Hoàn thiện quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp vắc-xin dịch tả vịt và viêm gan vịt nuôi cấy trên tế bào

- Đánh giá độ dài miễn dịch bằng công độc Đánh giá miễn dịch bảo hộ trong thực tế bằng phương pháp phi lâm sàng và công độc QT nuôi cấy tế bào - Xây dựng qui trình bảo quản, vận chuyển v

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ DỰ ÁN

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT Ở

QUY MÔ CÔNG NGHIỆP VÁC XIN DỊCH TẢ VỊT VÀ VIÊM GAN VỊT

NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO

CƠNG TY THUỐC THÚ Y TW

CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

TP Hồ Chí minh, ngày … tháng … năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN

I THƠNG TIN CHUNG

Tên đề tài/dự án: Hồn thiện qui trình sản xuất ở qui mơ cơng nghiệp vác xin

dịch tả vịt và viêm gan vịt nuơi cấy trên tế bào

Mã số: DAĐL-2009/01

Thuộc: Dự án độc lập cấp Nhà nước

2 Chủ nhiệm đề tài/dự án:

Họ và tên: Trần Xuân Hạnh

Ngày, tháng, năm sinh: 1957 Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính Chức vụ: Phĩ tổng giám đốc Điện thoại: Tổ chức: 8 38225955 Nhà riêng: Mobile: 0908356656

Fax: 08 38225060 E-mail: tranxuanhanhnavetco@yahoo.com

Tên tổ chức đang cơng tác: Cơng ty TNHH một thành viên thuốc thú y TW - NAVETCO

Địa chỉ tổ chức: 29 Nguyễn Đình Chiểu, Q1, TP Hồ Chí Minh

Địa chỉ nhà riêng: 29 Nguyễn Đình Chiểu, Q1, TP Hồ Chí Minh

Địa chỉ: 29 Nguyễn Đình Chiểu, Q1, TP Hồ Chí Minh

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PHẠM QUANG THÁI

Số tài khoản: 931.90.01.00030

Kho bạc nhà nước quận 1 – TP Hồ Chí Minh

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Nơng nghiệp và PTNT

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 12 năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ tháng 7 năm 2009 đến tháng 9 năm 2011

- Được gia hạn (nếu có): Gia hạn tới 30 tháng 9 năm 2011

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Ghi chú:

- Lý do thay đổi (nếu có): Không

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét

chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu

có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

1 04/6/2008 Tóm tắt hoạt động KHCN của tổ chức đăng

Quyết định về việc thành lập Hội đồng KH

và CN xét duyệt thuyết minh dự án độc lập cấp Nhà nước xét chọn bắt đầu thực hiện trong kế hoạch năm 2009

Bộ KHCN ban hành

4 Số 1412/QĐ-BKHCN,

ngày 09/7/2008

Quyết định phê duyệt tổ chức cá nhân chủ trì đề tài, dự án SXTN độc lập cấp nhà nước thực hiện trong kế hoạch năm 2009

Bộ KHCN ban hành

Bộ KHCN ban hành

Bản qui chế chi tiêu kinh phí Dự án SXTN

“Hoàn thiện qui trình sản xuất ở qui mô công nghiệp vác xin dịch tả vịt và viêm gan vịt nuôi cấy trên tế bào”

Mã số: DAĐL-2009/01

Cơ quan chủ trì Dự

án SXTN ban hành (NAVETCO)

10

Số 310a/2011/

QĐ-CTTY, ngày

13/9/2011

Quyết định thành lập Hội đồng đánh giá cấp

cơ sở dự án SXTN độc lập cấp Nhà nước Cơ quan chủ trì dự án (NAVETCO)

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án: Khơng

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Khơng

- Lý do thay đổi (nếu cĩ):

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Trần Xuân Hạnh Trần Xuân Hạnh

Chủ nhiệm: Tổ chức, quản lý, thực hiện triển khai dự án theo tiến độ và qui trình công nghệ

Tổ chức thực hiện đầy đủ các nội dung của dự án, đúng tiến

độ Hồn tất báo cáo

2 Phạm Quang

Thái

Phạm Quang Thái

Phụ trách phát triển mạng lưới phân phối tiêu thụ sản phẩm Đào tạo

CB cơng nghệ

Tổ chức phát triển mạng lưới và Tiêu thụ vác xin dịch tả vịt

3 Nguyễn Văn

Dung

Nguyễn Văn Dung

Thư ký DA Kỹ thuật giữ giống, bảo quản giống và

SX vác xin

QT kỹ thuật làm giống sản xuất vác xin, giữ giống vi rút vác xin và vi rút cường độc

4 Tơ Thị Phấn Tơ Thị Phấn

Đào tạo cán bộ làm chủ QTSX và

sử dụng vác xin phịng bệnh

Cán bộ thành thạo thao tác và làm chủ qui trình sản xuất

5

Nguyễn Thiên

Thu Thiên thu Nguyễn Triển khai thử nghiệm VX phịng

thí nghiệm và thực địa

Đánh giá tính an tồn và bảo hộ của

VX trong thực tế sản xuất

6

Phạm Hào

Quang

Phạm Hào Quang

Triển khai thử nghiệm VX phịng thí nghiệm và thực địa

Đánh giá tính an tồn và bảo hộ của

VX trong thực tế sản xuất

7

Nguyễn Thị

Lam Hương Nguyễn Thị Lam Hương - Xây dựng phương pháp

kiểm tra miễn dịch bảo hộ

- Đánh giá độ dài miễn dịch bằng công độc

Đánh giá miễn dịch bảo hộ trong thực tế bằng phương pháp phi lâm sàng và công độc

QT nuôi cấy tế bào

- Xây dựng qui trình bảo quản, vận chuyển và sử dụng vác xin

- Qui trình kiểm nghiệm vác xin

- Qui trình bảo quản vận chuyển và sử dụng vác xin

10

Hồ Văn Hoàng Hồ Văn

Hoàng Sản xuất vác xin qui mô công

nghiệp

Đã SX 150 triệu liều vác xin đạt tiêu chuẩn

11

Nguyễn Bá

Hiên Nguyễn Bá Hiên

Phân lập, giám định và đánh giá

sự lưu hành bệnh viêm gan vịt tại

ĐB sông Cửu Long

Khẳng định sự tồn tại của bệnh viêm gan vịt So sánh sự tương đồng về mặt kháng nguyên củ chủng vi rút phân lập với chủng vi rút

Phân lập, giám định và đánh giá

sự lưu hành bệnh viêm gan vịt tại

ĐB sông Cửu Long

Khẳng định sự tồn tại của bệnh viêm gan vịt So sánh sự tương đồng về mặt kháng nguyên củ chủng vi rút phân lập với chủng vi rút

Phân lập, giám định và đánh giá

sự lưu hành bệnh viêm gan vịt tại

ĐB sông Cửu Long

Khẳng định sự tồn tại của bệnh viêm gan vịt So sánh sự tương đồng về mặt kháng nguyên củ chủng vi rút phân

- Lý do thay đổi (nếu cú):

7 Tỡnh hỡnh tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian, kinh

1 Hội nghị khoa học cơ sở đỏnh

giỏ tiến độ dự ỏn, nghiệm thu

tiến độ do Cty chủ trỡ

Đỏnh giỏ kết quả tiến độ của

DA, thỏng 1/2010, tại Cụng

- Đỏnh giỏ, xỏc nhận kết quả đạt được theo tiến độ ngày 04/9/2011, tại Cụng ty NAVETCO

8 Túm tắt cỏc nội dung, cụng việc chủ yếu:

(Nờu tại mục 15 của thuyết minh, khụng bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sỏt trong nước và nước ngoài)

Người,

cơ quan thực hiện

1 Phaõn laọp vaứ giaựm ủũnh vi ruựt

vieõm gan vũt

ẹaựnh giaự tớnh tửụng ủoàng khaựng

nguyeõn virut phaõn laọp vụựi vi rut vac

xin

Thaựng

TS Nguyễn Bỏ Hiờn Trường ĐH NN Hà Nội

-2 Qui trình công nghệ sản xuất vaực

xin dũch taỷ vaứ vieõm gan vũt ủoõng

khoõ

- Choùn lửùa vaứ thớch ửựng teỏ baứo nuoõi

caỏy

- OÅn định ủieàu kieọn kỹ thuật nuoõi caỏy

treõn teỏ baứo qui moõ saỷn xuaỏt

Tháng 12/2009

04/2010 ThS Nguyễn Văn Dung

-NAVETCO

- Phoỏi troọn thớch hụùp tỷ lệ giữa 2 loaùi

kháng nguyờn vaứ dung moõi.

