Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần - Chuyên đề

Tiến hành lấy mẫu 5 đợt, mỗi đợt cách nhau 2-5 ngày tuỳ theo từng giống Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tạo thể nhị bội từ thể tứ bội thông qua lai hữu tính * Khả năng ra hoa của các giống k

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

VIỆN SINH HỌC NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYÊN ĐỀ

“Nghiên cứu tạo thể nhị bội từ thể tứ bội thông qua lai hữu tính và nuôi

cấy bao phấn khoai tây”

Thuộc đề tài TẠO GỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS

BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

Hà Nội, 2008

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ

Phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai lại (back cross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985) vấp phải những khó khăn về mặt

đặc tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum) Đó là bộ genom

của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n=4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự phân ly sau lai tạo với một quần thể rất lớn, rất phức tạp, đòi hỏi quá trình chọn lọc rất nhiều công sức Quá trình này đòi hỏi tối thiểu 10 năm để có được một giống lai

ra đời (Fitsden, 1984) Ngoài ra, nhiều đặc tính chống chịu do nhiều gen quy định sẽ

có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau Con đường để khắc phục khó khăn này đã được Wenzel et al (1974) đề xuất cho thấy sự áp dụng tổ hợp các kỹ thuật của công nghệ tế bào trọng tạo giống khoai tây bao gồm các kỹ thuật: giảm độ bội từ tứ bội xuống monoploid, sau đó chọn lọc thể lưỡng bội dihaploid và cuối cùng dung hợp tế bào trần 2 thể diploid đã chọn lọc để tạo giống khoai tây tứ bội tetraploid mang các đặc tính mong muốn Theo định hướng này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chuyên đề

“Nghiên cứu tạo thể nhị bội từ thể tứ bội thông qua lai hữu tính và nuôi cấy bao phấn khoai tây”

PHẦN II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các dòng , giống khoai tây được lưu giữ tại Viện sinh học Nông Nghiệp-Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Trong đó: S.phureja 48 là giống khoai tây dại do Viện nghiên cứu nguồn gen cây trồng Đức cung cấp

NY115, Dakota Diamond, Lachipper, Megachip, Beacon Chipper, là các giống chế biến được nhập nội từ Mỹ

2.2 Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu nuôi cấy bao phấn các dòng, giống khoai tây

* Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến khả năng tồn tại của mẫu cấy

- Thí nghiệm với 3 chế độ khử trùng (8 giống khoai tây khác nhau):

CT11: Đ/c 1 + 1BA + 0,5Ki + 10%ND CT12: Đ/c 1 + 1BA + 0,5Ki + 0,2IAA + 10%ND

* Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh (4– 50C) đến tỷ lệ tạo callus của bao phấn khoai tây (%),(sau 3 tuần nuôi cấy)

Tiến hành lấy mẫu 5 đợt, mỗi đợt cách nhau 2-5 ngày tuỳ theo từng giống

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tạo thể nhị bội từ thể tứ bội thông qua lai hữu

tính

* Khả năng ra hoa của các giống khoai tây

* Kết quả lai giữa dòng khoai tây dại Solanum phureja48 và các dòng khoai tây tứ bội

3.2 Phương pháp nghiên cứu

- Các thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên , 3 lần lặp lại

* Phương pháp lai

+ Khoảng 2-3 giờ chiều hôm trước hái hoa cây bố (những bông hoa nở từ sáng), gói vào giấy thấm sạch rồi để vào phòng thoáng mát, ngày hôm sau lấy hạt phấn cho vào tờ giấy sạch rồi đem lai với cây mẹ

+ Tiến hành khử đực cho cây mẹ vào chiều hôm trước (khử ở những bông hoa sắp nở), khoảng 10-11 giờ sáng hoặc 2-3 giờ chiều hôm sau thì thụ phấn cho cây mẹ

* Phương pháp trồng

Trồng giống S.phureja trước, sau đó cứ cách 7 ngày trồng các giống còn lại Sau 30 ngày thì kết thúc trồng

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu nuôi cấy bao phấn các dòng, giống khoai tây

Bảng 1: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến khả năng tồn tại của bao phấn khoai tây (%) (sau 1 tuần)

Diaman

t Solara KT2 NY115

Dakota Diamond

- Tỷ lệ mẫu sạch đạt từ: 29 – 54% và 41 -68%

Như vậy chế độ khử trùng kép tỏ ra thích hợp hơn đối với tất cả các giống khoai tây, điều này đwocj thẻ hiện qua tỷ lệ mẫu nhiễm giảm hơn 12 -13%, đồng thời tỷ lệ mẫu sạch tăng hơn 12 -14% so với chế độ khử trùng đơn

Bảng 2: Ảnh hưởng của nền môi trường khác nhau đến tỷ lệ tạo callus của bao phấn khoai tây (%), (sau 3 tuần)

_ Trong tất cả các giống, giống NY115 tỏ rưa thích hợp với hầu hết các loại môi trường với tỷ lệ hình thành callus từ 40,9 – 69,8%; tiếp đến là giống Dakota 41 – 70,1%, giống KT2 45,5 – 68,7%; giống Lachipper 48,3 – 50,9%; kém nhất là giống Beacom Chipper chỉ hình thành callus ở 1 môi trường

