Nghiên cứu sự tương tác giữa Lectin và enzim amylase và proteinase.PDF

Lịch sử nghiên cứu lectin [13] được chính thức thừa nhận bắt đầu từ năm 1888 khi Stillmark phát hiện ra tính chất ngưng kết tế bào hồng cẩu của người và nhiều động vật khác của rixin - m

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC K H O A HỌC T ự NHIÊN

NGHIÊN CỨU Sự TƯƠNG TÁC GIỮA LECTIN VÀ

ENZIM AMYLASE VÀ PROTEINASE

CN Trần Văn Quang - giảng viên trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

4 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

Nội dung nghiên cứu:

- Thu mẫu và phân tích các chỉ số về enzim (proteinase và amylase) ở

một sổ loài sinh vật biển và nấm lớn

- Tách, tinh sạch chế phẩm lectin từ một số mẫu được chọn

- N ghiên cứu sự tương tác giữa lectin tách được với proteinase và amylase tự nhiên và thương phẩm

lọc phân tử qua cột Sephadex G-100 và bằng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE-cellulose (độ sạch tăng lên gần 10 lần).

- 18 loài nấm lớn mọc tự nhiên và được nuôi trồng đã được nghiên cứu điều tra về hoạt độ proteolytic (PA) và amylolytic (AA) phát hiện thấy AA ở 16/18 loài (chiếm 88,9%) và PA ở 12/16 loài (chiếm 75%)

- Thử nghiệm phương pháp W olgemuth trên bản nhựa cho thấy có thể dùng phương pháp cải tiến này để xác định hoạt độ của amylase

- Ket quả nghiên cứu tính chất của proteinase và amylase ở 3 loài nấm

ăn thường gặp là: nấm sò trắng, nấm hương, nấm rơm, cho thấy proteinase ở các loài nấm trên thuộc nhóm proteinase - serine và/hoặc proteinase-aspartic, còn amylase là a-am ylase và/hoặc ß-amylase

- Khi tương tác với enzim, lectin từ rong biển ưỉva conglobata đã kìm hàm hoạt độ của các proteinase ở nấm sò trấng, nấm hương và nấm rơm,

nhưng không ảnh hưởng tới hoạt độ của amylase ở các loài nấm trên Lectin

tách từ Hải miên Caỉỉyspongia sp hầu như không ảnh hưởng đển a-

chymotripsin nhưng lại kìm hãm rõ nét hoạt độ của papain

6 Tình hình kinh phí của đề tài

Kinh phí được cấp: 20 triệu đồng

Kinh phí quyết toán: 20 triệu đồng

STUDY ON INTERACTIONS OF LECTINS AND ENZYMES

(PROTEINASE AND AMYLASE) AND THEIR POSSIBLE APPLICATION

SUMMARY

Five species o f marine coral and sponge were examined for lectins (hemagglutinins) and hemagglutinating activity (HAA) was found in extracts

o f 4 species o f which Callyspongia sp is the species containing ABO blood

group non-specific lectin with the highest HAA Lectin from this sponge was partially purified by sephadex G-lOO gel filtration and DEAE-cellulose ion- exchange chromatography (the purity o f the preparation is increased in about

10 times) The lectin is relactivily thermostable (50% HAA remained at 60‘*C

in 30 minutes) and its HAA is inhibited by Lactose

Eighteen species o f mushrooms growing in nature and cultivated were screened for presence o f proteolytic and amylolytic activities (PA & AA) and

AA was found in 16/18 species (88,9%) and PA in 12/16 species (75%) Activity o f amylase can be determined by procedure o f W olgemuth carried out in microtiter plate

Characteristics o f proteinase and amylases from Pleiirotus pulmonatus,

Lentinula edodes and Volvariella volvacea (three edible mushrooms) were

estimated and the results obtained show that proteinases in these mushrooms belong to group proteinase-serine and/or proteinase-aspartic, and amylases are a-am ylase and/or (3-amylase

Studies o f interaction o f the lectins and enzymes showed that lectin

from marine alga Ulva conglobata have no effect on activity o f amylases, but

inhibits activity o f proteinases in three mushroom above mentioned, while

the lectin isolated from Callyspongia sp has alm ost no influence on activity

o f a-chym otripsin, but markedly inhibits the activity o f papain

Nghiên cứu lectin và enzim

2.1 Kết quả nghiên cứu lectin ở một số loài nấm và sinh vât biên

2.2 Ket quả nghiên cứu amylase và proteinase ở nấm lớn

3.1 Tương tác giữa lectin và proteinase

3.2 Tương tác giữa lectin và amylase

nguyên còn ít được khai thác này sẽ mở ra những triển vọng mới cho việc ứne dụng trong sinh học và y học.

Trên cơ sở những điều đã trình bày trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu sự tương tác giữa ỉectin và enzint amylase và prơíeỉnase và khả năng ứng dụng".

