Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đồng hoá xyloza dùng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Từ những tiềm năng ứng dụng của hệ enzim trên, trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm tới việc xử ]ý các phụ phẩm nông nghiệp thành thức ăn chãn nuôi dễ tiêu nhờ khả năng phân giải xenl

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

TÊN ĐỀ TÀI:

PHẢN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

MẢ SỐ: QT 00.16

CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS K iểu H ữu Ả n h

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

I BÁO CÁO TÓM TẮT

1 TÓM TẮT KẼT QUẢ ĐỂ TÀI ĐẠT Đ ư ợ c

Xylan là ihành pliắn chủ yếu của hemixenluloza ở thực vật Sau xenluloza, xylan là loại

|H>lií>accai il (ni sinh phong phú nhất trong thiên nhiên Trong thành tế bào thực vật, xylan có ihê ợhiêiyi 30% họn g liíợng khô Dãy ià sán phẩm quang hợp mà hàng Iiăm cây xanh c!ẽ lại

chu Irái dãi, là dỏng biĩ Iluii khổng lổ nếu nhu con người không biết sử dụng, nhưng SC là

nguồn cac bon và ngụổn năng lượng vô tận nếu như con người biết cách khai thác, mà chú

>1 u nhò vào,nhóm vi sí,nh VỘI có khá Iiăiig phftn giải

TVuỉig vài chục Iiãin gẩti ctíìy, ngượi ta đã chú ý đến các enzyni phíln giái xyiau cún vi

sill h V Ạ í: Những e iizy m này được chú ý vì một mặt chứiigphân gải xylan c u n g cấỊi Iigiiỏn Cíịcbon dế liêu và năng lượng c h o chính các vi sinh vật sản sinh ra cluing, và qua đổ cung câị) Iiguổn c a c b o n và n ă n g l ượng c h o c á c si | ih vật k há c , mộ t mặt c h ú n g tham gi a vào quá trình lõng lurởng, Iiuơng thành và chín của ngũ c ố c và các loại quá N goài ra, xylanaza CĨÌII“

gịúp cho các vi sinh vật XAm Iihập vào bên trong cây và quả Mặt khác, các hệ Ihống en /y m phân húy xylan có tiệm năng đáng kể trong cấc ứng dụng công nghệ sinh học

Từ 30 chủng nấm sợi có hoạt tính xylanaza đựơc phân lập từ các vùng phụ cận ớ Hà ,N'>ịi chúng tôi đã chọn ra được l chủng có hoạt tính CMC-aza và xylanaza mạnh nhất có ký liiớu là A p - 146 KIiuAii lạc chủng Ap-146 phái Iriển nhanh trên môi inrờng Czapek ở Iihiệi (In 24-2ố“C Kích ihiíớc kh11ÁII lạc d = 4-5cm Trong 2 tuẩii nuôi cây, bề mặt khuấii lạc I0IIJ’ lựo hơị hỏng và gỏ ghé, mép khuẩn lạc móng, trải rộng có màu từ trắng đến xám nhạt () vùng có các đầu bào tử phái triển mạnh sinh ríi từ sợi khí sinh thì mỏng mánh, từ sợi cư chất thì có màu lục vàng sÃm Bọng hình chai, có kích thước 5,5 - 7,7 f.im, hiếm khi có kích thước ỉ ÓI I hon Cuống bào lử có íì trên bọng Thường lừ 5-6 cái, hiếm khi có từ 8-10 cái với kích ihưóc

5,5- 8,5j.i 111 X 2,8-3,3ị.ún, Ihế bình 5 ,5 -6 ,5 X 2,0-2,5j.im Conidi c ó dạng hình cáu có gai với kích lliước 2,8 - 3,5 [ 1111.

Dựa vào khoá phân loại K.B.Raper, D.I Fenell " The genus Aspergillus", chủng này Ũuik; xac.dịnh \ìì Aspergillus /Hjrvatlu'ciii.s.

Chủng Ap-146 sinh Irướng và lổng hợp enzym CMC-aza và xylanaza tối liên 11)01 nường CVapck có bố sung 5g CMC và 5g xylan với nhiệt đô nuôi 30°c, pH6, thời gian Iitli

Đ ã xây dựng được qui irình đơn eiản để sản xuất c h ế phẩm dùng trong chần nuôi gia súc.