- Trong tất cả các môi trường , môi trường số 10 tỏ ra thích hợp với nhiều giống khoai tây (5 giống), với tỷ lệ hinhg thành callus từ 45,5 -> 69,8%, tiếp đến là môi trường số 3 và 12 (4 giống), kém nhất là môi trường số 6 và 8 (chỉ có 1 giống có phản ứng tạo callus)

Đặc biệt ở môi trường số 122, tỷ lệ hình thành callus đạt cao nhất 70,1%

Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến khả năng tạo callus của bao phấn khoai tây (sau 3 tuần nuôi cấy)

Kết quả cho thấy, xử lý lạnh có ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành callus của các giống khoai tây ở công thức không xử lý, tỷ lệ hình thành callus đạt dưới 50%, trong khi đó tỷ này ở các công thức có xử lý là 41,5 -63,2% (xử lý lạnh ở 24 và 36h).Và đạt hiệu quả cao nhất là công thức xử lý lạnh ở 36h cho tỷ lệ hình thành callus ở tất cả các giống đều cao Tuy nhiên, càng xử lý lạnh lâu hơn thì tỷ lệ hình thành callus lại giảm xuống, thậm chí có một số giống bao phấn có thể bị chết

Bảng 4: Ảnh hưởng của thời điểm lấy mẫu đến tỷ lệ tạo callus (%) (sau 3 tuần nuôi cấy)

Bảng 5: Tình hình ra hoa của các giống khoai tây

Diamant Solara KT2 NY115 Dakota Diamond Lachipper Megachip Beacon Chippper S.phuerja

- Solanum phureja 48 là loài khoai tây dại, đây là nguồn mẫu quan trọng cho công

tác lai tạo giống, đặc biệt là sử dụng làm bố để hạ độ bội của các giống dòng khoai

tây 4X nhằm tạo vật liệu khởi đầu cho dung hợp tế bào trần

- Qua bảng trên cho thấy: thời gian từ trồng -> ra hoa của các giống dao động từ 55

-> 75 ngày Giống Beaconchipper có thời gian ngắn nhất (55 ngày) và dài nhất là

giống S.phureja (75 ngày) Đều này rất quan trọng trong quá trình lai tạo, bởi để các

giống ra hoa trùng khớp với nhau thì chúng ta cần trồng giống S.phureja trước

giống khác từ 10 – 20 ngày

Kết quả lai giữa S.phureja và các giống khoai tây tứ bội

Qua quá trình lai tạo giữa S,phureja và các giống khoai tây Diamant, Solara, KT2,

NY115, Dakota, Lachipper, Megachip, Beaconchipper, kết quả cho thấy: chỉ có tổ

hợp giữa S.phureja vàY115 đạt được 40% số quả sau khi thụ phấn Tuy nhiên gặp

điều kiện bất thuận một số quả lai được đã bị thối, do đó không thu được hạt lai

Còn các tổ hợp lai giữa S.phureja và các giống khoai tây khác không thu được kết

quả

PHẦN IV KẾT LUẬN

- Chế độ khử trùng tốt nhất trong nuôi cấy bao phấn các giống khoai tây là chế độ khử trùng kép: HgCl2 0,1% trong 4’ + HgCl2 0,1% trong 1’

- Môi trường cho tỷ lệ hình thành callus của bao phấn cao nhất (70,1%) là môi trường: MS + 1BA + 0,5Ki + 0,2IAA + 10% nước dừa

- Môi trường thích hợp cho sự hình thành callus từ bao phấn của các giống khoai tây là môi trường : N6 +1BA + 0,5Ki + 0,2IAA + 10% nước dừa

- Thời gian xử lý lạnh (4 – 50) trong 36 giờ cho hiệu quả hình thành callus của các giống khoai tây là tốt nhất

- Nụ hoa ở giai đoạn 1 và 2 (khi cây bắt đầu ra nụ từ 7- 12 ngày) cho sự hình thành callus đạt hiệu quả cao nhất

Thủ trưởng đơn vị Chủ nhiệm đề tài

GS.TS Nguyễn Quang Thạch TS Nguyễn Phương Thảo

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI VIỆN SINH HỌC NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYÊN ĐỀ

“Nghiên cứu làm sạch virus các vật liệu khởi đầu mang các đặc tính mong muốn

phục vụ chương trình tạo giống khoai tây”

Thuộc đề tài TẠO GỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS

BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

Hà Nội, 2007

2

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong công tác chọn tạo giống khoai tây, việc sử dụng khoai tây tứ bội sẽ có

sự phân ly mạnh ở thế hệ sau do đó công tác chọn lọc rất phức tạp, tốn nhiều thời gian, công sức và tiền của Đồng thời có thể mất mát một số tính trạng tốt trong quá trình chọn lọc Trong khi đó khoai tây nhị bội có đặc tính di truyền ổn định, ít phân ly nên thuận lợi hơn cho quá trình chọn lọc Do đó việc đánh giá chọn lọc được các dòng khoai tây nhị bội mang các đặc tính nông sinh học có ý nghĩa, có khả năng kháng bệnh, đặc biệt là bệnh virus sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống là một vấn đề có ý nghĩa then chốt

