Nghiên cứu Proteinaz được tiết ra từ các vi khuẩn gây bệnh côn trùng trong phức hệ cộng sinh tuyến trùng - vi khuẩn

ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC T ự NHIÊNCÁC VI KHUẨN GẦY BỆNH CÔN TRÙNG TRONG PHỨC HỆ CỘNG SINH TUYẾN TRỪNG-VI KHUAN MÃ SỐ: QT - 0 1 - 15 CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS.. Phan Thị

ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC T ự NHIÊN

CÁC VI KHUẨN GẦY BỆNH CÔN TRÙNG TRONG PHỨC

HỆ CỘNG SINH TUYẾN TRỪNG-VI KHUAN

MÃ SỐ: QT - 0 1 - 15 CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS Trịnh Hổng Thái

Ch lì IIX lôi xin chã II ! hủ nil cùm (in Till II i> lâm 67;//”

iiíịIìc smli hoc, DllQdllN Tritníi tủm Sinh học phún íử YÙ

Côn lị iHịliệ lữ hào dã lạo mọi íliứu kiợn cá/ì ỉíìicĩ rỡ traiiy ihicl

bị cũni’ như ý úp dỡ VC (iìuycn lìióiì clc clí' lủi ill ực Ini'll vó kcí

2 Pi ol e in az của vi khuẩn P h olorhabdư s

2.1 Ntzhicn cứu tính chất của protci na/

Phu lục 2: Các bài báo khoa học

TÓM TẮT CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN c ứ u KHOA HOC CỦA

CÁ N H Ẩ N

S C I E N T I F I C P R O J E C T

PHIẾU ĐANG KÝ KẾT Q U Ả NGHIÊN c Cu KHOA HÓC'

B A O C A O T O M T Ă T

T e n dỏ tài: Ng hi ên cứu proleinaz dirợc Iici la lừ các VI khuân i:áv benh Lt'II

t r ù n g t r o n g p hức hệ c ộ n II sinh lu veil trìiriLi-\ 1 khuã n

Ngườ i ( h ự c h iê n :

• Chú trì dề tài: TS Trinh H ó n a Thái Khoa Sinh hoc Trưừriii Đại hoc

K H T N

• Các cán bộ tham gia:

ThS Phan Thị Mà: Trung tâm Cóng nuhộ Sinh học Đ I 1 Q G HN

CN Lương Th uỳ Dương: Khoa Sinh hoc, T r ư ờ n 2 Đai hoc Khoa học

Tự nhiên

- Tr ịnh Thị T h a nh Hương: Khoa Sinh học, Tr ường Đai hoc Khoa học

Tự nhiên

N ội d u n g n g h i ên cứu đã đ ã n g ký:

• Nuôi cấy vi k hu ẩn phân lập từ tu vốn trùnu

ra

C á c kết q u ả c h í n h đà đat được:

H e te r o r ìia b d iú s , nuôi cấy các c hủ ng vi khuẩn ph ân lập được.

• N » h i ê n c ứ u m ộ t s ố t ính c hấ t c ủ a p r o te i na z ngoạ i b à o từ c á c VI k h u a n gâ y

b ệ nh côn trùng

Sản p h ẩ m k h o a học đã h oàn thành:

• 4 bài b áo k h oa hoc trong đó 2 bài báo đ ă n e t ro n s Tap ch 1 Di truyen ứng d ụ n g và 2 bài báo khoa học dã gứi đănii i ro n s Tap chí Khoa học cua

Đ H Q G H N

6 Kê t q u à đ à o tạo:

b à y trong Hội nghị khoa học sinh viên K h o a Sinh học t há ns 3 năm 2002

7 T ó m tát kết q uả nghiên cứu:

• H o ạt độ pr otei naz m ạ n h nhát ớ pH 8 Sau khi xứ lý ỏ- 6 0 " c trone 20 phút,hoạt độ e n z y m còn k ho ang 5 0% hoạt đô ban đáu

M n 2+đã làm t ăng hoạt độ enzym, nhất là C V \

ki m loại đo bị ức chẽ mạ n h bới E DTA và o- phenant hroline

hoat đ ộ e n z y m còn k ho ản g 15% hoạt đô ban đấu

• T h ử mlì h ư o n e c u a u k c h a i ức chi ' il.k liiL‘11 n h - >n 1 chi> i!u_\ c i ì / \ i n h ư-

m ạ n h iVvi 11) 1 A vã r \ l S I ' in' Hi! i!*» ư, d k ' m t nl i nil/ll Km ỉ I ) TA

• T r o n g số các ion kim loại hoá trị hai được thư, e n / y m bị ức chê manh bới

H g 2\ sau đó đến C u 2" N r \ Z n 2+ C o : ~ và P b: \ Nạược lại các lon M n : '

C a 2+ đ ã làm t ăng hoat đó enzvm

s ạch q u a các bước: kết tủa băng axeton sắc ký qua cột D E A E Sephadex A-

50 và cuối c ù n g q u a cột Mini Q PE 4.6/50 Kết quá thu được 5 đính protein

có hoạt tinh enzy m Tr ong đó một dinh protein đã được gìn đi phân tích trình

BSc Tr inh Th] Thanh Huong, Faculty ol Biology, llanoi liniVLTsilN ol Science.

