hồi lun cách thuỷ với 70m l etanol 96% trons 7 giờ, rồi thu lấy dịch chiết, ô n lại quá trình chiết vói etanol n ó n s này thèm hai lần nữa Gộp các dịch ch iết lại với nhau, cất loại dung m ôi trên bếp cách thuỷ, cuối cùng sấy khô ở nhiệt độ thấp (-70°C)
đến khi khô ròn, thu được phần chiết etanol Càn p h in chiết này và tính
hiệu suất so với khối lượns của n su yên liệu khô.
Tiến hành tương tư, nhưn.s dùng nước cất làm dung m ỏi, ta thu đượcc, • 7 1—• ^ —
phần chiết nước của mẫu thực vật.
2.2 H oạt tính in vitro c h ỏ n g ký sinh trùng sốt rét P la sm o d iu m
ý a lc ip a r u m củ a một sò cày thu ốc Việt N am
1 Trừ các cây Cúc liên chi dại và Hà thủ ô Griffith.
2 Ri êng lá Thưcmơ sơn đã được phơi khò rồi rửa sach băng rươu trước khi sấy khô và xay
thành bột.
Trang 14Chuẩn bị mẫu nuôi và thử hoạt tính
N uôi cấv Plasm odiu m / 'alciparum liên tục tronc m ôi trườns đầy đủ (gồm R PM I1(W0, G entam ycin, Hepes, duns dịch NaHCO? 5% và 10% huyết
thanh nơười) theo phươnơ pháp bình nến của w Traser và J B Jensen [7,8].
Sau đó tiến hành khảo sát sự đáp ứns của P lasm odiu m /a lc ip a ru m đối
với các du ns dịch thử (mẫu thử) theo phươns pháp của s Thaithonc, G H Beale và M C hutm onskonkul [9] Các thử nshiệm được tiến hành trẽn phiến nhựa 96 lỗ Mật độ ký sinh trùng được đưa vào khi thử thuốc là từ 0,4 đến 0,7% hồng cầu nhiễm Hematocrit 5% Sau 24 21Ờ và 48 2ĨỜ thay môi trường m ói không có thuốc (với ống chứns) hoặc mòi trirờns có nống độ thuốc tương ứng Sau 72 siờ lấy ra làm lam siọ t mỏnơ N huộm G iem sa, soi trên kính hiển vi và đếm để xác định tỷ lệ hồng cầu nhiễm ký sinh trùng.
M ỗi mẫu thử được thử tối thiểu 3 lần Nếu kết quả không giống nhau thì thử nghiệm được tiến hành lại đếm số lượng ký sinh trùng / 10 0 0 0
hổng cầu để xác đinh MIC (M inim um Inhibitory Concentration).
Có thử đối chứng với các dung m ôi hoà tan các phần chiêt.
K ế t q u ả và n h ậ n x é t
Kết quả chiết các mẫu thực vật được nêu ở bảng 1.
Trang 15Khối lượn 2
mẫu (g)
Chiết bằns etanol Chiết bầng nước
Ký hiệu mẫu
Khối lượng phần chiết (g)
Hiệu suất (^ y 1
Ký hiệu mẫu
Khỏi lượng phần chiết (g)
Hiệu suất (%)'
1 Dây ký ninh
(Tinosporu crispa L Miers.)
Thân dày leo
Trang 16Đ ể điều chê các dung dịch gốc, đã hoà tan các phần chiết trons dung môi thích hợp tương ứng, như etanol, đimetyl suníoxit (D M SO ) nước, hoặc hoà tan ngay trong môi trường RPM I1640 (xem bảns 4) Ảnh hưởns của etanol và của DMSO lên sự phát triển của ký sinh trùns Plasmodium
ị'alciparum đã được khảo sát và nêu ờ các bản 2 2 và 3.