Chính vì vậy chúng tôi đã thực hiện chuyên đề:

“Nghiên cứu làm sạch virus các vật liệu khởi đầu mang các đặc tính mong muốn phục vụ chương trình tạo giống khoai tây”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Chọn lọc và kiểm tra được tình trạng nhiễm bệnh virus của các dòng khoai tây nhị bội có các đặc tính mong muốn sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho công tác tạo giống Đồng thời làm sạch virus trong trường hợp cần thiết

1.2.2 Yêu cầu

- Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất các dòng

khoai tây nhị bội trong điều kiện in vivo

- Đánh giá tình trạng nhiễm virus của các dòng khoai tây nhị bội bằng phương pháp ELISA

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

* Đối tượng:

Vật liệu nghiên cứu gồm 8 dòng khoai tây nhị bội có nguồn gốc từ Trung tâm Nghiên cứu khoai tây của Viện Nghiên cứu Tài nguyên cây trồng – Bavaria - Cộng hòa liên bang Đức cung cấp.: H1959/195, A15, A16, A41, A56, B186, B208, H1929/34

* Vật liệu

3

- Cây trồng từ củ được tạo ra từ nuôi cấy mô

- Hoá chất dùng để Test ELISA

+ Đệm nghiền mẫu: 8g NaCl; 0,2g KH2 PO 4 ; 2,9 Na 2 HPO 4 12 H 2 O; 0,2g NaN 3 Tổng thể tích 1000ml

+ Đệm carbonat: 1,59g Na 2 CO 3 ; 2,93g NaHCO 3 Tổng thể tích 1000ml

+ Đệm pha kháng thể: 1000ml PBS – T, 2% PVP; 0,2% ovalbumine

+ Dung dịch rửa bản ELISA: 1000ml PBS; 0,2g KCl; 0,5ml Tween20

+ Dung dịch đệm subtrat: 97ml Diethanolamin; 0,2g NaN 3 Tổng thể tích 100ml

* Địa điểm tiến hành:

Viện Sinh học Nông nghiệp–Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất của các dòng khoai tây nhị bội ngoài đồng ruộng

- Thời vụ: Vụ đông Trồng: tháng 11, thu hoạch: tháng 2

- Vật liệu trồng: Củ in vitro

- Thí nghiệm khảo sát không lặp lại

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Chiều cao cây (cm): Đo trực tiếp từ gốc đến đỉnh sinh trưởng

+ Số lá (lá): Tổng số lá tại thời điểm theo dõi

+ Đặc điểm hình dạng thân, lá và củ

+ Các chỉ tiêu năng suất: Khối lượng trung bình củ, năng suất lý thuyết, năng suất thực thu

+ Phân loại củ theo đường kính củ (Φ): 1cm 2cm, 3cm, 4cm

+ Các chỉ tiêu sinh hóa: Hàm lượng đường hoà tan, hàm lượng tinh bột, hàm lượng vitamin C

2.2.2 Kiểm tra tình trạng nhiễm virus của các dòng khoai tây nghiên cứu bằng phương pháp ELISA

Phương pháp ELISA được thực hiện theo quy trình sau:

Bước 1: Cố định kháng thể IgG đặc hiệu của virus vào bản ELISA

IgG hòa trong dung dịch đệm carbonat, cho vào mỗi giếng 200µl Đặt bản ELISA trong hộp ẩm có nắp đậy, để vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 2 giờ Sau khi ủ, các giếng được rửa bằng dung dịch đệm rửa (PBS-T) 4 lần

Bước 2: Cố định dịch cây vào bản ELISA

Bước 4: Cố định chất nền vào bản ELISA

Hòa chất nền NPP (nitrophenol phosphate) vào dung dịch đệm subtra theo tỷ

lệ đã cho Sau đó nhỏ vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA để trong hộp ẩm được đặt ở nhiệt độ phòng Quan sát sự phản ứng màu ở các giếng Sau 1 giờ các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng dương tính, giếng không có màu là không có phản ứng Kết quả được đọc chính xác hơn trên máy đọc ELISA ở bước sóng 405nm

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

- Các chỉ tiêu đo đếm được xử lý kết quả trên phần mềm Microsoft Excel

- Kết quả test ELISA được đọc bằng máy đọc ở bước sóng 405nm, sau đó được tính theo công thức:

ODn

ODs

N S =

OD s : giá trị OD của mẫu

OD n : giá trị OD của đối chứng âm

<2 thì kết luận mẫu không bị nhiễm virus

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất của các dòng khoai tây nhị bội ngoài đồng ruộng

3.1.1 Động thái tăng trưởng chiều cao và số lá

Đặc điểm sinh trưởng phát triển chiều cao và số lá là những đặc điểm về kiểu hình, kiểu hình được thể hiện là sự biểu hiện của kiểu gen dưới sự tác động của môi trường như yếu tố đất đai, khí hậu, kỹ thuật trồng trọt… Động thái sinh trưởng chiều