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN

Để tìm hiểu một hợp chất tự nhiên, thông thường người ta bắt đầu bàng

nhiên Trên cơ sở kết quả nghiên cứu điều tra, một hoặc một số đổi tượng giàu hợp chất quan tâm hoặc chứa họp chất có tính đặc hiệu đáng chú ý, được chọn

để nghiên cứu sâu hơn Việc nghiên cứu lectin và enzim cũng tuân theo quy tắc trên và đã được triển khai rộng rãi trên các đối tượng sinh vật

1.1 Lectin - một số tính chất và ứng dụng của chúng

Ngày nay, lectin được định nghĩa là: "Protein hoặc glycoprotein liên kết đưÒTig không có nguồn gổc miễn dịch, có khả năng ngưng kết tế bào hoặc (và) kết tủa phức chất xacarit" [12] Từ định nghĩa này thấy rõ hai tính chất quan trọng của lectin là khả năng ngưng kết tế bào, trong đó có tế bào hồng cầu, và khả năng kết tủa các phức chất xaccarit Người ta thường phát hiện lectin bằng chính một trong hai phản ứng này

Lịch sử nghiên cứu lectin [13] được chính thức thừa nhận bắt đầu từ năm

1888 khi Stillmark phát hiện ra tính chất ngưng kết tế bào hồng cẩu của người

và nhiều động vật khác của rixin - một độc tố có bản chất protein được tách ra từ

hạt thầu dầu {Ricinus communis) Sự ngưng kết hồng cầu này là khác nhau ở các

động vật khác nhau; không ngạc nhiên khi lectin còn được gọi là hemagglutinin Tuy vậy, rixin không chỉ ngưng kết tế bào hồng cầu mà còn ngưng kết các tếbào khác như: tế bào gan, tế bào biểu bì, bạch cầu

Công trình của Stỉllmark đã kích thích các nghiên cứu về huyết thanh học

và miễn dịch học Tiếp sau nghiên của Stillmark, hàng loạt nghiên cứu đã được công bố về sự có mặt của lectin ở thực vật, vi sinh vật và động vật

Từ giừa thế kỷ thứ XX trở đi, nhờ tiếp cận hoá sinh và việc áp dụng cácphương pháp mới trong kỳ thuật tách chiết các hợp chất tự nhiên, các nghiên cửu về lectin đã được triển khai sâu rộng và một loạt tính chất độc đáo và khả nâng ứng dụng của lectin đã được đề cập

1.1.1 M ội sổ tính chất hoả lý của lectìn [14]

- về thành phần hoá học: Trong thành phần axit amin của các lectin đã

được nghiên cứu thì axit amin axit (như aspactat) và các hydroxiamino axit (như xerin, treonin) chiếm tỷ lệ khá cao (khoảng 30%), còn các axit amin chứa lưu huỳnh ít hoặc không có Mặc dầu vậy, về thành phần axit amin cũng như trình tự của chúng trong chuỗi polypeptit của lectin, người ta nhận thấy nhừng lectin tách ra từ các loài cùng chi hoặc cùng nhóm có thành phần và trình tự axitamin giống nhau nhiều hoTi là những loài khác chi khác nhóm

Tuyệt đại đa số các lectin đã biết, trong thành phần của mình, ngoài axitamin còn chửa thành phần đường (xáccarit) Các đường tìm thấy trong lectin thường là mannose, glucose, galactose, galactosamine Người ta cũng tìm thấy trong phân tử của một số lectin các ion kim loại như Mg^^, Ca^^, M n‘^ Các ion kim loại này cần thiết cho sự tương tác giữa các gổc đường và lectin

- Khối lượng phân từ của lectin

Khối lượng phân tử của các lectin khác nhau là rất khác nhau Tuy nhiên, khối lượng phân tử của đa số lectin đã nghiên cứu dao động trong khoảng từ 32 kDa đến 120 kDa; sự khác biệt là các lectin liên kết axit sialic: phân tử có hoạt tính của chúng là những tập hợp với khổi lượng vào khoảng từ 200 đến 500 kDa Đặc điểm nổi bật của hầu hết các lectin đã nahiẽn cứu là cấu trúc phân tử

có hoạt tính gồm các phần dưới đơn vị (pdđv) Phân tử có hoạt tính có thể là dimer, tetramer, hexomer hoặc cao hơn như các lectin liên kết axit sialic có thể gồm từ 10 đến 24 pdđv Các pdđv có thể là giống hệt nhau hoặc khác nhau, kết hợp với nhau thành đại phân tử nhờ các liên kết không cộng hoá trị hoặc nhờ các cầu disulíìia Phần dưới đơn vị của lectin có thể là một chuỗi polypeptit hoặc có thể gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptit nối với nhau bàng các cầu disulÍLia Mỗi pdđv có thế có các trung tâm liên kết đường và/hoặc không có trung tâm liên kết ion kim loại, thể hiện tính đa hoá trị của phân tử lectin