Bảng 2 Ảnh hưởng của etanol lên sự phát triển cùa
P la s m o d iu m /a lc ip a r u m
Nồng đô etanol Mât đô k\ . / sinh trùns {% hổns cầu nhiẻm)
trong môi trường Chủng T966 Chủns KI Chủns F25
Nồng độ DMSO Mật độ ký sinh trùng {% hồns cầu nhiễm)
trong môi trường o w Chủng T966 Chủns KI Chủng F25
Bảng 4 tổng hợp các kết quả khảo sát sự đáp ứ n s của Plasm odium
ị'alciparum đối với các dung dịch thử (mẫu thử), với các số liệu MIC nhận
được thông qua việc khảo sát sự đáp ứng đối với các mẫu thử có nồng độ giảm dần.
14
Trang 17Bảng 4 S ự đáp ứ n g của P la s m o d iu m /a lc ip a r u m đối với các mảu thư
Trang 18nước lá Thường sơn) là có tác dụng rõ rệt đối với Plasm ođium ỹalciparum
cả chủng nhậy lẫn chủng kháng, MIC = 2,5 Ịig/ml Mẫu 7b (phần chiết nước lá Đa đa) ức chế sự phát triển của ký sinh trùns ở nồns độ 60|W m l- mẫu 6 b (phần chiết nước lá Cúc liên chi dại) ờ n ồn s độ lOOus/ml Các phần chiết nước khác cần nồng độ cao hơn để ức ch ế sự phát triển của ký sinh trùng.
Trong số các phần chiết etanol, các mẫu thử 3a (phần chiết etanol lá Hồng bì núi, MIC = 2 0 0 |ig /m l), 4a (phần chiết etanol lá Na, MIC =
3 00|ig/m l), 8a (phần chiết etanol vỏ Cây sữa, MIC = 500ụ g/m l), 9a (phần chiết etanol rễ Hà thủ ô đỏ, MIC = 1.000u g/m l) lOa (phần chiết etanol hoa
và lá Cỏ roi ngựa, MIC = 500jag/ml) và 12a (phần chiết etanol rễ Hà thù ô Griffith, MIC = 5 0 0 |ig /m l) đều có MIC ở n ồ n s độ trùns với non? độ ức chê của dung m ôi (etanol hoặc DM SO, xem các bảnơ 2, 3 và 4) vì vậy khỏn^ thể được xem là có tác dụng.
Các mẫu thử la (phần chiết etanol thân Dây ký ninh, MIC = 100- 200uơ/m l), 5a (phần chiết etanol lá lẫn n sọ n Ngải cứu, MIC = 200ịig/rnl)
và 1 la (phần chiết etanol ruột Thảo quả, MIC = 150-200uơ/m l) thể hiện tác dụng ức ch ế ký sinh trùng, tuv khônơ thật mạnh.
Các mẫu thử 2a (phần chiết etanol lá Thường sơn, MIC = 0 ,5 uơ/m l),
6a (phần chiết etanol lá Cúc liên chi dại, MIC = 30u 2/m l), 7a (phần chiết etanol lá Đa đa, MIC = lS u s /m l) và 13a (phần chiết etanol lá Khổ sâm,
MIC = 62,5|ig/m l) có tác dụng ức chế rõ rệt sự phát triển của Plasm odium / 'alciparum, cả chủng nhậy lẫn chủng kháng.
T óm tắ t k ế t q u ả chính củ a m ụ c 2.2
Đã khảo sát in vitro về tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét
Pỉasmodium /a lc ip a r u m (chủng nhậy và chủng kháng với chloroquine) của
13 loài cây thuốc V iệt Nam K ết quả cho thấy phần chiết etanol của các
mẫu thực vật có tác dụng ức c h ế in vitro đối với Plasm odiu m f.alciparum
mạnh hơn so với phần chiết nước tương ứng Cả phần chiêt etanol lẫn phần
chiết nước của lá Thường sơn (D ich roa febrifiiga Lour.) đều có tác dung
manh lên chủng nhậy cũng như chủng kháng với chloroquine Các phần
chiết etanol của lá Cúc liên chi dại (p a rth en iu m h ysterophorus L.), lá Đa đa
16
Trang 19(H arrisom a p e r /o r a ta (Blanco) Merr.) và lá Khổ sâm (C roĩon ĩonkinensis
Gagnep.) cũng thể hiện hoạt tính lìì vi tro rõ rệt lèn P ỉasm odiu m /alciparu m ,
cả chủng nhậy lẫn chủng kháns với chloroquine.