B u d g e t a nd c o nt en t s:

Bu dget : Investigation of proteinases from e n l o m o p a t h o c c m c bacteria to

e v al u a t e the role of pat hogenic 1 actors in the symbiont complcx of

n c m a to de -b ac t er ia

Cont ents :

+ Isolate and pr eliminary classification of hactcria 11 (>111 nematode

ext ra cell ular proteinases from the haclcria

+ Purification o f protemases using the various ch roma tog raph y

t echniques

+ Character izati on of proleinases 1mm ihc bacl cna

M a i n results:

Res ul t s 111 sciencc Hill technology:

f is o la lc .Uhl [Vrc 11 m IIUIIV L I.INSII KalKMi t'i c n lo n x 'p ilh o L v iiK K k K t i i :

Xi'!ìtn'li(ihihi\ tiihl

riii'icrlitilhlii'-+ S o n ic p in k 'in a s L s w e re p m i l i o l I M ill \ < r - a i ì h i t t ' , 1 1 1 , 1 ! ’ ■ I l l

II si lie the dirom.ii v’iirapln IIIL-Itii "I" "I ỊỊi-l I i l l "I I I"ỉi c\v •

+ Char acter izati on of proteinases: their pH opt i mum was 8 temperature

P r ot ei nas es were strongly inhibited by E DTA and PMSF

+ Tr inh H o n g Thai, Trinh Thi Th an h Huong I Alone Thu y Duoim

Phan Thi Ha, (2002) X enorhabdus sp CA: characterization of

G en et i cs and Applications (Biot echnology N u m b e r ) pp 1-5

+ Tr inh H o n g Thai, Trinh Thi T ha n h H uon g, Phan Thi Ha, (2002 )

e n t o m o p a t h o g e n i c bacteria {Xeiioihabdits sp XS4) Genetics and

App lic ations ( Bi ot echnology N u m b e r ) pp 6-12

+ Tri nh H on g Thai, Trinh Thi T ha n h Hu ong, Luong Thu y Duong Phan Thi Ha, (2004).: Compos it ion of ext racellular proteina.ses

p r o du ce by e n t o mo p at ho ge n ic bacteria (Xenoiliiibihts sp CA) J

o f Science Natur al Sicence (in press)

Photoi'habclus lum inesce/is HP J of Scicncc Natural S i c c i k j

(Biological n u m b e r ) (in press)

BÁO CÁO CHI TIÊT

X e n o v h a h d u s và P h o to rh a b d u s là các VI khuân còng sinh với tuyên trùng

S t e m e m e m a và H e te r o r h a b d itis tương ứng Tu yế n trùng ký sinh còn trùng dã được

c hứ ng m i n h c ó tác d u n g gáy chết đối VỚI nhiểu loại sâu hai cây trông [6 ], Tuyến trùng

ca m n h i ễ m m a n g trong ố ng tiêu hoá cua mì nh vi khuân còng sinh tao nên phức hộ tuyen trung-vi k h u ân có k h ả năng ký sinh gãy bênh cỏn trùng Khi iiập còn tr ù n1', tuyên trùng c ó k h ả n ã ng x â m n h ập qua lớp biểu hi ngoài của côn trùne đẽ vào x o an ' ’

míiu va giai p h o n g V] k h u a n Xe/ioiiicibdus và Photorìiưbdus Vi khiũin nhãn lòn r u

n hành, giêt c ôn trùng và trợ giúp cho sự sinh sán cua tuyến trùnu [2.13J Trono qua

t n n h n a y , VI k h i u i n đtì t ạ o r a CBC Săn p h â m tríio đỏ i t h ứ c á p n h ư c h i u k h á n ư s i n h I i I \ii

các c n z y m t hủy p h ân n h ư lipaza [17] và proteinaz [12.14,15,16] N°ười ta cho răníi các

■san p h a m truo doi thư c ả p nay thcim giíì vào sư sinh sán và phát tricn cim luvcn irĩm1’ trong côn tr ùng b ằ n g c ác h ức c h ế sự phát triển cua các sinh vât khác va tao ra các chat dinh dư ỡng d o h oạt đ ộ n g c ủ a các e n z y m thủy phán

T r o n g c ô n g t rì nh n à y , c h ú n g tỏi đ ã tiến h à n h n g h i ê n cứu c ác p m l c m n x do VI

k huẩn Xentìrhabclus và Photorliabcliis tiêl ra n h ăm lìm hi cu vai trò hệnh sinh m a

c n z y m này tr ong q u á trình gây b ện h côn trùng c ua phức hộ cộn« sinh (LIyen Irùnii-vi khuẩn

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

Phòi i " T u y ủ 11 t r ù n e V i ệ n S i n h t hái \ à Tà i n i i u v c n Si n h vái, N y h i a Đ n - I i r I 1CỈ11 II ỉ Nội CII11U c á p

Vi k h u â n đ ư ợ c p h â n l ập t r ẽ n mõ i inrờii!: \ B 1 A - m o i Iru-'IIL! (.linh ikrơiii:

( > ' cao lỉm , ^ pcpion, I5n lh a c h dan IIƯOV dcn l i u tici tiling 11 >>I1;J 3<> phui "

Iinn co chứa 2511112 Bromothvmol Blue \a 40illi; rriplk-iụltetra/^lium ( lil'M’hlc I ' -i i

m ộ t k h u á n l ạc, c à y và o m ỏ i trườno di nh Hirfino •

Dịch nuôi cấy sau 48 giò đươc ly tám 10.000 ròng/phú trong 10 phút + c Ihu

lấy dị c h tr ong, sau đ ó lọc q u a m à n g 0 2 2 p m và s ử d ụn g cho nghiê n cứu pro.ema/

T i n h s ạch m ô , phẩn proteinaz q u a cộ sác ký ,rao đõ, a„„ ,n Dịch nuôi cấy dư, ,

h í p p hụ trẽn cột D E A E Sephadex A-50: ( 1 6 1 0 c m , Cột đ ư ạ c cân băng vo, dóm T ns - HC1 2 0 m M , pH 8,0 Các protein k h ô n g hấp phụ trên CỘI được rứa vái cùng dóm trẽn Sau đ ó thôi c á c protei n h í p phụ trên cột sứ dung cùng loa, đ è m trẽn có chứa N a d v.-i các n ồ n g độ (M): 0,1; 0,2; 0.3; 0,4; 0,5 và ] 0