Đ ã thử nghiệm bước dầu trong chăn nuôi Gà và cho kết quả khả quan

Nguyễn Ngọc Long

I

XYLANOLYTIC ACTIVITY OF SOME FILAMENTOUS FUNGUS STRAINS ISOLATED IN HANOI REGION

Xylan is a major component of plain Jvemicel 1 Lilose Afler cellulose, il is the most abundant renewable polysaccharide in nalmo Xylan and cellulose are ihe predomiiuml

hemicellulosic polysaccharides found in I Ik- cell walls of land plains, in which they may

constitute more than 30% of the dry weighi Aside fiom terrestrial planls, inuiine iilgiic

a ls o s y n t h e s iz e x y la n s o f different c h e m ic a l Nlriiclure.

Xylanoiylic enzymes of microorganisms have received a great deal of attention ill the Iasi 10 years These enzyme systems in c of imeiesi for several reasons Oil I ho one

hand, Ihey are involved in providing sourccs of carbon and energy for llie organisms that

produce them and for hosts harbouring xylanase-producing organisms and they arc involved in the growth, maturation, and ripening of cereals and fruits Moreover,

xylanases appear to be involved in llie invasion of plants and fruits by palliogens On Ihe

o ilie r hand, xylan-degrading enzyme sysk Ills have considerable potential in several biotechnological applications

In this study 30 filamentous fungus strains capable of degrading xylan and/or

cellulose were isolated from soil in I he suburbs of Hanoi some of which showed high

activity in attacking die both substrates Among 1 he most actively enzyme-producing strains, Ap-146 was selecled for further lesls Morphological and CLillLiral chaiuclei istics

of this strain were identified and according 10 Rapei and Fennel (1965) il was classified

as Aspergillus parvuthecius.

The optimal conditions for growth iincl activity of Aspergillus jhu vathci ins

Ap-146 CMC-ase and xylanases during growth on Czapek medium added by 5 g CMC and 5 g xylan were 30°c and pH6 The highest activities toward CMC and xylan reached after tluee days of fermentation

ll is n o t e w o r t h y that c o r n c o b as a ỈI II Lital SLihslj al e e x e r t e d a s l i m u l a l o r y ei'fecl

on enzyme production by Aspergillus Ap-1-lỏ

CHÚ NHIỆM ĐỂ TÀI

3 2 7 2 Ảnh hưởng cùa nguồn N itơ

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ 1«

NĂNG SINH TỔNG HỢP CMC-AZA VÀ XYLANAZA

4.3.1 Ả nh hưởng của p H nuôi cấy

4.3.2 Ả n h hưởng của nhiệt độ

III NỘI DUNG CỦA BÁO CÁO CHÍNH

1 T Ổ N G QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỂ

Xylan là thành phần chủ yếu của hemixenluloza ở thực vật Sau xenluloza, xylan là loại polisaccarit tái sinh phong phú nhất Irong tự nhiên Trong thành tế bào thực vật xylan có thể chiếm tới trên 30% trọng lượng khô Trong rơm rạ, bã mía, xylan chiếm 30%, trong gỗ của các cày lá kim - 8 -12% và trong gỗ của các cây lá bán, 20 - 25% Ngoài các thực vật sông trên cạn trong đó xylan chủ yếu có câu Irúc dựa Irẽn bộ khung poly p-l,4-D-xyloza, tảo biển cũng tổng hợp xylan có cấu trúc khác nhau dựa trên bộ khung poly p - i , 3 - D - x y l o z a ộ m ộ j Sô' loài tảo lục (|Chiolophyceae) và tảo đỏ (Rhodophyceue) thiếu hẳn xenluloza, xylan tạo nên các cấu trúc sợi kết tinh cao

Hàng loại vi sinh vật phân giải xenluloza cũng có khá năng phân giải xyỉan Từ khoảng hơn một thập ký nay, người ta đặc biệl quan tâm tới các enzim phân giải xylan của vi sinh vật Những enzim này được chú ý vì một số nguyên nhân Một mật, chúng tham gia vào việc cung cấp các nguồn cacbon và nãng

lượng c h o các vi sinh vật sản sinh ra chúng, và cũng qua đó, c u n g cấp ngu ồ n

cacbon và năng lượng cho các vật chủ chứa các vi sinh vậi sản sinh xylanaza Chúng tham gia vào quá trình tãng trưởng, trưởng thành và chín cua ngũ cốc và các loại quả Ngoài ra, xylanaza cũng tham gia vào sự xâm nhập của các vi sinh vật vào bên trong cây và quả Mật khác các hệ thống enzim phân hủy xylan có tiềm năng đáng kể trong các ứng dụng cóng nghệ sinh học

Trong vài thập kỷ vừa qua, công nghiệp thuý phân nhờ enzim đã được triển khai ớ nhiều nước với tốc độ nhanh chóng Cùng với các enzim thuỷ phân quan trong khác, xylanaza đã được sán xuất với qui mô công nghiệp và ứng dung rộng rãi vào các mục đích khác nhau

Hướng sử dụng đó đươc Coughlan và Folan (1979) cu thế hóa như sau:

l C hế biến thực phẩm :

Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn.