5

cao của 8 dòng khoai tây nhị bội được đo từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng, 7 ngày đo

một lần Chiều cao là trung bình tất cả các thân chính của 20 khóm từng dòng Theo

dõi động thái tăng trưởng chiều cao cây giúp chúng ta thấy được khả năng sinh trưởng

và phát triển của các dòng, khả năng thích ứng với điều kiện ngoại cảnh trong từng

giai đoạn nhất định ở điều kiện khí hậu Miền Bắc nước ta Kết quả được thể hiện ở

Bảng 1 cho thấy các dòng nhị bội đều sinh trưởng tốt Tuy nhiên, thời gian

sinh trưởng của thân chính rất ngắn trong khoảng từ 63 ngày đến 85 ngày như dòng

H1959/195 sau 63 ngày là ngừng sinh trưởng thân chính, còn một số dòng như A56,

A41, B208, B186 đều có thời gian sinh trưởng thân chính là 84 ngày

Nhìn chung các dòng đều có chiều cao tương đối thấp và không đều nhau, một

số dòng như A56 cao 14,9±0,47, dòng H1959/195 cao 16,2±0,42 đặc biệt dòng A15

cao 13,7±0,5, dòng H1929/34 chỉ cao 9,6±0,51 trong khi đó dòng A41 cao tới

28,8±1,06 và dòng A16 cao nhất đạt 31,0±1,06

Sinh trưởng chiều cao thân chính được thể hiện trên đồ thị cho thấy hầu hết

các dòng đều sinh trưởng chậm, từ tuần 1 đến tuần thứ 4 thì các dòng B186, A41, H1959/195 và dòng A15 là sinh trưởng thân chính rất mạnh đặc biệt là hai dòng H1959/195 và dòng A15 Từ tuần 4 cho thấy hai dòng H1959/195 và dòng A15 có tốc

độ tăng trưởng chiều cao giảm đi trong khi đó dòng B186 và A41 vẫn tiếp tục tăng

trưởng rất mạnh

Qua đồ thị biểu diễn sự sinh trưởng về chiều cao cho thấy có đến 6 dòng sinh

trưởng chiều cao rất chậm, và chiều cao thân chính cuối cùng cũng thấp, đặc biệt là

dòng H1929/34 chỉ đạt chiều cao cuối cùng là 9,6±0,51 dòng A15 là 13,7±0,5

Bảng 2 Động thái tăng trưởng số lá của 8 dòng khoai tây nhị bội

Tuần5 9,5±0,38 10,0±0,56 14,1±0,24 13,7±0,5 13,0±0,3 11,1±0,23 14,9±0,4 13,0±0,36 Tuần6 10,7±0,38 12,1±0,71 16,3±0,36 15,2±0,6 13,7±0,35 12,6±0,25 18,0±0,5 13,6±0,36

Hình 1: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng chiều cao cây của các dòng

khoai tây nhị bội

7

Tuần7 10,8±0,46 11,5±0,68 18,7±0,45 17,2±0,5 14,2±0,41 13,8±0,29 22,0±0,6 15,0±0,55 Tuần8 10,8±0,35 9,2±0,65 18,5±0,57 16,2±0,5 13,8±0,57 12,2±0,3 21,2±0,8 13,2±0,34 Tuần9 11,2±0,45 11,3±0,67 21±0,71 18,6±0,7 15,4±0,55 12,7±0,32 23,9±0,9 13,8±0,35

Bảng 2 cho thấy cùng với sự tăng trưởng về chiều cao thì sự tăng trưởng số lá

cũng rất mạnh, giao động trong khoảng 1 đến 2 lá/tuần, tuy nhiên hầu hết các dòng

đều có số lượng lá cuối cùng là tương đối thấp và không đều nhau, có một dòng chỉ từ

12 đến 14 lá, một số dòng có số lá nhiều hơn đạt từ 20 đến 26 lá như A41 và B208,

trong đó có dòng đạt số lá cao nhất là A16 đạt 26,3±0,9 lá Dòng có số lá thấp nhất là

dòng H1929/34 đạt 12,0±0,59 lá, dòng H1959/195 đạt 12,7±0,32 lá, dòng A56 đạt

12,9±0,25 lá

Sự tăng trưởng số lá của các dòng qua các tuần cho thấy 8 dòng này sinh trưởng rất mạnh trong giai đoạn đầu, từ khi trồng đến tuần thứ 8 đặc biệt là dòng B186 sinh trưởng rất mạnh, tổng số lá là 14,6 lá

Tuần thứ 7 đến tuần thứ 10, hầu hết các dòng đều sinh trưởng có số lá giảm

đi, tốc độ tăng trưởng số lá giảm lớn nhất là dòng H1929/34 đây là thời kỳ cây khoai

A15

Hình 2: Đồ thị biểu diễn sự tăng số lá của các dòng

khoai tây nhị bội

8

tây bước vào giai đoạn cơ quan sinh dưỡng phát triển mạnh đã ức chế quá trình sinh

trưởng của lá

3.1.2 Đặc điểm thân, lá, củ của các dòng khoai tây nhị bội

Đặc điểm thân, lá, củ của 8 dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu được thể hiện ở