Các p h ân đ o ạ n có hoạt tính proteinaz thu được từ cột D E A E Sephadex A Õ 0 được d ô n lại và loại mu ối , sau đó được tinh sạch tiếp qua cột Mini Q PE 4.6/50

X á c đ ị n h hoạt độ củ a protcinaz: hoạt độ' proteinaz đã được xác định theo phương p h á p K u n i t z có cải tiên như đã m ô tả trước đây [16]

Đị nh lượng protein theo phương pháp Bradford sử dụ ng a l bumin huyết thanh ho làm chuẩn

Đ i ên di protein trên gel polyacylamit có SDS ( SDS -P AGE) theo phương phá,, cùa L a e m m l i ( 1 9 7 0) [10]

Điện di pr o te i na z theo phương pháp của H e us se n vù Dovvdlc (1980) dược thực hiện n h ư đã m ỏ ta từ trước [16],

1 P r o t c i n a z c ủ a vi k h u ẩ n X en o r ì i a b d u s

1.1 Ng h i ê n cứu tính ch ấ t của pr ot ein a z

l 1.1 p H thích h o p củ a p ro tei n a z

Sir t h i n e c á c đ ệ m c ó n ỏ n i i (.lộ 0, 2 M đ è x á c đ i n h pl í t h í c h h o p c u n p r o i c n u / d,ì

cho Ihây: với x s c n / y m hoạt đónt: mạ nh (V pl 1 «s ớ pll 10 hoại dọ L'11/ v m Lii:im manh

chí c ò n k h o á n g MYi s o vó'i ho ạ t đ o c ư c dai Vớ i ma i l C A h o a i đ ộ c ủ a n i / v m il.it a IV

l ỉ a i ( í p l ] s T u i p ] I 7 h o a i d ô b ă n l i k h o a n g 9 0 ' r s o \ O I 111 t ; i ( đ o U I V ( X u ( l ì m l i I I

■ xs

H ì n h If Ả n h h ư ớ n g c ủ a pH đến hoat độ proteinaz cùa vi k huẩn cóng sinh với

1.1.2 Ả n h h ư ở n g củ a các chát ức chê dặc hiệu nh óm đến hoạt đô enzym

Các chất ức c h ế đ ặc hiệu n hó m được sử d ụn g gổm: PMSF pCMB, EDTA o-

p he nant hr oline với n ồ n g độ cuối cù ng trong hỗn hợp phán ứng là 10 ''M Két qua cho

thấy e n z y m bị ức c h ế m ạ n h bới EDTA, hoạt độ chí còn kh oá ng dưới 2 0 r/( so vói đói

c h ứ n ° (hình 2) E D T A là hai chất ức c h ế đặc hiệu vói n h ó m proteina/, kim loại

Ị n x s

B C A

Hì nh 2: Ả n h hướng cù a các chai ức c h ế dặc hiệu nh ó m len hoại

độ protcinaz c ủ a vi k huẩn Xenorluibclus sp.

1.1.3.Ả n h h i r i n g của ion kim loai hoá trị hai (lẽn hoa i (lộ enzym

T r o n g s ố 8 IOI1 k i m l o ạ i h o a trị h a i d i r ợ c i h i r ( C a \ M g M n ỉ :L-; • < " ■ ( 11 ■ / i r ' l i " - 1' ) , e n / y m bị ứ c c h õ m ạ n h b ớ i l l u s a u d o đ ó n c u \ à / I I - i v - Ht " - L , u

l o n C r ' \ à M e : ' (-tã l à m l a n g h o ạ i đ ọ e n / v n i , r õ r ộ l n h á i l a ( ;i

B ả n g l : An h hường cùa các inn kim loai hoá tri hai đến hoạt dó

proteinaz của X enorhabdus sp.

G iữ d u n g d ịc h e n / y m ớ 60 °c , sau những kho ang thời gian nhai clịnh làm !anh

n h a n h c h ú n g và x á c đ ị n h hoạt độ p r o te i na z ở 3 7 ° c Kết q u ả c h o t hây hoạt đỏ c n / y m

k h o ả n ^ 5 0 % so với hoạt độ ban đầu T uy nhiên, với CA, e n / y m kém bén hơn, đe da» được giá trị trên chí sail ch ư a đôn 10 phut

Tlioi L'ian (pl ui t )

H ìn h ì Su- h ic r < 1 I , u .ló p r m o in :,/ M U v i k l u ú n V n r , M>

i hco thoi eian \ ứ lv t ’ M I (

1 1 ĩ 1’h a n lú-l, t h à n h p h u n p w t r ì m r b m v i d ư n d i

Đ ể đi s â u phân tích thanh p h á n p r o te n a z c ó t rong dị ch nuôi ca> VI k hu â n, c h ú n g tôi đã tiến h à n h điện di trên gel polyacrylamit có SDS va có cư chát gelatin n K , (hình 4) Các b ă n g e n z y m được n h ận thấy trên bán gel nằm trong 3 vùng (I II vu III) vơi d;>

di đ ộ n g điện di t ương ứng bằng: (0-0,08), (0,09-0 20) và (0.25-0.31) Trong đó các bãng trong v ùn g II thê hiện hoạt độ m ạ n h nhất, c hú ng bị ức c h ế ma nh bới cá FDTA YU PMSF N g ư ợ c lại, hai loai ch ất ức c h ế này đều k h ô n g ức chẽ' các b ă n g trong vù ng I

H ì n h 4 Đ i ệ n di pr otei naz trên gel po lya cr yl ami t có SDS và có cư chất gelatin

0, 1%: ảnh hư ởn g c ủ a E D T A và P M S F lên hoạt độ c ủ a pr otei naz trong dịch nuôi cây vi

k h u ẩ n Xenoì ìtabdns sp CA.