- Tỉnh đặc hiệu đường của lectin

Khả năng liên kêt đường (xáccarit) là một trong những tính chất quan trọng nhất của lectin Đặc tính có thể liên kết với một loại đường nhất định, chủ yếu là đưòng đơn (monoxaccarit) thể hiện tínli đặc hiệu đưòng của lectin Việc

xác định tính đặc hiệu này dựa trên mức độ ức chế phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu khi so sánh các đưòng thêm vào phản ứng với nồng độ nhất định, ỏ đây sự ức chế khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu của lectin là do trung tâm liên kết đường của lectin bị đưòng được thử phong toả (liên kết trước) nên không tiếp xúc được với các trung tâm thụ cảm trên bề mặt tế bào hồng cầu Trung tâm liên kết đường của lectin được phân bố trên mồi pdđv của lectin và là một domen gồm một số gốc axit amin chính được bao bọc bởi một vùng gồm các

tương tác giữa lectin với đường, chúng liên kết với lectin ở những vị trí nhất

định gọi là các trung tâm liên kết kim loại Các trung tâm này thường phân bổ ờ vùng gần trung tâm liên kết đường của lectin Việc loại bỏ các ion kim loại trong những trường hợp này làm mất hoạt tính liên kết đường cũng như một sổ tính chất khác của lectin Trong số các lectin đã nghiên cứu, những lectin liên kết Galactose và N-Axetyl-Galactosamine chiếm ưu thế về số lượng cũng như sự phổ biến

Như vậy, khả năng liên kết đường của lectin mang tính chọn lọc và thuận nghịch và là cơ sở của nhiều tính chất sinh học và ứng dụng quan trọng của lectin

1.1.2 M ột số tính chất sinh học của lectin [14]

- S ự ngim g kết tế bào

Nếu tất cả các tế bào được bao bọc bởi đường thì với khả năng liên kết đường của mình, lectin dễ dàng ngưng kết các tế bào, trong đó có tế bào hồng cầu, là điều đễ hiểu Chính phản ứng ngưng kết này cho đến nay vẫn được dùng

để phát hiện sự có mặt của lectin trên các đối tượng nghiên cứu

Phản úng ngưng kết xảy ra khi trong những điều kiện nhất định lectin tạo thành nhiều cầu nối giữa các tế bào cạnh nhau Sự ngưng kết này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất phân tử của lectin (số lượng trung tâm liên kết đường), tính chất của bề mặt và trạng thái sinh lý của tế bào hay điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, pH, nồng độ tế bào Những thay đổi không làm m ất khả năng liên kêt đường của lectin như thay đôi hoá trị (sô phân dưới đơn vị) hay kích thước phân tử, có thể ảnh hưởng lớn đến sự ngưng kết tế bào của lectin Thí

dụ, sự polyme hoá lectin đậu tương làm tăng khả năng ngưng kết hồng cầu bởi lectin tới 100 - 200 lần; ngược lại khi biến đổi lectin đậu rựa (Con A) từ dạng tetrameric thành dạng hoá trị hai (dimer) làm giảm hoạt tính ngưns kết của lectin tới 500 lần Sự thay đổi thành phần xaccarit trong phân tử lectin không ảnh hưcmg đến khả năng ngưng kết tế bào.

Đa số các nghiên cứu về ngưng kết tế bào bởi lectin được tiến hành với các tế bào động vật, kể cả tế bào hồng cầu máu người Máu người khác máu

ngưng kết tế bào hồng cầu, người ta phát hiện một số lectin có tính đặc hiệu nhóm máu, nghĩa là một lectin chỉ gây ngưng kết tế bào hồng cầu thuộc một nhóm máu nhất định trong số các nhóm máu kể trên Ngoài tế bào động vật, lectin cũng liên kết các tể bào khác như vi khuấn, vi nấm, protozoa, tế bào thực vật Sự ngưng kết tế bào là cơ sở của nhiều ứng dụng quan trọng của lectin

- Khả năng kích thích phân bào: khi tương tác với các tế bào lectin có khả

năng kích thích phân bào nguyên nhiễm (mitosis) như trong nghiên cứu với tể bào limpho T của hệ miễn dịch ở người Lectin đầu tiên được nghiên cứu về khả năng kích thích phân bào nguyên nhiễm là lectin từ đậu côve (phaseolus vulgaris) - ký hiệu là PHA, Không phải bất kỳ lectin nào cũng gây kích thích phân bào, nhưng nhiều lectin từ cây họ đậu đỗ là tác nhân gây kích thích phân bào (mitogen) các tế bào limpho T ở người

M ột nghiên cứu khác [15] cho thấy lectin của hạt một sổ loài mít hoang dại ở Việt Nam cũng biểu hiện khả năng kích thích phân bào các tế bào limpho

T ở người

- M ột vài tính chất khác của ỉectin

Một số lectin từ lâu đã được biết là độc tố như rixin, abrin, modexin Một số thực vật khác hay vi sinh vật cũng chứa lectin - độc tố, nhưng độc tính của các lectin thường thấp hơn nhiều (tới 1000 - 2000 lần) so với độc tính của rixin và abrin