Sản xuất các thực vật đơn bào!

Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép, protein từ rau và quả

Thu nhận thạch từ rau câu

Cải thiện độ hoà tan của các nguyên liệu trong công nghiệp lên men

Dùng làm chất trợ giúp tiêu hóa

Loại bồ các chất sợi không mong muốn

4 Chống ồ nhiễm

Phân huỷ rác thải thực vật

5 Lẻn men:

Cung cấp cơ chất cho việc tổng hợp metan, etanol, glycerin, axit lactic

6 Sản xuất phân bón từ p h ế thải nông nghiệp.

Từ những tiềm năng ứng dụng của hệ enzim trên, trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm tới việc xử ]ý các phụ phẩm nông nghiệp thành thức ăn chãn nuôi dễ tiêu nhờ khả năng phân giải xenluloza và xylan của các chủng nấm sợi Hướng nghiên cứu này đặc biệt có ý nghĩa đối với lợn gà là những động vật dạ dày hoàn toàn không có nãng lực dồng hóa xylan, xenluloza và một số polisaccarit bển vững khác nhưng thức án cùa chúng chứ yêu lại là cám và các phụ phấm nông nghiệp giàu xylan và xenluloza Hệ enzim xenlulaza-xylanaza có thế đóng góp trên cả hai phương diện : 1 nâng cao giá trị dinh dưỡng (trước hết là hàm lượng protein) của thức ăn chăn nuôi, và 2 cái thiện độ tiéu hóa các cơ chất khó tiêu cho dộng vật

1.2 CẤU TRÚC CỦA XYLAN

Cấu trúc của xylan khá thay đổi, từ các chuỗi l,4-p-polixyloza đến các heteropolisacarit phân nhánh mạnh Tiếp đầu ngữ "hetero" nói lên sự có mật của các đường khác với D-xyloza, chuỗi chính của xylan tương tự với của xenluloza nhưng thay cho D-glucoza là các D-xyloza Các nhánh gồm L-arabinofuranoza liên kết vói vị trí cacbon số 3 của D-xyloza và các nhánh gồm axit D-glucoronic hoặc axit 4-metil-D-glucuronic liên kết vị trí cacbon số 2 Cả hai nhánh đường chuỗi bên đều liên kết với chuỗi chính bang liên kết a-glycozit Mức độ phân nhánh phụ thuộc vào nguồn Ihực vật Xy lan cua một sô' loài gỗ đặc biệt là gổ cứng, được axetil hóa, chẳng hạn xylan cứa gỗ bulô chứa > lmol axit axetic/2mol D-xyloza Phản ứng axetil hóa thường diễn ra ở vị trí cacbon số 3 hơn là ở vị trí C2, song cũng gặp cả hiên tượng axetil hóa kép một gốc D-xyloza (hình 1)

H ìn h 1.- C ấ u tr ú c của xylan gỏ cứng

5

Giữa cấu trúc hóa học của xylan và nguồn gốc cây chủ cũng như vị trí irong

tế bào có mối liên quan với nhau Do đó các nguyên liệu chứa xylan có thể có các polyme xylan gần gũi vể cấu trúc nhưng khác nhau lì nhiều vể tính chất Xylan của ihục vật trên cạn thường có mặt với lý ỉộ khác nhau trong thành tế bào của tất

cả các mô lmhin hóa song cũng được tìm thấy cả ở những loài thực vật khác như rêu, dương xỉ Chúng thường là các thành phần cúa thành thứ cấp ở các mô có chức năng cấu trúc nhưng phần nào cũng tồn tại trong vách sơ cấp của các tế bào đang sinh trướng cũng như trong Ihành sơ cấp của hạt và củ ớ một số loài thực vật,

ở đó chúng có chức năng dự trữ ớ tất cá các vị trí siêu cấu trúc khác nhau trong ihành tê bào thực vật, xylan tương tác với các thành phần cấu trúc khác đặc biệt là với các sợi nhỏ xenluloza, với các poỉime phi xenluloza và phổ biến nhất là với linhin Tương tác không cộng hóa trị giữa xylan với các polisacarit khác chủ yếu

là nhờ các liên kếr hidro, còn việc nối xylan, linhin và mộl số axit phenolic với nhau thì do các liên kết cộng hóa trị đảm nhận