C h ú thích trên hình điện di: giếng 1: đối c hứ ng nước; 2: E DTA ; 3: PMSF; 4:

D M S O

proteinaz bị ức c h ế bới E D T A , mẫ u n gh iê n cứu đươc đ iên di trôn gel polyacrylamit có SDS và có c ơ c h ấ t gelatin 0,19c C h uẩ n bị mẫ u n hư sau: m ả u được u VỚI E D T A với non ° độ c uối c ù n u t r o n s hỏn hợp phán ứng bằng 10 ' M tron í: 10 phút, sau đó bổ SUMII ion kim loại với n ồ n g độ cuối cùng bằng 10 ' M; 2.5 10 'M và 5 10 VI Kốt qua ctã cho Ihãv: c ác ion C a :+ Ba:+ M s :+ M r r \ Pb2+ đã làm t ãn e rõ rệt hoai đõ cn/.ym thuoc

ilíiV’ l ưu V là: c á c i on C a : ‘ B a : \ MíZ: \ M n :+ c h i a n h t i u o n u đ ó n h o ạ t d o c u a b;m;j

p r o l c i ĩ r i / 0 c ò n P b 7 * c h i c ó l á c d u n e d õ i v ớ i b u n g 0 3 1 T u y nil ill'll, c h ú n g t ôi c hư i

lìm 111"IV ion k i m loai n à o c o tác tiling khui p hụ c hoai tinh c u a c ác b a n y c n / \ m Mill- II

( h ì n h ỉ p h u l ục)

1.2 Tinh sạc h m ậ t p h â n pro tei na z từ Xenor ha bdỉ ts sp XS 4 va Xenorhabdưs

sp CA

Đ ê có thê t ách các protein có hoạt tính proteinaz ra khói các protein khác tmnu dịch nuôi cấy, c h ú n g tôi đã xử dụng các phương p háp sãc ký theo các con đưong sau đây:

dịch nuôi c ấ y vi k h u ẩ n X eu o r h a b d u s sp Kết q u ả trên hình 5 cho thấy: các phân đoạn

có hoạt tính pr ot ei n az chủ yếu là nh ũ ng phân đoạn k h ô n g hấp phụ trôn cột và đưoc rửa khỏi cột trong m ộ t s ố lần rửa đẩu tiên bằng đ ệ m Tr is- HCl 2QmM, pH 8 ,0 Proiemaz đã được tách ra khỏi các protein h ấ p phụ trên cột

Hình 6 : s ắ c ký trao đổi ion dịch nuôi cây vi k h u ẩ n X o ư u h a b d u s sp trẽn cột

D E A E S e p h a d e x A - 5 0 (a: x s , b: CA) Cột được cán b ăn g với đ ệm T n s - H C l 2()mM pi I

0 °- 0 3' 0 4' 0 -V và 1,0 T ố c dó chay: 30 ml / íĩiờ Th e lích mỏi phân đoan: 3 ml

2 P r o t e i n a z c ủ a vi k h u ẩ n Photorhahdus

2 1 N g h i ê n c ứ u t í n h c h ấ t c ủ a p r o t e i n a / ,

2.1.1 p H thích h ọ p của pro teinaz

H oạt độ e n z y m được xác định trong các đệm có pH khác nhau: đém Sorensen

0 2 M pH 6,0; pH 7,0 và pH 8.0; đệm Briton 0 , 2M pH 9,0 và pH 10.0 Kết qua xác đinh ánh h ư ớ n g c ủ a pH lên hoạt độ e n z v m được trình bày t r o n 2 hình 6

H ìn h 6 : Ả n h hư ởng c ủ a pH đến hoat độ protei naz dịch ngoại bào

vi k h u ẩn p h im in e s c e iis l ỉ p

Tr ê n h ình 6 la thấy hoạt độ e n z y m đạt cực đai khi xác định tại pll 8,0 Hoạt d;» của e n z y m g i ả m d ầ n ở pH 7,0 và 6,0 đặc biệt giam m a n h ở pH 9,0 và 10,0 N hư vây

pH thích hợp c h o hoạt độ c ủ a e n z y m la 8,0

2 1.2 Ả n h h ư ở n g các ch ấ t ức c h ế đ ặ c hiệu n h ó m đến h o ạ t dô enzym

Các chất ức c h í đặc hiọu được nghiên cứu là: P MSF pCMB E DTA (1-pho

E n z v m dược ú vói c á c chãi ức ché đặc hiệu với n ón g đ ộ cuối c ù n g i r o n s h>>" hl,p b;llls

VC ánh hư ớng c ủ a c á c chái ức chẽ đạc h i í u lẽn hoại lính e n z y m d u o c ch, r.1.1 hình 7

Hìn h 7' A n h hư ơng cua C3.C chât irc chc đăc hiêu nh óm đén hoíit dỏ protcinu/

dịch ngoại bào vi k huẩn p lu m in escetìs H p

oạt tính), s au đ ó đ ế n P M S F (ức c h ế 28%) Các chất còn lại k h ôn g ảnh hướrm tới ho;.it

đ ộ c ủ a e n z y m

2.1.3.Ả n h h ư ở n g của ion k i m loại hoá trị hai đến hoạ t độ enzyni

Các ion k i m loại được n gh iê n cứu gồm: M n 2+ C a 2\ F e 2\ C d :+, Ra: \ M í t ’

P b 2+, C o 2+, Z n 2+, N i 2+, C u 2+, và H g 2+ Ion ki m loại được bổ s ung vào dịch enzym với

n ồn g độ 10 1 M, ủ h ỗn hợp trong 10 phút Xác định hoạt độ protei naz dã cho thấy các ion M n 2+, C a 2+ có tác d ụ n g tăng cường hoạt độ en zv m Ngược lai các ion Pb2', C o2'

