Phân tích ADN ty thể của người để xác định cá thể và huyết thống

M ục tiêu và nội dung nghiên cứu: + Xác định phương pháp tách chiết ADN ty thê từ tóc rmười, góp phần vào việc giám định gen trong xác định quan hệ huyẽì ihốns và nhận dạng cá thế người.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌG Tự NHIÊN

PHÂN TÍCH ADN TY THE CỦA NGƯỜI

- PGS.TS Nguyễn Văn Mùi ĐHKHTN, Đ H Q G Hà nội

- CN Hoàng Thị Hồng Lê, Khoa Sinh Đ HK H TN ĐHQ G H à nội

- N guyễn Van Minh, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQ G H à nội

- PGS.TS Nguyễn Văn Mùi, ĐHKHTN, Đ H Q G Hà nội

- CN H oàng Thị Hồng Lê, Khoa Sinh Đ HK H TN Đ H Q G Hà nội

- Nguyễn Van Minh, Khoa Sinh Đ HKHTN, ĐHQ G H à nội

M ục tiêu và nội dung nghiên cứu:

+ Xác định phương pháp tách chiết ADN ty thê từ tóc rmười, góp phần vào việc giám định gen trong xác định quan hệ huyẽì ihốns và nhận dạng cá thế người.+ Giải trình tự ADN ty thể từ thân tóc người

Các kết quả đạt được:

+ Đ ã xác định được phương pháp tách chiết A D N ty thể từ thân và chân tóc của người bằng việc sử dụng dung dịch Chelex 10% và dung dịch DTT Sản phẩm thu được có đủ độ sạch để nhân các cặp mồi ty thể L I 5965 và H I 6491, L I 5997 và

H I 6401 ở đoạn HV1

+ Đ ã hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân ADN ty thể bằng 2 cặp mồi L I 5965

và H I 6491, L I 5997 và H I 6401 từ tóc của người Việt

+ Giải trình tự nucleotit đoạn ADN là sản phẩm nhân mồi LI 5997 từ thân tóc của 4 cá thể của một gia đình có 3 thế hệ cho kết quả:

- Giữa bà ngoại và mẹ không có sự khác biệt nào ớ vùng siêu biến HVI

- Giữa con và mẹ (và bà ngoại) có sự khác nhau về 1 cặp nucleotit tại vị trí 143 (theo trình tự A D N của người con và là vị trí 16175 trên hệ gen ty thể chuẩn) ở con là cặp A-T, con bà và m ẹ là cặp G-C

- Giữa con và bố có tới 4 cặp nu khác nhau tại các vị trí 18 (trons; hệ gen tv thểchuẩn là vị trí 16050), của con là T và của bố là G: vị trí 91 (trong hệ gen ty thểchuẩn là vị trí 16123) của con là G ,và của bố là C: vị trí 145 (trong hệ °en tv thểchuẩn là vị trí 16175) của con là A và của bố là G: vị trí 292 (trong hệ ơen ty thểchuẩn là vị trí 16324)của con là A và của bố là G

Kết luận: dung dịch DTT dùng để tách chiết ADN từ thán tóc người, giải quyết đươc khó khãn trong nghiên cứu xác định cá thể và huyết thống khi mẫu vật

đã bị phân huỷ, trong nghiên cứu hài cốt cổ nhãn Kết quá trẽn cho thây sự khác biêt di truyền hệ sen ty thể giữa dòng bà-mẹ-con gái và bố - con gái Đổng thời tại vùng siêu biến HVI này (được đãc trưng b ằns 2 cặp mồi đã sử d u n2 là Lí 5965 và

H I 6491 L I 5997 và H I 6401) thực sự là vùna có nhiều biến đối o' cấp độ phán tử, điểu đó cho phép xác định chính xác lới mức cá thế

-Tình hình kinh phí của đề tài:

Quán lý hành chính và chi phí.khác: 2 200000 đ

Báo cáo để tà i QT 05-23

Subject o f scientific research 2005

Tile: Analysis mitochondria DNA of hum an for individual determination and

C o d e: Ọ T 05-23

L eader o f reasearch: Chu Van Man

R easearch o f cooperation:

Dr Nguyen Van Mui; Bs Hoang Thi Horn: Le; Nguyen van Minh

O bject and contens o f research:

+ Establish a method to isolate mitochondrial DNA from human hair, gene determination in the dercent relationshif and hum an identities

+ D N A sequencing from human hair trunk

R esults o f reasearch:

+ The method to isolate mitochondrial DNA from human hair beenestablished by using 10% Chelex solution and DTT Obtained products were pure anough to amplify mitochondrial primers LI 5965 and HJ6491, L I 5997 and H I 6401

at H V I fragment

+ Completion of mitochondrial DNA amplifying protocol by two mitochondrial primer sets, L I 5965 and H I 6491, L 15997 and H I 6401 from Vietnam ese human hair trunks and root

+ Nucleotide sequence from Iv 15997 am plifvins products from hair trunks of

4 person beloneins to a 3-2eneration family save the followina results:

* There was no difference between the supervarianble region HVI mother and gxandmather

% Between child and mather (and orandmother) there was a difference of one

nucletide at position 143 (according to the DMA sequence of the child and at position 16175 according to the mitochondria DNA sequence of human) A-T in child and G-C in mother

* Between child and father, there was 4 different nucleotides at following positions: nucleotide T in child and G in father at position 18 (at position 16050 according to the mitochondria DNA sequence of human); G in child and c in father at position

91 (at position 16123 according to the mitochondria DNA sequence of human): A in child and G in father at position 145 (at position 16175 according to the DNA mitochondria sequence of human); A in child and G in father at position 292 (at position 16324 according to the mitochondria DNA sequence of human)

4

In conclusion, DTT solution used to isolate DNA from human hair trunks solve the problems in, determining identity and dercent relationshif while samples were decom posed Results of DNA sequence show the differences in mitochondrial genomes among grangmather - mother - daughter and father - daushter In addition, the supervariable regiong HVI (specialised by two primer sets, L I 5965 and H16491, L15997 and H16401) is really a regions with lots of molecular variations, allowing the accurate determination of indentities.

Xác nhận của BCN Khoa Sinh học

Báo cáo đê tà i QT 05-23

Báo cáo đề tà i QT 05-23

1- M Ụ C LỤC

1- Mục lục

trang6

6.3- Phương pháp tách chiết ADN ớ chân tóc người sử dụng dung dịch Chelex 24

6

C Á C C H Ữ V I Ế T T Ấ T

(Polymerase Chain Reaction)

6

2 - LỜI M Ở ĐẨU

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ thông tin vào nhữns năm cuối thế kỷ XX - đầu thế kỷ XXI Sinh học phân tử và Côn2 nghệ gen đã có những bước phát triển nhảy vọt, đặc biệt là việc giải mã ra bộ °en người Bộ gen người gồm 2 phần chính : Bộ sen nhãn (23 cặp nhiễm sác thê = 3.2 tý bp) và bộ gen

tế bào chất (genome ty thể - 16569 bp) Việc giai m ã ra bộ gen ty thê đã góp phần rất lớn trong việc chẩn đoán, điều trị các bệnh liên quan đến di truyền ty thể, và cũng như trong khoa học hình sự và pháp y

Trinh tự hoàn chỉnh của hệ gen ty thể người đầu tiên có kích thước 16569 bp được công bố vào năm 1981 Cho đến nay, có hàn2 ngàn trình tự các đoạn gen ty thế của các dân tộc khác nhau trên thế giới được giải mã và đăn° ký trona các ngân hàng trình tự gen quốc tế : EMBL/EBI (Anh), Gcnbank (Mỹ) Hệ °en ty thẻ ]à kiểu đơn di truyền hoàn toàn theo mẫu hệ vì vậy nó là công cụ rất hữu hiệu để phản tích

di truyền quần thể người Hiện nay, người ta biết đến hàng trăm bệnh di truyền ty thể do đột biến ADN Phân tích các đột biến ADN ty thể có thể dùng để chẩn đoán nhanh và chính xác cũng như hướng điều trị một số bệnh

