Nghiên cứu một số protein có hoạt tính sinh học ở một vài loài sinh vật biển Việt Nam

Chúng được ứng dụng rộng rãi trong y học và sinh học như một số lecĩin trong V học được dùng làm chỉ thị xác đmh nhóm máu người 8,9, để nghiên cứu hóa học miễn dịch và miẽn dịch tế bào

Bô MÁO DUO vn lìÀniẠO

D M l i n t ụ l ]< )( ' ( ;j A II A N < n

I Kl H )IN( ; I >A I H O C K I I H A II n r 11' Mi l l I N

HfsO CflO TONG KẾT

D K F A I:

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PROTEIN

LOÀI SINH VÃT RIẼN VIẾT N A M

ĐE TAI:

BÁO CÁO TÓM TẮT k ế t q u ả v à t ì n h h ì n h

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỂ TÀI NĂM 1995

'k'k'k

1 T ên dề tài: "N ghiên cứu m ột sô P ro te in có h o ạ t tín h sinh học ỏ

m ột vài loài s in h v ậ t biển Việt nam "

M ã số: QG - 95 - 14

2 C h ủ trì đổ tài: GVC N guyễn Q u a n g Vinh

3 M ục Liêu và nội d u n g n g h iê n cứu:

- N ghiên cứu diều t r a về lectin và p r o te in a z a ở rong biển và dộng

tín h lectin, tro n g đó lectin của các loài rong lục thuộc chi ư ỉv n lif»n kốt dặc hiệu với (lường L-Kucose, còn lectin của h u y ê t t h a n h sam hiển ('()

h o ạ t độ cao n h á t vả bị ức chê m ạ n h n h ấ t bởi a x ít N-Axotyl -

n e u ra m in ic

- Đã p h á t hiện loài có p ro te in a z a , chủ yêu là proteiiia7.il t r u n g tín h đến kiểm yếu EDTA k h ô n g ức chê h o ạ t tín h proteolytic r’j rong biển, n h ù n g lại kìm h ãm h o ạ t độ củ a p ro tc in a z n r ủ a h u y ế t Um nil Ríini biển, tro n g khi dó H g C b kìm h ã m h o ạ t tín h p roleolylic d I'onp {lo m à không kìm h ã m h o ạ i dộ c ủ a ])roteinaza ỏ các loại ro n g lục dã Million cứu

- Đã lin h sạch và n g h iên cứu tín h c h ấ t củ a lectin từ rong lu r ư ìv n

conglohntỉì và từ h u y ê t 1 h a n h sam T a c h y p jp u s íIKỈPIÌÌntỉis Ijf'din ( ITa

rong lục có tín h dặc h iệu nhỏm m áu 0 cua người, h o ạ t tín h phụ ỉlniộc vào ion C a 24 , bị ức chê dặc h iệu bởi đường L-Fucose và có ])H thích hợp

ở k h o ả n g 8-9 L ectin tác h lừ h u y ế t t h a n h s a m có khối lượng I'lifm từ lớn ( ~ 200KDa), cũng cần ion C a 2+ cho h o ạ t dộng của m ìnli CO pH

2

th íc h hợp ở k h o ả n g 7,5 và h o ạ t độ bị ức c h ế m ạ n h n h ấ t bởi Axil N-

A cety l-n eư ram in ic c ả h a i lectin là n h ữ n g p ro te in tương dối bổn nhiệt

- Đã công bô' 2 bài báo ở các tạ p chí c h u y ên n g à n h , m ột bài ỉ)áo R ắ p công bô"

OUTLINE REPORT ON RESULTS A N D REALIZATIO N OF SUBJECT OF SC IEN TIFIC RESEARCH

- S c re e n in g for lectin s a n d p ro le in a s e s from m a r in e o rg an ism s

- P urificatio n a n d S tu d y of p ro p e rtie s of Uie lec tin s ii’OTii ROITIO chosen species

4 R e s u lts achieved:

- 26 d iffere n t m a r in e o rg a n ism s from N o rth a n d ( '(Mitral

S e a s h o re s of V ie tn a m w ere screen ed for le c tin s a n d p ro trin a sp s