9

H1959/195 Thân đứng, có cạnh, màu tía Lá chét to, màu xanh đậm

A16 Thân bò, có cạnh, phân cành

mạnh, màu xanh

Lá chét nhỏ, màu xanh đậm

A15 Thân đứng, có cạnh, màu xanh

nhạt

Lá chét to, màu xanh

Đặc điểm hình dạng thân, lá là 2 chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng đến năng suất

và mật độ trồng Hầu hết các dòng đều có chiều cao thân vừa phải, thân đứng hoặc thân bò, lá có màu xanh đến xanh đậm, số lá nhiều, do vậy mà khả năng quang hợp tốt, tích luỹ nhiều chất khô cho cây, có thể trồng dày, đây là cơ sở cho năng suất củ cao Qua bảng 3 thì dòng A15 và H1959/195 là hai dòng tiềm năng nhất, có thân đứng, lá chét to Những dòng còn lại thường có thân bò, không có hoặc có lá chét nhỏ

- Mắt củ sâu, màu hồng

tím Ruột củ vàng

A56

- Củ dạng oval, vỏ màu vàng xẫm

- Mắt củ nông, màu vàng nhạt

- Ruột củ vàng

11

B208

- Củ dạng dài, vỏ màu vàng xẫm

- Mắt củ lồi, màu tím

- Ruột củ vàng

B186

- Củ dạng oval, vỏ màu vàng

- Mắt củ nông, màu trắng

- Ruột củ vàng

H1959/195

- Củ dạng oval, vỏ màu nâu tím

- Mắt củ sâu, màu tím

- Ruột củ trắng

H1929/34

- Củ dạng oval, vỏ màu vàng

- Mắt củ nông, màu vàng

- Ruột củ vàng

Trong 8 dòng thì chỉ có dòng H1959/195 là có vỏ củ màu nâu tím, ruột củ màu trắng và dòng B208 có củ dạng dài còn lại các dòng khác đều có củ dạng oval, oval –

12

tròn, màu sắc vỏ củ và ruột củ màu vàng, là những dòng có triển vọng về hình dạng củ

và màu sắc ruột củ, được người tiêu dùng ưa thích

3.1.3 Đường kính củ và năng suất của các dòng khoai tây nhị bội

Đường kính củ và năng suất của các dòng khoai tây nhị bội được thể hiện ở

bảng 5 và bảng 6

Đường kính củ của các dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu không quá lớn, đều

dưới 4cm, đa số có đường kính từ 1cm đến 2cm

Bảng 5: Bảng phân loại đường kính củ của các dòng khoai tây nhị bội

Đường kính Φ)

Dòng

0<Φ<=1(cm) (% Số củ)

1<Φ<=2(cm) (% Số củ)

2<Φ<=3(cm) (% Số củ)

3<Φ<=4(cm) (% Số củ)

Sự biến động năng suất giữa các dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu là rất lớn,

dao động từ 4 - 81 tạ/ha, năng suất không cao Năng suất của dòng H1959/195 đạt cao

nhất Dòng H1929/34 đạt năng suất thấp nhất

Sự biến động năng suất giữa các dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu là rất lớn,

dao động từ 4 - 81 tạ/ha, năng suất không cao Năng suất của dòng H1959/195 đạt cao

nhất Dòng H1929/34 đạt năng suất thấp nhất

Bảng 6: Năng suất của các dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu

Năng suất Dòng

Năng suất lý thuyết (tạ/ha)

Năng suất thực thu (tạ/ha) A15 70 61,6 A16 40 36,0 A41 70 68,5 A56 30 26,5 B186 20 17,6

13

B208 60 58,0

3.1.4 Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng khoai tây nhị bội

Những chỉ tiêu hóa sinh là vô cùng quan trọng trong việc quyết định giá trị

dinh dưỡng và hướng sử dụng của củ khoai tây Do vậy sau khi thu hoạch củ chúng

tôi tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh của 7 dòng khoai tây nhị bội, không

đánh giá dòng H1929/34 vì dòng này thu được năng suất quá thấp và củ thu được quá

bé Kết quả được thể hiện ở bảng 7

Bảng 7: Hàm lượng đường khử, hàm lượng tinh bột, hàm lượng vitamin C trong

củ của các dòng khoai tây nhị bội

0,25

0,27

9,41 6,52

5,80

6,67

12,87

5,91 10,01

15,65

13,48

15,05 16,18 14,42 14,61

21,28

]

Qua bảng 7 ta thấy:

Trong 8 dòng khoai tây nghiên cứu thì dòng H1959/195 là dòng có hàm lượng

tinh bột cao nhất (21,28%), hàm lượng đường khử thấp (0,27%), rất thích hợp cho chế

biến Những dòng còn lại tuy có hàm lượng tinh bột thấp hơn nhưng vẫn có thể sử

dụng làm khoai chế biến vì có hàm lượng đường khử rất thấp (<0,5%) hoặc có thể sử

dụng làm khoai ăn Hàm lượng Vitamin C dao động từ 5,8 – 12,87mg, đây chưa phải

là hàm lượng cao nhưng có thể chấp nhận được

Qua khảo sát đặc điểm nông sinh học của 8 dòng khoai tây nhị bội chúng ta

thấy đây là những dòng khoai tây có tiềm năng cho năng suất cao, chất lượng tốt, có

thể dùng làm nguồn vật liệu ban đầu cho công tác chọn tạo giống

3.2 Kiểm tra tình trạng nhiễm virus của các dòng khoai tây nghiên cứu bằng

phương pháp ELISA

14

Các dòng khoai tây nhị bội đã đánh giá được đặc tính nông sinh học Nhưng

để có thể đưa các dòng khoai tây này vào chương trình tạo giống thì chúng phải ở tình

trạng sạch bệnh Vì vậy cần thiết phải kiểm tra độ sạch bệnh của các 8 dòng khoai tây

nghiên cứu, trong trường hợp các dòng bị nhiễm virus phải tiến hành tẩy sạch virus

