Nghiên cứu điều chế chất cộng hợp miễn dịch Lectin - Sepharose dùng trong chẩn đoán kháng thể và kháng nguyên một số bệnh ung thư

ehúiiịi loi vẩn cô gắng vận dụng những kiến thức và thành tựu tiến bộ của th ế giới liong lình vực này, kếl hợp với những hợp lác trong nước và qu ố c tế và có thế bước đâu lưa c h ọ n m

ĐAI HỌC QUỐc: (ỈIA HÀ NÓI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

4 Học viên T h ạ c sĩ Tr ần Thị Phưong Liên

5 Tiến sĩ T r ư ơ n g Văn Châu

M ã sô

Chủ trì dê tài

: Q T 0 0 1 9 : IHỈS.'1'S Đỗ N gọc Liên

IIẢ NỘI TI1ÁNG 5- 2 0 01

LỜI C Ả M ƠN

Ch ún g lỏi xin chán thành cám ơn Ban Giám dốc và Ban Khoa hoecrCòng nuliệ - Đại học Quốc gia Hà Nội Ban Giám hiệu, Ban Chu nhiệm Khoa Sinh học, các phòng Khoa học Công nghệ và Đào tạo sau Đại học, phòng Tài vụ trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

đã xét cluvệt, cung cấp kinh phí cũng như tạo mọi điểu kiện tốt đê Ihực hiện

đẽ lài nghièn cứu khoa học này

Ch ú ng tôi cũng xin cảm ơn các ban lãnh đạo của các cơ quan phoi họp nghiên cứu nhu' Bộ môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, c 01141

ty Dược phẩm Trung ương I, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Hà Nội cát' bệnh viện 108, bệnh viên Bạch Mai và bệnh viện K Hà Nội

Cuối cùng, chú n g tôi xin tướng nhó' và biêì ơn những bệnh nhân d an g SOI1U

và đã khuất vì những đó ng góp của họ cho các nghiên cứu bước đâu với muc đích tót dẹp là chân đoán sớm căn bệnh hiếm nghèo đế kéo dài thoi gian sống hữu ích cho mọi người

IỈẢNÍỈ CÁC C H Ữ VIẾT T Ắ T VẢ KÝ HI ÊU

Con A Con G leclin từ hạt đậu c e n s iío n n is và c gladiata

11 ?• h\ : Hum an Se rum Albmnin

HĐ T S : Hoạt độ tổng sô

lu : Immunoglobulin, globiilin miễn dịch (IgA, IgG, IgM, IgD, IgE)

vSDS - P A G E : Sođium Dodecyl Sulíate - Polyacrylamide gel ElectroỊihdrcsis

M H C : Main Hislocompatibility Complex Phức hệ phù họp ló

chức chủ yêu

TC R : T - C c l l Rcceptor

TN F : T u m o ur Necrosis Factor Yếu tố hoại tử ung thu'

U T BM TB G : Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC)

LỈTNH : Ung thư noãn hoàng (H um an Yolk sac T u m o m )

M Ở Đ Ầ U

Ung thư là một căn bệnh hiểm nghèo của loài người T h e o thông kc cua Par km g 1 (1998), toàn thế giới có khoảng 7 triệu người được chắn đ oá n là m;ìe bènli 1111« tlur và trong năm đó có trên 5 triệu người đã chết vì bênh này () ViòlO ~ o JNam ngay lừ 1993, theo GS Phạm Thụy Liên - chuy ên gia vế ung lim đã co70,00 0 người bị bệnh ung thư trong tổng số 71 triệu dân lúc đó, nghĩa là cứ

kh oán g 1 ngàn dân thì có I người bị ung thư Đ ó là mộ t tỉ lệ khá cao

Sang đáu thô kỳ 21, khi nén kinh tê công nghiệp ngày cà ng phát Irièn nan

ô nh iễ m mòi trường tăng lẻn, các bệnh truyền nhiễm phát triển vẫn là moi ho' ngại lất lớn đòi với sức khoé cộn g đổng, nhất là trong hoàn cánh của nước t;i

Ung thu là một cán bệnh rất phức tạp về ng uyên nhân bệnh sinh vàphương pháp diều trị Việc kiểm soát và phát hiện sớm đê điều tiị có thô’ làmgiám tỷ lệ tu' vong và kéo dài thời gian sống của bệnh nhân