L ectin s w ith r a t h e r low litre w ere d ete c te d in 19 species, anion <*■ UiPTii

th e lectin s of g reen alg ae UÌVR b ind specifically L-F ucoso and (ho lcctin of h a o m o ly m p h of h o rsesh o e crab T a c h y p ỉe u s tr id c iita in s lias

th e h ig h e s t litr e a n d its activ ity is in h ib ite d m o stly by N -.\c p tv i-

lìcuranìĩiìic a cid

P ro te in a s c s , m ostly n e u tr a l or w e a k -a lca lin e prolei liases worn found ill L6 species ED TA does not in h ib it tile proteolytic activ ity of

e x tr a c ts from Liu* seaw eeds, b u t it does in h ib it a ctiv ity of p ro te in a s e of

h o rse sh o e n ab JIgC l2 in h ib its proteolytic activ ity of e x tr a c ts from 1*0(1

seaw eed s, b ill (Iocs not inhibit activity of proU 'inasn IVom g ro rn

P u rifica tio n a n d stu d y of p ro p e rtie s of th e specific le c tin s from

g ree n alg a Ulva conglobata a n d h o rse sh o e crab w ere c a rrie d out.

T he Jectin of th e alg a w as found to be specific for h u m a n () blood group a n d its h a e m a g g lu tin a tio n w as in h ib ite d by L -F ucose a n d

EDTA T h e lectin re q u ire s C a 2+ for its a ctiv ity a n d h a s th e o p tim u m

pH for h a e m a g g lu tin a tio n in th e r a n g e of 8-9

T he loctin from T tr id e n ta tu s h a s a h ig h m o le c u la r w eight

(~200KDa), also re q u ire s C a 2+ for its a ctiv ity a n d th e liHema­

g g lu tin a tio n of th e lectin is in h ib ite d m ostly by N -A c e ty l-n e u rfiininic

- P ay for chem icals a n d in s tr u m e n ts : 1.383.000 (1 VN

- P ay for a n a ly s is of sam ples:

- P a y for ty p in g docum ents:

- F e e s of p u b lis h in g papers:

750.000 (1 VN350.000 (1 VN210.000 d VN

MỤC LỤC

Trang

Mơ đ á u 4

Nguyồn liệu và phương pháp 4

Kết quả và thảo luận 6

Kết luận 8

Tài liệu tham kháo 9

Phụ l ụ c

'-ì

3

MỞ ĐẨU

Trong sỏ các hoạt chất cỏ nguồn gốc tự nhiẻn ( chât có hoạt tính sinh học) phái kề đên hoocmôn, các chất kháng sinh, các thuốc điểu trị nhiẻu bệnh khác

nhau đặc biệt là các protein có hoạt tính đặc hiệu Chúng không chỉ có vai trò

quan trọng trong đời sống sinh vật mà còn có ý nghĩa to lớn đôi với đời sống xă hội con người

Lectin và proteinaza là những protein có hoạt tính sinh học Chúng được ứng

dụng rộng rãi trong y học và sinh học như một số lecĩin trong V học được dùng làm

chỉ thị xác đmh nhóm máu người (8,9), để nghiên cứu hóa học miễn dịch và miẽn

dịch tế bào (7) ; các proteinaza cũng rất được quan tâm vì ý nghĩa thực tiễn to lớn

của chúng trong đời sống như để chê biến cá, thịt, bột dinh dường cao cấp, làm phụ gia trong công nghiệp sản xuất chất táy rửa, mỹ phám, làm thuốc (1)

Mặc dù vạy, cho đến nav, lecrin và proteinaza mới được nghiôn cứu nhiéu

chu yếu trôn các đối tưonơ động vật, thưc vật bậc cao hay vi sinh vật Đối với sinh vật biỏn, một ngưổn nguvồn liệu quí giá về các hợp chất có hoạt tính sinh học, lại rất phong phú và đa dạng vé thành phán giông và loài ử vùng biến nhiệt đới như nước ta, thì việc nsihiẻn cứu các chất nói trôn còn rất hạn hẹp, hầu như mới hát đáu