Cơ chê tác động của lectin - độc tổ như rixin, abrin đã được biết khá rỏ Ngưòi ta thây các lectin trên đều cấu tạo gồm hai chuỗi polypeptit (chuỗi nặng p- và chuỗi nhẹ a-) nối với nhau bằng các cầu disulfua Chuỗi P- có trung tâm

liên kết đưòrng, còn chuồi a- thì ức chế sinh tổng hợp protein trong các hệ thống

vô bào, thể hiện độc tính của lectin Phân tử lectin nguyên vẹn (gồm chuồi nặng P- và chuỗi nhẹ a-) khi đã liên kết với gốc galactose (hoặc N-Acetyl-

Galactosamine) trên bề mặt màng tế bào qua chuồi ị3, được tế bào thu nhận và ở

đó chuỗi a - ức chế sinh tổng hợp protein bàng cách ngăn cản quá trình kéo dài chuồi polypeptit trên riboxom

M ột số lectin có khả năng tương tác với các kháng thể của người (IgA,

I g D ) [ 1 6 ]

Ỉ.I.S ử n g dụng của lectin [14]

Với những đặc trưng và tính chất của mình, lectin đang được ứng dụng rộng rãi trong hoá sinh học, tế bào học, miễn dịch học, y học, dược học, và nhiều lĩnh vực liên quan khác

Trước hết, lectin là công cụ hữu hiệu để nghiên cửu các phức chất đường như các glycoprotein, glycolipit, polyxaccarit mà nhiều chất trong sổ này là những phân tử có hoạt tính sinh học như các kháng thể miền dịch, các enzim có bản chất glycoprotein - glycoprotein là thành phần của bề mặt màng tế bào Nhờ tính chất liên kết đường của lectin nên khi một polyme sinh học (biopolymer) nào đó liên kết với lectin có thể coi đó là bằng chứng rằng polyme đó có chứa đường, hơn nữa nếu lectin có tính đặc hiệu đường nhất định thì có thể khẳng định đường (hoặc các đưòng) liên kết đặc hiệu với lectin có trong thành phần xaccarit của poỉyme sinh học đã nghiên cứu

Một khi lectin được gắn vào giá thể không tan (như agarose hay sepharose) sẽ trở thành phương tiện hữu hiệu trong sắc ký ái lực để tinh sạch các glycoprotein, glycolipit, hay các phức chất đường khác Thực tế bàng sắc ký ái lực trên cột chửa lectin người ta đã tinh sạch được nhiều glycoprotein của màng

tế bào, nhiều polyxaccarit, oligoxaccarit, hay glycolipit và nghiên cứu tính chất của chúng ConA là lectin được dùng rộng rãi với mục đích này Lectin từ hạt

các loài thuộc chi Artocacpus cũng được dùng để tinh chế protein kháng thể

huyết thanh người [16, 17'

Gần đây lectin còn được ứng dụng trong kỹ thuật ELLA (Enz>Tne-Linked Lectin Assay) và kỹ thuật ELLA được dùng để xác định thành phần và tính chất của chitin [18] hay các dẫn xuất đường trong tương tác với lectin [19].

ứ n g dụng quan trọng khác của lectin là việc xác định cấu trúc hoá học các yếu tố quyết định nhóm máu A, B, o ở người Chính việc sử dụng các ỉectin đặc hiệu nhóm máu (như lectin đặc hiệu nhóm máu A của đậu Lim, lectin đặc hiệu

nhóm máu o của đậu Lotus tetragonoỉobus hay của lươn Anguilla angidỉỉa kết

hợp với nghiên cứu phản ứng ức chế bởi đường của các lectin trên, ns;ười ta đã xác lập được các loại đường ưu thế miễn dịch của các kháng nguyên A, B, và o (H) tương ứng là N '-Acetyl-galactosam ine, D-Galactose và L-Fucose

M ột ứng dụng khác của lectin là việc sử dụng chúng như chất tải thuốc trong hoá trị liệu chữa bệnh hay được dùng như chất dẫn thuốc có định hướng trong chữa bệnh theo liệu pháp LEAPT (Lectin-directed enzyme- activated prodrug therapy) [11],

Ngoài các ứng dụng đã kể trên, lectin còn được dùng để phân loại vi khuẩn [20, 22], nấm cũng như nghiên cứu cấu trúc màng của chúng, để chẩn đoán bệnh do nhiễm khuẩn [21]

1.2 về enzim và enzim amylase và proteinase

Enzim, như chúng ta đã biết, là những chất xúc tác sinh học, thúc đẩy các

là protein đơn giản hoặc phức tạp Xét về tính chất và đặc điểm xúc tác, enzim

có nhiều tính chất giống như các chất xúc tác vô cơ, nhưng chúng thể hiện hàng loạt đặc điểm chỉ có ở loại chất xúc tác smh học như: tính kém bền nhiệt, hoạt

độ của enzim phụ thuộc nhiều vào pH và thành phần của môi trường, nhưng chúng lại có tính đặc hiệu và hiệu quả xúc tác cao Nói chung, sự xúc tác bởi enzim xảy ra với tốc độ cao trong các điều kiện nhẹ nhàng (như điều kiện trong

cơ thể sống) Bên ngoài cơ thể sống, trong các điều kiện gần với điều kiện trong

cơ thể, enzim vẫn duy trì được tính đặc hiệu và hiệu quả xúc tác cao

Theo bản chât hoá học, enzim có thể chia thành hai nhóm lớn: enzim là protein đơn giản và enzim phức tạp mà trong thành phần ngoài protein ra còn

chứa các yếu tố khác không phải là protein gọi là các coenzim; các coenzim

thường có thể là dẫn xuất của các vitamin hay các ion kim loại

Theo khuyến cáo của Hiệp hội sinh học quốc tể, tất cả các enzim đã biết

được chia thành sáu nhóm:

1) Oxidoreductase - là những enzim xúc tác cho các phản ứng oxi hoá -

khử

2) Transferase - những enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển nhóm

nguyên tử (như nhóm amin, nhóm metyl, gốc photphat )

3) Hydrolase - các enzim này xúc tác cho các phản ứng thuỷ phân các

6) Ligase (synthetase) - xúc tác cho các phản ứng tổng hợp các chất

Mồi nhóm enzim trên còn có thể được chia thành các phân nhóm nhỏ hơn

tuỳ vào cơ chất chịu chuyển hoá hoặc cơ chế xúc tác

1.2.1 A m ylase

Amylase thuộc nhóm enzim thuỷ phân - Hydrolase Amylase là tên gọi

chung cho các enzim thuỷ phân các polyxaccarit (tinh bột, glycogen ) thành các

sản phẩm maltose và glucose Thuộc nhóm này có 3 loại: a -Amylase, p~

Amylase và y-Amylase hay glucoamylase Amylase có phổ biến ở động vật

(trong nước bọt, dịch tuyến dạ dày, trong máu, trong gan), trong thực vật (ở hạt

ngũ cốc nảy mầm), trong dịch nuôi cấy vi sinh vật hoặc vi nấm

- a-Am yỉase là một endoenzim có khả năng phân cắt các liên kết a-1,4

glucozit nam ờ bên trong cơ chât (tinh bột, glycogen) một cách ngẫu nhiên; quá

trình thủy phân polyxaccarit bởi a-A m ylase là quá trình đa giai đoạn, sản phẩm

thuỷ phân đường đa bởi a-Am ylase chủ yểu là các oligoxaccarit (dextrin) và một

phần maltose, rứiừnơ sản phâm không băt màu với iot Tác động của a -Amylase

thường làm giảm nhanh độ keo, độ polyme hoá của pol>7caccarit Vì vậy có thể

xác định hoạt độ của a-Amylase bằng cách đo sự thay đổi độ nhớt của duna dịch hoặc nhờ phản ứng màu với iot.

a-A m ylase là một metaloenzim, trong phân tử có chứa ion Ca'", khi tách

a-A m ylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối, rượu loãna, hoạt động tốt trong môi trường axit yếu (pH 5-7) Các a-Amylase có độ bền nhiệt khác nhau, bền nhất là các enzim tách từ vi sinh vật

- ỊỈ~Ámylase

Enzim này phân cắt các liên kết 1,4 glucozit từ đầu không khử của phân

tử polyxaccarit để tạo thành các phân tử maltose Sản phẩm thuỷ phân bởi Ị3-

mình (rất bền khi không có Ca^ ) nhưng hoạt động của nó cũng bị kim hãm bởi

lot pH thích hợp cho hoạt động của enzim trong khoảng 4-6 P- Amylase kém bền nhiệt hơn a-Amylase; nó có phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt có nhiều trong hạt nảy mầm

- Gìucoamyỉase

Glucoamylase là một exoenzim, thuỷ phân liên kết a-1,4 glucozit trong phân tử polyxaccarit, tách tuần tự từng gổc glucose từ đầu không khử của đại phân tử và có khả năng xúc tác thuỷ phân cả liên kết 1,6 glucozit Glucoamylase

có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, dextrin, maltose thành glucose mà không cần trợ giúp của các amylase khác Đa số các glucoamylase

đã biết đều thuộc loại enzim "axit", thể hiện hoạt lực tối đa ở pH 3,5-4,5 Hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng đến 70*^0, kém bền dưới tác dụng của rượu etylìc, axeton Glucoamylase có trong dịch tiêu hoá, trong gan của người và động vật; trong hạt nảy mầm, đặc biệt trong môi trường nuôi cấy

các vi sinlì vật mà chủ yếu là chủng nấm mốc Aspergillus.

- Y nghía kinh tẻ - kỹ thuật của amyỉase

Amylase là enzim có ứng dụne; rộng rãi nhât H àns năm trên thế giới khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất lên lới hàng chục \ạ n tấn và ngày càns tăns Amylase được dùnơ trona nhiều lĩnh vực như; Cỏn2 nehiệp thực phẩm, y

học, nông nghiệp Trong công nghiệp thực phẩm, việc sàn xuất rượu, bia được cải thiện khi thay thế một phần phương pháp truyền thổng bằng sử dụng các chế phâm amylase như việc dùng amylase của nâm môc hay vi khuân đê đường hoá các nguyên liệu phi malt đã tiết kiệm được nguyên liệu cao cấp, tăng hiệu suất rượu bia, giảm thời gian sản xuất, tăng năng suất lao động, giảm giá thành sản phẩm.