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp ELISA để kiểm tra độ sạch virus, kết quả

đọc bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405nm thể hiện ở bảng 8

Bảng 8 Kết quả kiểm tra virus trên 8 dòng khoai tây nhị bội bằng

phương pháp ELISA

Chú thích: (-): Không nhiễm; (+): Nhiễm

Kiểm tra virus PVX Kiểm tra virus PVY Dòng Giá trị OD ở bước

sóng 405nm

Mức độ nhiễm

Giá trị OD ở bước sóng 405nm

Mức độ nhiễm

Hình 3: Hình ảnh test ELISA 8 dòng khoai tây nhị bội A Kiểm tra virus

PVY; B Kiểm tra virus PVX

15

Kết quả kiểm tra virus bằng phương pháp ELISA cho thấy cả 8 dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu đều có phản ứng âm tính với virus PVX và PVY, là những dòng hoàn toàn sạch bệnh virus PVX và virus PVY, do vậy không cần phải tiến hành tẩy sạch virus mà có thể sử dụng ngay trong công tác chọn tạo giống

PHẦN IV KẾT LUẬN

Từ những kết quả trên chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

1 Kết quả khảo sát các đặc điểm nông sinh học của 8 dòng khoai tây nhị bội

(H1959/195, A15, A16, A41, A56, B186, B208, H1929/34) trong điều kiện in vivo:

- Chiều cao cây dao động từ 9,6-31 (cm) Số lá biến động từ 12-21,8 (lá) Hầu hết các dòng có thân bò trừ dòng A15, A16, H1959/195 có thân đứng Đây là chiều cao vừa phải, tạo điều kiện cho lá quang hợp tốt

- Hình dạng củ của các dòng khá khác nhau: oval, oval-tròn, dài Chỉ có dòng H1959/195 có vỏ củ màu nâu tím, ruột củ màu trắng còn lại các dòng khác đều

có vỏ củ và ruột củ màu vàng Đây là những dòng có triển vọng về hình dạng củ và màu sắc ruột củ, được người tiêu dùng ưa thích

- Năng suất của các dòng có sự biến động lớn từ 4-81 tạ/ha Dòng H195 có năng suất cao nhất, dòng H34 có năng suất thấp nhất

- Dòng H195 là dòng có hàm lượng tinh bột cao nhất (21,28%), hàm lượng đường khử thấp (0,27%), rất thích hợp sử dụng làm khoai chế biến Những dòng khác

có thể sử dụng làm khoai ăn

2 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ELISA cho thấy cả 8 dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu đều sạch bệnh virus PVX và virus PVY Do vậy không cần phải tiến hành làm sạch virus cho các dòng này

3 Các dòng khoai tây nhị bội đem khảo sát có tiềm năng về năng suất, phẩm chất, đồng thời lại hoàn toàn sạch virus, đây là những nguồn vật liệu ban đầu rất có ý nghĩa trong công tác chọn tạo giống

16

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Vũ Triệu Mân, “Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật”, NXB Nông Nghiệp, 2003

2 Nguyễn Thị Hân (2007) “Đánh giá sinh trưởng, phát triển, tạo củ in vitro của một

số dòng giống khoai tây nhị bội và thu thập các thông tin về marker phân tử có liên quan đến tính kháng bệnh virus ở khoai tây”, Báo cáo thực tập tốt nghiệp

3 Ye-Su Song, Leonard Heptimg, Gunther Schweizer, Lorenz Hartl, Gerhaard Wenzel,

Andrea Schwarzfischer (2005) “Mapping of extreme resistance to PVY (Ry sto ) on chromosome XII using anther-culture-derived primary dihaploid potato lines” Theor

Appl Genet 111: 879-887

Thủ trưởng đơn vị Chủ nhiệm đề tài

GS.TS Nguyễn Quang Thạch TS Nguyễn Phương Thảo

17

PHỤ LỤC

Bảng 9: Vị trí các dòng khoai tây nhị bội in vitro trong bản test ELISA PVX

Bảng 10: Vị trí các dòng khoai tây nhị bội in vitro trong bản test ELISA PVY

18

Bảng 11: Giá trị OD 405nm sau khi test ELISA kiểm tra virus PVX

19

Bảng 12: Giá trị OD 405nm sau khi test ELISA kiểm tra virus PVY

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

VIỆN SINH HỌC NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYÊN ĐỀ

“Nghiên cứu đánh giá và chọn lọc dòng khoai tây nhị bội (diploid) chống chịu virus PVX và virus PVY phục vụ chương trình tạo giống khoai tây bằng kỹ thuật dung hợp