Xuất phát tư nhừng điéu nói trên chúng tôi đãt cho đề tài nhiệm vụ: nghiẽn

cứu điéu tra về lectin và proteinaza ở một số loài sinh vật biển; tinh sạch và nghiôn

cứu đặc tính kha nâng ứn» dung của chúng, nhằm «óp phản khai thác ntĩuổn nguyỏn Liệu phong phú, quí giá này ớ nước ta

NGUYỀN LIỆU VÀ PHƯƠNG PH A P NGHIÊN c ứ u

- Mẫu rong hiến hoặc đóng vật biến (sam) được thu gom ử vùng ven hiến va ven đao vung Hài Phòng, Quang Ninh, Thanh Hỏa Mẫu đang tươi hoặc kho được háo quan trong tu lạnh trước khi dùntĩ

- Các chàt cỏ hoạt tính được nghiên cứu từ dich chiôt rontí biên hoặc huvct thanh động vât Dich chiẽt thu đươc hàng cách nghiổn mau rony; VỚI Jộm photphat

4

muối (PBS) pH 7,4 , ly tâm thu lấy dịch trong (

bàng nước cất ( trong các thí nghiệm vé proteinaza) Trưởng hợp động vật thi dung

huyôt tương sau khi ly câm hoặc đế lãng tô bào

- Hoạt tính lectin được phát hiện bủng phán ứng ngưna kèt tẽ bao hỏng cáu máu người và động vật Phán ứng nàv cũng như thừ nghiệm vé tính đặc hiệu đường của các ỉectin được tiến hành theo các phương pháp đã trinh bày trước đây (2)

- Hoạt tính proteolytic ịproteỉnaia) tron^ các rnảu được phát hiện hãng

phương pháp khuyếch tán trồn đĩa thạch (4) với cơ chất cazein 0,1% ớ pH 6,5 và

pH 8 ,ỉ , nổng độ thạch là 1,5% Tiến hành xác đinh ở nhiệt độ phòng ( 25°C) trong

15 giờ, sau đó nhuộm đĩa thạch bằng dung dịch Amit đen 10B 0,1% Đánh giá hoạt

độ enzim theo kích thước vòns phân giai không màu trên nền xanh đậm

Anh hưởng của một sô chất đăc hiệu nhỏm đến hoạt độ enzum được xác định bằng cách ù dịch chiết với chất nghiên cứu trong 20 phút ờ nhiệt độ phòng, sau đỏ mới đưa lên đĩa thạch đê xác định hoạt độ, song song với việc hoạt độ enzim như trên

- Tinh sạch các lectin Lectin cỏ trong dịch chiết trong hoặc huyèt thanh sam

được tinh sạch bằng việc kết hợp phương pháp sác ký lọc gel trên cột sephadex G-75 hoặc G-200 và trôn cột trao đổi ion DEAE-Xeluỉô, dùng đệm tris - có pH tương ứng, sử dụng gradient NaCl đế rút protein có hoạt tính tư cột Các chế phàm lectin thu được đem điện di trong gel ịx>lyacrvlamứ có SDS trong đìẽu kiện có chất khừ theo phương pháp Laemmli (5) đê kiểm tra độ tinh sạch

- Hàm lượng protein được xác định theo Lowrv (6)

- Niịhièn cứu một sỏ rinh chất của rác lecĩìn tách rừ sinh vật biSn.

Sư ức che hoạt tính lectin bời đường ( hay tính đặc hiệu đương cuu lecrin)

được xác định như đã noi trên í2)

Ảnh hươĩiỉĩ cưa pH đẽn hoạt đô Ircỉin được xác định bona cách tiến hanh

phán ứns n«ưntĩ kết hỏng cáu bơi lectin ớ các pH khác nhau tron® khoang pH 5-10

Ảnh hướng cua các ion kim loai hỏa trị 2 Phan ứn« ntỉưng kêt hổng càu cua lectin được tiến hành trong điêu kiện co mặt các ion như Ca-+ với các nnnii

đô khác nhau

5

Ảnh hưởng của nhiệt độ Hoạt tính ngưng kết hổng cầu của lectin được xác định sau khi xử lý protein ở các điéu kiện nhiệt độ khác nhau và trong các khống thời gian khác nhiiư.

KẾT QUA VÀ THẢO LUẬN.