Mục đích của đề tài này, trong điều kiện rất hạn chê về kinh phí ehúiiịi loi vẩn cô gắng vận dụng những kiến thức và thành tựu tiến bộ của th ế giới liong lình vực này, kếl hợp với những hợp lác trong nước và qu ố c tế và có thế bước đâu lưa c h ọ n một sô lectin tinh chê lừ nguồn thực vật của Việt N am , “ nghiên cứu điều c h ế chất cộng hợp miễn dịch lectin - Sepharose d ùn g chắn đ o án sớm kliánu ngu yên và kháng thể của một số bệnh ung thư ở người”

Nội dung của đề tài bao gồm hai phán

Pììảu thứ Iihàt, lựa chọn phương pháp đê tinh c h ế một sô leclin co hc;ii

tính ứng dụ nụ quan trọng trong y học miễn dịch

Pliần thứ hai, nghiên cứu thử ngh iệm điều c h ế chất cộ n g hợp miễn dịch

lcctin dể nghiên cứu sự biếu hiện bất thường của kháng thể và kh án g nguyên (V một số bệnh ung thư, góp phần chắn đoán sớm đặc biệt là ung thu' gan và ung thu vòm họng

Các c ô ng việc nghiên cứu mới chi là bước dầu nhưng đã thu được nhứnu kcì qu á hứa hẹn và sẽ được tiêp tục kéo dài trong nhiều n ăm đế hoàn Ihiện mọt

bộ sinh phẩm trong chẩn đoán một sô bệnh ung thư hiểm nghèo C h ú n g loi rai

m o n u sự giúp đỡ của các cấp lãnh đạo nhà trường, Khoa và các cơ quan hữu quan

1HỈS.TS Đ ỗ N g ọ c Liên - Bộ môn Hóa Sinh, khoa Sinh học

Trư ờn g Đại học Khoa học T ự nhiên, Đại học Qu ốc gia Hà Nội.

2.2 C ác cún bộ tham gia:

N C S T h ạ c sĩ Ngu yễn Văn Lợi

i liạc sì Nguyỏn Thị Than h Loan

Tiến sì; Ng uy ền Hạnh Phúc

l i ê n sĩ/'Trương Văn Châu

Cl,cÀ(r

Họ c viên T h ạ c su Trần Thị Phương Liên

3 Nội (lung nghiên cứu đã đãng ký:

3 ỉ ỉ lo à n thiện qu y trình tinh chê m ột sỏ lectỉn có hoạt tính ứng (liuiiỊ

q u a n t r ọ n ẹ t r o n g n g h i ê n c ứ u m i ế n d ịc h V h ọ c '

3.2 Nghiên cứu thử nghiêm điều c h ế chất cộng hợp miễn dịch trong chán

đoán sớm một sô bệnh ung thư, xét nghiệm sự biểu hiện bất thường cua kháng thè và kháng nguyên chỉ điểm ung thư (Tum or m arker antigen)

4 Các két qua chính đã đạt được:

4.1 Đã tinh ch ê được 5 loại lecỉin có hoạt tính đạc hiệu miễn dịch là Con

A Con G 3 loại lacalin, trong đó đã lựa chọn được 3 loại, có hoại lính mien dịch đậc hiệu cao đê thiết kế bộ sinh phắm miễn dịch nghiên cứu chắn đoán sớm úng thư

4.2 Đã thiết kê được 4 bộ sinh phẩm dạng cột ái lực miễn dịch: Con A

S ephar osc 4B, Con G-Sephnrose 4B, J 1 -Sepharose 4B và J4- Sepharose 4B Có

hoại tinh đặc hiệu ca o để tóm hắt kháng thể và kháng nguyên chì điếm một so bệnh ung thư: ung íhư gan, ung thư vòm họng

Q u y trình Ihiẽt kê các cột ái lực miễn dịch này đạt liêu chuẩn cao:

- Có ái lực miễn dịch đặc hiệu

- Kha lìãng d ùn g và báo quán lâu dài hàng năm ở 4"C

- Giá thành bang một phẩn ba so với sản phẩm phai mun của nước ngoài

- Sử dụ n g tài n gu y ên trong nước, có giá trị kinh tê cao

4.ĩ Bước đáu đã và đ ang hoàn thiện quy trình lạo ra bộ sinh phàm ilưới

dang xót n gh iệm nhanh miễn dịch hiện đại là (ELiSA: enz ym e Linked

ỉm nu m o so r b en t Assav)

4.4 c ác kết quá nghiên cứu đã đăn g 3 bài báo trong Tạp chí Dược học v;ì

I báo cáo O' hội nghị Sinh học cơ bán toàn quốc tháng 8/2000

5 T ó m tát các kết quá nghiên c ứ u '3

5.1 Đã thăm dò nghiên cứu tinh c h ế một số lectin từ một sô loài cà\ họ đậu và họ dâu tằm và cuối cùn g đã hoàn thiện quy trình sác ký ái lực dạc hiện

cao đẽ tinh c h ế được 4 loài lectin ứng d ụn g đặc hiệu bắt giữ miễn dịch kháng thò’

IgA và kháng n g u y ên AFP

Đ ó là lectin Co n A và ConG lừ hai loài đậu dại trồng ở Việt Nam (Yên Bái

Lào Cai, Ba Vì - Sơn Tây) tluiộc chi Canavalia ensiformis, Canavalia gl;uli;il;i

Đ ây là hai loài đậu dại chưa được dùng cho thực phẩm vì ở hạl chứa nhiên

gl uco/it và axit Xia n hy d ri c (HCN) có độc lính cao

Sụ' phân loại khoa học đã được xác nhận bằng các phân tích hình thái <;fụ

hạt và hoa do tiến sĩ phân loại học- chuyên gia đậu đỗ- Nguyễn Đ ãn g Khôi (>■

T ru ng tâm Khoa học Tự nhiên và C ôn g nghệ Quốc gia thực hiện

Trên co' sớ khoa học đó, chúng tôi đã tiến hành phương pháp tinh chê ;ii

lực có cái biến kỹ thuật của Golstein & cộ ng sự và đã thành cổng điều chê ilnnu

tinh khiết cao của hai loại lectin này

Một sô lính chất của lectin Co nA và CoitG

+ Tinh khiết chí chứa một băng Protein trong SPS-PAGE

+ Hàm lượng Protein trong chê phẩm đã đò ng khô 90-95%

+ Hoại đ ộ n g liêng ngưng kòt hổng cầu nh óm máu A: 7,2 X 10 đon vị/mu

(liên Im! piotein ch ế phẩm) và 6.6 X lOVtưn vị/mg tương ứng (nêu m u.1 chc

phẩm nàv cùa h ãn g hóa chất SIGMA nổi tiêng Ig phải trả I80USD, dang ctóim

khó) Đ ộ sạch tăng từ 10 đôn I 1,5lần so với dịch chiết PBS

+ Có tính đặc hiệu đường glucoza, manno/.a và dẫn xuàl cua dni ni i co iln' linh dặc hiệu cao với kháng nguyên A F P ung thu.

+ So sánh với tiêu chuẩn quốc tế, các chê phẩm lectin ái lực miễn (lịch lì.IV

đã đại được liêu chuẩn cao và đã được chứng minh trong xét n g h i ệ m miỏn tlịcli bệnh viêm gan và ung thư gan

+ Ráo quán dạng d un g dịch và dạng đ ôn g khô h àn g năm vẫn có hoại lính miễn dịch cao (Ứ4° c, có chất chố ng khuân azide 0,04%)

5.2 Hoàn thiện quy trình điều c h ế cột ái lực M uci ne - Sepharose 4B lại

Việt Nam đế linh ch ế ái lực lectin mộ t sô loài mít chọn lựa có hoạt lính ái Itk miẻn dịch đặc hiệu cao Đ ó là các lectin mít dai, mít tô nữ, mít dại Táy Nuiivẽn

có tòn phân loại khoa học tưoìig ứng là Arlocarpus helerophyllus l.iimk Aitocarpus Champetlen Cìagn và Arlocarpus - masticata Gagn

Một sô đặc tính của c h ế phẩm lectin là:

+ Tính khiết đồ ng nhất chứa 2 tiểu đơn vị 14 và !7 k D a trong điện ili SDSPAGE

+ Hoạt dộn g liêng tương ứng 65 0,5 x 10 '; 5 2 0 , 2 x 1(ý và 9 6 0 x 1 0 ' don vị

lui/ma, protcin Và độ sạch sau khi tinh c h ế trên cột sắc ký ái lực tăng từ 3 đèn 7 làn so với dịch chiết thô lừ hạt

+ So sánh với tiêu chuẩn lectin quốc tế, c h ế ph ẩm có đ ộ tinh sạch cao hàm lượng P ro te in tiên 9 0 % (phấn còn lại là muối đệm)

+ Có hoại tính dặc hiệu cao với IgAI được chứng m in h bằng kỹ IỈHI.H XÓI nghiêm miễn dịch ơ u c h t e r l o n y

5.3 Thiôt k ế cột ái lực trong điều kiện tai Việt N am chứa chât c ộ nu họ'Ị>

miền dịch lectin- Sepharose: 11- Sepharose 4B; J2- Sepharose 4B; J4 Sephaiosc 4B d ù n g đế bắt giữ miễn cỉịch IgAI của bệnh nhân ung thư gan và ung thu' vòm

h o n u c

Kết quà phân tích nồ n g độ IgAl từ huyết thanh bệnh nhân ung thu' gan la 7.85 ± 0,80 (với 11= 30) tăng gấp 2,76 lán so với người bình thường (2.84

±0.2 8)m g/ ml , khác biệt có ý nghĩa (hống kê

5.4 Thiêt k ế CỘI ái lực cliãl cộng hợp miền dịch C o n A - Sepharosc 4B \ .1 ConG Sephnrose 4B đè bắt giữ kháng nguyên ung thư gan A F P (ung thư bicu mo

tè bào gan HCC) để tinh chê có hiệu quá AFP ỏ' các ma LI huyêl thanh ung lim Các chê phấni k h áng nguvên nàv sẽ được sử dụng trong nghiên cứu lạo khánu

thỏ (la đòng và đơn dòng liong chươiti; (rình nghiên cứu sau này đế phái hiện stVm

unu thu' b;mg phương pháp xét Iiụhiộm miễn (lích hoàn thiện cao

5.5 Đang hoàn thiện Cịiiy limlì xét nghiệm ELiSA liên kê( lectin míí dê bál

giữ ái lực kháng thổ IgA 1 từ huyết thanh bệnh nhân ung thu' gan

Kêì quá cho thấy:

- Sử clune bộ si nh phẩm (lạng ELISA xét nghiệm lìồng độ lgAI luiyét Ihanli cho kè! quả xét nụhiệm nhanh, chính xác cao và xác định được nồng độ IgAI huyèl

thanh bệnh nhàn ung thu' gan (7.5 ± 0,5)mg/ml (ăng gấp 2,5 lán so với người không

mác bệnh (2,84 ± 0,8)/mg/ml Và đôi với viêm gan siêu trùng (10,98 ±0,83)mg/ml

(dã nghiên cứu tù' 1998-1999) gấp 3,86 lân so với bình thường

5.6 Đang nghiên cứu quy trình tao bộ sinh phắm dạng ELISA cho XÓI

nghiệm khánu nguyên ung thu' AFP và bộ sinh phàm xét nghiệm phân biệt khánc

nctiyèn AF: P của bệnh nhàn viêm gan siêu trùng và bệnh nhân ung thư gan

ít T i n h hình kinh phi (lề lùi.'

6.1 Kinh phí được câp ngày 15/8/2000: 7.000.000đ (Bảy triệu: gổm ca lièn

quản lý đề lài 300.000(1)

6.2 Các khoán đã chi:

- Mục 1 10: Vật lu' văn phòng

- Mục 1 12: In ấn, mun tài liệu làm c h ế ban, ảnh tiêu bán

- Mục ỉ 13: Công tác phí và đi thu mua mẫu lại Ihực địa

- Mục I 14: Ticn thuê hợp đồng làm phân (ích và thuê

300.000c1 700.000c1

X AC: NH Ạ N (UA BAN CH ú NIIIÊM KIK) A ( H Ú TRÌ f)í; TẢI

PG S TS Đ ỗ N g ọ c Liên

t

S U M M A R Y

StUtỉy OI1 piepniation C)f Lectin - Sepharose Conjugates for tliagnosiic oỉ anlihociy and a n l c g e n ' s T m n o r markers