Xác định và so sánh trinh tự ADN ty thể, nhất là các đoạn siêu biến (hypervariable) H V 1 và HV2 của D-Loop là phương pháp có độ tin cậy cao và chính xác, được sử dụng rộng rãi trong khoa học hình sự và pháp y trên thế giới đễ giám định cá thể và huyết thống Vì vậy nên việc nghiên cứu ADN ty thể có ý nghĩa thực tiễn rất cao Nhưng do thời gian và mục đích cho phép nén chúng tôi chỉ tiến hành

đề tài dựa trên những ứng dụns vào trong khoa học hình sự và pháp V

Công nghệ gen ứng dụna vào khoa học hình sự trên thế giới được biết đến lẩn đầu tiên vào nãm 1985 nhờ công trình nghiên cứu của Alex Jeffrey và các cộng sự Đâv là công nghệ có tính đột phá trong khoa học hình sự, giúp giải quyết mọi vụ án tưởng chừne như bế tắc Tuy nhiên, ở nước ta việc ạiám định ADN ty thể trong xác định huyết thống đã đang bắt đầu Ngoài một số các đề tài của Viên công nghệ sinh học thì Viện khoa học hình sự - Bộ Công an dã tiến hành giám định ADN ty thể sử dụng sự tổ hợp của 2 cặp mồi cho đoạn siêu biến H V l,đ ể giải quyết nhừns vụ việc mang tính hình s ự n h u n a chưa có tính chất phổ cáp rộns rãi

Xuất phát từ tinh hình trẽn mà chúns tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân tích ADN ty thế của người dể xác định cá thê và huyêt thốns nhằm góp phán vào việc giám định gen trong xác định quan hệ huyết thốn" và nhận dang cá thể người

*

7

Báo cáo để tà i QT ()o-23

4- NỘI DUNG CHÍNH

4.1 Lịch sử nghiên cứu

Bộ gen người gồm 2 phần chính : Bộ gen nhân (23 cặp nhiễm sãc thể = 3.2

tỷ bp) và bộ gen tế bào chất (aenome ty thể = 16569 bp)

4.1.1 Cấn trúc A D N /V the à lìgười

Ty thê (phần lớn là các bào quan có chứa các enzym chịu trách nhiệm san xuất nãng lượng) là các cơ quan tử sán xuất ra nãn s lượng của tẽ bào Ty thể thường có dạng thuôn hoặc dạnơ hình trứng Ở cá tê bào thực vật và tế bào động vật đều có chứa ty thể Sô' lượng ty thế trong mỗi tế bào thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, có một vài ty thể trong tế bào biểu bì cho đến hàng nsàn ty thể ờ trong tế bào cơ vân.Không giống như các bào quan khác, ty thè có 2 màng riêng biệt M àns ngoài tương đối xốp, có chứa protein được gọi là Porin Tuv nhiên, màng trono rất ít khi

kháng và tập trung các lon cực âm có phospholnpid gọi là C ardiolopin Ngoài ra, màng trong còn tính xoắn cao với cấc nếp gấp iĩọi là cristae, chúng làm cho diện

tích bể mặt tiếp xúc cùa tế bào tăng lên Màng trong cũng có các enzym xúc tác cho quá trình hô hấp tế bào, qua đó để cung cấp năng lượng cho tế bào [20]

Không gian ở trona của màng trong gọi là chất gian bào ở trong chất gian bào và màng trong, các chuỗi phản ứng hoa học xảy ra để cung cấp năng lượng cho

tế bào Đường và axit béo bị phân huv thành hai đơn bị cacbon, sau đó đi vào các chuồi phản ứng như axit citric hay chu trình Krebs Đường bị phán huỷ trong tế bào chất trong khi axit béo bị phân huỷ trong ty thế bởi chu trình p oxi hoá Chu trinh axil citric sinh ra các electron đẽ đi vào chuỗi vận chuyển điện tử

Tiếp theo, quá trình sản xuất nàng lượna là do proton được sinh ra bởi các electron thông qua chuỗi vận chuyển điện tử, quá trình này còn được gọi là quá trình tổng hợp ATP - đó chính là nãng lượng sinh học đáu tiên trong hệ thống sinh vật học A D N có trong m àns sinh chất khác biệt so với ADN ớ trons nhãn của tế bào ADN ty thế này tổn tại tron2 NST đơn mạch vòna khá hoàn chính ADNmt có kích Ihưóc 16569 bp và 2ồm 37 sen ADNmt mã hoa cho 13 polypeptit trons chuỏi hỏ hấp ADN ty thê mã hoá cho protein ở phức hệ I và IV của chuỗi vận chuyến điện

tử Như đã biết, ADNmt cũna mã hoá cho A RN r và cho cá quá trinh tống hợp ATP Ngoài ra, ADN ty thế có chứa cytochrom B đay là một yếu tố quan trọng khác

k h ô n2 thế thiếu trong chuỗi vận chuyên điện tử mà trong đó ADNmt chỉ mã hoá một phẩn và ADN trong nhân sẽ m ã hoá nốt phán còn lại [20], Hệ gen ty thể hoàn chỉnh của nsười đẩu tiên được Anderson và các tác si ả khác tai Cambridse (Anh)

công bô vào năm 1981 và được chinh sửa lại vào năm 1999 (Anderson cl uì., 1981; Andrew ct ư! 1999) Đãv là hệ sen ty thê cua đai diên nsưòi đa tráng và được coi là

trình lự chuán Cho đến nav đã có 186 trình tự hoàn chinh của “ín o m e ty thế na ười ihuộc các ch Ún" tộc và dán tộc khác nhau được n°hiẽn cứu và đãn s kv trona các Nsũin hàne trình lự aen quốc tế EMBL (EBI)/Genbank/DDBJ(Insman 2003)

Các cons bố này cho thấy trình tự ADN t\ thế cua các chúng tộc và dân lộc khác nhau có nhữna khác biệt nhất định, v ề cấu trúc, aenome ty ihế người là phán

lử ADN mạch vòns, bao gồm 37 sen mã hoá cho 13 chuỗi polypeptide tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào 22tARN và 2i ARN và dược di truyén theo mầu hệ [6] Sơ

đổ như hình !

8

Báo cáo đề tà i QT 05-23

KS ATPase 8/6 ■ C o m p le x 1 I I tRHAạ

I I Cytochrome b im Complex 4 H I rRNAs

Hình 1 : Cấu trúc ADN tv thế ó' người

4.1.2 Quá trình tiến hóa A D N ty th ể ở người

Do các đặc điểm như : di truyền theo mẫu hệ, mức độ đột biến cao số lượng bún sao lớn và không tái tổ hợp ADN ty thế là một công cụ híĩu hiệu cho nghiến cứu sự tiến hoá ớ người Các biên thế ADN ty the là trung tính sẽ tránh khỏi không

bị loại bỏ trong quá trình chọn lọc tự nhiên đẽ trở thành phố biến theo xu thế di truyền Nghiên cứu phân loại các nhóm kiểu đon/nhóm đơn bội hay dòng pha hệ được tiến hành sớm vào đầu thập kỷ 80 trên cơ sở sử dụng các enzvm hạn chế đế

cắt ADN ty thê người sau khi tách tinh sạch (Brown, 1980; Denaro et £// 1981: Johnson et £//.,1983, Cann <7 aì., 1987) Kỹ thuật RFLP, trên cơ sơ có mặt hay không

có mặt một điếm cắt enzym hạn ché nào đó ADN ty thể cua một cá thể, quán the (dàn tộc) có thể được xếp vào một nhóm đơn boi nhái định Ví du : Khoảng 76% ADN ty thế của người Châu Phi được xếp vào nhóm đơn bội L dặc trưng cho sự cỏ

mặt của các điếm cát của Hpư\ và Dclrỉ tại các vị trí 3592 và Ị 0394 tương ứng.