Trong công nghiệp dệt: amylase được dùng để rửa hồ trước khi nhuộmvải

Trong y học: người ta dùng amylase để sản xuất glucose tiêm hoặc hỗ trợ cho bừa ăn của người ốm nặng

1.2.2 Proteinase

Proteinase cũng là các enzim thủy phân thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình phân cắt các liên kết peptit trong các peptit hoặc protein có sự

Trong các proteinase, enzim tiêu hoá được nghiên cứu sớin nhất Năm

1857, Corvisart đã tách được tripxin từ dịch tuỵ, đó là proteinase đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm Vào năm 1961, Bruke đã tách được pepxin từ dạ dày chó

Các proteinase ở thực vật được phát hiện muộn hơn và Wurtz là người đầu tiên tách được proteinase ở thực vật vào năm 1879, đỏ là papain từ cây đu

đủ {Carica papaya) Từ nửa đầu thế kỷ 20 trở đi, nhờ áp dụng những phương

pháp mới, người ta đã phát hiện thêm nhiều proteinase khác như bromelain ở dứa, catepxin ở mô động vật và đặc biệt nhiều proteinase khác nhau từ các giống

vi sinh vật Baciỉỉus, Aspergỉỉìus, Streptomyces

Việc phân loại và gọi tên enzim xúc tác cho phản ứng thủy phân protein cũng thay đổi theo thời gian Theo Grasman và D ykerhoff (1928), các enzim nhóm này được phân loại như sau:

Proteinase

Protease

Peptiđase

11

Theo Bergman và Ross (1936), peptidase lại được chia thành 2 nhóm nhỏ là: Enđopeptidase và exopeptidase.

Barret và Donald (1986) chia các enzim nhóm này như sau:

+ Proteinase - serine (EC.3.4.21)

+ Proteinase - cysteine (EC.3.4.22)

+ Proteinase - Aspartic (EC.3.4.23)

+ Proteinase - Kim loại (EC.3.4.24)

- Proteinase - serine

Là những proteinase có nhóm -OH của gốc axitamin serin trong trung tâm hoạt động (TTHĐ) có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzim Thuộc phân nhóm này gồm các enzim như tripsin, Chymotripsin, Kalikrein, Hoạt độ của chúng bị kìm hăm mạnh bởi D iisopropylfluophotphat (DFP) và nhiều protein đặc hiệu khác (ppí)

Các Proteinase - serine thường hoạt động mạnh ở vùng pH kiềm và chúng

có tính đặc hiệu tương đối rộng Tính đặc hiệu thể hiện chúng chỉ phân cắt các liên kết peptit về phía axitamin có chứa nhóm -CO- của liên kết bị phân giải Vỉ

dụ tripsin thuỷ phân các peptit chứa nhóm -CO- của các axitamin kiềm như Lysin, Arginin

- Proteinase - cysteine

Trong trung tâm hoạt động của các enzim phân nhóm này thườna chứa nhóm -SH Nhóm -SH có vai trò quan trọng trong phân tử enzim vì nó có khả năng phản ứng cao, tham gia vào sự tạo thành phức trung gian enzim - cơ chất, kết hợp giữa cơ chất và cofactor, duy trì cấu hình của enzim

Các proteinase - cysteine thường hoạt động mạnh ờ môi trường pH tm ng tính và có tính đặc hiệu rộng Proteinase - cysteine chỉ hoạt động mạnh khi nhóm -SH không bị bao vây Vì thế các chất như: cysteine, axit ascorbic, glutation khử ở nồng độ xác định có tác dùng làm bền, hoạt hoá các enzim này

cloromercuriben-zoat (P-CMB) hay iodoaxetamit ức chế mạnh hoạt độ của các proteinase - cysteine EDTA có khả năng liên kểt với kim loại trong dung dịch,

vì vậy thường làm tăng độ bền của proteinase “ cysteine

- Proteinase - Aspartic

Phân nhóm này gồm các proteinase có chứa các nhóm cacboxil (-C 0 0 -) trong TTHĐ Nhóm cacboxit này thuộc mạch bên của Aspactat, glutamat, đóng vai trò xúc tác trong TTHĐ của enzim

Các proteinase- Aspartic thường hoạt động mạnh ờ môi trường pH axit và

bị ức chế bởi Diazo-axetyl norleucine m etylester (DNM E) Chúng có tính đặc hiệu đối với các axitamỉn thơm hoặc axitamin kỵ nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị phân giải

- Proteinase - kim loại

Là nhừng proteinase cần kim loại cho hoạt động xúc tác của chúng Kim loại có thể tham gia vào hoạt động xúc tác của enzim theo nhiều cách khác nhau:

là thành phần cấu tạo của enzim, hoặc tạo thành liên kết cộng hoá trị với các gốc axitamin trong phân tử enzim Ngoài ra một số ion, đặc biệt là Ca“~ thường có tác dụng làm bền cẩu trúc không gian của phân tử enzim do đó có ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzim

Các proteinase kim loại hoạt động mạnh nhất ở môi trườna pH trunạ tính

và có tính đặc hiệu về phía gốc axitamin chứa nhóm -NH- của liên kết peptit

Hoạt động của các proteinase - kim loại bị kìm hãm dưới tác dụng của EDTA, a- phenantrolin.