3 Quy trỡnh kiểm nghiệm vavs xin về

vụ trựng, an toàn và hiệu lực

- Phương phỏp trọng tài

- hoạc phương phỏp thay thế

Tháng 12/2009 6/2010

ThS Đỗ Văn Dũng - NAVETCO

4 Qui trỡnh bảo quản vỏc xin

Qui trỡnh vận chuyển vac xin

Qui trỡnh sửỷ duùng vacxin

12/2009 12/2010 12/2009

6/2010 6/2010 6/2010

ThS Đỗ Văn Dũng - NAVETCO

5 Qui trình đánh giá bảo hộ của vac

xin trong điều kiện thực tế bằng

phửụng phaựp huyeỏt thanh hoùc và

cụng độc

- Xác định ng−ỡng hiệu gớa kháng thể

bảo hộ trong huyết thanh vũt đ−ợc

tiêm vac xin trong phòng thí nghiệm

và thực tế

Tháng

12 /2009 12/2010

BS Nguyễn Thị Lam Hương - NAVETCO

6 ẹaựnh giaự keỏt quaỷ tieõm phoứng

7

Sản xuất vac xin nhũ giaự dũch

taỷ vaứ vieõm gan vũt ủoõng khoõ

Đạt vô trùng, an toàn, hiệu lực

12/2010 8/2011

BS Hồ Văn Hoàng NAVETCO

8

- Đào tạo NCS

- Đào tạo thac sĩ

Đào tạo làm chủ qui trỡnh sản

xuất, sử dụng thành thạo thiết

bị sản xuất

12/2012

12/2010

-1 NCS tiến sĩ đang làm

-1 ThS đó hoàn thành

TS.Trần Xuõn Hạnh, BS

Tụ Thị Phấn - NAVETCO

TS Nguyễn Bỏ Hiờn ĐHNN

- Lý do thay đổi (nếu cú): Do dự ỏn được gia hạn 9 thỏng

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đó tạo ra:

Thực tế đạt được

xuất vaực xin dũch taỷ vaứ

vieõm gan vũt ủoõng khoõ

nuụi cấy trờn tế bào

Qui trỡnh saỷn xuaỏt vaực xin nhũ giaựủoõng khoõ oồn định, ủạt tieõu chuaồn voõ truứng, an toaứn vaứ hieọu lửùc

Qui trỡnh saỷn xuaỏt vaực xin nhũ giaựủoõng khoõ oồn định ở qui mụ cụng nghiờp, ủaùt tieõu chuaồn voõ truứng, an toaứn vaứ hieọu lửùc

Đạt theo đăng ký

2 Qui trình kiểm nghiệm

vác xin dũch taỷ vaứ vieõm

gan vũt đụng khụ

- Đỏnh giỏ tớnh ổn định về vật lý, vụ trựng, an toàn và miễn dịch của vỏc xin

Qui trỡnh kiểm nghiệm vỏc xin đụng khụ dịch tả vịt và viờm gan vịt

Đạt theo đăng

ký

3 Xõy dựng phương phỏp

kiểm tra miễn dịch bảo

hộ để theo dừi đỏnh giỏ

miễn dịch của đàn vịt

- Hoàn thiện phương phỏp đỏnh giỏ miễn dịch bằng kỹ thuật huyết thanh học

- Xỏc định ngưỡng hiệu giỏ

Qui trỡnh kỹ thuật đỏnh giỏ hiệu giỏ khỏng thể bảo hộ trong huyết thanh vịt

Đạt theo đăng

được tiờm phũng trong

thực tế

khỏng thể bảo hộ trong huyết thanh của vịt được tiờm vỏc xin trong phũng thớ nghiệm

và ngoài thực tế

vịt được tiờm vỏc xin phũng thớ nghiệm và ngoài thực tế

bỡ trong, bao bỡ ngoài theo yờu cầu vận chuyển

- Đỏnh giỏ theo dừi nhiệt độ

và điều kiện vận chuyển

Qui trỡnh vận chuyển vỏc xin đụng khụ dịch tả vịt và viờm

Qui trỡnh sử dụng vỏc xin đụng khụ dịch tả vịt và viờm

Số lượng, nơi cụng bố

(Tạp chớ, nhà

xuất bản)

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

- Lý do thay đổi (nếu có)

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Địa điểm

(Ghi rõ tên, địa chỉ nơi ứng dụng)

Kết quả

sơ bộ

1

- Qui trình sản xuất vác

xin dịch tả vịt đông khô

nuôi cấy trên tế bào (qui

mô công nghiệp)

- Qui trình sản xuất vác

xin nhị giá dịch tả vịt và

viêm gan vịt đông khô

nuôi cấy trên tế bào

6/2010 Công ty TNHH

một thành viên thuốc thú y TW

Áp dụng sản xuất 150 triệu liều vác xin dich tả vịt đông khô nuôi cấy trên tế bào (trong đó có 160.000 liều vác xin nhị giá dịch tả vịt và viêm gan vịt đông khô)

2

Qui trình kiểm nghiệm vác

xin dịch tả vịt đông khô và

vác xin nhị giá dịch tả vịt

và viêm gan vịt đông khô

6/2010 Công ty TNHH

một thành viên thuốc thú y TW

Áp dụng để kiểm nghiệm vác xin dịch tả vịt đông khô và vác xin nhị giá trước khi xuất xưởng

3

Qui trình kỹ thuật đánh giá

hiệu giá kháng thể bảo hộ

trong huyết thanh vịt vịt

được tiêm vác xin phòng thí

nghiệm và ngoài thực tế 12/2010

Công ty TNHH một thành viên thuốc thú y TW

Được áp dụng để đánh giá miễn dịch của vịt được tiêm vác xin

Áp dụng tại kho vác xin của Công ty và tại các chi cục thú y

Các chi cục thú y

Áp dụng tại Công ty khi vận chuyển vác xin tới các chi cục thú y và từ các chi cục tới địa điểm tiêm phòng

Các chi cục thú y

Các chi cục thú y và người sử dụng vác xin để tiêm phòng

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

- Phân lập và giám định thành công vi rút viêm gan vịt lưu hành trên đàn vịt nuôi ở một số tính thành phía nam là công việc có ý nghĩa cả về mặt khoa học và thực tiễn Điều này cho phép chúng ta đánh giá chính xác hơn tình hình lưu hành bệnh viêm gan vịt trêncả nước và thiệt hại do bệnh gây ra Với việc giám định xác định vi rút viêm gan vịt phân lập thuộc serotype 1 (DHV 1) sẽ là cơ sở tốt cho công tác nghiên cứu sản xuất vác xin có hiệu quả phòng bệnh