9

Báo cáo dể tà i QT 1)5-23

Nhóm đơn bội L rát lớn này sau đó được chia ra ihành các nhóm đơn bội nhỏ hơn là

L I , L2 và L3 (Watson er aì 1996) Trên 77% nu ười Châu Á hình thành nhóm đơn

bội hay còn gọi là nhóm đơn bội M, với đặc tnrng là sự có mặt của điếm cắt của

Dclcỉ tại vị trí 10394 và Aliiỉ tại vị trí 10397 Siêu nhóm đơn bội này được chia làm 2

nhánh/nhóm đơn bội M và N Dựa trên số liệu RFLP với sớ enzym nhiều hơn người

ta đã phân loại ADN ty thể người thành 3 nhóm đơn bội đối với người Phi 9 nhóm dơn bội (H U ,K ,T U ,V ,W và X bao gổm háu lút ADN ty thế người Châu Âu Bác Phi và người da trắng ở vùng Tây Á, và 9 nhóm đơn bội khác là A.B.C.D.E.F.G.M

và N là nsười Cháu Á Châu Đại Dương và Bắc Mv Ngoài ra người ta cũng gộp được một sô' nhóm đơn bội thành các cụm nhóm dơn bội, ví dụ HV UK, TJ WIX Gần đâv, các nshiên cứu đọc trình tự h àns (ự nucleotit của các vùng siêu biến HV1 và H V2 trẽn đoạn điều khiến D-Loop cũng như các gen tv thế đặc biệt là việc aiái m ã toàn bộ hê gen ty thể của nhiều đại diện các dán tộc đã cung cấp một cách

chi tiết và chính xác hơn rất nhiều (Igman et a i , 2000; Kivisild et a l 2002; Kong et

a! 2003) Các nhóm đơn bội hiện riay được ký hiệu bằng chữ in hoa nói trên, rồi

được chia thành các nhóm nhỏ hơn với các chữ số Ai Cập (1,2,3 ) sau đó lại chianhỏ tiếp nữa theo các chữ viết thường a,b,c

4.1.3 N ghiên cứu A D N tỵ th ể người ở vùng Đỏng Á

Trong các trình tự gen hoàn chinh có đại diện của người Hoa (Truns Quốc), n°ười Nhật Bản, người Hàn Quốc, người Hoa \ à người bán xứ (Đài Loan), người Philipin naười Mã Lai và người Thái Lan là những nsười Châu Á có quan hệ mật thiết với nsười Việt Nam Đặc biệt, gần đáy nhóm nghiên cứu của Trươna á Bình (Z hans Ya-Ping) tại Viện Động Vật học Côn Minh, thuộc viên Hàn Lâm Khoa học Trung Quốc, đã và đang tiến hành dự án giái mã genome ty thể và nhiễm sắc thế Y

của 56 dân tộc cư trú tại Truna Quốc (Kong et aL, 2003) Đ ồns thời, các tác giả Trung Quốc (Yuan eĩ ơl., 2001; Li et aì 2002: Kona et í// 2003) cũng đã phản tích

trình tự đoạn D-Loop và các gen khác trên hệ 2en tv thế đế nghiên cứu quan hệ di truyền tiến hoá của các dãn tộc khác nhau, tro ne dó đáng chú V là có cá các dân tộc như M iao ( H ’M ons) Yao (Dao) Buyi/Bouvei ( Bô' Y) Lahu (La Hủ) là các dân tộc ít người có tại Việt Nam, hay các dân tộc Zhuang (Choang, gán gũi với người Tàv Nùng của Việt Nam) Tại Thái Lan cũng đã có côn° trình nahiên cứu so sánh trình tự đoạn D-Loop của ADN ty thế naưòi Thái và các sắc tộc miền núi (hill tribes) như neưòi Lisu, người Musu, người Phuthai na ười Lao Sons, người Chona

nsười bán xứ Sakai (Fucharoen eỉ aỉ., 2001) Nsoài mục đích nshiẽn cứu về quan

hệ di truyền tiến hoá các nshiên cứu hệ sen IV thể của các tộc nsười trẽn thế ai ới déu có các định hướns ứna dụns rộns rãi tron2 chán đoán và điéu trị các bênh di truyền ty thế irons xác đinh cá thê và quan hệ huyêt thốna điẽu tra tội phạm và quan lý nhãn sự [6]

4.2 C ác rỏi loạn chức năng ty thế

N hư ta đã biết, hệ sen ty thể chi siái mã hoá cho một số lượng rấi ít pioiein / enzym Vì vậy chức năns ty thể được thực hiện nhờ vào hàna loai các protein / enzym do ìien nhàn quvét định \'à dược tons hop tron Lĩ ló' bào chất rói được \ậ n chuycn đến ty the Do vậy các rối loạn IV the (huy bònh do ty thú’) có the phái sinh

do nhữne dột biến ơ ccn nhân hoặc 0' gen ly thế Mọt so roi loan t\ ihó chí ánh hướiiiĩ dến mộl co quan {ví dụ bệnh thán kỉnh thi iiiãc di liu \c n Lchcr) Nhưnii cũiiíi

10

Báo cáo đê tà i QT <>0-23

có những rối loạn ảnh hưởng đến rất nhiều cơ quan và thường có những đặc điểm nổi trội (ví dụ các bệnh về thần kinh cơ) Những rối loạn ty thể có thể có ỏ bất cứ lứa tuổi nào Những đột biến ADN nhãn thường thây ở tuổi ấu thơ còn những đột biến ADN.ity thế thì xảy ra muộn hơn[6]

4.2.1 C úc rối loạn ly th ể do A D N nhân

Những dột biến và thav đổi ADN nhân thường gây nên hàng loai những rối loạn ớ chuỗi hô hấp và !à nauyên nhân chính của khá nhiều bệnh Người ta đã quan sát thấy Hội chứng Leigh (Leigh syndrone) có liên quan đến hiện tượng nhân đói các đoạn 5 bp trong gen mã hoá tiểu phần 18kDa AQDQ complex I (Van den

Heuvel et al., 1998) và đột biến gen hóa các tiểu phán NDUFS7 complex I (Triepels

ct al 1999) Các bệnh loạn dưỡng chất trắng não và độna kinh co giật

(Leukodistrophy and mvoclonic epvlepsv) liên quan đến đột biến của các gen mã

hoá tiểu phần NDUFV1 complex I (Scheulke el al 1999) Bệnh viêm não cơ tim

(Cardioencephalomyopathy) do đột biến gen mã hoá tiếu phần NDUFS2 complex I

(Loeffen et ơ/., 2001) Còn bệnh teo thị giác và mất điều hoà (Optic astropy and ataxia) do đột biến genmã hoá tiểu 'phần Fp của complex II (Brich-Machin et ơ i

Cũng có những rối loạn có liên quan đến mất đoạn ADN ty thể thứ phái Mất

đoạn ở gen A ní 1 (Kaukonen el a l 2000) hoãc Twinkle (Spelbrink et uì 2001) đều

có thể gây bệnh liệt mất cơ ngoài trội do nhiễm sắc thế thường (Autosomal

dominant external ophthalmoplegia) Mất đoạn ó' sen POLG (Van Goethem et aỉ.,

2001) có thê sây các bệnh liệt mắt cơ ngoái lặn do nhiễm sắc thể thườne (Autosomal recessive external ophthalmoplegia) hoặc liệt mát cơ nsoài trội do

nhiễm sắc thê thường Mất đoạn ở gen Thymidine phosphorvlase (Nishion ct a!