Với việc phát hiện các proteinase mới, mỗi phân nhóm proteinase trên còn bao gồm các họ enzim có thể có nguồn gốc rất khác nhau

- ứ n g dụng của proteinase

Có hai cách chính trong sử dụng proteinase: (1) Điều hoà định hướng tác dụng của enzim trong chính nguyên liệu chửa nó và (2) tách enzim ra khỏi nguyên ỉiệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong các quá trình sản xuất và nghiên cứu

Sử dụng enzim theo cách thứ nhất trong nhiều trường hợp làm tăng giá trị sản phẩm, ví dụ có thể dùng yếu tố nhiệt độ để điều chỉnh hoạt độ của một sổ enzim trong cá, chè, thuốc lá làm tăng rõ rệt vị hương, màu sắc của sản phẩm Tuy nhiên, phạm vi ứng dụng enzim theo cách này thường bị hạn chế

Sử dụng enzim theo cách thứ hai thì phạm vi ứng dụng rộng rãi hơn và hiệu quả hofn Theo cách này proteinase được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như; trong công nghiệp thực phẩm để chế biến bơ, phomat, sản xuất nước mắm, sản xuất nước giải khát , trong công nghiệp dệt để hồ tơ, rũ hồ lụa, trong công nghệ dược phẩm và y học dùng làm thuốc tăng khả năng tiêu hoá, tăng chất lượng bột dinh dưỡng, làm thuốc tiêu viêm, thuốc uổng giảm đau (a- chymotripsin) Đẻ phục vụ mục đích trên, ở nhiều nước đã hình thành và phát triển mạnh ngành kỷ thuật sản xuất chế phẩm enzim

N hư vậy, việc nghiên cứu có nhóm chất riêng rẽ như lectin hay enzim proteinase và amylase đã đưa lại những hiểu biết giá trị và các ứng dụng hiệu quả trong đời sống xã hội Mặc nhiên, trong sinh giới hay trong cơ thể sinh vật, các chất không tồn tại độc lập, chúng có thể tương tác với nhau tạo sự chuyển hướng trao đổi chất theo chiều có lợi cho sinh trưởng và phát triển của sinh vật Mặt khác, trong sử dụng các nguồn nguyên liệu tự nhiên cho mục đích kinh tế hoặc đời sống, người ta cũng đã hướng tới sử dụng nhừng sản phâm tự nhiên có tác dụng tăng cường như thuốc (các thực phẩm chức nãnạ) N ahiên cứu sự tương tác giữa các chất, một mặt làm sáng tỏ vai trò của từng chất, mặt khác làm

C H Ư Ơ N G 2 NGHIÊN CỨU LECTEV VÀ ENZIM

N hư đã nêu ở trên (phần mở đầu) - Lectin và enzim được nghiên cứu nhiều trên các đổi tượng động thực vật bậc cao hoặc vi sinh vật Các đổi tượng sinh vật bậc thấp như nấm, rong biển hay một số động vật biển chưa được quan tâm nhiều, trong khi đó nguồn sinh vật này ở nước ta rất đa dạng và phong phú Đối tượng mà chúng tôi quan tâm là một số loài nấm lófn và một số sinh vật biển được thu gom ở các vùng khác nhau trên cả nước

Việc điêu tra nghiên cứu lectin, proteinase và amylase được tiến hành như sau: phát hiện lectin trong nguyên liệu bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu máu người; hoạt độ của proteinase và amylase được khảo sát theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với các cơ chất tương ứng (cazein đối với proteinase

và tinh bột đối với amylase)

Đổi với hoạt độ của amylase, ngoài phưomg pháp khuếch tán trên đĩa thạch, chúng tôi còn xác định hoạt động của enzim này bằng phương pháp Wolgemuth có cải tiến (thực hiện trên bản nhựa có các hàng giếng nhỏ V =0,2ml)

Hàm lưọng protein được xác định bàng phương pháp Lowry Tinh sạch một phần hay thu chế phẩm tinh sạch các protein có hoạt tính trên bàng phương pháp sắc ký lọc phân tử qua cột sephadex hoặc/và cột trao đổi ion DEAE - cellulose (DEAE - cel)

2.1 Kết quả nghiên cứu lectin ở một số loài nấm và sinh vật biển

Các nghiên cứu điều tra trước đây của chúng tôi đã phát hiện một số loài rong biển và một sổ loài nấm lớn được nuôi trồng hoặc mọc tự nhiên chửa lectin với hoạt độ ngưng kết tể bào hồng cầu naười (HAA) khá cao (bảna 1)

Lectin ở một số loài trên đã được tinh sạch và nghiên cứu các tính chất đặc trưng

Kết quả nghiên círu điều tra lectin ở một số động vật biển (bảns 2) cho thấy lectin cũng khá phổ biển ở đối tượng này Mặc dù không có tính đặc hiệu

nhóm máu người, trong sô 5 loài đã điêu tra có 4 loài chứa lectin và loài có hoạt

độ HAA cao nhất là Hải miên {Caỉlyspongia sp.)