- Sản xuất thành công vác xin nhị giá viêm gan – dịch tả vịt bằng công nghệ nuôi cấy

tế bào, với chất lượng ổn định về: Vô trùng, an toàn, hiệu lực là một việc làm có ý nghĩa về thực tiễn Nó chứng tỏ chúng ta hoàn toàn có thể sử dụng và làm chủ được một công nghệ sản xuất tiên tiến mà hiện nay thế giới đang sử dụng rộng rãi để sản xuất vác xin

- Dùng công nghệ nuôi cấy tế bào trong sản xuất vác xin giúp chúng ta giải quyết được những hạn chế khi dùng phương pháp sản xuất vác xin trên phôi trứng, đó là: Khả năng tạp nhiễm và lây truyền bệnh cao; Công sức và chi phí sản xuất nhiều

hơn; Khó khăn trong việc sử lý chất thải sinh học và như vậy nguy cơ ô nhiễm môi trường khá cao

- Với số lượng trứng sử dụng hạn chế khi sản xuất vác xin bằng công nghệ nuôi cấy tế bào sẽ giúp khắc phục được khó khăn về nguồn cung cấp trứng cho sản xuất vác xin

- Về công nghệ: Vác xin sản xuất bằng công nghê tế bào có độ tính khiết cao hơn và vác xin được sản xuất ở dạng đông khô, vì vậy vác xin rất thuận lợi chi việc bảo quản, sử dụng, đáp ứng được yêu cầu của người tiêu dùng

b/ Hiệu quả kinh tế xã hội

- Thành công trong việc sản xuất vác xin nhị giá viêm gan – dịch tả vịt sẽ đáp ứng được nhu cầu của người chăn nuôi về việc phòng bệnh có hiệu quả bệnh viêm gan vịt và dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi ở nước ta

- Hiện nay chăn nuôi vịt phát triển mạnh với nhiều loại hình chăn nuôi khác nhau Khó khăn lớn nhất ảnh hưởng đến sự ổn định và tăng đàn là tình hình bệnh dịch, trong đó quan trọng hơn cả là bệnh dịch tả và viêm gan vịt Do vậy, việc sản xuất được vác xin nhị giá viêm gan vịt – dịch tả vịt dùng công nghệ tế bào, không những đảm bảo được chất lượng của sản phẩm, mà còn giúp nâng cao được nâng lực sản xuất vác xin để có thể đáp ứng được về mặt số lượng, với giá thành hợp lý, để cung cấp phục vụ cho người chăn nuôi vịt phòng bệnh hiệu quả hai bệnh này trên đàn vịt nuôi, góp phần mang lại hiệu quả kinh tế của người chăn nuôi

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo

định kỳ

Lần 1 31/12/2009 Dự án được tổ chức triển khai nghiêm túc, khoa học các nội dung đề ra Đã triển khai 4 nội dung: 1) Phân lập và giám

định vi rút viêm gan vịt 2) Hoàn thiện qui trình công nghệ

sản xuất vác xin nhị giá bao gồm: lựa chọn tế bào nuôi cấy;

ổn định điều kiện nuôi cấy; thích ứng chủng vi rút vác xin lên tế bào lựa chọn thích hợp; phối trộn vác xin nhị giá 3) Đánh giá chất lượng vác xin, bao gồm: Nghiên cứu ảnh hưởng về miễn dịch giữa 2 chủng vi rút vác xin; Tiến hành thử nghiệm vác xin viêm gan vịt thích ứng lên tế bào 4) Ứng dụng sản xuất vác xin đông khô dịch tả vịt nuôi cấy trên tế bào qui mô công nghiệp

Lần 2 30/12/2010

Hoàn thành các nội dung như đăng ký đúng tiến độ và chất lượng Đã sản xuất 100 triệu liều vác xin dịch tả vịt đông khô nuôi cấy trên tế bào (trong đó có 160.000 liều vác xin nhị giá) đạt tiêu chuẩn xuất xưởng

Lần 3 31/8/2011 Hoàn thành đầy đủ các nội dung đã đăng ký trong DA

II Kiểm tra

định kỳ

Lần 1 30/12/2010 Hoàn thành các nội dung như đã đăng ký Đồng ý gia hạn thực hiện dự án đến 30 tháng 9 năm 2011

Lần 2 4/9/2011 Đã hoàn thành các nội dung đăng ký trong DA

III Nghiệm thu

TỔNG HỢP CÁC NỘI DUNG KHCN, SẢN PHẨM CỦA DỰ ÁN

1 Phân lập và giám định vi

rút viêm gan vịt

- Thu thập được 07 mẫu vịt nghị bệnh VGV

- Phân lập được 03 mẫu vi rút: VGV - V-TG, V-DN1, Navet – V- DN2 Các chủng vi rút viêm gan vịt phân lập được cĩ độc lực cao và ổn định

Navet Tiến hành giám định và so sánh với vi rút vác xin

Các chủng vi rút viêm gan vịt

Đạt theo đăng ký

2

Xây dựng Quy trình sản xuất vác

xin viên gan vịt và dịch tả vịt đơng

khơ nuơi cấy trên tế bào

1

Qui trình sản xuất vác xin Viêm gan

và dịch tả vịt trên

tế bào

Đạt theo đăng ký

2.2

- Lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế

bào thích hợp để nuôi cấy virút

văc-xin

- Thử nghiệm SX trên hệ thống chai lăn

- Thử nghiệm SX trên chai 3 tầng

Phương pháp nuơi cấy qui mơ cơng nghiệp

2.3

Thích ứng vi rút vac xin viêm gan vịt

trên tế bào chọn lựa qui mô sản xuất

- Xác định điều kiện nuôi cấy virút đạt hiệu giá cao nhất

Đã xác định được điều kiện nuôi cấy vi rút đạt hiệu giá cao nhất

Các thơng số nuơi cấy vi rút đạt hiệu quả cao

2.4 Xác định liều miễn dịch của vi rút

vac xin viêm gan trên vịt (PD50)

Đã xác định liều miễn dịch của vi rút vac xin viêm gan trên vịt (PD50).

Liều PD50 của vi rút VGV trên vịt

2.5 Xác định công thức phối hợp thích hợp các đơn chủng vi rút trong vác

Xác định điều kiện đông khô và lựa

chọn quy trình đông khô vắc-xin nhị

giá

Xác định được quy trình đơng khơ vác xin nhị giá Qui trình đơng khơ vác

xin nhị giá

2.7 Đánh giá hiệu giá sau đơng khơ của

- Kiểm tra an tồn Các lơ vác xin được tiến hành kiểm tra an tịan trên vịt các

lứa tuổi khác nhau

Cơ sở khoa học hồn chỉnh QT kiểm nghiệm

- Kiểm tra hiệu lực Kiểm nghiệm hiệu lực các lơ vác xin tiến hành trên bản

động vật và phương pháp thay thế Kết quả các lơ vác xin đạt các tiêu chuẩn và thực tế sử dụng trong sản xuất cho kết quả an tịan và bảo hộ tốt

Cơ sở khoa học hồn chỉnh QT kiểm nghiệm

4 Xõy dựng qui trỡnh bảo quản vỏc

xin

1 Đưa về chuẩn húa điều kiện bảo quản 2-8 độ C

Xỏc định được độ dài bảo quản ớt nhất 12 thỏng

QT bảo quản vỏc xin đụng khụ dịch tả và viờm gan vịt

Đạt theo đăng ký

5 Xõy dựng qui trỡnh vận chuyển vỏc

6 Xõy dựng qui trình sử dụng vỏc xin 1

- Xỏc định đối tượng tiờm phũng vỏc xin

- Qui định liều tiờm đường tiờm vỏc xin

- Bảo quản vỏc xin trong quỏ trỡnh tiờm

- Bao bì, nhãn mác, hạn dùng, cách tiêm, đường tiêm, liều tiêm

Qui trỡnh

Đạt theo đăng ký

7

Xõy dựng qui trình đánh giá bảo hộ

của vac xin trong điều kiện thực tế

bằng phửụng phaựp huyeỏt thanh hoùc

Đạt theo đăng ký

9 Sản xuất vỏc xin (Liều) 150triệu

liều

đăng ký

10 Đào tạo cụng nghệ, Đào tạo khoa

học - Cỏn bộ kỹ thuật làm chủ qui trỡnh sản xuất; - Vận hành thành thạo thiết bị;