Z n 2+, N i 2+, C u 2+, và H g 2+ ức c h ế hoạt đô e n z y m trong đ ó ion H g 2+ tác dụng mạ nh nhất (ức c h ế 6 8 % ) C á c ion c ò n lại ả n h h ư ớ n g k h ổ n c rõ r à n g tới hoạ t đ ộ c n z y m (hình 8)

M i l t e l i t l ’ h / n C'|| !-)<■

< '.K h'H k in I' ‘.li

2.1.4 Đ ộ bén vói nhiệt ở 60"c

phút Sau m ỏ i thời gian ú e n z y m đuực lấy ra va cho n g ay vào 4 T Xác dịnh hoái dọ protei naz t heo p h ư ơ n g p h áp Kunitz, ta có kết quả trẽn hình 9

H ì n h 9: Đ ộ bển nhiệt củ a proteinaz trong đ ịch ngoại bao vi khuán

p lu m in e s c e n s ỉ ĩ p

còn 5 0 % và sau 10 phút ú 6 0 ° c hoạt tính e nz ym chi còn 2 4% so với hoạt dò han dấu

Có thể kết luận r àn g e n z y m trong dịch ngoại bào do vi k h u ẩn p lu m in e s c e n t u p li cl ra

k hô ng bền với n hiệ t độ

2.1.5 P h á n tích th àn h p h á n p r o tei n a z b ằ n g điện di

Bằng p hư ơ n g p h áp điện di e nz ym c h ú n g tỏi đã thu được kết q u á vẽ thành phan protcinaz tr o ng di c h n g h i ê n cứu (hình 2 phụ lục)

1Dưa vào kết q u á điện di củ the chia các p r o t e i n a / thanh 3 khu vực lớn Khu VƯU

I g ổ m c á c p r o t e i n a z c ó d ò di d ộ n g đi ện di ( R f ) từ 0 , 0 3 đốn 0 , 0 8 I r o n ” dó c ó ha! bãim en/.vm c h í n h : hãn li I có R í 0.03 và bãnu 2 LÓ 0,08 Khu vưc II ch ứa các p m t c m a / có

dô di đôn11 clicn di lừ 0.2^ đèn 0,39 va cn/.vm o' khu vực III có (tộ di đọni: (liện di (' ỹ

p r o l c m i / n ã m i r o n í! k ì m VI IV I v à II c ò n 1: 1) ỉ A ú c c h é m a n h L tv p i o i c i n 1 / k h u \ ! k I

\'à moi phan khu VIIV III Như vay cac pmtciiKi/ ihui'v khu MR I hi Ưv d v Km 1HDTA va PMSI-

, ™ „ r J hư! n ? ,c " c; k i on ki m h' “ ■ " h ' “ - P'V— o

CO 1 C d ụ n g k h ô i p h ụ c và l ã m l ăng h o a , lính cu a c ác b a ng e n , ™ t hunc khu vục ỉ và III

d ụn g rõ rẹt lén b ã ng 0 , 08 c òn Mg=*và Co-’* co tóc dung rõ rệt lén t a n g 0.03

2 2 T i n h s ạ c h p r o t e i n a z

P r o t e m a z c ủ a vi k h u ấ n dã đưạc tinh sạch qua các bước: kê, lua háng axclõn VK

Dịch nuôi c ây vi k h u án sau khi tua bán SI ax êi ô n được c ha y qua cột DÍÍAK

Scphadcx A Õ O (hình 10), hoạt độ cn/.ym ma n h nhãì dược rút xu ốn g cột à nony ilo

NaCI 0 2 M C á c phân do an na\ dược do n lại, sau k lì 1 loại imioi được ch.iv Lị LUI m i

đó dinh chù yếu đã dược iiửi cĩI phân tích trình lự axil a m m

H P 3 0 2 c 4 0 1; I u v 1 280nm

HP302c40I: I Cone

HP3(J2c40 I: I FractionsmAU

Hình 11 Ti nh s ạch pr ot ei naz củ a vi k huẩ n p l u m i n e s c e n t H p q u a cột Mini Q PE

4.6/50 Cột được cân bằng với đệm Tris-HCI 20 mM, pH 8.0 (đệm A) Protein hấp phu trên cột được rút xuống bằng đêm trẽn có NaCl IM (đệm B) với gradient 0- 40 rr B Tốc độ chay:

THUNG TÁr/ THỘNG Tir^j

IV B À N L U Ậ N

N h u váy, tro ng mỏ i Iruóng nuôi cấy vi khuân X t m r i ú M m va ri„.,„rhaM u> dã

tạo ra c á c p r o t e i n a z C á c enzyni này hoạt đ ộn g mạnh a pH 8 và đirợc phán loại t h ui y

n h ó m p r o l e i n a z k i m loại d ự a Irên lính c há t bị ức c h ế d á c hi ệu bói E D T A t heo phán loai

cúa Hartley (1960) [9].

P r o tei naz ki m loại là e nz ym được tìm thấy ớ nhiều loai vi khuán gãy bệnh con

[11,12] P r ot e i n a z k i m loại c u ng được tìm thấy ờ các vi khuấn cóng sinh với tuvón

t rùng thuộc c ác c h ủ n g X eno rh a b d u s [14,15,16] và P h o to rh a b d u s [12,15.16],

Các n g h i ê n cứu từ trước đều cho biêt vi khuấn cộr)2 sinh với tu yen tiùn° tiẽt ra một lượng lớn p r o t ei n a z trong môi trường nuôi câv [4,12,14.15.161- Các proteinaz na\ được phân loại t h uộ c protei naz kiềm với pH thích hợp b àn g 8 và thuộc nhó m protein,!/ kim loại do c h ú n g bị ức c h ế m ạ n h bởi Ẹ D T A c h ún g kh ôn g bị ức ché bới