Bảng 1 Hoạt tính lectin (HAA) của một sổ rong biển và nấm lớn

Hải Phòna) định loại

Hai loài trong sô các loài đã điêu tra trên là nấm Naucoria sp và Hải miên

Caỉlyspongia sp được chúng tôi chọn để nghiên cứu tiếp theo về lectin.

- Tính đặc hiệu đường của ỉectin

K êt quả nghiên cứu mức độ ức chế phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu của lectin từ nấm Naucoria sp và Hải miên bởi một sổ đường đơn và oligoxacarit được trình bày ở bảng 3

Bảng 3 Sự ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu máu người của nấm và

hải miên bởi đường

chế hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ hải miên Calỉyspongia sp., đặc biệt

là đồng phân a-Lactose ức chế khá mạnh (tới nồng độ 0,025M) gấp gần 10 lần P-Lactose (0,2M) Việc không phát hiện thấy loại đường ức chế lectin từ nấm

Naucoria sp có thể là do số loại đường được thử còn hạn chế, trong khi đó sự

ức chế hoạt độ ngưng kết của lectin từ hải miên bởi hai đồna phân của cùng một loại đưòng với mức độ khác nhau có thể giả thiết là trong dịch chiết của hải miên có thể tồn tại hai lectin khác nhau (các isolectin) Đây cũng là điều khá thú

vị vì nguồn sinh vật bậc thấp nói chung và sinh vật biển như hải miên khá phong phú, nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về lectin

- Anh hưỏmg của nhiệt độ

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ hai loài sinh vật trên được nghiên cứu bằng cách xử lý mẫu ở các nhiệt độ khác

cầu máu người như thường lệ Ket quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4

B ảng 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lectin từ nấm Naiicoria sp và hải

miên Caỉlyspongỉa sp.

Từ bảng 4 và ảnh 1 thấy rõ lectin từ hai loài được nahiên cứu trên khá bền

của hải miên ở 80^c trong 30 phút vẫn biểu hiện tới 25% hoạt độ, thậm chí ở 100*^C vẫn còn duy trì được >5% hoạt độ Đây cũng là điều kiện thuận lợi trong việc bảo quản v à xử lý mẫu khi khai thác đôi tượng này

19

chứng tỏ lectin có khôi lưọng khá lớn, và việc đỉnh protein này tách khôno rõ ràng (kèm vai ổLnh) nói lên rằng có thể đây không chỉ gồm 1 loại lectin.

Bảng 5 Tóm tắt kết quả sắc ký lọc phân tử dịch chiết hải miên

{Caỉỉyspongỉa sp.) qua cột Sephadex G-100

Mầu

Hàm lượne protein

Hoạt độ tổna

HAAy'ma protein)

Độsạch

Thô (dịch

N ghiên cứu phổ protein trong dịch chiết hải miên băng phương pháp sẳc

ký trao đổi ion trên cột DEAE- cellulose ÍDEAE - cel) (hình 2, bảng 6) cho thấy

protein cua dich chiêt hải miên qua cột DEAE - cellulose biểu hiện dưới dạns sau đinh protein chinh, trong đó có 1 đỉnh (tách không rõ ràns) có hoạt tính lectin; đỉnh protein này được rút khỏi cột ở nồng độ NaCl 0,4M Sự phân tách các protein ở đây rõ hơn và protein - lectin cũng được tinh sạch hơn, độ sạch tăng lên gần 10 lần.

Bảng 6 Tóm tắt kết quả sắc ký dịch chiết hải miên

qua cột DEAE - cel

Mau

Hàm lượng protein

Hoạt độ tổng số

Hoạt độ riêna (đv HAA/ma protein)

Độsạch

2.2 Kết quả nghiên cứu amylase và proteinase ở nấm lớn

Hoạt độ của amylase và proteinase ở các loài nấm lớn mọc tự nhiên hoặc được nuôi trồng trên địa bàn Hà Nội và một số nơi khác (như Lâm Đồng, Thừa Thiên Huế) được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Kết quả điều tra (bảng 7) cho thấy mặc dù hoạt tính khôna cao nhưng amylase và proteinase có phổ biến ở các loài nấm đã nghiên cứu: 16/18 loài (88,9%) có AA và 12/16 loài (75%) chửa PA ỏ nhữnạ loài biểu hiện AA và PA thì enzim axit và tm ng tính chiếm ưu thế (kết quả xác định AA và PA ở pH axit yểu và ở pH kiềm không trình bày ờ đây) Hơn nữa, liên hệ với hệ thốnR phân

đặc tính này

B ảng 7 Hoạt độ amylolytic (AA) và hoạt độ proteol}tic (PA) ỡ một số

Ghi chú: - Tên loài nấm do GS.TS Trịnh Tam Kiệt định loại

- Hoạt độ của các enzim được xác định ờ pH 6.5;

- Dấu (+) là có hoạt tính, số càna lớn ihể hiện hoạt độ càns mạnh;