- Cỏn bộ thỳ y và người chăn nuụi sử dụng vỏc

- Đào tạo 01 thạc sĩ khoa học

- Đào tạo 01 TS khoa học

Đạt theo đăng ký

MỤC LỤC

I ĐẶT VẤN ĐỀ

II NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

III KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Nội dung 1: Kết quả phân lập vi rút viêm gan vịt cường độc

Nội dung 2: Hoàn thiện qui trình sản xuất vác xin nhị giá viêm gan –

dịch tả vịt

Nội dung 3: Đánh giá chất lượng vác xin nhị giá viêm gan – dịch tả vịt

Nội dung 4: Xác định độ dài bảo quản vác xin và xây dựng qui trình bảo

quản và vận chuyển vác xin

Nội dung 5: Đánh giá sử dụng vác xin trong sản xuất

IV KẾT LUẬN CHUNG

V TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1: Kết quả phân lập vi rút viêm gan vịt trên phôi vịt

2 Bảng 1.2: Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên vịt

3 Bảng 1.3: Xác định liều EID50, ELD50, LD50 trên trứng và trên vịt

4 Hình 1.1: Kết quả giám định bằng phương pháp RT-PCR

5 Bảng 1.4: Kết quả phản ứng trung hòa

6 Bảng 2.1 : Kết quả thích ứng vi rút viêm gan vịt trên tế bào xơ phôi

9 Bảng 2.4: Đánh giá đáp ứng miễn dịch của vi rút vác xin DTV và vi

rút vác xin viêm gan vịt với các cách gây miễn dịch khác nhau

10 Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra an toàn vác xin nhị giá

11 Bảng 3.2: Kết quả chuẩn độ vi rút vác xin nhị giá viêm gan vịt và

dịch tả vịt

12 Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra hệu lực của vác xin nhị giá trên vịt

13 Bảng 3.4: Đánh giá miễn dịch dịch tả vịt trên vịt khi miễn dịch

bằng vác xin nhị giá viêm gan và dịch tả vịt

14 Bảng 3.5: Kết quả bảo hộ vịt thụ động chống lại vi rút viêm gan vịt

dùng huyết thanh vịt được miễn dịch với vác xin nhị giá

15 Bảng 3.6: Kết quả xác định miễn dịch viêm gan vịt bằng phản ứng

trung hòa

16 Bảng 3.7: miễn dịch thụ động viêm gan vịt ở vịt con từ mẹ được

tiêm vác xin nhị giá viêm gan và dịch tả vịt

13

14

15

16 1723

24

25 2732

3233

34

35

36

37

17 Bảng 4: Độ dài bảo quản của vác xin nhị giá viêm gan và dịch tả

vịt

18 Bảng 5.1: Đánh giá an toàn của vác xin trên vịt ở các lứa tuổi khác

nhau

19 Bảng 5.2: Tỷ lệ bảo hộ của vịt miễn dịch sau khi thử thách bằng vi

rút viêm gan vịt cường độc

20 Bảng 5.3: Tỷ lệ bảo hộ của vịt miễn dịch sau khi thử thách bằng vi

rút dịch tả vịt cường độc

21 Bảng 5.4: Kiểm tra đáp ứng kháng thể trên vịt được tiêm phòng

với vác xin nhị giá

22 Bảng 5.5: Khả năng bảo hộ của vịt con nở từ vịt mẹ được tiêm vác

xin nhị giá sau khi công vi rút viêm gan vịt cường độc

23 Bảng 5.6: Kết quả bảo hộ thụ động trên vịt với huyết thanh vịt hậu

bị được tiêm vác xin nhị giá và công độc với vi rút viêm gan vịt

40

45

46

54 46

47

48

48

BÁO CÁO

DỰ ÁN: HÒAN THIỆN QUI TRÌNH SẢN XUẤT Ở QUI MÔ CÔNG NGHIỆP VÁC

XIN DỊCH TẢ VỊT VÀ VIÊM GAN VỊT NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO

Ở Trung Quốc, vi rút DHV lần đầu tiên được phân lập và xác nhận năm 1982 (Guo, Pan, 1984) và cho đến nay bệnh viêm gan vịt do DHV gây ra ngày càng xuất hiện nhiều hơn Vào năm 1989, lần đầu tiên xuất hiện dịch viêm gan vịt ở Đài Loan với tỷ lệ vịt chết đến 90% trên đàn vịt 3-4 ngày tuổi và huyết thanh tối miễn dịch đã được sử dụng

để trị bệnh (

Vi rút viêm gan vịt thuộc họ Picornaviridae, có kích thước nhỏ, khoảng 20-30

nm, gồm 32 capsome, không có vỏ bọc ngoài cùng Hệ gen của vi rút viêm gan vịt chứa acid ribonucleic (RNA) sợi đơn dương có độ dài khoảng 7600 đến 7700 nucleotide và đuôi poly A gồm 18 nucleotide ở đầu 3’, chứa duy nhất một khung đọc mở (open reading frame) mã hoá cho một protein chung (polyprotein)

Dựa trên kết quả nghiên cứu về gen và huyết thanh học, người ta phân vi rút gây bệnh viêm gan vịt thành 3 serotype khác nhau là DHV-1, DHV-2 và DHV-3 Trong đó, phổ biến hơn cả là vi rút viêm gan vịt serotype 1 (DHV-1) bao gồm khoảng 60 – 70 chủng đã được phân lập từ năm 1950 đến nay (Levine et al., 1950; Asplin, 1965; Gough

et al., 1985; Toth, 1969; Haider, Calnek, 1979 Đặc trưng của bệnh là vịt chết nhanh với

tỷ lệ chết rất cao (Lê Thanh Hoà et al., 1984; Nguyễn Văn Cảm et al., 2001; Nguyễn Phục Hưng, 2004); mổ khám bệnh tích thấy gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên bề mặt

gan (Bùi Thị Cúc, 2002; Woolcock, 2003) Đến nay, bệnh viêm gan vịt do vi rút serotype

1 đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam

Vi rút viêm gan vịt serotype 2 chỉ gồm có 2 chủng mới phân lập ở Đài Loan Và vi rút viêm gan vịt serotype III phát hiện ở Anh và Mỹ, gây tỷ lệ chết không đáng kể (Woolcock, 2003) và mới đây được thông báo có 15 chủng phân lập được ở Trung Quốc

và Hàn Quốc (Stanway et al., 2005; Tseng et al., 2006, 2007a; 2007b ; Ding, Zhang, 2007; Zhang et al., 2008)

Có nhiều phương pháp được áp dụng để xác định vi rút viêm gan vịt như: phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch và phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (Enzym Linked Immunosorbent Assay – ELISA) (Zhao et al., 1991) Gần đây phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) và PCR cho phép xác định chính xác vi rút gây bệnh cũng như nghiên cứu sâu về sinh học phân tử của vi rút (Tseng et al.,

2007; Cheng et al., 2009; Kim at el., 2009)

Ở Việt Nam, bệnh viêm gan vịt lần đầu tiên được phát hiện năm 1978 (Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng, 1985), nhưng vẫn chưa phân lập được mầm bệnh tại thời điểm đó