Giống như hầu hếl các polisacaril có nguồn gốc thực vật khác, xylan thể hiện tính chất đa dạng về độ trùng hợp và vể các phân tử thành viên, điểu này tương ứng vói sự có mặt của chúng trong nhiều loài thực vật và sự phân bô' cúa chúng trong các loại mô và tế bào Tất cả các xylan của thục vật Irên cạn đểu được đặc trưng bởi chuỗi chính l,4-f3-D-xylopiranozil mang một sô' lượng thay đối các nhánh thay thế monosacarit trung tính hoặc monosacarit uronic hoặc các oỉigosacarit chuỗi bên ngắn

Từ chuỗi đơp giản l,4-P-D-xylopưanozil, tính phức tạp về cấu trúc của xylan lăng lên theo số lượng của các monosacarit và oligosacarit thay thế gắn vào chuỗi này

1.3 ĐẶC T í n h c ủ a c á c Hệ THỐNG ENZIM PHÂN HỦY XYLAN

Do cấu trúc phức tạp của xylan, đế phân húy và cải biến nó cần có mộl sô enzim khác nhau Hai enzim glycanaza chủ yếu giải trùng hợp bộ khung hemixenluloza là endo-l,4-p-xylanaza và enđo-l,4-P-mannanaza Các oligosaccarit nhỏ sau đó sẽ được thủy phàn tiếp nhờ l,4-P-D-xyloziđaza, 1,4 (3- D-mannoziđaza và l,4-|3-D-glucoziđaza Các nhóm bên được phân cắt bới a-L - arabinozidaza, a-D -glucuroniđaza a-D-galactoziđaza Các nhóm bên este hóa sẽ được giải phóng nhờ axetyl xylan esteraza và axetyl galactoglucomannan esteraza (hình 2)

Ac

A raf

a1

IAc

4X yip 1 -4Xyip Ị -4Xyip 1 ■

2

1a

Hình 2 Vị trí tàn công cứa các enzim phân giãi xylan

1.3.1 Các xylanaza.

Ớ vị khuấn và nấm thường tổn tại 3 - 5 loại xylanaza Chẳng hạn, Ohkoshi

và ctv (1985) nhận thấy Aeromonas sp ưa kiềm tổng hợp 3 loại xylanaza;

Streptumyces sp cũng tạo Ihành 3 xylanaza khác nhau (Murao và civ, 1985) Các

xylanaza khác nhau c ó thê bắt nguồn tù những cái biến sau phiên dịch cúa cùng

một sản phẩm Việc phán loại xylanaza cũng chưa thống nhất Nếu dựa vào thứ tự axit min của vị trí xúc lác có thế chia xylanaza Ihành hai loại: xylanaza có trọng lượng thấp và xylanaza có trọng lượng cao Xylanaza cũng có thể được phân loại dựa vào sự khác nhau giũa các enzim llmý phân xylan và các enzim thuý phân xylodextrin, giữa các enzim thuý phân theo cơ chế enđo- và exo-, giữa các enzim tác dụng ưu tiên và không ưu tiên lên các vị trí thay thế trên chuỗi xylan

Xylanaza của Trichoderma hoại dộng tối thích ớ nhiệt độ 45 65°c, pH 3,5 6,5, trong đó có 2 xylanaza bển ớ 50°c Irong một giờ và mội loại bển ở 60(,c trong 20 phút Trái lại, xylanaza lừ vi khnấn ưa nhiêl Thermostoga sp có nhiệl tlộ tối ưu là 105°c ở pH 5,5 Xylanaza chịu kiểm từ Bacilllls. sp có phạm vi pH tối thích và dộ bển pH khá rộng, tới pH 10

-Xylanaza là các enzim dạng enđo (.liến hình, tác dụng lên chuỗi xylan ihco kiêu iuỳ tiện, làm giám mức độ irùng hợp cùa cư chất và tách ru các oligome ngán hơn, xylobioza và một phẩn xyloza Kiêu tác dụng của xylanaza và các sản phấm thuý phân thay đổi tuỳ theo nguồn enzim Hai xylanaza nhỏ tinh chế từ một ill ương phấm hemixenlulaza thể hiện hoạt tính phán giải xylan không hoà tan hoàn toàn hơn xylan hoà tan và sán phàm của phán ứng là xylobioza Hai xyianaza từ A.niger thuỷ phân xylan hoà tan nhanh hơn xylan phân nhánh không lioà lan, chúng không có hoạt tính lên xylan không hoà tan Ihiêu phân nhánh, điều này chứng tỏ các xylan cần các điếm phân nhánh nầm gần chu lác dụng cúa xylanaza Các xylanaza khổng cát nhánh bị hạn chế tác dung dối với arabino-4- melilglucuronoxylan Tác dụng của xyl.maza cũng bị ánh hướng bới sự có mặi

cua c á c nh ó m bèn ax eúl.