1999) gây bệnh não tuý thần kinh dạ dày ruột (Mitochondria! neuroaastrointeriinalencephalomyophathy)

4.2.2 Các rối loụn (lo A D N ty thê

Cho đến nay, nsười ta đã biết đến trên 150 bệnh tật di truyền khác nhau theo mẫu hẻ do tv thể quyết đinh Các bệnh do rối loạn ADN ty thế thường được biếu hiện rất đa dạng Chúns có thế liên quan đén rối loạn quá trình mã hoá protein hoãc đơn thuần chi là nhũna đột biến thav đối các nucleotit (Servidei 2002)

Các bệnh như liệt mất tãna tiến kinh niên (Chronic progressive extern al ophthalmoplegia CPEO) hội chứns K earn s-S a u e (Kearns-Savre syndrome KSS) đái d ườn2 và điếc (Diabetes and deafness) đểu do mãt đoạn hoặc sắp xếp lại irons son Các đột biến GI 1777A T ]4484C G 3460A cũng làm biến dổi protein, dẫn đen liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (Leber hereditary opticneuropalhy LHON)

Đột biến trons Hen Cytb «áy bệnh khôna dune nạp vận độns \ à mvoslobin niệu

(Exercise intolerance and myoslobulinuria)

N hữns đột biến thay đổi các nueleotit trẽn ARNĩ có thế £ây khá nhiều bệnh: Các thay đổi A3243G T3271C.A3251G sây viêm não tuv nhiễm lactic acid với các tình net aiốne dột quy (Mitochondrial encephalomyppathy with ladies acidosis and stroke-like episodes MELASi: A8344G.T8356C ã V■ hộnh llìân kinh co uiát cơ (Myoclonic epilepsy with racíied-rcd fibers, Ml-RRF): A3243G T4274C Líáy 11 cl

Báo cáo dế tà i QT 1)5-23

mál cơ ngoài tăns tiến kinh niên (Chronic proaessive external ophthalmoplegia CPEO): T 14709, A12320G gãy bệnh liệt cơ (Myophathy)I A3243G.A4269G gây bệnh liệt cơ tim (Cardiomyopathy); A3243G.C12238A 2âỵ bệnh đái CÌƯÒT12 và điếc

(Encephalomyopalhv): A7445G gây điếc do thần kinh cảm nhận không hội chứng (Nonsyndromic sensorineural deafness); A1555G sây điếc không hội chứng do aminoglycoside (Amino-alycoside-induced nons\ ndromíc deafness)[6]

4.3 Giám định ADN tv thế trong khoa học hình sự và pháp V

Vùng điều khiển (D-Loop) có 2 đoạn siêu biến H V l và HV2 với tốc độ tiên hoá nhanh, do đó thỏno tin vể các trình tự này có ý nshla quan trọna cho giám định

cá thế và giám định huyết thốna trong khoa học hình sự (Forensic Science) và pháp

y (Legal Medicine) Hiện nav tại Mỹ Tây Au Nhật Bán và các quốc gia khác, việc tìm kiếm người mất tích, các diều tra hình sự đều dựa trên các giám định gen trong đó bao gồm phân tích trình tự các đoạn ADN nhân và ADN ty thể Đặc biệt, trong những trườns hợp mẫu sinh phẩm còn sót lại sau thời gian đã quá lâu (hàng chục hay hàng trãm năm) ADN nhân' do mạch thắng bị phân huý rất nhiều nên việc phán tích là rất khó khăn Trong khi đó, ADN ty thể mạch vòng, có kích thước tương đối nhỏ nên tồn tại láu bền theo thời gian trong các mỏ xương, răng và tóc Một số công trinh nổi tiếng về ứng dụng ADN ty thể trong giám định cá thể như giám định

hài cốt của các thành viên trong gia đinh Nga hoàng (Gill eí uìì., 1994; Ivannov el ứ/ 1996), di hài \ u a Louis XVII của Pháp (Jehaos el ill.,2001) Chươna trình tìm

kiếm lính Mỹ mất tích trong chiến tranh tai Việt Nam và Triều Tiên chủ yếu cũng dựa trên giám định ADN trong đó có ADN ty thể

4.4 N ghiên cứu ADN ty thê ỏ Việt Nam

Cho đến nay các nshiên cứu irons nước YC đặc điếm hệ sen của các dân tộc (tộc người) Việt Nam bao gồm cấu trúc hệ gen ty thế còn rất ít ói và các thône tin có dược còn rất hạn chế

Trong khi đó ờ nước nsoài từ nhữns nãm 1992 đã có cỏn° bỏ của các nhà

khoa học Mỹ (Ballinger er ưỉ 1992) dùng phương pháp PCR- RFLP và lai phân tứ

để nghiên cứu ADN ty thế của naười di cư thuộc chủng tộc Mongoloid cổ đại, trons

đó có đừ ns các mẫu ADN người Việt' (không rõ nguồn gốc)

Tiếp theo đó sau này có thêm côns trình nrơne lự về sự đa hình ADN ty thế nmrời Việt Nam với số mẫu bao 2ồm 50 nsười Việt (Kinh) thu thập tại Hà Nội của nhóm các nhà khoa học Pháp kết hợp với Vũ Triệu An Trường Đại học Y, Hà Nội Bans kỹ thuật PCR-RFLP trẽn ADN ty thế và HLA, các tác gia này đã đưa ra két luận ù n s hộ 2Ìa thuyết cho rằns neười Việt (Kinh* có nsuổn sóc kép lừneười Truns

Quóc và các quán thế Thái-Indonesia (Invanova ci ui 1999) [8J.

Tuv nhién phưưns pháp PCR-RFLP còn co nhiêu han ché nén ké! luận này đòi hòi phai có nhữns nehièn cứu kiếm chứng them Việc giái mã hê sen ty thế d iã c chăn sẽ có dỏne 2Óp quvết định cho câu irá lòi (.liính xác \ ẽ quan hệ di truyền liến hoá cua II2ười Việt Nam

Bẽn canh mội số nehiẻn cứu cua các lác 2 Íá Trung Quốc và Thái Lan vé hệ CL'I1 tv thế (chú \c u là đoan D-Loop) cùa mội số dãn lõc ít neười cư trú tại các nước

do cũ n s như ơ \ 1 c I Nam hệ ucn nói chung va hệ gcn ly ihè nói riC112 cua các tộc n^nrời Viêt Nam cũn" dã có dự án cấp nhà nưoc cua Viện Cone ns:hệ Sinh học

\ ’iột Nam ntihiẽn cứu \c hộ een ty ihõ cua người Viẽi Nam

Báo cáo đê tà i QT 05-23

4.5 Sinh học phán tử và các ứng dụng trong khoa học hình sự

4.5.1 Lịch sứ phát triển cửa khoa học hình sự

Sinh học hình sự trên thế giới có lịch sử phát triển khoáns hơn 50 năm Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, hơn 50 năm trước đây khoa học hình sự thế giới đã ứng dụng các thành tựu của sinh học, y học nói chuns và huyết học nói riêns vào công tác điều tra xác dịnh tội phạm Những nghiên cứu này chủ vếu dựa vào sự phàn biệt nhóm máu ABO, hệ MN các nhóm protein huyết thanh Nhưng kết quá của những nghiên cứu trên chi có tác đụng loại trù mà không có kha nãna xác định chính xác đến từng cá thế neười Thực tế đã cho thấy độ tin cậy cùa phương pháp huyết học là khống cao [2],

Vào những năm cuối thể kv XX, cùrm VỚI sự phát triến cua các ngành cõng nghệ khác, thì công nghệ sinh học cũng phái triển mạnh Một phát minh quan trọng

đó !à phát minh ra chuỗi phán ứna polymeraz (I’CR) do Kary Mullis tiến hành tại nước Anh vào năm 1985 Và phương pháp này nhanh chóng được sử dụng rộng rãi trong nhiềũ lĩnh vực nghiên cứu y-sinh học khác nhau do khá năng nhân bội và độ nhạy của nó rất cao

Công nghệ gen ứng dụng vào khoa học hình sự trên thế giới được biết đến lần đầu tiên vào năm 1985 tại nước Anh hhờ công trình nghiên cứu của Alex Jeffreys và các cộng sự Khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hoá protein trong máu người, Jeffreys đã phái hiện ra trình tự đoạn ADN được lặp lại một số lẩn các đoạn lặp nàv được gọi là tiểu vệ tinh (minisatellites) Các tiểu vệ tinh này được phát hiện thấy trong mọi tẻ và ở những vị trí khác nhau trnns hệ sen nsười Ông CŨI1S phát hiện ra

số lần lặp lại của các doạn ADN này ở mồi cá thê ỉà khác nhau Bans cách ứna dụne

kỹ thuật xác định chiều dài, trinh tự của nhữn° đoạn ADN lặp lại này, Jeffreys đã tạo ra phương pháp định dạns ADN nsưòi (DNA linaer printing) [II]