Từ năm 1979 đến năm 1984, bệnh đã xảy ra ở nhiều địa phương làm chết nhiều vịt con Bằng phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và phân lập vi rút, các tác giả đã khẳng định vịt chết do nhiễm vi rút viêm gan vịt (Lê Thanh Hòa et al.,

1984)

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly (2001) cho biết từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2001 khi điều tra 20 ổ dịch tại các địa phương: Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang đã xác nhận các ổ dịch của vịt là do vi rút viêm gan vịt gây ra, vi rút với tỷ lệ nhiễm trong đàn lên tới 100%, lứa tuổi mắc bệnh từ 1

- 21 ngày tuổi, tỷ lệ chết từ 48,57 - 90% Đặc biệt, gần đây nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta chưa thích ứng được với điều kiện môi trường, nên bệnh viêm gan vịt càng xảy ra nhiều hơn, nhất là ở các địa phương là Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long gây tổn thất rất lớn (Nguyễn Đức Lưu et al., 2002) Gần

đây tại Thanh Hóa, Nam Định bệnh xuất hiện, với tỷ lệ chết biến động từ 80 – 100% (Cục thú y, 2002) và theo thông báo của OIE, bệnh viêm gan vịt gây thiệt hại khá cao trên đàn vịt nuôi tại Việt Nam (OIE, 2006)

Đã cĩ một số nghiên cứu về phân lập vi rút tại một số tỉnh Miền Bắc (Trần Minh Châu, 1985; Trần Thị Lan Hương, 2007) và các tác giả xác định vi rút gây bệnh viêm gan trên vịt tại Việt Nam thuộc type I Trong một nghiên cứu khác, Lê Thanh Hịa và Nguyễn thị Diễm Quỳnh, 2008 đã so sánh đoạn gen VP1 từ chủng vác xin cĩ nguồn gốc Ai Cập dùng sản xuất vác xin phịng bệnh viêm gan vịt tại Việt Nam với các chủng vi rút phân lập thuộc nhĩm DHV type I cho thấy cĩ tính tương đồng kháng nguyên cao

Ở Miền Nam, tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long chưa có những nghiên cứu chính thức về sự lưu hành của bệnh, tuy nhiên vào năm 2003 nhiều

ổ dịch gây chết trên vịt con 1 – 7 ngày tuổi ở các tỉnh Long An, Đồng Nai và TP Hồ Chí Minh, cũng như trong những năm gần đây các ổ dịch ghi do vi rút viêm gan vịt, ở những mức độ khác nhau vẫn xẩy ra và gây thiệt hại lớn cho nghề chăn nuơi vịt Vì vậy việc xác định sự lưu hành của vi rút viêm gan vịt và bệnh viêm gan vịt trên đàn vịt nuôi tại một số tỉnh phía Nam là một công việc cần thiết

Nghiên cứu chế tạo vác xin phịng bệnh viêm gan vịt dùng phơi gà, vịt đã được thực hiện tại Việt Nam (Trần Minh Châu, 1990; Nguyễn Bá Hiên, 2007) Năm 1983, bằng phương pháp tiếp đời liên tục qua phơi trứng từ chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được tại Phú Xuyên-Hà Sơn Bình, các tác giả đã tạo được chủng vi rút nhược độc (Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng, 1985) Năm 1985, một vác xin được sản xuất từ 3 chủng

vi rút nhược độc viêm gan vịt: chủng TN của Asplin, E32 của Pháp và VN của Việt Nam

đã được nghiên cứu (Trần Minh Châu et al., 1985; Lê Thanh Hịa et al., 1984 Gần đây

Bộ mơn Vi sinh vật - Truyền nhiễm trường Đại học Nơng Nghiệp - Hà Nội đã nghiên cứu các đặc tính sinh học của giống vi rút Vác xin nhược độc viêm gan vịt chủng DH – EG –

2000 (Nguyễn Bá Hiên, 2007) Giống vi rút này đã được sử dụng để sản xuất vác xin Bước đầu vác xin đã được nghiên cứu về hiệu lực và cho kết quả tốt

Vác xin viêm gan vịt vơ hoạt cũng đã được nghiên cứu sản xuất từ vi rút viêm gan vịt type 1 dùng phương pháp nuơi cấy vi rút trên phơi gà, vơ hoạt vi rút bằng BEI (Binary Ethylenimine), dùng bổ trợ dạng nhũ (Woolcok 1991) Vác xin được dùng tiêm phịng cho đàn vịt giống để tạo miễn dịch thụ động cho đàn vịt con

Nghiên cứu về hiệu lực của vác xin viêm gan vịt vô hoạt cho thấy vác xin có khả năng tạo miễn dịch tốt cho đàn vịt (Gough, 1981) Sử dụng 3 lần vác xin viêm gan vịt type 1 vô hoạt nhũ dầu cho đàn vịt giống sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho đàn vịt con Tại Việt Nam đang sử dụng rộng rãi một loại vác xin nhược độc viêm gan vịt do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất với chủng vi rút được sử dụng làm vác xin có nguồn gốc từ Hàn Quốc Ngoài ra, một chủng vi rút vác xin nhược độc khác của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng đã được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng, 2004; Nguyễn Bá Hiên, 2007), qui trình sản xuất (Bùi Thanh Khiết, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007), đặc tính phân tử và đã bước đầu được ứng dụng vào thực

tế Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử của chúng tôi cho thấy các loại vác xin sử dụng tại Việt Nam đều thuộc genotype 1

2 Bệnh dịch tả vịt

Bệnh dịch tả vịt được phát hiện đầu tiên ở nước ta vào năm 1963 và năm 1969 vi rút đã được phân lập và giám định Nguyên nhân bệnh là do vi rút herpecvi rút, ADN vi rút Vi rút có thể gây bệnh cho vịt ở mọi lứa tuổi, với tỷ lệ chết cao đến 90% ở các đàn vịt mẫn cảm Ở Việt Nam hàng năm thiệt hại do bệnh gây ra ước tính vào khoảng 20% trong tổng số thiệt hại do các bệnh khác gây ra Nghiên cứu gần đây trong 10 tỉnh thuộc đồng bằng sông cửu long cho thấy sự lưu hành rất cao của bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi, khoảng 30% mẫu chẩn đoán dương tính với vi rút dịch tả vịt (Trần Đình Từ và cs, 2004)

và tỷ lệ chết do bệnh dịch tả vịt tại đàn vịt nuôi tại Tỉnh Cần Thơ chiếm 38,6% (Nguyễn Đức Hiền, 2004)

Do tính chất nguy hiểm của bệnh, nhiều nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, bệnh học và vác xin phòng bệnh đã được thực hiện ở Việt Nam Nghiên cứu về vác xin được tiến hành vào những năm 60s và 70s của thế kỷ trước, với chủng vác xin có nguồn gốc từ Trung Quốc (Trần Minh Châu và CS, 1968-1978) Từ năm 1995 đến 1998 để nâng cao năng lực chẩn đoán và phòng bệnh bệnh dịch tả vịt, một chương trình nghiên cứu hợp tác giữa công ty NAVETCO và trường đại học Queensland và AAHL của Úc đã được thực hiện thành công Thông qua chương trình hợp tác này, nhiều thông tin về bệnh dịch tả vịt 

đã được bổ sung, một số kỹ thuật chẩn đoán như PCR, ELISA đã được phát triển, đặc biệt đã nghiên cứu thành công vác xin dịch tả vịt sử dụng công nghệ tế bào

Như đã nêu ở trên, có những dấu hiệu cho thấy có sự lưu hành của vi rút gây viêm gan trên đàn vịt nuôi ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu long Những ghi ngờ này cần được chứng minh bằng các chứng cứ khoa học vì vậy việc phân lập và giám định vi rút viêm gan vịt trên đàn vịt nuôi ở khu vực này là cần thiết nhằm khẳng định sự tồn tại của bệnh, hơn nữa khi đưa vác xin viêm gan vịt chế từ chủng vi rút vác xin DH - EG - 2000 vào phòng bệnh viêm gan vịt ở nước ta nói chung và khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long nói riêng thì việc xác định có sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút vác xin DH