The icsulls ohtaincd oí lliis projccl are:

1 Fivc Lectins vvere purified íYom 5 species o f Vietnamẹse (Arícx ti/>/>ii\ hclcroỊìììxlliis, A champedc'II, A masticata Canavaỉio i‘Ịisifontiis CaihiYdlhi

ìị Iiulidtd) for preparation ()f immunological conjugates to dingnose Tunioi markers

2 Sludy on IgAl Concentration from healthy and Tumoui (íICC

1 lep aiocellukư Carcin om a) sera using iinmunological Conjugates basccl ('II lacalin - Sepharose 4B affinity column The results obtained showed thai IgAI Cdiicentralion íiom liuman Hepalocelltilarcarcinoma (HCC) s e m m (7,85 ± 0,8 mg/ml), is 2,76 times higher llian thai of healthy human (2,84 ± 0,28 mg/ml)

3 Using m odiíied ELISA technique períeeteđ in om laboratorv ( E n / v m - L.cclin linketl I m m un o Assay) we liave shovved IgAI Concentialion íYom Scra uí

n c c paticnts is same in Comparison vvith Affinity chr om at og ia ph y techniqtic

4 Usiim highly puriíied leclins Con A and Con G from seeds ol l u o species Canavalid cnsiỊormis and Canavalia ạlưdiata to m ak e ConA and Con G

- Sepharosc 4B a n i 11 ity C ol um ns for tMcctirtịỊỊ serum T u m o r markci AP I’ in palienls of livei and brcast cancer, we showeci a high speciíic interactiorì bclxveen lectins Con A or Con G and AFP as well as soine pathologicnl glvcopioteins Thai was Ihe nia in base for om later research on leclin alTinity AF1J markers in carly diagnostic ()f HCC, especially in palients al high risk snch

as cỉironic hcpaíilis and Cirrhosis

This results was published in 4 papers of national joum als

IVoịect Co - ordinator

A ssoc P r o f Do N goe IJeii

N g à \ nay, người ta đã chứng minh ung thư là mộ t căn bệnh hiểm ng h èo co ban chài gen và bàn chất tiếp thu di truyền Thê m vào đó, người la c ũ ng dà

c h ư n u m i n h c á c y ê u tô tác đ ộ n g p h ứ c l ạ p b ê n t r o n g c ơ t h ê v à m ô i I r ư ờ n u Mills: quanh dã tao ra những nguyên nhân gây ra bệnh ung (hư

Tron " mỗi tô bào luôn luôn tồn tại các gen ung thư gọi là O n c o u c n CIIII k' bào là nhữnu gcn lạo ra các sán phẩm kiếm soái các tín hiệu hoạt hóa V.I I.mu sinh lô bào Đó là các thụ thê (Receptor) của các yếu tô tăng trưởng, các piotein truyền dẫn tín hiệu nhu' Photpholyrozin Kinaza (PTK), các k i n a / a cua SCI Iii/trenonin, protein G, các protein lliam gia vào báo vệ c h ố n g oxy hóa (Bcl-2) hoậc các yếu lô phiên mã (C-myc) Các oncogen này có thế được hoạt hón bãim một đột hiên Đột hiến này đã làm rỏi loạn hay đối kh án g lại cơ chê đicu hòn sinh lí cùa sự biếu hiện các oncogen Những đột biến của các gen họ ras là mội

ví dụ dược thây rõ ở phần lớn các khối 11 của người, gáy ra sự p h o n g bê (bao váv)

m ộ t loại p r o t e i n là p 2 l r a s , l à m t h a y đ ổ i c ấ u h ì n h h o ạ t đ ộ n g , c h ố n g lại SƯ b ã l h o ạ i quá trình thuy phân CìTP thành GDP Chính quá trình thủy phAn CÌTÍ’ dã curn: cáp tín hiệu cho sự hoạt hóa phân chia tê bào Tác độ ng cua các on co g en co IỈK' được thực hiện băng sự chuy ên đoạn nhiễm sắc thể, liên q u an đèn sự tlicu hòa cua các aen khác Ví dụ sự chuyên đoạn nhiễm sác thể 14 và 18 liên quan đón

o n c o g e n Bcl-2 nằm trên nhiễm sắc thê 14, vùng DJ của gel IgH (chuỗi nạnLi 1^)