Từ đây giám định tư pháp vể gen ra đời gọi là ADN finger printing (ván tay

di truyền) hay còn có tên khác là ADN profile {tổ hơp các kiểu gen trons giám định gen của một cá thể cần phân tích) Vùng lặp lại được biết đẽn đáu tiên nàv gọi là nhĩms đoạn lặp có tần số truns bình Kỹ thuật mà Jeffreys thực hiện aọi là phán tích lính đa hình về chiều dài cứa các đoan ADN dược tạo bới các enzvin giới hạn (RFLP) [11] Phươna pháp này được sử dụns lần đầu tién đẽ phán tích ADN nhữns người nhập cư vào Anh, sau đó một thời gian ngắn được dùng đế xác định thu phạm một vụ siết nsưòi N sàv nay phươns pháp định dans ADN Ứ02 dụna trons khoa học hình sự đã trở nên phố biên trên thê giới và thực sự m ans lại hiệu quá rất cao trong xác định tội phạm, xác định huyết thống Đã có hàng trăm phòns thí nahiệm cua Mv tiến hành phân tích ADN, phần lớn các nước ỏ' Cháu Âu và Cháu Á có chươne trình ứns dụns phưưns pháp định d ans ADN vào trona khoa hoc hình sự

4.5.2 Cứt phifo'níi pháp thường ilìuìV trong smlì hoc hình sự

/) Pluicnạ pháp phân Hell AD N

Phương pháp phân tích ADN được dùns tie xác định huyet ihõnu cha - con

mẹ - con hay cá thể chính xác

2) C ơ s ỡ khoa học của việc ỉiiứm (lịnh XCI 1 iron i> Aiìc ílinli huyết thniìx

Năm 1956, Jot* H intjio và Albert Levan đã xác định chính xác răna o nsười

trona mỏi cá thế ớ Irons nhãn tẽ bào có chứa 46 nhicm sãc tho xếp thành 23 cặp

nhiễm sãc thế Iil'ona done (lức 2 ÌỐH2 nhau từn<j dõi mội) Tron2 đó cặp thứ 23 là nhiễm sác thê, eiói lính, các cặp còn lại co chức năng xác định các đặc lính khác nhau cua cơ lliẽ Bộ nliiẻm NŨC thé dược bao lỏn du> trì lừ the hộ nav sail” the he khác Ne oa I trừ tế bào trứiií’ \'à tinh trùne chi có 23 nliiẻm sác thè (tc hào đơn bôi)

Báo cáo đề tà i QT 05-23

còn tấl cả các tê bào khác đéu có sơ lượng nhiẻm sác thế là 46 (tế bào lưỡng bội) Thê hệ con cái bao giò cũng được thừa hưởna các đặc tính di truyền từ thê hệ bỏ mẹ với xác suất ngang nhau, nshĩa là 23 nhiễin sác thế từ bố thôn° qua tinh irùns 23 nhiêm săc thế từ mẹ thông qua trứng Sự kết họp iỉiữa trứng và linh irùns đã báo tổn được bộ nhiễm'sắc thế từ mẹ thỏna qua trứng Sự kết hợp giữa trứns và tinh trùns đã bảo tồn được bộ nhiễm sắc thể là 46 đê tạo nên một cơ thẻ hoàn chính Từ nauyên lv này mà trong giám định gen người ta đã ứns dung đế xác định quan hệ cha - con

mẹ - con

Khi nghiên cứu về cấu trúc ADN của sinh vật nhân chuấn người ta thấy rãne ADN bao gổm các trình tự mã hoá (exon) và các trình tự khôns mã hoá(intron) Các trình tự mã hoá ở sinh vật nhãn chuán chìm trong một khối ADN lớn mà hiện nay còn chưa rõ tác dụng Tuỳ mức độ hiện diện cua chúng trort2 nhãn, các trình tự ADN được chia làm 3 loại [1] :

- Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10 - 15% hệ sen động vật có vú Đó là những trinh tự ADN ngắn (10 - 200 Kb) khôns mã hoá

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25 - 40% hệ gen người, chúng có kích thước lớn hơn (100 - 1000 Kb) và đa dạng hơn các trình tự lặp lại nhiều lần Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ bộ gen

- Các trình tự duy nhất là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc trưng cho từng gen (Hồ Huỳnh Thuỳ Dươna, 199S)

Các intron là các trình tự không m ã hoá bao sồm các đoạn lặp lại nhiều lần (STR) và các đoạn lặp lại trung bình (VNTR) bởi vậy chúng có tính đa hình cao nên rất có giá trị đê phân biệt cá thể Đây chính là điếm mấu chốt đế ứns dụno trons siám định gen hình sự

3) Phương pháp RFLP Các tiếu vệ tinh (minisarelìiỉe.s)

Nãm 1985 tại nước Anh, Alec Jefreys và các cộns sự khi nehién cứu các đoạn ADN mã hoá protein trons máu naười mvoglobulín đã phát hiện ra minisatellites (tiêu vệ tinh )

• Đ ặc điểm của các tiểu vệ tin h [7]

Là những đoạn trình tư ADN lặp lại mói số lán có Irons mọi tè bào và ớ nhữns vị trí khác nhau trong hệ sen n°ưò'i

Mỗi đoạn lặp có chiểu dài từ 9 - 24bp tone cô n s chiểu dài năm trong khoáng

Mặc dù có ưu diẽm là có độ chính xác cao nhunc phưưna pháp phán lích Southern \o'i các mẫu dò đa locus dô lìm ra cát bán£ nói bát duơc phân hiệi một cách dẻ dàng

14

Báo cáo đẽ tà i QT Õ-23

M ặc dù cĩ ưu điểm là cĩ độ chính xác cao nhưng phương pháp này van cĩ những hạn chế [9]:

Phương pháp này địi hỏi lượng mẫu ADN' lớn ( khống 100 nanooram) và ADN phái cịn nguyên vẹn khĩna bị phân huỷ

Các bước tiên hành phức tạp dịi hỏi kỹ thuật viên cĩ trinh độ cao

Khơng tự độns hố được

Với những trườns hợp ADN bị tách mạch, enzym 2ÍỚÍ hạn sẽ khõng cắt được

4) Định dạng các đoạn A D N lặp lợi ngắn (STR typing)

• Các đoạn AD N lặp lại đoạn ngắn (STR)

Qua “chương trinh hệ gen người” các nhà khoa học đã phát hiện ra các đoanADN lặp lại đoạn nsắn cĩ tần số cao (microsatellites hav short tandem repeat) Đặcđiếm của STR [8] :

Là các trình tự nucleotide ngắn được lặp lại nhiều lần liên tiếp nhau và cĩ

số lần lặp lại khác nhau ớ các cá thế khác nhau

Một đơn vị lặp lại cĩ chiều dài từ 2 - 5 nucleotide Vớt các dạng lặp lại 2nucleotide:

+ Dạng CA / G T chiếm khoảng 0,5% hệ gen

+ Dạng CT / GA chiếm khống 0,2% hệ gen

Tuy nhiên, người ta sử dụng dang lặp lại 4 nucleotide trong giám dịnh gen do

nĩ cĩ độ phân giải cao và hệ số trùng' lặp tương đối thấp

Tổng cộns chiều dài < 100 bp

• Phưong pháp xác định trinh tự đoạn ngắn STR ( STR typing )

Phương pháp này xác định tính đa hình của các đoạn STR nhị' phản ứngPCR Uu điểm nổi bát của phương pháp PCR là khá năng nhãn nhanh một đoanADN lên hàng triệu lần sau một thời gian n°ắn [61 Phương pháp này cĩ ưu điểm :

Phân tích các đoạn ADN ngắn nên cĩ tính báo tồn cao

- Địi hỏi một lượng mẫu ADN rất nhỏ phương pháp cĩ thẻ thành cơng chivới một sợi tĩc hoặc 40 tinh trùng [7],

- Thời gian phân tích naắn

- Cĩ thể thế tự động hố đuục

5 N G U Y Ê N LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI ÊN c ử u

5.1 N guvên liệu, hố chất và thiết bị

5 / / Đ ơi H(Ợnf> níịhiéìì cứu

* Tĩc của thế hê bà, thế hệ bố me và con (lây cá phần chăn tĩc và phán thántĩc)