Hiện nay việc nghiên cứu hemixcnluluza 1 ất được chứ ý Các cơ chát tự nhiên cải biến Ihường thích hợp cho VÍỘL xác đinh hoại lính phán giái xylan, mặc

du cac cơ chât tự nhiên cũng rất quan uọng Việc xác định hoại lính cúa các enzim cãt nhánh cẫn sự hợp tác của xylanaza Hơn nữa hoạt tính xylanaza không chi được đo VỚI một c h ế phẩm xylan do tính dị nguyên của các xylan tuỳ theo nguồn gốc và c h ế phẩm.

1.3.2 Các p-xy!oziđaza

Các exo-l,4-p-D -xyloziđaza là những enzim thủy phân xylooligosaccarit

và xylobioza thành xyloza bang cách tách lần lượt từng gốc D-xyloza khỏi các đẩu không khử P-xylozidaza có mặt trong hầu hêt các hê thống enzim phân húy xylan gặp ở vi sinh vật, song nấm là bọh sán sinh enzim này dưới dạng ngoại bào mạnh nhất

Các exo-l,4-(ì-D -xyloziđaza là nhũng enzim khá lớn có trọng lượng phân tử vượt quá ỈOOkDa và thường bao gồm 2 dưới đơn vị Hầu hết các p-xyloziđaza đều chí ra hoạt tính cao nhất đối với xylobiozu, song không có hoạt tính đối với xylan Hoại tính đối với xylooligosaccarú giảm nhanh khi độ dài chuỗi lãng dần Một sô' [3-xyloziđaza cũng có hoạt tính Ị3-glucoziđaza Một đậc điếm quan trọng của các (3-xyloziđaza là chúng rất mẫn cảm với sự kìm hãm bới xyloza, diều này có thế gây ánh hưởng quan trọng tới sản lượng cnzim trong quá Irình sản xuất

1.3.3 Các a-arabin oziđaza

Các otarabinofuranozidaza là nhữnti enzim thủy phân các nhóm a L

-a-arabinofuranozil của arabinan, arabinixylan và arabinogalactan Sự sản sinh các a-arabinozidaza ở vi sinh vật ihường có quan hệ với sự sản sinh các enzim phân húy pectin và hemixenlulaza a-arabinozidaza tinh khiết lừ

L-arabino-D-xylan của lúa mì Khi phản ứng diễn ra đã xuâì hiện mội chất kết tua

vó đinh hình gồm chú yếu D-xylan và một lương nhó arabmoza Adiewartha và

c lv ( 1 9 7 9 ) đã tạo nên hàng loạt các arabinoxylun lừ a ia b m o x y la n bót mì linh

khiết bàng cách loại bỏ một phẩn các nhánh bén arubinozil nhà a-arabinoziduza

Theo các tác giả này tác dụng hoà tan của các nhánh thay Ihế arabinozil khòng do

sự hidrat hóa (thuỷ hóa) tăng lên mà do khả năng của chúng ngăn cản sự kết vón gian phân tử của các gốc xyloza không bị thay thế

1.4 SẢN XUẤT ENZIM PHÂN GIẢI XYLAN.

Giá cả của enzim là một trong các yêu tò quyết định tính kinh tê của một quá trình xúc tác sinh học và cồ thể giảm đi bằng cách tìm ra các điều kiện tôi thích cho việc sản xuất enzim, bằng cách phân lập các biến chúng năng suất cao

và (có thế) bằng cách thiết kê nên các chủng sán xuất có hiệu quá nhờ kỹ xáo di truyền M uốn vậy cần phải hiểu các'Cơ chế điều chính sinh tống hợp enzim Nhũng nghiên cứu về điều chính các enzim phân giải xylan chủ yếu tập trung vào việc gây cảm ứng enzim dưới các điểu kiện khác nhau chứ không phải là việc điều chỉnh gen Ngoài ra, chỉ có hai enzim dược tập trung nghiên cứu là xylanaza và xylozidaza

Các enzim phân giải xylan có lẽ là nhũng enzim cảm ứng Xylanaza và xylozidaza được tạo thành mạnh mẽ khi sinh trưởng trên xylan và tổng hợp enzim

bị kiềm c hế dị hóa bởi các nguồn các bon dễ đồng hóa như glucoza hoặc xyloza.Xylan không thể xâm nhập vào tế bào, do đó tín hiệu dùng kích Ihích tống hợp các enzim phân giải xylan phải là các chất có trọng lương phân tử thấp, ví dụ xylobioza và xylotiioza Các oligosacarii dược tạo thành nhờ sự ihuỷ phân xylan trong môi Irường bởi mộl lượng nhỏ e n /im được long hợp kiến trúc Sự cám ứng cũng có thể diển ra nhờ các alkyl và aryl P-D'Xylozit lổng hợp ớ Aspegillus sp hay nhờ metil p-D-xylozit ở nấm men Các hợp chất này giúp cho sự lạo thành các cnzim phân giải x y lan khi vắng mạl xylan và xylooligosacaril ớ nấm men