Chính vì vậy chúng tôi đã thực hiện chuyên đề:

“Nghiên cứu đánh giá và chọn lọc dòng khoai tây nhị bội (diploid) chống chịu virus PVX và virus PVY phục vụ chương trình tạo giống khoai tây bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Đánh giá đặc tính kháng bệnh virus PVX và PVY của các dòng khoai tây nhị bội qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử Giới thiệu các tổ hợp lai thích hợp và các mồi phục vụ cho chọn lọc con lai sau dung hợp

1.2.2 Yêu cầu

- Đánh giá khả năng kháng virus qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA

- Đánh giá khả năng kháng virus qua chỉ thị phân tử

- Đề xuất các tổ hợp lai và các mồi chọn lọc con lai sau dung hợp

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

* Đối tượng:

Vật liệu nghiên cứu gồm 8 dòng khoai tây nhị bội có nguồn gốc từ Trung tâm Nghiên cứu khoai tây của Viện Nghiên cứu Tài nguyên cây trồng – Bavaria - Cộng hòa liên bang Đức cung cấp.: H1959/195, A15, A16, A41, A56, B186, B208, H1929/34

* Vật liệu:

- Cây trồng từ củ được tạo ra từ nuôi cấy mô

- Hoá chất dùng để lây nhiễm virus PVY (Phụ lục 1)

- Hoá chất dùng để test ELISA (Phụ lục 2)

- Hóa chất dùng để tách chiết ADN (Phụ lục 3)

- Hóa chất chạy PCR (Phụ lục 4)

- Hóa chất điện di (Phụ lục 5)

- Máy chạy PCR, máy điện di, máy chụp ảnh điện di…

- Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR được trình bày trong bảng 1

* Địa điểm thực tập

Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá khả năng kháng virus của các dòng khoai tây nhị bội qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo

* Nội dung

8 dòng khoai tây nhị bội từ cây nuôi cấy mô trồng trong bồn thuỷ canh, đặt trong nhà lưới được sử dụng làm cây để lây nhiễm nhân tạo Giống thuốc lá C71 được dùng làm cây chỉ thị

20 ngày sau khi trồng cây sinh trưởng phát triển ổn định tiến hành kiểm tra tình trạng nhiễm bệnh virus của 8 dòng nhị bội và cây chỉ thị bằng phương pháp ELISA

25 ngày sau khi trồng tiến hành lây nhiễm nhân tạo Sau 2 tuần lây nhiễm (thời gian ủ bệnh) tiến hành kiểm tra tình trạng nhiễm bệnh bằng phương pháp ELISA

* Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp lây nhiễm nhân tạo theo mô tả của Hill (1984) và Kado (1972) (Phụ lục 6)

- Phương pháp ELISA được mô tả ở phụ lục 7

2.2.2 Đánh giá khả năng kháng virus của các dòng khoai tây nhị bội qua chỉ thị

phân tử

* Nội dung

ADN tổng số của 8 dòng khoai tây nhị bội sau khi tách chiết và tinh sạch sẽ được

tiến hành phản ứng PCR, sử dụng các mồi đặc hiệu cho phép nhân lên đoạn có liên kết

chặt với các gen kháng virus Từ đó đề xuất các tổ hợp lai và các mồi chọn lọc con lai sau

dung hợp

* Phương pháp nghiên cứu:

- Sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số của GS Hans –

Joerg Jacobsen trường Đại học Hannover (phụ lục 8)

- Điện di ADN tổng số và sản phẩm PCR:

ADN tổng số được kiểm tra độ nguyên vẹn trên gel agarose 1% Sản phẩm PCR

được kiểm tra trên gel agarose 3%

Bản gel sau khi chạy được nhuộm bằng Ethidium bromide và được chụp hiện

Theo M.R Marano và cs [4], GM339 nhân đoạn ADN liên kết với gen

kháng virus X Nb

STM0003-111

PrimerF:AATTGTACTCTGTGTGTGTG PrimerR:GGAGAATCATAACAACCAG

Theo Ye-Su Song và cs

[7], STM0003-111 nhân đoạn ADN liên kết chặt với gen kháng virus Y

Ry sto

3 STM0030

PrimerF:AGAGATCGATGTAAAACAC

GT PrimerG:GTGGCATTTTGATGGATT

Sử dụng để đánh giá tính

đa hình

4 STM0037

PrimerF:AATTTAACTTAGAAGATTAGTCTC

PrimerR:ATTTGGTTGGGTATGATA

5 STM1104

PrimerF:TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG

PrimerR:ACGTTAAAGAAGTGAGAGTACGAC

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR

Tm

72ºC

2 phút 1,5 phút

30 chu kỳ

Bảng 4: Nhiệt độ gắn mồi cho các mồi trong phản ứng PCR

STT Mồi Nhiệt độ gắn mồi (Tm)

ODs: giá trị OD của mẫu

ODn: giá trị OD của đối chứng âm

PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đánh giá khả năng kháng virus của các dòng khoai tây nhị bội qua phương

pháp lây nhiễm nhân tạo

Cây in vitro của 8 dòng khoai tây nhị bội đã được kiểm tra và kết luận sạch virus