Tĩc [9J : Hình dạns tĩc là một đặc điếm hình thai cua cơ thê níiưịi được di truyén

ne ười ta coi đĩ là mội [rone nhữne đặc điếm quan trọne nhất trong nshién cứu Chuns lộc

Tĩc dược chia làm hai phán : thân tĩc và chân lĩc

- Thân tĩc là phần nhỏ ra khỏi bể mặt da đươc câu tao từ 3 lớp như sau :

+ Lĩp tuý : ĩ' irons cùna bao sồm các tế bào đã hố sừne nhưns cịn chứa di tích nhãn tê bào khỏns chứa sãc tĩ’

+ Lĩp bao : là lớp vĩ neồi 2ổm c;’tc tẽ hào vuv sùìii: dã mũi di lích nhãn và khịne chứa săc tố

+ Lớp vo năm "iữa 2 lĩp tuy và bao Đây là lớp chu \ẽ u lao nen lĩc sỏm các lé hào váy Mine, cịn chứa di tích và co sãc tố Hai lớp vỏ và luv ihườníĩ chứa các hot khí nhất là trong lĩc bạc

15

Báo cáo đê tài QT 1)5-23

- Chân tóc là phán nằm khuất trong da ở phía cuối, rể tóc dầy lên để hình thành hành tông hay tầng sinh lông Tại đáv có các mạch máu đi tới để nuôi tóc Rẻ và hành !ông được chứa trons bao lỏns Trên thành mỗi bao lóne có lừ 2-5 lỏ mơ của các tuyến nhờn Mày tóc được quv định bới số Iươn2 và trạns thái cua sắc tỏ melanin trong lớp vỏ, sắc tớ ở trạng'thái đa hạt sẽ làm cho lóc đen sác tò ó trạng thái phán tán sẽ làm cho tóc có màu đỏ hoe hay màu nâu

Kv hiệu và trình tự mói tv thể đả sử dụng như sau :

4 H 1 6 4 0 1 V- TO A TTT CAC GGA GGA TC-G TG 3

5 1 3 Thiel hi

Các thiết bị thuộc Ti una lâm SHPT và CNTB irirờn” ĐHKHTN:

- Máy ổn nhiệt ( Block heater Anh )

- Máy li lâm E p p e n đ o r l centrifuge 5 4 1 7 R i E p p c n c l o r f - Đức)

- M á v li t â m E p p e n d o i f cenlníiiiỉL- > 8 0 4 (f p p c n d o r ! - Đ ứ c )

- Mú\' tit) pH (Beckman Mỹ)

- Máy vortex - Mini Sharker (Kika Works - Malaysia)

16

Báo cáo để tà i QT 1)0-23

- Bộ điện di đứng nhò mini - sub cellGT (Bio - rad - Italy)

- Máy PCR Thermalcycler (Singapore)

5.2 Phương pháp nghiên cứu

5.2.1 Phương pháp tách chiết A D N sử dụng C heìex

Chelex là một loại nhựa tạo phức có ái lực cao đối với các ion kim loại đa hoá trị Nó là chất trùng hợp của Styren divinylbezen, có chứa những ion iminodiacetat

và hoạt động như nhóm tạo phức Khi có mặt của Chelex trong quá trình đun nóns

sẽ tránh được sự biến tính cùa ADN bởi các ion kim loại tạo phức có thể xúc tác trong quá trình làm gãy ADN ờ nhiệt độ cao tron^ những dung dịch có cường độ ion thấp Chelex còn liên kết với những tạp chất nsăn cản quá trình nhân bội ADN(PCR) [4],

Tách chiết A D N từ chân tóc 1 16!

1 Cắt chân tóc dài khoảng 0,5 cm cho vào ống Eppendorf loại 1.5 ml Cho thêm 1

ml nước cất loại ion lắc đều

2 Li tâm 10 phứt, tốc độ 12000 vòng/phút

3 Loại bỏ nước, giữ lại chân tóc Lặp lại bước nàv 3 lần

4 Cho thêm vào ốn° Eppendorf 100 Ltl Chcle.x \ 0 c/(.

5 u ớ nhiệt độ % °c qua đêm

rất n h i é u A D N ly t hế.

- Tách chiếl A D N lliân lóc [ 16]

; ĨAV- Ih Q str; TI^ ; Hi; v Ệrj Ị

Báo cáo đề tài QT 05-23

5 u ớ nhiệt dộ 5 6 ° c qua đêm

6 Lác nhẹ, ủ ớ 100°c trong 15 phút

7 Ly tâm 12000 vòns/phút trong 3 phút Lấy dịch bẽn trên làm phan ứne PCR

5.2.3 Phương pháp định hrợiii’ A D N bâng quan í’ phó ké / 4!

Nguyên tắc : Dựa vào sự hấp thụ ánh sánu tứ ngoai ở bước sóng 260nm cua các bazơ purin và pyrimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu cho phép xác định nồng dộ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị O D 2fi,imn tương ứng'với một nồn« độ là :

50ịig cho một duns dịch ADN sợi đôi

40p.g cho một dung dịch ADN sợi đơn

Đế kiểm tra độ sạch của dung dịch ta do thêm giá trị OD ớ 280 nin Tại bước sóng nàv các protein có mức hấp thụ cao nhất Một dung dịch axit nucleic được xem

là sạch (không lẫn nhiều protein) khi có tỉ số O D ;w,mn/O D 2K{)nm khoáng 1,8 - 2.0

Bước 3 : Ly tâm 12000 v/p, 2 phút ó' 4 ° c Đổ dịch trong ốna ihu mẫu

Buóc 4 : Bổ sung 700 Ị0.1 dung dịch ríra màng (M embrane Washino Solution) vào cột nhỏ Ly tâm 12000 v/p 2 phút, 4 °c Đổ dịch trons ống thu mẫu

Bước 5: Rửa lại với 500 ni dung dịch rửa màna và ly tâm 12000 v/p, 5 phút ở 4°c

Bước 6 : Chuyển cột nhỏ sang Eppendorf 1.5 ml mới và bố suns 50 |il nước Đế o nhiệt độ phòns 1 phút Sau đó ly lâm 12000 v/p irons 1 phút

Bước 7 : Bỏ cột nhỏ và thu lại dịch ó Eppendorf có chứa ADN dạna hoà tan A D \ tinh sạch được siữ 0' 4 ° c hoặc -20 °c sau khi được điện di kiểm tra trẽn sel aaarose

n eu y ên tác bổ SUI1S \'ới đoan ADN đích ớ đáu 3' và đoạn bát đầu luna hợp được xác đinh tại \’Ị II í 5 ’ cua mồi

Một chu kỳ PCR dược thực hiện qua 3 2Íai đoan :

1 Giai đoạn biến tính ADN khuôn : 2 sợi của chuỗi xoăn kép ADN đượctách ra khi nhiệt độ lên cao trên 9 0 °c

2 Giai đoan iỉán mỏi : Khi nhiệt độ phan lìng giam \u n n a (khoan” từ 45

- 65°C) mổi licn kết với đoạn đặc thù theo nguyên tãc bỏ sung

3 Giai đoạnkéo dài mỏi nhừ ADN pol>m eia/a (illLIÕ11 LI ơ 70c - 72‘C)

IS

Báo cáo để tà i QT 05-23

Sản phẩm PCR được tính theo hàm số mũ vì mỗi đoạn do mồi kéo dài lại làm khuôn cho chu kỳ sau N hư vậy, sau mỗi chu kỳ sô bản sao của ADN gấp 2 lần và sau n chu kỳ sán phẩm thu được là 2"

sẽ tiến hành ở nhiệt độ tối ưu và enzym có vai trò kéo dài ADN mồi bằng cách nôi các nucleotide hoạt hoá với nhau theo một trình tư bổ sung với chuỗi ADN mẫu