Candida íilbidus chí có metil p D-xylo/.il mới cảm ứng tống hợp xylanaza Các alkyl và aryl p-D-xylozit khác không có khá năng trẽn Ở nấm men hệ thống phân giải xylan cũng có thể được cảm ứng bởi các izome của xylobioza

Xylanaza ỏ nấm sợi có lẽ là enzim cám ứng hoặc dưới sư diều chính cúa

hiên tương giải k iề m chế Những nghiên cứu vế điều chính ớ nám thường gặp khó

khãn do xylanaza và xenlulaza được tạo ihành đồng thời và do tính dặc hiệu chéo đối với cơ chất của hai enzim trên.

Enzim phân giải xylan và enzirn phán giải xenluloza ớ mội sô nấm sợi có lẽ chiu sự điêu chinh riêng rẽ Khi sinh trướng trên xylan một số loài tổng hợp các xylanaza đặc hiệu chỉ chứa ít hoặc không chứa hoạt tính xenlulaza Nhưng khi sinh trưởng trên xenluloza, xenlulaza đưưc tạo thành cùng với xylanaza, có lẽ do xenluloza còn nhiễm một chút xylan hoặc do sụ giải kiếm chê do xenluloza nguồn các bon được sử dụng chậm gây nen Thí nghiệm với các chất cám ứng xác định trọng lượng thấp ở T reesei cũng cho kết quả tương tự, chắng hạn sophoroza cảm ứng cả enđo-1,4 p-glucanaza đặc hiệu và không đặc hiệu, xenlobiohidrolaza (exo-1,4 glucanaza) và rất ít xylanaza Xylobioza chỉ cám ứng các xylanaza đặc hiệu Vì vậy để thu nhận hệ thống phân giải xylanaza không lẫn xenlulaza chi cẩn nuôi vi sinh vật trên xylan không lẫn xenJuloza

Tuy nhiên phương hướng trên không thể áp dụng cho mọi loại nấm Chẳng hạn, ở Schizophyllum commune việc sán xuất mạnh xylanaza gắn liền với việc sản xuất xenlulaza

Nấm sinh trượng yếu trên xylan khi vắng xenluloza Khá nàng lạo thành hệ thống phân giải xylan không lẫn xenlulaza được cần phải được làm sáng ló ớ các chủng Aspergillus vì chúng thuộc sô bọn tổng hợp mạnh nhất xylanaza và xylozidaza

Một phương hướng có triển vọng khác đế thu nhận xylanaza không lẫn xenlulaza là phân lập các biến chủng khuyết xenlulaza hoặc tạo các chủng lái tố hợp thích hợp nhờ kỹ xảo di truyền

Cần chú ý rằng xylan kích thích tổng hợp xenlulaza ớ Streptomyces thivưgnscus và T reesei. Còn chưa rõ dây có phải là do tác dụng đặc hiệu cúa

một sô đoạn x y la n hay chí đơn thuần là một sự kích thích c á c tế bào bới inột

nguồn các bon dễ dàng chuyển hóa hưn \cnluloza

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp tạo điều kiện cho việc kiến trúc nên các chúng vi sinh vật chứa bộ máy enzim chon lọc Mục tiêu của kỹ thuật ADN lái lố hợp

11

trong việc chuyển-hóa sinh học xylan gỏm 2 hướng: (1) kiến trúc nên các chúng sản xuất có hệ thống phân giải xylan khóng lẫn xenlulaza và (2) cải thiện các dặc tính lên men của các vi sinh vật lên men xyloza quan trọng trong công nghiệp bằng cách ghép vào các gen đọc mã chu xylanaza và xylozidaza sao cho có thê diễn ra sự lên men xylan trực tiếp.

Tất cả các công trình ghép gen cho dến nay mới chi tập trung vào vi khuấn, chẳng hạn gen xyianaza đã được tách ra lừ Bacillus sọ. và được biếu hiện trong £

coli.