P MSF [14 ,1 6] T u y nhiên, rất ít công trình nghiên cứu đi sâu phân lích thành phấn proteinaz ng oại bào c ủ a vi k hu ẩn cộng sinh với tuyến trùng Tr ong nghiên cứu này

c h ú ng tồi n h ận th ấ y pr otei naz ngoại bào của Xenorhabchts sp CA kh ôn g những bị ức

c h ế m ạ n h bởi E D T A m à còn bị ức c h ế m ạ n h bởi PMSF Bàng kỹ thuật điện di protcinaz, c h ú n g tôi đ ã xác đinh được thành phần c ủa proteinax, tronti dó bán 12 protcinaz có hoạt đổ m ạ n h nhất thuộc vùng II bị ức c h ế m ạ n h bới cá E D T A và PMSI \ còn các b à ng pr ot ei naz trong v ù n s III bị ức c h ế m ạ n h bới P M S F nh ưng cũng bị ức chó' một phấn bới E D T A N g h i ê n cứu ảnh hưởng c ủa các lơn kim loai đốn hoạt độ protei na/

dã cho thấy c ác ion C a 2\ Ba2+ M g 2\ M n :+ có tác tiling khôi phục hoạt tính cua ban.:0.25 sau khi bị ức c h ế bới E D TA còn P b2+ chí có tác d u n g với hãng 0,31 Vì vây có thế c ho r à n ơ hai b ă n g này thuộc loại proteinaz kim loại-xêrin như dã dược tìm thây ơ

vi k huẩn B a c illu s p u m ih ts [5].

S o s á n h ° i ữ a c á c c h ù i m VI k h u ẩ n d ư ợ c n g h i ê n c ứ u X í ’i i ( >r h ( i b ( l u \ v à

m a n h o p l i s k é m h e n \iVi n h i ệ t l í n / v m hi ức c h õ m a n h h.li i ; i ) l \ va I' M, SI'

r i i o i o r l i u h i l n s d c u c o c h ư a k ì n i ! p r o t c m a / hi irc LỈÌC h.M H ) I A \ ;i ['MSI- II: í:

urơn- này da ihn.vc 1’hnm Thi IV,MI H u l l va llcniẠk l 'rK.nok | | "7-Ị' tim ilú> •

DFP m ộ t c hất ức c h ế đặc hiệu proteinaz xérin Vì vậy các hang protoina/ nà} được

x ế p vào loại p ro te i na z ki m loại-xẽrin

V c vai tro c u a proteinaz: protcinaz la enzvm có vai trò I'iit cỊUíin tron° tronơ quá trinh sinh tr ương va phat t n e n cua sinh vật Đỏi với phức họ cộng sinh tuvên I['ùn°-\|

k h u ẩ n , khi phức hệ này x â m nh ập vào cỏn trùng, vi khuân nhân lên vã tiết ra một so

p r o te i n t r o n g đ ó c ó p r ot ei n az C á c p r o te i n a z được c h o là c ó vai trò q u a n t r ọ n s tham £ia vào q u á trình diệt côn trùng băng các h làm két tủa các protein má u và phá huv các te bào m á u c ủ a c ô n tr ùng [7], Ngoài độc tính của nó các san phám ihuv phán cua

p r o te in a z c ò n c u n g c ấ p chất d in h d ư ỡ n g c h o SƯ phát triển c ủ a tu y ến trim s C ù n s VỚI

proteinaz, các protei n khác, đặc biệt là các protein đõc do vi khuán tạo ra đã được

c h ứn g m i n h c ó vai trò qu an trọng trong quá trình gây bênh còn trùng [ 3 8 Ị Đóng thời

với việc n g h i ê n cứu các protei naz của X enorhabdus sp XS4, c hú ng tỏi đa ne tiên hành

n gh iê n cứu c ác pr otei n độc và sư tương tác c ủa hai loại protein này n hằm tìm hướrm ứng d ụ n g c ó h iệu q u ả tao c h ế p h ẩm diệt côn trùng gây hại Các nghiên cứu dang được tiếp tục thực h iệ n có n h iề u triển vọng

Q u a n g h i ê n c ứ u pr ot ei naz ngoại b ào của vi k h u ẩ n cộn g sinh với tuyên trùng, chứng tỏi rút ra m ộ t s ố kết luận sau:

1 Vi k h u á n c ộ ng sinh với tuyến t rùng đã tạo ra m ột lượng lớn proteinaz khi

n uôi c ấy trong m ôi trường nhân tạo

2 P r ot e i n a z hoạt đ ộ n g m ạ n h nhất tại p H 8 E n z y m kém bén với nhiệt

m ạ n h bời H g 2+ sau đó đến C u :+ và Z n 2\ N gượ c lại các ion C a 2' M g : ‘

đ ĩ l àm tăn ° hoạt độ e n z v m c ủa vi k h u án X e n o r h a b d u s , còn Mn* da lam

t ă n ° hoạt dô e n z y m c ủa vi khuẩn Pliotorìuilhliix.

4 T h à n h phấn proteinaz ngoai bào cua vi khuan X cnorhahdus và

P hoto rh a ln lits khá da d an g và phong phú T r o ng dó có (hành phan

VII TÀI LIÊU THAM KHẢO

s y m b o l i c a l l y a s s o c i a t e d wi th i nsect p a t h o g e n i c n e m a t o d e s o f the families

H e t e r o r h a b d i t i d a e and Steinernematidae J Gen Microbiol 128: 3061- 3065

as so ci at e d e n t o m o p a t h o g e n i c bacteria, n emat od es and their insect hosts In: Par asit es a nd Pat ho ge n s of Insects Beckagc N T h o m p s o n s F eden ci B (Eds)

A c a d e m i c Press, N e w Y o r k , Vol 2 p 1-23

Mi cr ob iol , 64 ( 8 ): 302 9- 3035

c h ar a ct er i za ti o n o f an ext racell ular protease fr om X en o rhabdus liematopliila

M ic r o b i o lo g y , 68(3): 1297-1304.