Việc triển khai đé tài bắt đầu bàng nghiên cứu điéu tra vé lecrin và

proteinaza Kết quá điéu tra cho thấy 70-80% sơ lồi sinh vật biển đã điều tra cĩ

chứa các hoạt chất trên ( 21 trong sơ 26 lồi cĩ lectin và 16 trong sơ 21 lồi cĩ proteinaza) (bảng 1 và 3) Về hoạt chất lectin thì đối với các lồi rong biển đã nghiên cứu, hầu hết đểu cĩ lectin với hoạt độ thấp và khơng đặc hiệu nhỏm máu người Kết quả này phù hợp với kết quá điều tra trước đây của chúng tơi (2) và cũng tương tự nghiên cứu điều tra đã cơng bố vẽ lectin ử rong biển trên thế giới (14) Kết quá bảng 1 cũng cho thấy đa số dịch chiết các lồi rong đã ngưng kẽt hổng cầu máu nsừơi cũng ngưng kết hổng cầu động vật Trong số các mẫu đã thử

thì rong lục codium arabicum và huyết thanh sam cĩ hoạt tính lectin cao nhất, mặc

dù khịníỊ đặc hiệu nhĩm máu người

Kết quả nghiồn cứu tính đặc hiệu đường (bảng 2) cho thấy các lồi rong lục

thuộc 7chi Lĩ h a cĩ lectin bị ức chê đặc hiệu bởi đường L-Fucose; lectin của rong

codium arabicum bị ức chế hỏi N-Acetyl-Galactosamine, cỏn lectin huyết thanh

sam bị ức chế mạnh nhất hời axit N-Acetyl-neuraminic Nhữnìỉ lectin liẻn kết đặc hiệu L-Fucose thường cĩ đặc hiệu nhĩm máu o của người như trưởng hop lectin

tách tư táo Uỉva lactuca (8) Những lectin đặc hiệu nhỏm máu người, hoặc đặc hiệu

đ ư ờ n g c a o c ỏ V n g h ĩ a lớ n t r o n g V h ọ c v à s i n h h ọ c

Kẻt quá nshiơn cứu điéu tra vé proteinaza ( báng 3) cho thày ờ sinh vật biến

proteina /a thuộc loại trung tính đên kiém yếu, nghĩa là trong khóna pH 5-8 Vồ

tính chit đãc hiệu nhỏm thì prmeinaza của các lồi rong hiến kho nu bị ức chê bời EDTA, trong khi đỏ prnteinaza của huvết thanh sam lại bị ức chế bới EDTA (3), níỉhĩa là các prnieinaza huvồt ihanh sam thuộc loại proreinaza kim loại Đày cĩ thơ

là sự sai khác giữa prmeinaza đơng vật và thực vặt hiến Mặt khác cũng cĩ ihê thấy

s ư s ai k h ú c n ữ a t r o n g c á c p r n t e i n a i a ừ c á c l o à i r o n g h i ế n : H í ỉ C N ứ c c h ị ’ p r n í v i n a i d của các lồi rontỉ đị mà khịng ưc chè các proteinaza ronơ lục.

6

Trôn cư sơ những kết quá níihièn cứu điều tra chúng tỏi đã tiên hành tinh

sạch lectin từ rong lục Ulvư congỉobata vả lử huyêt íhanh sam hiên.

Việc tinh sạch lectin từ roníỉ luc Uỉva coniỊlobưtu được thực hiện nhơ kêt

hợp phương pháp lọc phàn tứ qua cột Sephadex G-75 với sác ký trao đối ion tiêp theo trẻn cột DEAE - xelulo Khi sác ky Lọc gel, các phân đoạn cố hoạt tính lectin được rút ra dưới dạng một đỉnh sau hai đính protein khổng có hoạt tính ( hình l), chiếm khoáng 10% ỉượng protein hòa tan được chiêt rút ra từ rong Khi sắc ký tiẽp theo trên cột DEAE - xelưlo, lectin cũng chỉ rút ra khỏi cột dưới dạng một đính protein duy nhất ở nổng độ NaCl 0,2M ( hình 2) chứng tỏ sự đổng nhất của chố phẩm