Ngoài việc đưa vào các gen mới, kỹ ihuật tạo dòng còn giúp cho việc khuếch đại các gen được biểu hiện Chẳng hạn, việc tống hợp xylanaza ớ B subtilis được nâng cao có hiệu quả khi dùng môt plasmit mang gen lừ B pumilus. Chúng chuyển nạp đã tạo thành mmọt lượng xylunuza ngoại bào nhiều gấp ba lần chúng cho Hơn nữa, enzim đã được tổng hợp theo kiểu kiến trúc chứng tỏ các yếu tố điểu chỉnh của chủng cho dã vắng mặt ớ plasmil dùng trong chuyến nạp

2 ĐÔI TƯỢNG NGHIÊN cứu

30 chủng vi nấm có hoạt tính phân giải xenluloza và xylan được phân lập từ đất ngoại Ihành Hà Nội theo các phương pháp vi sinh vật học ihông thường, sau

đó được bảo quản tại sưu tập giống của Bộ mòn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, được ký hiệu từ Ap-120 đến Ap-149

Sau khi chọn được một chủng (chủng Ap-146) có dồng thơi hoạt lính của cá hai loại enzim, chúng tôi dã sử dụng chúng này cho các nghiên cứu tiếp theo vể

các dặc đ iể m sinh học và phân loại, về ảnh hướng của các điểu kiện m ôi trường và

nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzim của nó và cuối cùng, tạo ra một chế phẩm thô từ các phụ phẩm nông nghiệp và sơ bộ thử nghiệm trong chăn nuôi gia cẩm ớ quy mô nhỏ

3.2.1.1 M ôi ưưcmg phân lập và giữ giông.

- Môi trường Czapek (g/1)

- Xác định hoạt tính enzim iheo phương pháp khuếch tán ưén thạch: Đun mồi trường (0.1% xylan , 1% thạch trong đệm xúrat 0.01 M, pH 6.5) đố vào hộp

Petri Dùng khoan nút chai, đục lỗ để nhỏ enzim thô Nhỏ dịch Lugol, 10 phút sau

đo vòng phân giải xylan

Nghien cưu anh hưởng của các điểu kiên mỏi trường đên khả năng sinh

enzim được tiên hành khi lên men lắc 220v/ph ò mòi trường thích hợp Irong 3

ngày

ctv.,1979)

Cân 10 g cám cho vào 100ml nước máy, đun sôi cách thuý Irong 10 phút

Lọc và thu được dịch chiết cám, khử trùng 1 atm/ 30 phút

- Môi Irường cám đặc,

Cân 10 g cám (hqặc bã mía, hoặc bã sấn, hoặc rơm) cho vào bình chứa

lOOml nước máy (khử trùng ở 1 atm/ 30 phút)

3.2.2 Điều ch ế hemixenluloza (Chen và ctv, 1979).

10 g rơm (đã phơi) + 100 ml NaOH (1-24%), giũ ớ 30 - 12Ơ’C / M 8 giờ, ép

rơm qua vải màn Rửa rơm còn lại bang nước cất Trộn các dịch lọc lại để thể tích

cuối cùng là 100 ml chỉnh pH dịch lọc tói 5 bằng HC1

Thêm vào dịch lọc 150 ml etanol 95%, giũ' ớ nhiệt độ phòng trong 24 giờ

Giữ tủa và rửa bằng etanol 70% để loại linhin và các chất khác Túa loại nước

bằng etanol 95% và etanol được loại nhò lọc và hong khỏ chân không ở 50°c Sản

phấm khô là hemixenluloza

3.2.3 Chiết rút enzim.

Với mỏi trường cám đặc: thêm nước câì vào cơ chất dã lên men theo ty lệ

1/10 (g /1 ), lắc mạnh rồi giữ ở nhiệt độ phong trong 2 giờ và lọc

Với môi trường dịch chiết cám: lắc đểu môi trường đã lên men, rồi lọc

D ịc h thu được g ọ i là dịch e n z im iho, thứ hoai lính e n z im hãng phương pháp

khuếch tán trẽn thach (mục 3.2.4 1 )

3.2.4 Xác định hoạt tính

3.2.4.Ấ Phương pháp khuếch tân (rởn (hạch (Williams., 1983).

Đun each thuy hôn hợp gồm 0,1% xylan và 1% ihạch trong đệm xitrat 0,01 M , p H 6,5 rôi phận ra các đĩa Petri Sau khi thạch đóng thì dục lỗ, rỏ vào mỗi

lô o lm l dịch enzim £)ê các đĩa vào tủ lanh trong 18 giờ, rổi chuyến sang tú ám ủ

ở 28-30°C/ 2 h Phát hiện vòng phân giải bằng thuốc thử Lugol (15 phút) Đo kích thước vòng phân giải

Hoạt tính enzim được tính theo kích thước vòng phân giái: D-d (mm) trong

đến trọng lượng k h ô n g đổi, cân trọng lượng.