Sự biếu hiện quá mức của gcl Bcl-2 và sự mất di cơ c h ế chết theo chưưim li inli cua lê bào (apoptosis) lympho B dần đến ung thu' dò ng tế bào B Ironu các Inniịi lâm tó hào niáin (tuý xirơng) Sự chuyến đoạn giữa các nhiễm sác Ihè (<s 14) u;i\

ra cho đa sô các trường họp II lympho Biukill liên quan đôn pr o lo- on cog cn ( myc, làm đột biên các chuỗi nặng cùa các globnlin miễn dịch (Ig) Một VI du nu;i

Retinoblastoma, khối II VVilms ) Các anti-oncogen mã hóa ch o các protcii) CIIII

bộ khmm tê bào (cytoskeleton) hoặc các protein điều hòa chu trình tê bào hn.k sưu chữa ADN, hoặc trực tièp, hoặc gian tièp qua trung gian các yêu lo phicn m.1 (transcriplion) Nh ữn g anti-oncogen đó thường xuyên bị biến đổi trong các khoi

li tự phái cua người Đạc biệt là trường hợp prolein p53 có gen m ã hóa cho n t » bi đột biên có tói hơn 50% tạo ra khối u ở người Bình thường protein p53 nì! II biổu hiện trong các tế bào bình thường nhưng rất giàu ở các t ế bào bị “ Slrcssl" làm nhạy cám biến đổi cấu trúc của A D N (ví dụ Stresst oxv hóa, bị chiếu xạ hi nhiễm các chất gây ung thu' hóa học) sự biểu hiện quá mức của p53 làm phonu

bê (bao vây) pha GI cua chu trình tê bào, lừ đó ngăn cản c ơ c h ế sửa chữa ADN

11 ƯỚC khi phân chia tế bào Nếu quá trình sửa chữa ADN bị mất đi, protein 53 lạo điếu kiện dỗ dàng, hay cho phép tế bào chết theo chương trình (bằn g t|ii;í tlình apoptosis) Sụ' dột biên gen p53 có thể đạt lới việc tích luỹ một proíein bâl hoại \ I protcin này không có kliíi năng giúp cho cơ c h ế sửa chữa A D N , tù' đó sẽ ci11\ II I

SƯ sòng của các tế bào bị tổn thương tiếp tục có khá Hãng biến d ạ n g ác lính V k \ dưa (in vitro) mộ! allen p52 bình thường vào các tê bào ung thư có thc sẽ lam mất di phenotyp ác tính Sự bất hoạt chức năng của p53 còn có thê gây ra sự biếu hiện quá mức của gen m dm -2 , là gen mã hóa cho một câu tử gắn của p53

Sư chuyên d ạn g ác tính của một tế bào xáy ra theo nhiều giai đoạn iươnu ứng vói sự hoạt hóa các o n cog en và sự bất hoạt đ ồng thời củ a các gen kìm hãm ung thu' (anti-oncogene) Đây là CO' chê đan g được giải thích ch o một số m ỏ hình ung thu' do các virus gây ra Cụ thể là, các protein biến d ạ n g E l a và E l b cua cát virus gây ung thu' Adenovirus sẽ tạo phức hệ với protein R b (a nl i-oncogen tham gia trong bệnh retinoplastoma và những loại ung thu' k há c) và tạo phức hộ \(Vi p53 Các prolein E6 và E7 của papillomavirus HP V1 6 và H P V I 8 (tlni phạm u;i\ ung thu cổ tử cung) sẽ kết hợp với p53, sau đó kết hợp với Rb và tù' đó ng;m Ciin

c h ứ c n a n e , c h ố n g UI 1U t h u ' c ủ a c h ú i ì £

1.2 C ác kháng nguyên thài bồ m ảnh gh ép ung thu và kháníỊ níỊnyên

( l á c h i ệ u UIIÍỊ t h ư :