- EG - 2000 và chủng vi rút gây bệnh lưu hành ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long và

có thể sử dụng chủng vi rút vác xin để phòng bệnh hay không là việc làm hết sức quan trọng

Đánh giá hiệu lực của vác xin phòng bệnh viêm gan vịt khi chỉ tiêm vi rút vác xin nhược độc viêm gan vịt và tiêm kết hợp với vác xin dịch tả vịt đã được Toth tiến hành năm 1970 (Thomas E Toth, 1970) Người ta đã chứng minh rằng vác xin nhị giá chứa vi rút vác xin viêm gan và dịch tả vịt khi sử dụng tiêm phòng cho vịt có khả năng bảo hộ được vịt khi thử thách bằng công cường độc với các chủng độc vi rút viêm gan và dịch tả vịt

Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn thu được từ các chương trình nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh viêm gan và dịch tả vịt, cũng như căn cứ vào một số đặc điểm của hai bệnh này về mức độ thiệt hại cho đàn vịt nuôi và khả năng phòng bệnh bằng vác xin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một vác xin nhị giá viêm gan và dịch tả vịt để phòng bệnh cho đàn vịt nuôi (giống con và vịt giống) đồng thời phòng được hai bệnh bệnh viêm gan và dịch tả vịt

II/ NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1.1 Phân lập và giám định vi rút viêm gan vịt

− Thu thập bệnh phẩm

− Phân lập và giám định vi rút

− So sánh kháng nguyên giữa chủng phân lập và chủng vi rút vác xin

1.2 Hoàn thiện qui trình

− Hoàn thiện qui trình nuôi cấy tế bào để sản xuất vác xin

− Hoàn thiện qui trình kiểm nghiệm vác xin nhị giá viêm gan và dịch tả vịt

− Xây dựng qui trình bảo quản vận chuyển vác xin, kiểm tra độ dài bảo quản của vác xin sau 3, 6, 9, 12 tháng

− Xây dựng phương pháp kiểm tra miễn dịch và theodõi đánh giá miễn dịch sau tiêm phòng

− Đánh giá hiệu quả phòng bệnh trên thực tế sản xuất

2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Giống cường độc dịch tả vịt dùng kiểm nghiệm vác xin, có hiệu giá EID50 = 106, 4 /ml

- Giống cường độc viêm gan vịt do Bộ môn vi sinh vật, trường đại học nông nghiệp Hà Nội cung cấp, EID50 = 10- 7, 7/ 0,2 ml, ELD50 = 10- 5,8/ 0,2 ml, LD50 = 10- 7, 5/ 0,5

ml (trên vịt 2 ngày tuổi)

- Giống vi rút nhược độc viêm gan vịt chủng DH - EG - 2000 có nguồn gốc từ Viện

Nghiên cứu vác xin Cairo – Ai Cập do Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) cung cấp có ELD50=10-5,3 và EID50=10-7,87

2.3 Trứng vịt, gà có phôi

- Phôi vịt 12 -13 ngày tuổi, từ vịt mẹ chưa được tiêm vác xin viêm gan vịt từ trại vịt

giống VIGOVA, Đồng Nai

- Phôi gà 9 – 10 ngày tuổi, từ đàn gà giống ISABROWN khỏe mạnh của trại gà giống Hồng Sanh, Bình Dương

2.4 Vịt thí nghiệm

- Vịt từ 1 – 7 ngày tuổi, khoẻ mạnh ấp nở từ đàn vịt bố mẹ giống siêu thịt trại vịt giống

VIGOVA, Đồng Nai, chưa được miễn dịch đối với vi rút viêm gan vịt

- Vịt tuổi 1 tháng đến 2 tháng tuổi, chưa tiêm vác xin hay không có kháng thể viêm gan

và dịch tả vịt

2.5 Môi trường và hoá chất thí nghiệm

- Môi trường nuôi cấy: Môi trường căn bản MEM (Minimum Essential Medium), hãng Sigma

- Huyết thanh bê sơ sinh (Newborn Calf Serum), hãng Gibco, NewZealand

- Pippett các loại; chai lọ có nút vặn 50, 100, 250, 500 ml vv

- Chai nhựa (T25, T75), vỉ nhựa (6 lỗ, 96 lỗ) dùng nuôi cấy tế bào

- Các dụng cụ phải được xử lý vô trùng trước khi đưa vào sử dụng: bình chứa 1lít, 5 lít, bình khía có thanh nam châm, chai nhựa nuôi cấy tế bào, đĩa petri, cốc thủy tinh

100 ml, 500 ml, ống đong, kẹp, kéo, quặng thủy tinh, vải lọc, syringe 20ml, 50ml, kim lớn dài 10cm, bình ly tâm

- Tủ ấp trứng, tủ ấm nuôi cấy tế bào, máy ly tâm lạnh, bể nước ấm 37oC, máy khuấy từ, kính hiển vi soi ngược, máy ra chai bán tự động, máy đông khô, máy dập nút, máy in nhãn, máy dán nhãn đèn soi trứng, khay đựng trứng Tủ lạnh dương, tủ lạnh âm, tủ đông sâu, kho lạnh

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương pháp phân lập vi rút viêm gan vịt

- Mẫu gan được nghiền nhỏ, pha với dung dịch PBS có chứa kháng sinh thành huyễn dịch 1/5, để ở nhiệt độ 4oC trong 2 giờ, sau đó ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút Lấy huyễn dịch ở trên xử lý bằng clorofoc 5% trong 10 phút Thu nước trong và đem cấy truyền trên phôi vịt ấp 13 ngày tuổi

- Trứng có phôi 13 ngày tuổi, soi trứng chọn những quả có phôi khoẻ mạnh Đánh

dấu buồng hơi, vị trí phôi Sát trùng toàn bộ phần vỏ bằng cồn 70o, sát trùng vùng buồng hơi bằng cồn iod 5%

- Tiêm trứng: Đục 1 lỗ trên đỉnh buồng hơi bằng dùi tiêm trứng, dùng syringe 1ml hút mẫu huyễn dịch (chuẩn bị như miêu tả ở trên) , tiêm với liều 0,2 ml/trứng Dùng parafin hàn kín lỗ tiêm, để trứng vào khay và cho vào tủ ấm 37oC ấp tiếp

- Theo dõi trứng sau 18, 24, 48, 72, 96 giờ, kiểm tra phôi trứng sống chết Những quả có phôi chết trong thời gian theo dõi và những thai sống sau 96 giờ cho vào tủ lạnh

4oC trong 8- 12 giờ Sau đó mổ trứng thu nước trứng và kiểm tra bệnh tích phôi Các mẫu nước trứng được bảo quản ở -80oC Mẫu thu từ nước trứng sau đó được dùng để xác định

sự hiện diện của vi rút viêm gan vịt bằng phương pháp gây nhiễm cho vịt và giám định vi rút dùng kỹ thuật RT- PCR

3.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào CEF một lớp

- Dùng trứng gà có phôi 9 - 10 ngày tuổi Soi và chọn những trứng có phôi phát triển tốt, khoẻ mạnh để làm tế bào

- Sát trùng trứng bằng cồn iode, dùng kéo cắt vỏ trứng và dùng kẹp lấy phôi ngâm vào dung dịch Hanks’ (hoặc PBS) có kháng sinh Cắt bỏ đầu, cánh, chân và phủ 

tạng, lấy phần thân và ngâm vào dung dịch Hanks’ Rửa thân phôi với dung dịch Hanks’ 3 lần