3.2.6 Xác định khả năng sinh lrưởng của chủng Ap-146 trên mỏi trường chứa các cơ chất tự nhiên

Chúng A p-146 được cấy trên môi n ường cám đặc ở nhiệt độ phòng

Số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong ]g môi trường nuối cấy thể hiện khả năng sinh trưởng của chủng trong điều kiện đó

3.2.7 Xác định các điểu kiện ảnh hưởng đến quá trình lén men ó chủng Ap-146

3.2.7 Ị Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đấu.

Chúng A p '1 4 6 dược nuôi irong moi trường dịch chiêì cám ớ các nhiệt độ

25 35 40, 45, 50 và 60"c, sau 3 ngà) xác dịnh hoạt tính xylanaza, C M C -a/a trong dịch nuôi cấy (mục 3.2.6.1), xác định sinh khối

15

3.2.7.2 Ảnh hưởng của pH ban đẩu

Nuôi chủng Ap-146 ở môi trường dịch chiết cám dược chính pH theo các thang pH 4, 5, 6, 7; 8 và 9 bằng NaOH 0.1N và HC! 0,1 N, sau 3 ngày nuôi cây ớ nhiệt độ 28 - 30° c đem xác đinh hoạt tính xylanaza và CMC-a^a trong dịch nuôi cấy và xác định sinh khối

3.2.7.3 Ánh hưởng của nguồn các bon tự nhiên

Cấy chúng Ap-146 vào các bình chứa cư chất là cám, bã mía, bã dứa, lõi ngô, rơm, bổ sung urê 2%, rỉ đường 2%, NaNO} 1% Sau 5 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính xylanaza và CMC-aza của dịch nuôi cấy

3.2.8 Đ ộng thái lẻn men

Chủng Ap-146 được cấy đều vào 15 bình nón chứa mỏi trường dịch chiết cám, p H 6 có thể tích như nhau và nuôi ớ 30°c Cứ sau 24h lấy ra 3 bình để xác

định các thông s ố lên men Lấy trị sô' trung bình giữa 3 giá trị.

3.2.9 T hử nghiệm trong chăn nuôi gia cám

- Gà con nuôi công nghiệp của các hộ gia đình ớ Xã Đặng xá, Gia Lâm, Hà nội được sử dụng cho thí nghiệm

_ Thí nghiệm được tiến hành tại nhà Anh Khưưng, Xã Đặng Xá - Gia Lâm -

Hà nội

Tiong 30 chủng nấm sợi có hoạt tính xylanaza và xenlulaza, chúng tôi đã

lựa c h ọ n được c h ủ n g A p - 1 4 6 vừa c ó khá nãng phân giải xylan vừa c ó khá năng

phân giải xenluloza dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

4.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHẢN LOẠI.

Khuẩn lạc phát triển nhanh trên môi trường Czapek ở nhiệt độ 24-26°C Kích thước khuẩn lạc d = 4-5cm Trong 2 tuần nuôi cấy bề mật khuấn lạc lóng léo hơi bông và gồ ghề, mép khuẩn lạc mỏng, trải lộng có màu từ trắng đến xám nhạt,

ớ vùng có các đầu bào tử phát triển mạnli sinh IU từ sợi khí sinh thì mỏng mánh,

lừ sợi cơ chấl thì có màu lục vàng sẫm Bọng hình chai, có kích ihước 5,5 - 7,7 Ị.im, hiếm khi có kích thước lớn hơn Sterigmata 2 tầng mọc hạn chế ở đính bọng Cuông bào tử có ít trên bọng từ 5-6 cái Hiếm khi có từ 8-10 cái hên bọng, kích

thước 5 ,5 - 8 , 5 | i m X 2,8-3,3|_im, thể bình 5 ,5 -6 ,5 X 2 , 0 - 2 ,5f-im Conidi c ó dạng

hình cầu có gai với kích thước 2,8 - 3,5 1-im

Dựa vào khóa phân loại của K.B Raper và D.I Fenell " The genus

4.2 ĐẶC ĐIỂM NUÔI CẤY

4.2.1 Chọn mỏi trường

Chủng Ap-146 được nuối cấy lắc 2007ph, ở 30°c trong bình nón dung tích

250 ml chứa 50ml các môi trường sau : Czapek, Khoai tây được bố sung 3% saccaroza, nước chiết giá bổ sung 3% succaroza, Czapek - CM C / xylan ( thay saccaroza bằng 5 g C M C hoặc xylan) Cấy 5 % giống, sau 3 ngày xác định hoại tính CMC-aza, xylanaza và sinh khối (bảng 1)

4 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu

i x l c c d ũ ỷ