Step 1: denatiưatií Giai doan 1: Biến tính ớ

19

Báo cáo đề tà i QT Õ-23

mổi và tổng hợp phái cĩ 2 đoạn mồi mới khuếch đại được một Ýne đặc hiệu của ADN Đặc điểm của 2 đoạn mồi nàv là phái dài khoảng 15 - 30 bp chúng cĩ trình

tự giống 2 đầu đoạn ADN đích cần nhản lên mỏi ADN mồi lai shép được với mồi một chuỗi ADN đích và XII hướns tổng hợp của mội chuỗi ADN đích và xu hưứne tốna hợp ADN lừ 2 mồi này ỉà nsược chiều nhau ADN mồi thứ nhất chi huy sự tống hợp của một chuồi ADN và chuỗi này sẽ lai ghép tiếp với ADN mồi thứ 2 ỏ' chu kỳ tiếp theo.Sau chu kỳ thứ nhất, sàn phẩm ADN là loại dài được tổng hợp quá xa trình

tự bố suns của ADN mồi kia Sau chu kỳ thứ hai xuất hiện các sán phấin ADN ngắn lai 2hép với ADN dài Sau chu kỳ thứ 3, cĩ các sán phẩm ADN kép ngắn

Trong những chu kỳ tiếp theo, sản phẩm này nhân lẽn theo hàm số mũ đến khi một trong các thành phần hỏn hợp của duns dịch phán ứns bị giới hạn hoặc polymeraza giảm hoạt tính Trons thực tế sự nhán lên của một đoạn ADN chi trung binh là 10K lan

Dưới tác dụns của dịng điện mội chiều, các đoạn ADN sẽ di chuvển từ cực

ám sans cực dương Đoạn nào cĩ trọng lượng phân tử thấp hơn, kích thước nhỏ hơn

sẽ di chuyển nhanh hơn và nsược lại

Tính linh độn° của phân tử trong bán gel dưới tác dụng của một điện trườns được tính theo cơng thức :

L02 |a = Los 14, - K ,cTrons đĩ :

Loa p.,,: tính linh đ ộ n2 của phân tử trong mơi trườna lỏna

N ổ n s độ Acrylamide Kích thước trune bình các đoạn cần phân tích

Báo cáo đê tà i QT 05-23

Đợi cho 2el trùna hợp hoàn toàn trong ít nhất 1 2 ÌỜ

Lãp bán gel vào binh điên di

Tra mẫu, chạy điện di ỏ' điện áp 100 - 120 voi trong 2 giờ.

5.2.7 KỸ thuật nhuộm bạc

Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm bạc cùa Budowle B (1991) Phươns pháp này có ưu điểm đơn giản và hiệu quả cao, thời sian tiến hành nsắn độ nhạy cao (chí với 1 ng cũne cho kết qua tốt)

Các bước tiến hành :

Cố định 3 phút với lOOml H NOì 1 ( r

Rửa 5 aiâv với 200 ml H20 loại ion

Nhuộm 20 phút với 20Óml AgNO^ 0.2%

Rửa 5 giây với 200 ml nước loại ion Hiên 2 - 5 D h ú t với 200 ml Na-,CO, và 11

5 Hiện 2 - 5 phút với 200 ml N a2CO, và 170 ul Formandehyt

5.2.8 Phương pháp xác định trình tự đoạn A D N sau rinh sạcli

Trình tự đoạn ADN sau tinh sạch được xác định theo phươns pháp của Sanger Nguyên tắc cùa phươna pháp này là tạo ra các đoan hon kém nhau một nucleotid kết thúc bằng các ddNTP dược đánh dan huỳnh quane Đẻ tạo ra các đoạn xếp kết thúc bảng các loại ddNTP khác nhau, chúns tỏi đã tiến hành PCR sử dụng BigDve® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit có chứa các hóa chất cần thiết của phản ứns đọc trình tự như các dNTP ADN polymerase, các ddXTP Do vậy chún° tôi chi cần bổ sung thêm ADN khuôn (ADN plasmid hoặc sán phẩm PCR tinh sạch), mồi, đệm thích hợp Do 4 loại ddNTP trons BiuDve được đánh dấu huỲnh quans bans 4 mầu khác nhau nên chi cán tiến hành PCR irons một Eppendorf

Thành phẩn cua phan ứns PCR gồm: BitiDye 0.5X-, đêm IX; mối 3.2 pM:

ADN khuôn (ADN plasmid hoặc sán phấm PCR đã rinh sạch) Tons thê tích phan ứng là 15 (0.1 Chu trình nhiệt cua phản ứng PCR trên máy luân nhiệt GenAmp~ PCR System 9700 như sau: 96"c 1 phút: 25 chu kỳ (96 'C 10 eiãv: 50"c 5 eiãy: 60''C 4 phút): siữ ở 4°c

Sán phẩm PCR đươc tinh sach bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA: bố suns

5 ul EDTA 125 mM pH 8: 60 Lil ElOH I0 0 r r Đao nhẹ hỏn họp va đẽ O' nhiệt độ phòne tron tỉ 15 phút Tiẽp đỏ ly tám 12000 v/p 15 phút 4 ’c dẽ loại ho EtOH Bổ SUI1H 60 Lil EtOH 10c( và ly tâm 12000 v/p troiiL 10 phút Lam khó ADN bỏ suns

10 ụl Hi-Di™ Formamide và biến tính tại 95"C n o n s 5 phút Các mẫu được cho vào các giêng cua khay đựna mảu sau đó điện dr trong ống mao quan 80 cm X 50 um chứa POP-4™ cúa hãng ABI Mỹ

G i a i t r ì n h r ự v à M í / v s ô l i ệ u

T r ì n h t ự n u c l e o t i t c u a A D N v ù n e '\si'cu h i m d o i" đ ư ợ c uiai t r i n h i r é n m á \ tự

đ ộ n s ABI-377 (AB1-377 automated sequencer) cua Hãng Perkin-Eỉmer (Mỹ) Chuỏi nucleotit ihu được lừ A L )\ ly thè thãn tóc cua CMC mau dược SƯ dune de iru\ cap Noãn h à n 2 een bãrìii chươnt! trình BLAST <Ị ijjr v\ -1 u ỉ1;-11 InI.IÌI||.LV\ hkM j

Ch ươn s trình AssemblvLIGX V 1.9 và hệ chưoìic trinh Mac Vector 7.2 f Accel rv\

- Cho H 20 vào cuvet để làm đối chứns.

- Cho vào cuvet khác 1 ml ADN đã được pha loãno ớ nồng độ thích hợp (loãng

50 lần)

Kết quá OD được tính toán theo công thức sau :

Cadn (ng/ml) = O D 2(Sllnm X độ pha loãng X 50 ug

VỚI phương pháp tách chiết này các mẫu ADN của tóc có độ sạch (ODofionm/ODjxonm) từ 1,45 - 1,65 Vậy ADN tách chiết được có thể dùng cho phản ứng PCR

N guyên tắc

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt đế tổng hợp các đoạn ADN mới từ mạch khuôn trong mỏi trường có các dNTP và cãp mồi dặc hiệu Các đoạn ADN mới được tạo thành lại dược sử dụng làm khuôn Sau nhiều chu kỳ đoạn ADN quan tâm được nhân lén gấp bội nhờ vậy có thế có du số lượns phục vụ cho nhữns nshién cứu tiếp theo

Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:

- G iai đoạn biến tinh: ADN mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao

(94nC-96"C)

- G iai đoạn gân mói: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đáu của đoạn

AD N đích theo nguvẻn tắc bổ sung

- Giai đoạn kéo dùi chuối', nhiệt độ của hỏn hợp phan ứne đươc tãn« lén khoans 70 -

SO" c là nhiệt độ ihích hợp để cho Taq ADN polymerase kéo dài chuỗi

Báo cáo đê tà i QT 05-23

Với điều kiện của phòng thí nghiệm, chúni> tôi khảo sát 6 gia đình: tách chiết ADN của tóc bàng phương pháp sử dụng dung dịch Chelex và DTT, sau đó nhân đoạn mồi dùng 2 cặp mồi ty thể L I 5965 và Hlfi491 L I 5997 và H I 6401, kết quả của sản phẩm PCR được điện di và xác định sản phẩm xen có đúng là đoạn ADN cần nhân hay khỏna