B a cillu s p n m ilu s as me ta ll o en zy me A c ta M ic r o b io lo q ic a P olonica Ser B 6 ,

(23) :21-25

học sâu hại c â y trổng ơ Việt Nam T ạ p chí k ho a học và cô ng nghệ XXXVI (3): 24- 29

Serratia m a rc e s c c u s : phaue-resi st ant mut ant s with a d e c r e a se d resistance lo

C c c r o p i d i m m u n i t y and a decre ase d virulence to D ro s o p h ila J Gen Microbiol

10 L a e m m l i U.K 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly ol the

h e a d o f b ac t e r i o p h a g e T4 Nature, 227: 680- 685

11 M o r i h a t a K., 19 74 Comparative specificity of microbial proteinases Adv

En z y m o l Relat A reas Mol Biol,, 41: 179- 243

12 O n g K L , F.N Chang, 1997 Analysis of proteins from different phase variants

o f the e n t o m o p a t h o g e n i c bacteria P h o to rh a b d u s lum inescens by two dimen si on;'1

z y m o g r a p h y El ectr ophor esi s 18:834-839

H e t e r or h ab d i t i da e In: E n t om op at h og en ic N e m a t o d e s in Biological Control

G a u g l e r R., K a y a H.K, (Eds) C R C Press, Boca Rat on, p 23- 61

14.■ S c hm i d t T M , B Bleakley, and K.H Nealson 1988 Charatcrization of an

e x t ra c el l u l ar protease fr om the insect p at h og en 'Xenorhabdus lumincscens

Applie d and E n v i r o n m e n t a l Mi cr obi ology, 5 4 ( 1 1) :2793-2797

15 T rị n h H ồ n g T há i , N g u y e n Hoài Hà, P hạ m Thị Tr ân Châu, 1999 Bước đầu nghiên

c ứu p r o l e i n a z c ủ a vi k h u ẩ n p h â n lập t ừ t u y ế n t r ù n g S te in ern em a carpocapsae T L

và H e te r o r h a b d itis sp TK3 T ạ p chí sinh học, 21 ( l b ) : 173- 179.

P h o to rh a b d iis lnm inescưns J Geneti cs and Applications Specical Issue:

B io t ec hn o lo gy , p 10- 17

c l on in g and s e q u e n c i n g o f the lipase gene and anal ysi s of its expression in

p ri m a r y and s ec o n d a r y phases o f the bact erium J B a c t e n o L 175: 1665- 1673

PHỤ LỤC

1 2 3 4 5 0 7 8

■ (h )

Hình ỉ Điên di proteinaz trẽn gel polyacrylamit có SDS và có cơ chất íielatin 0 1( i : ánh

khi bị ức c h ế bởi ED T A

Chú ỉliích trên hình diện di: giếng 1, 5: đôi chứno nước; 2, 6 : dối chứim EDTA; 3 7 và 4,

'M, tưoìig ứng Sau khi đ iệ n di: nửa bàn gcl (c ó c á c g i ế n g 1-4) đượ c ú với d e m íily c in -N u O ll

0, IM pH 8,0 kh ô im có ion kim loại; nửa hàn gel (có các giống 5-8) dược u \'(í'i (lộm trcn LO

( ” ): (Al’\ (h): í V '

(T)

Hình 2 Điện di proteinaz trẽn gel polvacrylamit có SDS và có cơ chất gelatin 0 , 1 (7<: ánh

hườn'1 của c á c io n kim loại đ ố i với hoạt đ ộ p r o t e i n a z c u a VI khuẩn P h o i o l t a b d u s w v sau khi hi

ức chẽ bời EDTA

Chít illicit licit Itìiili diện di: aiếng 1, 5: dối chứng nước; 2, 6 : đối chứng EDTA; 3, 7 vu 4

8: pr o tc in a z sa u khi bị ức chê' bới E D T A dược u \'ới ton kim loại n ồ n g đ ộ 2 , 5 10 ' \ \ và

ion ki 111 IIKII II(MI li dỏ 2 '1 10 \1 • (>* )■ Cii , (b )'■ / x\ (L )■ \1 , (đ ): \1 II (c ): ] ’h , (I ) \ I(ti): Ctl \ ( h ): IV'*

P H Ụ L Ụ C 2

D A N H M Ụ C C Á C BÀI B Á O K H O A H O C

1 T rị n h H ồ n g Thái , Trịnh Thị Th an h Hương Lương Thu ỳ Dương, Phan Thị í la

(2002) X e n o ĩh a b d n s sp CA: Mó t số tính chất cùa proteinaz neoại bào út vi

C N S H ) , tr 1-5

2 Tr ịnh H ồ n g Thái , T rị n h Thị Th an h Hương, Phan Thị Hà, (2002) Nohiẽn cứu

m ộ t s ô tín h ch â t c u a p r o te in a z n g o a i bào từ vi k hu ẩn c ộ n g s in h với tuyến trùn”

{X enorhabdus sp XS4) T ạ p chí Di tr uyền & ứng d ụ n g ( Chuyên san CNSH) tr

6-12.

(2004) T h à n h p hần protei naz ngoại bào c ủ a vi k h u ẩn cộ ng sinh với tuyến trùỉiìỉ

(X e n o r h a h d u s sp CA) T ạ p chí kho a học, Đ H Q G H N ( đang in).

4 Trị nh Thị T h a n h Hương, Tr ịnh Hồ ng Thái, ( 2004) N g h i ên cứu một số tính chat

k h o a học, Đ H Q G H N ( đang in),

MỤC LUC

X enorhab dư s sp CA: Một sổ tính chất cua proteinaz ngoai bào từ vi khuin

c ộ n e sinh với tuyến trung.