Kết quả điện di trẻn gel polyacrylamit có SDS trong điều kiện có chất khử và khỏng cỏ chất khử cho thấy khi khồnơ cỏ chất khử lectin tinh sạch cho hai vạch protein tương ứng khối lượng 43 KDa và 21,5 KDa, còn khi cỏ chất khử chí nhân được một vạch tương ứng 21,5 KDa ( ánh 1) Kết quá này chứng tò độ tinh sạch của chế phám

Chế phẩm thu được có những tính chất đặc trưng cho những lectin đãc hiệu nhỏm máu o của người đã biết (8,9,14) hoạt tính bị ức chế đặc hiệu bời đường L- Fucose ( bang 3,4), hoạt độns: trong khoáng pH rộng pH 5-10 { bdng 5) Điêm khác biệt với các lectin đã biêt là nỏ cần ion Ca2+ cho hoạt đọng của minh ( bang 6)

Việc tinh sạch leciin từ hu vết thanh sam cũng được thực hiện nhở kết họp sắc kv trao đổi ion trên cột DEAE-xelulo với sắc ký lọc gel qua cột Sephudex G-

200 Khi sác ký trôn cột DEAE-xelulo, ỉectin được tách ra dưới dạng một đỉnh protein chính ơ nổng độ NaCl 0,25M chiêm 9,8% lượng protein lên eôt (đỉnh [ hình3)

Đinh có hoạt tính ( ÍỈỌĨ là DEAE I) được sắc ký lọc gel tiếp theo va kết qua cho thày proiein có hoạt tinh được tách ra khỏi phán khonư cỏ hoạt tinh ờ đinh đâu tiồn (đinh I hình 4) Kẽt qua điện di trủn gcl polvacrylamit (ánh 2) cho thav chẽ

p h à m c h i c h o 2 v ạ c h c h ứ n g lo đ õ l in h s ạ c h n h ấ t đ ị n h c ủ a c h õ p h à m

7

Kết qua nghiên cứu tính chất của lectin cho thấy protein này có khối lượng

phủn tứ lớn ( được xác định bàng sác ký lọc gel) tương ứng 20()KDa Lectin cũng

cán ion Ca2+ cho họat động của mình (báng 7) Lectin khòng bền nhiệt và có pH

thích hop cho hoạt đông ơ khoáng truns tính đên kiềm yêu (pH 7-9) đặc hiệt là hoại

tính của chế phàm bị ức chế manh nhất bởi axit N-Acetyl-neuraminic (bảng 8) Các

kết quả trên nói lên ràng lectin sam thuộc nhóm lectin liên kết axit Sialic, tương tự

háu hết các lectin liên kết axit Sialic đã biết (10,11,12,13); trong đó ion Ca2+ là cần

thiết cho hoạt đông của protein làm vai trò liên kết cúc dưới đơn vị thành đại phân

tử cỏ hoạt tính

KẾT LUẬN

17 19 trong số 26 Loài ( « 80%) rong biển và đông vật biển đã điều tra có

chứa hoạt chất lectin Lectin của rong lục thuộc chi Ulva liên kết đặc hiệu đường L-

Fucose, cỏn lectin của huyết thanh sam có hoạt độ cao nhất, không đặc hiệu nhóm

máu nhưng liên kết ưu thế với axit sialic.

16 trong số 21 loài ( -80%) đã điẽu tra có hoạt tính proteolytic ở pH trims tính đôn kiém yêu (pH 5-9) EDTA không ảnh hưừng đến hoạt tính proteolvỉic ớ

rong biển nhưng lại kim hăm hoạt độ của proteinaza của huvết thanh sam, cỏn

HgCL-) lòm hãm hoạt tính proteoivtỉc ở rong đỏ, mà không kim hăm proteinaza ở

rong lue

2/ Đã tinh sạch được lectin đặc biệt nhóm máu o của người từ rong lục

UI va conqlobatu và lectin liôn kẻt a xi ỉ sialic từ huvết thanh sam.