2.3 P hân lậ p và k h ả o sát cấu tr ú c hoạt chất
P hân lập và k h ảo sát cấu trúc hoat chất từ lá K h ổ sâm (Croton
to n k in e n sis G a g n ep , E u p h o rb ia cea e)
Sau khi cân nhắc dựa trên cơ sở hoạt tính, dược lý học dãn tộc, ncuổn nguyên liệu và hiệu suất các phần chiết, chúns tôi đã chọn lá Khổ sâm làm nguyên liệu để tiến hành phàn lập hoạt chất.
N g u y ê n l i ệ u t h ự c v ậ t
Lá cây Khổ sâm (Croton tonkinensis G asnep.) được thu thập ờ ngoại
thành Hà N ội tronơ thời kỳ cây đan 2 ra hoa Mẫu thực vật đã được TS Trần
Ngọc Ninh, V iện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Truns tàm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, siám định.
P h ư ơ n g p h á p v à t h i ế t b ị
Độ quay cực được đo trên máy Polartronic D (Schmidt T Haensch).
Các phổ hổng ngoại (LR) được shi trên thiết bị Nicolet Impact-410 FT-IR Spectrometer (viên nén KBr).
Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H N M R (400M H z) và 13c NM R (100M H z) được ghi trên thiết bị A M X -400 spectrom eter trong CDCI3, các
độ chuyển dịch hoá học (5) được thôns báo bằng ppm với các tín hiệu cua dung môi làm chất chuẩn nôi Đã tiên hành các khảo sát phổ NM R một chiều (*H N M R , 13c N M R , DEPT, NO ED) và hai chiều (CO SY , HMQC và HMBC).
Các phổ khối lượng (EIM S) được ghi trên thiết bị MS 9 0 2 Spectrometer Silica gel (M erck 6 0 -1 0 0 |im ) được dùng cho sắc ký cột (C Q , và silica gel (Merck 15-40p.m) được dùns; cho sắc ký cột nhanh (F Q sắ c ký lớp m ỏng (TLC) được thực hiện với các bản silica gel tráng sẵn (M erck D C -A lufolien
Trang 20P h â n lập và k h ả o sá t cấu trú c h o ạ t chất
Sau khi hong khô ngoài không khí, lá cây Khổ sâm được sấv ờ 4 0 ° c đến khô ròn, rồi xay thành bột Bột lá khô này được chiết chọn lọc với các dung môi khác nhau để thu các phần chiết tươns ứns Các phấn chiết được phân tách nhiều lần bằng sắc ký cột và sắc ký cột nhanh trên silica gel với các hệ dung m ôi rửa giải có độ phân cực tãns dần Đ ể định hướns cho việc
phân lập, một số phân đoạn đáns lưu ý đã được thừ hoạt tính in vitro ch ôn2
ký sinh trùng P la sm o d iu m ỷ a ỉc ip a ru m (B io a ssa y -g u id ed fraction ation ).
Kết quả đã phân lập được - bên cạnh nhiều hợp chất khác - chất ditecpenoid mới 1.
Chất rắn vô định hĩnh
[ a]D16 -1 2 1 °(c 1.0, CHC13)
HR-EIMS: m /z 360,2311 (M + )
(Tính được cho C „ H 3-,04 360,2300) EIMS m/z (cường độ tương đối): 360 (15), 332 (8), 269 (10), 227 (6), 161 (11), 135 (27), 105 (61), 91 (5 9 ), 67 (59), 55 (73), 43 (100), 41 (72), 39 (56).
IR: v m3X (cm -1) 3 482, 1735, 1729, 1649, 1387, 1367, 1252.
Cấu trúc của ditecpenoid m ới này đã được khẳnơ định là 7a-hidroxi- 18-axetoxi-e/?f-kaur-16-en-15-on (1) nhờ các khảo sát kỹ lưỡng về phổ Cộng hưởng từ hạt nhân:
‘H NM R, N M R , DEPT 90, DEPT 135, ‘H ^H COSY, HMQC, HMBC, các thí nghiệm N O E D
Hóa học lập thể ent được thừa nhân đã được ủng hộ bởi độ quay cực
âm của hợp chất 1 (xem ở trên).
18