Gia đình thứ 7 chúns tỏi tiến hành khảo S i l t tại phòng thí nghiệm trọng điếm Công n shệ gen, Viện c ỏ n a nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Cóng nghệ Việt Nam Kết quả giải trình tự ADN ty thể của cả 4 thành viên trong gia đỉnh này được

(httpy/wu'w ncbi.nlm.nih.gov/hlasi )■

(Accelrvs Inc.) và hệ chuơns irình GENEDOC 2.5 (Nicholas and Nicholas 1CW ) được sử dụno đê so sánh \'à đối chiếu phân tích

23

Báo cáo đê tà i QT 05-23

6.3 Phương pháp tách chiết ADN ớ chân tóc người sử dụng dung dịch C helex

1) Gia đình thứ nhất:

G ồm 4 người và hai thế hệ, tách chiết ADN của chân tóc bằng phương pháp

sử dụng dung dịch Chelex, sau đó nhân đoạn mồi dùng 2 cặp mồi ty thể LI 5965 và

H I 6491, L I 5997 và H I 6401, kết quả điện di sản phẩm PCR trên hình 3

Báo cáo đề tà i QT 05-23

2) Gia đình thứ hai:

G ồ m 3 người và hai thế hệ, tách chiết ADN của tóc bằng phương pháp sử dụng dung dịch chelex, sau đó nhân đoạn mồi dùng 2 cặp mồi ty thể L I 5965 và

H I 6491, L 15997 và H I 6401, kết quả điện di sản phẩm PCR trên hình 4.

Kết quả ánh điện di sản phẩm PCR trên hình 4 tương tự ờ gia đình thứ nhất, cho thấy khả năng tách chiết ADN ty thể từ chân tóc người bằng dung dịch Chelex 10% là tốt, đảm bảo mẫu ADN cho việc giải trình tự các cặp baze nitơ của đoạn siêu biên đối HVI Tuy nhiên có thể điều kiện, nhiệt độ trong khi chạy điện di không ổn định nên ngoài bãng chính còn xuất hiện thêm 1 vài bãng khác nữa

Báo cáo để tà i QT 05-23

3 ) G ia dinh thứ ba:

G ồm 4 người và ba thế hệ, tách chiêt ADN của tóc bằng phương pháp sử dụng dung dịch chelex, sau đó nhân đoạn mồi dùng 2 cặp mồi ty thể L I 5965 và H16491, L I 5997 và H16401, kết quả điện di sản phẩm PCR trên hình 5

500 bp

400 bp

Hình 5 : Ánh điện di sản phẩm PCR của gia đình ậ dùng 4 cặp mói ty thế

L 15965 và H 16491, L15997 và H16401, tách chiết ADN chân tóc băng Chelex

Hình 6: Á nh điện di sản phẩm P C R của gia đình ^ dùng 2 cặp mồi ty thể

L 15965 và H 16491, L15997 và H16401, tách chiết ADN thản toe bằng DTT

và ProteinazaK cho sản phẩm có độ sạch phù hợp yêu cầu phân tích tiếp theo Điểu này khẳng định phân tích được các mẫu ADN ty thể cùa người trong các trường hơp lấy mẫu khó khăn như không thè lấy mầu máu ngoại vi, phần chán của tóc và mảu xác người đã phân huý hết phần mỏ mềm (nội quan, c ơ ) mà chi lây được phán thân của tóc người

27

H ình 7: Ảnh điện di sản phẩm PCR của gia đình 5 dùng 2 cặp mối tv thê

L 15965 và H 16491, L 15997 và H16401, tách chiết ADN thân tóc hãng DTT

28

Báo cáo đề tà i QT 05-23

6) Gia đình thứ sáu:

Đê đánh giá và chuẩn bị cho việc xác định chắc chắn phương pháp tách chiết

A DN ty thê vùng siêu biên HVI của thân tóc người nhằm giải trình tự nucleotit của đoạn ADN thu được sau khi sử dụng các cặp mồi đặc trưng, chúng tôi tiến hành tách chiết A D N của gia đình thứ 6 bằng cả hai phương pháp dùng Chelex và DTT

Gia đình thứ 6 gôm 3 người và hai thê hệ, tách chiêt ADN của tóc bằng cả hai phương pháp sử dụng Chelex và DTT, sau đó nhàn đoạn mồi dùng 2 cặp mồi ty thế

L I 5965 và H I 6491, L I 5997 và H I 6401, kết quả điện di sản phẩm PCR trên hình 8

và hình 9

r , 0 f ì h y ,

W O b f í

m*sáằỀÊS&n

Hình 8: Ánh điện di sản phấm PCR của giỉi đình 6 dùng 2 cặp mổi tv thế

L 15965 và H 16491, L 15997 và H 16401, tách chiết ADN chân tóc bằng Chelex

có 1 vài băng phụ và mờ, có thê điều, kiện, nhiệt độ trong khi chay điện di không ổn định nên ngoài băng chính còn xuất hiện thêm 1 vài băng khác nữa

29

7) Gia đình th ứ bảy:

G ia đình thứ 7 chúng tỏi tiến hành khảo sát tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, V iện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

G ia đình này gồm 4 người và ba thế hệ là: bà ngoại, người bố, người mẹ và n°ười con gái Việc chọn lọc mẫu như trên là dưa vào hệ gen ty thể của tất cá mọi loài nói chung và của loài người nói riêng, có những nét đặc trưng riêng, di truyền mẫu hệ, không bị ảnh hướng tái tổ hợp, nên trong ] 5 năm gán đây đã trở thành đối tượng lý tưởng được sử dụng trong nghiên cứu phân loại, phá hệ, tiến hoá và di truyền quần thể

30

Báo cáo đề tà i QT 05-23

Chung tôi tách chiết ADN của thân tóc bằng phương pháp sử dụng dung dịch

DTT, sau đó nhân đoạn mồi VỚI sản phẩm tách chiết được bằng 2 cặp mồi ty thế

L 15965 và H I 6491, L I 5997 và H I 6401, kết qua điện di sản pham PCR được trình

d dN T P trong BigDve được đánh dấu huỳnh quang băng 4 mầu khác nhau nên chí cần tiến hành PCR trong một Eppendort

K ết quả giãi trình tự ADN ty the của ca 4 thành viên (rong gia đình này được sử dụng đế truy cập Ngân hàng LVI1 hăng chương trình BLAST (hllp://\vwAV.ncbi.nlm.nih.uov/blusl) Két quá truy cập ngân hàng gen báng chương trình BLAST đã khắng định trình tự được giai chính xác là trinh tự ADN cua ty the

31

Báo cáo đề tài QT 1)5-23

người Phân tích sâu hơn vị trí chính xác của đoạn ADN dược aiái trình tự chúns tỏi xác định theo hệ gen ty thể chuẩn từ vị trí đầu tiên của mổi là 15997 đến vị trí 16434 như sau:

If, 121 RTFiTTCTflCC crfccmwift THCTTCaXfl CCTCTfCTVC ATWfVflCCC FtKCCFCftTC

II — I I up I*-loop

16 1B Í BflfCCCCCCC CCCCCWTECT TflCflflGCflfiG TR O K CflfrrC (W CCTTCRFC TATCftfflCPrr

a- c lia Iiqười Bà ngoại:

K Ế T QUẢ GIẢI TRÌNH T ự A D N TY THẺ Ớ THÁN TÓC CUA BA NGOẠI <fỉi HIỆU M A C X I '

TCT ATTTAACTATTCTCTGTTCTTTCATGGGGAAGt AGATTTGGGTAt 'CAC cCAAGT A TTGACTCACCCATCAACAACCGCTATGTATTTCG1 ACATTACTGCC AGCC AC C ATGAA7

VrrGT AC AGTACCATAAATACTTGACCACCTCiTAÍ iTACA'1 GAAAAC c c A AC c CAC A R

A A AACCCCCTCCCCATGCTTACAAGC AAGTAC AGCAA I CAACCCI CA AC rATC AC AC A

TC A ACTGCAACTCCAAAGC CACCCC TCACCCACl AGCiATACCAAC A A AC c TAC c c ACC