Các ìecĩin tinh sạch đéu cần ion Ca2+ cho hoạt độriíì của minh và có pH

thích hop irons khoáng từ 7 đến 9 Lectin của rong ưlva chí nsưriíỉ kết hõnư cáu

máu o của người và liên kêt đặc hiệu với đườns L-Fucnse Lectin của huyết thanh

s a m liồn kôt m ạ n h n h ấ t v ớ i a x i t N - a c r t y l n e u r a m i n i c v à c ỏ k h ố i l ư o n ư p h â n lư

k h o á n g 2 0 0 K D a

8

l ỉ á n ^ 1 : l i o i i l ( l ộ n m m j 4 k ẽ l ( I I A ) ( l u i v o i l i d i i Ị ^ c a n J 1 | : Í I 1 n m i ũ i v ; i i l õ f i í 4 \ .1 [

e ũ a d u l l c l i i c t l i r c ; í c l o à i n m ^ 1 ► i »-n (I;ì n g h i ê n Í.IIU ( I I A / 5 0 1 1 11 ( l i d i 1/ l i i ê l )

B à n ^ 2 : Sirúv ché Ịilian iiiiị ; iiỊĩiniịĩ kêl cu;t (lịch chid ronj; )><»i (lumiy.

L o ạ t ( I m nu* Ni>n>' đ õ l ói l i n e n c u a <l ưi rnp í ' S v IK- chC- ( i n M i

sô cliíit t i ên ho:iL (ló c u / i m

( M i i c í l i' l ’ A 111 I.IC i ! ộ 1IC c h é l ’ A c h i u t : hi CII d i e II h n i ^ ( i â i i (].’m — l à k h ô n g c ó l i o u i ill"* ill i;'k r Ỉ H ' , !1' I K I 11'

N J i i o t u - h i c ; i

6 5 N^-e n i l r «' HC

<r >

Hình I - Sác ký lọc gel qua cột Sephadex 6-75 mẫu Ulva conglobnta.

Kích thước cột 2x80 cm thu phân đoạn 4ml Dùng đệm tris-NaCl pH 8,3 Tốc

độ chảy 30ml/giờ

đường chí protein - đường chỉ hoạt độ ngưng kêt hổng cầu

Hình 1 - Sác ký trao đối ion trèn cột DEAE-xeỉulô mẫu (ỉlvri cnn»iohntfi sau lọc gel.

Kích thước cột 2.7 X 20cm Đệm Tris.0.025M pH X.3 (ỉradien nong độ NaCl

0 01 - 0.50M Thu phân đoạn 5 ml Các ký hiệu khác như trẽn hình i

Hình J - Sắc ký trao đổi ion trên cột Di-’Alv-xckiln Mẫu huyct thanh sum

(TTridcntatus) Kích thước cột 2.7x8cm Oệin Tris (),M)M, pll 7.5 (ỉrndicn

nồng độ NaCl 0 - IM Thu phàn đoạn 4ml Đường -p-p-p- chỉ protein, dường -1-1-1- v à - chỉ hoạt độ n^ưng kết hồng cầu

aogrc ao OBGr2C -I nr.

Hỉnh 4 - Sác ký lọc gel trên cột Sephadex CỈ-200, mau huyết thanh sam chè phám qi

DEAE-xelulô Kích thước cột 1.8x95cm Đệm Tris-NaCl 0.1M pH 7,5 CaC 0,0IM Các ký hiệu khác như trên hmh 3

Ảnh hm’mn r.ia pH den liaụl (10 Clia Icclin

l iV V c o n ịiiư h u tii. N n n t i IỈÔ p r o t e i n 0 , 3 m u / t i l l ,

(li'in-4 (lộm L-Ó Ca , hunji call hilili Ihui'mi;

ÍIỈỊUTIỊỊ két hồnj» cẩu cùa icctin từ tủn

u cniỊỊỊlobitlii Nồ nu (lô protein lii (1,3 inu/inl,

B a n s 7: Ả n h ỉtưỞHịỉ cùa ion kim loại tỏi khả năng biếu hiện

hoạt độ của lectin sam biến.

Ion

Nổng độ (miM)

ức chê hoạt độ lectin sam biển.

A,B,E trôn bảnơ 7 và 8 là chè phàm lectin qua cac giai đoạn tinh sạch

A - Huvết thanh thò cua sam

B - Chế phàm DEAE ị

E - Chè phàm Sephadex G - 200Ị