2 Trịnh H ồng Thái Trịnh Thị Thanh Hương Phan Thị Hà

N g h iê n cứu một số tính chát của Proteinaz nsoại bào từ vi khuẩn còn" inh

với tuyến trùng (X e n o rh a b d ia sp XS4).

3 Dưcmg Văn Hợp, Sokoienko R G Hermann

Sử dụng kỹ thuật di truyền trong nghiên cưu tươnơ rác protein.

4 Chu Thị T h a n h 'Bình N au v ễ n Lân Dũns Lircrnn Thuv Dươn17

Phân lập, tuyên chọn và nghiên cứu các chuns nấm men có khá nănti phân giái xenlu!oz nhãm ứng dụng trong xừ 1Ý bã thài hoa quá làm ỉhức ũn chăn nuôi.

5 Đ à o Thị Lương, Phạm Vãn Ty, Trịnh,Thành Truna Nguyẻn Thị Anh Đào

N g h iè n cứu đặc điểm sinh hoc cua \ ạ khuẩn kháng Pseudomonas

s o ỉa n a c e a r u m gây héo cày trổng.

ì

Takashi Nakase.

B u lỉe ra ninhbiììhensis sp nov., một loài nấm men mới sinh bào từ bản được

phân lạp ờ Việt Nam.

7 N s u y ễ n Thị Hoài Hà Phạm Ván Ty, Nauvẽn Thị Kim Quv

N c h iè n cứu hoạt tính amvlaza của hai chủna Bacillus sp H5-1 và H5-4 dùng

trong sàn xuất phàn bón hữu cơ.

8 N s u v ễ n Thị Hoài Hà, Phạm Vãn Ty, Níiuvển Thị Kim Quv

N gh iê n cứu khá nãns sinh tổng hỢD bactenoxin của loài ìưcỉohaciHiis

p l a n t a m m L24.

9 Trịnh Tam Kiệt, Vũ Thị Kim Neãn Tran Thị Lan Trịnh Kiéti Oanh.

N c h iê n cứu sự m ọ c và sự hình thanh ọuá thể của nam irấne m ọc cum

L x o p h \llitm sp.

10 Trịnh Tam Kiệt, Vũ Thị Kim Níiàn, Trịnh Kiều Oan.il Trần Thị Lan, Hoàng Văn Vinh.

Nhũn ° nsh iè n cưu vé Num múa Gi'ifoihi 'romỉosiỉ.

t 1 Trịnh Tam Kiệt, L’do Graeíer B Schelegei Peter Saiuz.

N"hiẻn cứu Cìirvsospennins 3 c Đ >1 juá ỉ hè '■ií.'1'ocoiiin.', ni.!”>ìi(ì/!ijns!s.

1 2 Hoàng Ván Vinh Trinh Tam Kiel Đ o N p v Lié:i.

l ư ớ i p i n u r r ỉ I I S R t ’a r r ’ i s

13 1’nìn Tin Lan Trinh ĩ::m ;<ict

N d i i è ĩ i V.- 1R] m ó t sò J ;c - i nh -'OC _:ia J.ÍC ' oa i ’r o n y -.11

Corctniopi^iir^ins i ỉ i i h e r

X E t W R H A B D L S SJ> CA: M O T SỎ I IN Ỉ! C H x i ( I A IM'OIKKN X /

N G O Ạ I B A O 1 1 VI K H U Â N C O N G S Ì N H \ 0 1 i I 'l Í N ì IU Nc;

Trịnh Hổng Thái Trinh Thị Thanh Hưcnic Liru;^ Thus Dironj

K h o a Sinh học Tí.Cm;' Đ ụi Kh.ui Tự

P i i a - T l i i H j

Tru/lí! tủm cỏny /la!,,; Sinh ìu\ Dạ hộ.- Oil ■< yu: u: \ ;

ơ Việt N am một số chủng tuyến trims câv bệnh cõa trùne d ĩ đirơc p!i -ì Kip ùr

T r o n g bà i v i ế t trước [ 1 4 ] c h ú n g tòi đ ã tiến h à n h n e h i è n CƯU một sô lính ch It c ú ;

Stein ern em u ơ V iệ i Nam Các proteinaz này được phân loại thuốc nhóm proleinaz kim

l o ạ i d o bị ức c h è m ạ n h bơi EDTA và o - p h e n a l t h r o l i n e N h ă m l i ế p tục tìm hi ếu tính chà:

t rì nh b à y m ộ t s ố k ế t q u à n g h i ê n c ứ u v ề pr o t e i na ^ đ ư ợ c tiết ra từ VI khu ẩ n Xaiorli,iĩhlu.\

sp- C A một chùng vi khuẩn được phân lập từ tuyến trùiie Steinenii’imi rarpocaf'Mit’.

Vi khuân Xenorhakdus sp CA được phân lãp từ tuyến trùne Sti'iih i norm

c ư r p o c u p s a e do Phòng Tuvến trùng, Viện Sinh thái và Tài nsuỵèn Sinh vật, NchTa Đ ỏ -

Từ Liêm , Hà Nội c u n s cấp.

Phán iáp và nuôi cấv theo phưone pháp đã được mó tà như trước 114 1.

X á c đ ị n h h o a t đô c ù a p r o t e i n a z : h o ạ t đ ó p r o t e i n a z đã đ ư ợ c x á c định theo phươTtL'

2 Ánh hưởng cùa các chất ức ché (lác hiệu nhóm dến hoạt dó e n zy m

Tron” số 4 chất ức chế đặc hiệu nhóm đươc thừ nghiêm (PMSF, pCMB EDTA,

o-phcnaUhroìme) enzym bị ức ché mạnh nhất bời PMSF và EDTA (ức ché trẽn 90% ),

1 2 0

C á c c h ã t ức c hu (hìc b i ê u

1 lilt hating cua ion kim loại lìíHÍ [ri hai dcn hoot dó enzvitt