- Cắt nhỏ phần thân phôi bằng kéo sau đó cho vào bình có khía có thanh nam châm Cho dung dịch Hanks’ vào bình khía, 20ml/phôi, lắc xoay vòng để rửa sạch các thân phôi đã được cắt nhỏ Tiến hành rửa ba lần cho đến khi nước trong

- Cho dung dịch trypsin 0,25% đã làm ấm trước ở 37oC, với tỷ lệ 20ml/phôi (hoặc 20 lần so với phần tế bào lắng ở đáy), đặt bình khía lên máy khuấy từ và khuấy trong 20 phút ở nhiệt độ 37oC để tách tế bào Thu hoạch huyễn dịch tế bào vào trong 1 bình thuỷ tinh đặt sẵn trong khay nước đá, thêm một lượng môi trường MEM có 5% huyết thanh đã làm lạnh với tỷ lệ bằng với lượng trypsin dùng (20ml/phôi) để ngưng hoạt động của trypsin Lọc qua vải màn vào bình ly tâm, ly tâm lạnh với tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút

- Chắt bỏ phần nước bên trên, cho vào phần cặn tế bào khoảng 100 ml môi trường MEM/phôi, trộn đều nhẹ bằng pipette, đếm tế bào với 0,1% Trypan Blue Ghi

nhận số tế bào có trong huyễn dịch này Căn cứ vào số lượng tế bào sống thu được pha

với môi trường nuôi cấy (Trong 1 lít môi trường có 5% huyết thanh bê, 200.000 đơn vị Penicillin, 100.000 µg Streptomycine, 7,5% Sodium Bicarbonate (NaHCO3), HEPES 1M), điều chỉnh để có 1 x106 tế bào/ml (hoặc 1 phôi gà pha với 100ml môi trường phát triển) Tùy mục đích của thí nghiệm, có thể nuôi cấy tế bào trong chai hoặc vỉ nhựa Sau khi chia vào các chai, để tất cả các chai tế bào vào tủ ấm 37oC Kiểm tra sau 24 –

48 giờ, khi tế bào phát triển thành một lớp chiếm nhiều hơn 80% mặt chai thì có thể sử dụng để sản xuất vác xin

3.3 Giám định chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được bằng phản ứng RT-PCR

Các mẫu vi rút phân lập được từ bệnh phẩm, để khẳng định chắc chắn đó là vi rút viêm gan vịt chúng tôi sử dụng cặp mồi dùng cho phản ứng PCR thu nhận gen 3D bao gồm: mồi xuôi DHAV-1F và mồi ngược DHAV-1R, được thiết kế dựa trên trình tự chuỗi gen của các chủng DHAV-1 và cho sản phẩm PCR khoảng 467 bp

Để thực hiện giám định vi rút viêm gan vịt, nước trứng và gan vịt chết sau khi gây bệnh từ các mẫu nước trứng đã được dùng để tách chiết RNA dùng bộ kit của QIAGEN

(QIA – amp Viral Mini Kit, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và bảo quản ở -

+ Phương pháp xác định LD 50 của vi rút cường độc viêm gan vịt

- Thí nghiệm được tiến hành vịt 5-7 ngày tuổi khoẻ mạnh và chưa được miễn dịch với vi rút viêm gan vịt, mỗi lần tiêm cho 40 vịt/mẫu và có 4 vịt làm đối chứng

- Mẫu vi rút là nước trứng thu họach của những phôi chết từ 24 - 96 và đã được xác định là vi rút viêm gan vịt bằng kỹ thuật PCR Mẫu được pha thành các nồng độ từ

10-1 ÷ 10-10 Lấy 10 ống nghiệm vô trùng đánh số lần lượt từ 1 – 10, cho vào mỗi ống 4,5ml nước sinh lý Hút 0,5ml nước trứng vào ống nghiệm 1 và xử lý kháng sinh, trộn đều Sau đó hút 0,5ml ở ống 1 cho vào ống 2 và trộn đều Làm tiếp tục cho đến ống thứ

10 ta sẽ được các nồng độ 10-1 ÷ 10-10

- Tiêm vịt: mỗi nồng độ pha loãng tiêm 4 con với liều 0,5ml/con vào bắp lườn, vịt đối chứng tiêm 0,5ml nước sinh lý Theo dõi trong 10 ngày để quan sát những triệu chứng lâm sàng, xác định số con chết ở các thời điểm theo từng nồng độ Những vịt chết

mổ khám kiểm tra bệnh tích Số liệu thu được, tính toán xác định liều LD50 theo Muench

Reed-3.4.2 Phương pháp xác định một số đặc tính sinh học của chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được trên phôi

+ Phương pháp xác định chỉ số EID 50 của vi rút cường độc viêm gan vịt

Thí nghiệm được tiến hành 2 lần/mẫu, mỗi lần pha giống vi rút kiểm tra thành 10 nồng độ 10-1 ÷ 10-10 với dung dịch đệm PBS vô trùng Mỗi nồng độ tiêm 4 phôi liều 0,2ml/phôi và 4 phôi không tiêm để làm đối chứng

Sau khi tiêm trứng, theo dõi phôi chết vào các thời điểm 18, 24, 48, 72, 96 giờ, kiểm tra số phôi chết ở mỗi nồng độ Những phôi chết cho vào tủ lạnh 4oC/8-12 giờ Mổ

trứng, thu nước trứng và kiểm tra bệnh tích phôi Tính toán EID50 theo công thức của Reed - Muench

+ Phương pháp xác định chỉ số ELD 50 của vi rút cường độc viêm gan vịt

Giống vi rút kiểm tra được thành 8 nồng độ 10-1 ÷ 10-8 với dung dịch đệm PBS vô trùng Mỗi nồng độ tiêm 4 phôi liều 0,2ml/phôi và 4 phôi không tiêm để làm đối chứng Sau khi tiêm trứng, theo dõi phôi đến 96 giờ Kiểm tra và cho những phôi chết vào tủ lạnh 4oC Sau 96 giờ cho toàn bộ trứng vào tủ lạnh 4oC/8-12giờ Mổ trứng và kiểm tra bệnh tích của phôi Tính toán ELD50 theo công thức của Reed - Muench

3.4.3 Phương pháp khảo sát tính tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được và vi rút nhược độc viêm gan vịt chủng DH -

EG - 2000 thông qua phản ứng trung hòa trên vịt

+ Phản ứng trung hòa: Theo phương pháp huyết thanh cố định và vi rút pha

loãng:

- Huyết thanh miễn dịch: vịt lớn 10 con, khỏe mạnh và chưa được tiêm vác xin Tiêm

vác xin Viêm gan vịt chủng DH - EG - 2000 cho chúng, tiêm 2 lần cách nhau 1 tuần

sau 21 ngày lấy máu chắt huyết thanh

- Huyết thanh đối chứng: vịt lớn, khỏe mạnh và chưa được tiêm vác xin Nuôi trong cùng điều kiện và không được tiêm vác xin Viêm gan vịt chủng DH - EG – 2000

- Giống vi rút: là nước trứng đã chuẩn bị ở trên Pha loãng vi rút thành các nồng độ 10-1 đến 10-6 với nước sinh lý đã xử lý kháng sinh

Phương pháp tiến hành

- Lô thí nghiệm: Trộn kháng huyết thanh miễn dịch viêm gan vịt với các nồng độ vi rút

đã pha loãng theo tỉ lệ 1:1

- Lô đối chứng: Trộn huyết thanh đối chứng với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỉ

lệ 1:1

- Ủ hỗn hợp trên ở nhiệt độ 370C/1h

Thực hiện gây nhiễm trứng:

- Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0.2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ

- Phôi được ấp tiếp ở tủ ấp 370C trong 10 ngày Loại bỏ những phôi chết trước 24h

+ Đánh giá kết quả:

Tính toán chỉ số trung hòa NI - Neutralization index, Nguyễn Như Thanh, 2006 Nếu kết quả phân lập và giám định dương tính với kháng huyết thanh chuẩn, kết luận có

sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được và

vi rút nhược độc viêm gan vịt chủng DH - EG – 2000

III/ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

NỘI DUNG 1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI RÚT VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ĐỘC

1.1 Phân lập trên phôi vịt

Từ các mẫu thu thập được từ Đồng Nai, Long An, TP Hồ Chí Minh, chúng tôi đã

tiến hành phân lập bằng phương pháp gây nhiễm cho trứng vịt có phôi, kết quả cho thấy

các mẫu Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2 gây chết phôi với tỷ lệ cao biến

động từ 88% - 100% Vi rút gây chết phôi ở từng thời điểm tương đối ổn định, và số

phôi chết tập trung ở thời điểm 24- 72 giờ Trong khi đó các mẫu còn lại (Navet- V- HY2,

Navet- V- NB, Navet- V- LA1, Navet- V- LA2) số phôi chết với tỉ lệ thấp 0-4% Kết quả

trình bày ở bảng 1

Bảng 1.1: Kết quả phân lập vi rút viêm gan vịt trên phôi vịt

KH mẫu Độ pha loãng Liều tiêm Phôi chết/Tổng số tiêm Tỷ lệ %

Mổ khám các phôi chết của 3 mẫu Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2

cho thấy bệnh tích trên phôi điển hình bệnh viêm gan vịt với các biểu hiện như: Phù phôi, 

phôi còi cọc, xuất huyết trên da nhất là da vùng đầu, gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên

gan, xuất huyết thành đám thành vệt, lách sưng, thận sưng

Kiểm tra so sánh bệnh tích ở các các phôi chết cho thấy bệnh tích xuất huyết trên

da có ở 100% phôi chết Phôi chết có bệnh tích trên gan biến động từ 75 – 100 %, đặc

biệt ở thời điểm 25-48 giờ bệnh tích xuất huyết gan chiếm tỉ lệ cao nhất là 100% Ngoài

ra các bệnh tích khác thường thấy là phù ở vùng đầu, lưng, dưới da thường có một lượng

dịch, khoảng 25% phôi chết có bệnh tích phù phôi và 25% phôi chết có bệnh tích màng

nhung niệu sưng dày

Để xác định mẫu bệnh phẩm và mẫu nước trứng thu được từ các mẫu phân lập có

chứa vi rút viêm gan vịt hay không?, chúng tôi tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho vịt

mẫn cảm kết quả trình bày ở bảng 2 Kết quả cho thấy sau khi tiêm cho vịt nước trứng

nhiễm vi rút hoặc huyễn dịch từ mẫu bệnh phẩm Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet-

V- DN2, vịt đều bị bệnh và chết với tỉ lệ cao Hầu hết vịt chết có tư thế đặc trưng của

bệnh viêm gan vịt như cổ rụt lại, đầu ngoẹo ra đằng sau, chân duỗi thẳng (còn gọi là

Opisthotonus)

Bảng 1.2: Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên vịt

KH mẫu Độ pha lõang Liều tiêm Chết/Tồng số Tỷ lệ %

Theo dõi về thời gian vịt chết cho thấy các chủng Navet- V- TG, Navet- V- DN1,

Navet- V- DN2 gây chết vịt chủ yếu trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ Vịt

bệnh, chết có những biểu hiện triệu trứng và bệnh tích giống nhau giữa các mẫu là bệnh

phẩm và mẫu gây nhiễm sử dụng nước trứng nhiễm vi rút từ các chủng này

   Vịt con được gây nhiễm với bệnh phẩm từ mẫu Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2, có các triệu chứng như ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, chảy nước mắt, co giật và có

xu hướng tụm vào một góc Vịt chết đều có tư thế ngoẹo đầu và có biểu hiện gan sưng, xuất huyết điểm hay xuất huyết thành vệt, lách sưng và thận sưng

Trong khi đó vịt con được tiêm bệnh phẩm từ mẫu Navet- V- HY2, Navet- V- NB, Navet- V- LA1, Navet- V- LA2 và nước trứng từ các mẫu này không có biểu hiện triệu chứng của bệnh viêm gan vịt và vịt không chết

Với kết quả thu được cho thấy các chủng vi rút Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2 có độc lực cao và ổn định qua các lần thí nghiệm, điều này được chứng minh khi tiến hành xác định liều gây nhiễm, gây chết trên trứng vịt có phôi và trên vịt 2 –

5 ngày tuổi, kết quả trình bày ở bảng 1.3

       Bảng 1.3: Xác định liều EID 50, ELD 50, LD 50 trên trứng và trên vịt

Để giám định vi rút phân lập được, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR dùng cặp mồi DHV-1F (5’-AAG AAG GAG AAA ATY (C or T) AAG GAA GG-3’) DHV-1R (5’-TTG ATG TCA TAG CCC AAS (C or G) ACA GC-3’) khuếch đại trình tự có kích thước 467 bp trong vùng gene 3D và đặc hiệu cho vi rút viêm gan vịt typ I Kết quả trình bày ở hình 1.1

Từ kết quả RT- PCR, một lần nữa khẳng định chắc chắn ba chủng vi rút nghiên cứu là vi rút cường độc viêm gan vịt

1.2 Kết quả xác định tính tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập và vi rút vác xin viêm gan vịt nhược độc, chủng DH-EG 2000

Thí nghiệm dùng phản ứng trung hòa, được bố trí với mẫu huyết thanh kháng vi rút viêm gan vịt được tiêm phòng bởi vác xin nhược độc viêm gan vịt chủng DH- EG- 

  Số 1     số 2     số 3     số 4     số 5     số 6       PC      PC       NC     ladder 

500b 467b

2000, mỗi mẫu làm 2 lần và có các mẫu huyết thanh đối chứng Kết quả được trình bày ở

bảng 4

Bảng 4: Kết quả phản ứng trung hòa

Mẫu vi rút Chỉ số trung hòa (IN ) Colog IN

Theo Nguyễn Như Thanh (2006) chỉ sổ trung hòa biểu diễn liều tối đa của vi rút bị

trung hòa bởi huyết thanh so với đối chiếu được tính theo công thức: IN=cologSN/SS

IN: Index Neutralization (chỉ số trung hòa); SS: Serum speccial (huyết thanh miễn dịch);

SN: Seum normal (huyết thanh thường); IN từ 11- 50: phản ứng nghi ngờ; IN

>50:phản ứng dương tính

Qua bảng 4, chỉ số trung hòa (IN) lần lượt của các mẫu là 102,3, 102,6, 103.2, tương

đương với các chỉ số Navet – V – TG: 199; Navet – V – DN1 : 398; Navet – V – DN2:

1585 Từ kết quả này cho thấy, có sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút cường

độc viêm gan vịt có trong các mẫu Navet – V – TG, Navet – V – DN1, Navet – V – DN2

phân lập được trên đàn vịt tại một số tỉnh thuộc khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long và vi

rút nhược độc viêm gan vịt chủng vi rút DH - EG – 2000 vì kháng nguyên là vi rút nhược

độc viêm gan vịt chủng vi rút DH - EG – 2000 kích thích cơ thể vịt sản sinh ra kháng thể

có thể trung hòa kháng nguyên là chủng vi rút cường độc phân lập được

1.3 Kết luận

- Đã phân lập được vi rút viêm gan vịt cường độc trên các mẫu bệnh phẩm thu thập

được trên đàn vịt ở một số tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long Các chủng vi rút

viêm gan vịt phân lập được có độc lực cao và khá ổn định