được trồng trong nhà lưới và sử dụng làm cây để lây nhiễm Khi cây đạt chiều cao khoảng 20cm (3 tuần sau khi trồng), kiểm tra lại độ sạch virus của 8 dòng này bằng

phương pháp ELISA Kết quả kiểm tra cho thấy trước khi lây nhiễm cả 8 dòng này hoàn toàn sạch virus

Sau đó tiến hành lây nhiễm nhân tạo với virus PVY, phương pháp lây nhiễm được trình bày cụ thể trong phần phụ lục

Sau khi lây nhiễm 2 tuần, quan sát thấy cả 8 dòng đều không có triệu chứng bị nhiễm bệnh virus PVY trong khi cây chỉ thị (cây thuốc lá) có triệu chứng bệnh rất rõ Điều đó chứng tỏ 8 dòng khoai tây nhị bội này có khả năng kháng được bệnh virus PVY Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ELISA cũng chỉ rõ cả 8 dòng này đều phản ứng âm tính với virus PVY

Bảng 5: Kết quả kiểm tra test ELISA virus PVY đọc ở bước sóng 405nm

Dòng

OD405nm Nhiễm OD405nm Nhiễm OD405nm Nhiễm A15 0.654 - 0.331 - 0.479 - A16 0.619 - 0.312 - 0.503 - B186 0.640 - 0.37 - 0.432 -

A56 0.628 - 0.285 - 0.503 - A41 0.628 - 0.299 - 0.521 -

3.2 Đánh giá khả năng kháng virus của các dòng khoai tây nhị bội thông qua chỉ thị phân tử

Hình 1: Hình ảnh test ELISA 8 dòng khoai tây nhị bội A Kiểm tra

trước khi lây nhiễm; B Kiểm tra sau khi lây nhiễm virus PVY

Hình 2: Hình ảnh các dòng khoai tây nhị bội trong thí nghiệm lây

nhiễm nhân tạo virus PVY

Trong genom khoai tây người ta đã phát hiện có một số loại gen có khả năng

kháng lại bệnh virus Y, đó là loài S.stolonierum có chứa gen Ry sto , Ry sto na , Ry sto rns; loài

gốc từ loài S.stolonierum cho khả năng kháng rất cao đối với tất cả các chủng PVY Hơn nữa hông chỉ kháng PVY mà gen Ry sto còn cho phép các dòng, giống khoai tây chứa nó

kháng được một số loại virus khác nữa như PVA, PVV Vì vậy gen này được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm

Ye-Su Song và cộng sự (2005) [7] đã sử dụng 12 mồi AFLP và phân tích trên 106 mẫu giống khoai tây có nguồn gốc từ Đức, Hà Lan, Ba Lan để định vị gen Pysto và kết

luận locus của gen Ry sto nằm ở trên nhiễm sắc thể XII và được phát hiện bởi mồi SSR STM0003 – 111 Mồi STM 003 - 111 nhân đoạn ADN có kích thước 111bp cùng nằm

trên NST XII và liên kết rất chặt với gen Ry sto

Gen Nb là một gen trội cho phép khoai tây có khả năng kháng cao với các chủng PVX thuộc nhóm 1 (chủng PVX ROTH1), nhóm 2 (chủng PVY CP2) Marano và cộng

sự (2002) [4] đã xác định được vị trí của gen Nb nằm ở vị trí 0.76 cM trên NST số V,

giữa 2 marker AFLP GM339, GM637 Marker GM339 nhân đoạn ADN có kích thước 330bp liên kết rất chặt với gen Nb

Từ những kết quả thu thập ở trên chúng tôi đã sử dụng mồi GM3339 để phát hiện

ra gen kháng virus PVX, mồi STM0003-111 để phát hiện ra gen kháng PVY và một số mồi SSR khác để phân tích sự đa hình của các dòng khoai tây nhị bội phục vụ cho công tác chọn tạo giống

3.2.1 Đánh giá độ tinh sạch của ADN

Sản phẩm ADN tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

Qua ảnh điện di ADN tổng số của 8 mẫu khoai tây, ta thấy cả 8 mẫu đều xuất hiện 1băng ADN chứa ADN tổng số và ADN bị đứt gãy rất ít Như vậy ADN tổng số của 8 dòng nghiên cứu đáp ứng được yêu cầu của các thí nghiệm tiếp theo

- Khi sử dụng mồi GM339, những dòng khoai tây có đoạn ADN được nhân lên với kích thước 111bp, đúng như kích thước của đoạn ADN liên kết chặt với gen Rysto - gen kháng virus PVY là những dòng có chứa gen Rysto Trong 8 dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu có 6 dòng có chứa gen Rysto và như vậy có khả năng kháng virus PVY, đó là: A15, A16, A41, A56, B186, B208

So sánh với kết quả lây nhiễm nhân tạo thì 6 dòng có chứa gen kháng virus PVY đều biểu hiện khả năng kháng khi lây nhiễm nhân tạo Tuy nhiên có 2 dòng là H1959/195

H195 A15 A16 A41 A56 B186 B208 H34

250bp