Việc nghiên cứu các kháng nguyên có nguồn gốc thài bỏ các khỏi II Iliur

nuhiệm dã thu được những ticn bộ nhờ phương pháp tách d ò n g tè bào ung lim' \ .I

các lê bào lympho T Từ đó đã làm sáng tỏ vai trò cùa các lymp ho T gáy dọc

(Tc) dặc hiệu cho các (ế bào ung thư ghép vào hạch bạch huyết của các đ ộng vát

thái bỏ chíinti

Tù' một dò ng tê bào ung thư cấy ghép (ký hiệu t u m (+l) nhiều phò nu llií

imhiệm có thê nhận được các d òn g tê bào biến dạng (ký hiệu r*) bị thái bó bời

các cá thê’ nhận đổng sinh do tạo ra một đột biến in vitro Từ hạch bạch h u \ ê l

cua chuộl thụ nhận m ãn h ghép ung thư đã đột biến người ta lây ra các lympho 1

gây độc (Te) làm phân huỷ các lê bào (Tum-) nhưng k h ô n g có khá năng tiêu lìii\

dòng Tu m ( + ) của cha mẹ Các lympho Tc kháng lại Tu m( -) sẽ được tách dòiii:

bằng cách pha loãng có giới hạn Sau đó các băng ADN g e n o m cùa tế hào Ttimi-)

sẽ đirợc biếu hiện bằng cách truyền nhiễm vào các tê bào T u m ( + ) qua lninn man

vecto cosmid Các tế bào sau khi được nhiễm ge no m Tu m(-) sẽ trớ nên nhay Ciim

đỏi với sự phân hu ỷ và bộc lộ một kháng nguyên được nhận biết bởi các lympho

Te Chính những tê bào đó sẽ bị thải bỏ in vivo Người ta tiến hành phân tích

trình tự các mả n h A D N cài đặt và đã xác định được các peptit im m u n o g e n liên

kct với các phân (ử lớp I của phức hệ phù hợp tổ chức MHC Nh ữ ng péplil khánu

nuuyên này có đirợc là do những đột biến điểm trên phân tử A D N geno m

Vậy kháng n guy ên đặc hiệu ung thư là gì? Người ta thấy răng từ một số

khói 11 của người, có thể tách ra các dò ng tê bào phân chia vô hạn invitro trong

khi vẫn giữ dược những đặc tính chủ yêu về phenotyp của khối Li Klii nuôi cày

c á c tế b à o l y m p h o c ủ a b ệ n h n h â n ( lâ y t ừ m á u h o ặ c lọc ra t ừ k h ố i II) c h o l i ê p MIC

với các tế bào khôi u tự gh ép (autologous) đã được phân lập, Iigirời la sẽ nhận

dược phán ứng hỗn họp tế bào lympho-khối II Các tế bào ly m p h o T lăng sinh

trong những điều kiện nói trên nói chung đều là dạn g l y m p h o T-CD4* Tioiìịi

một sô trường hợp, người ta cũn g nhận thấy có một sô d ạ n g l y m p h o T-CD8* tãnu

sinh đã tiết ra T N F cx (yếu tố hoại tử ung thư alpha) do sự kích thích của các lò

bào khối 11 Nhờ sử dụ n g phương pháp trên, Bootn T và các c ộn g sự đã phái minh

ra một họ các gen m ã hóa cho kháng nguyên liên quan đến bện h ung thư hãe lô

( M A G E : m el an o m a associated genes) Từ máu của bệnh n hân ung thu’ hác lo

(dạng M Z 2), các nhà nghiên cứu trên đã tách một dòn g tê bào lym pho Tc C D 8 ’

đặc hiệu với khối 11 này (MZ2-E) Họ đã xác định được các hiên d ạn g tế bào cua

chính khối u có khá năng đối kháng lại sự phân huỷ tê bào (giống tương (Uronu

dò ng T u m ‘ ) sau đó các tác giá đã cho nhiểm các mánh A D N bổ sung lây lừ c;íc

lé Kio nhạy cám với SU' phân hủy tê bào (qua trung gian vectơ co s m k l ) vào các lé

hào đối khang phân hủy tè hào cùa dòng M Z2- E cho thấy d ò n g này xiiiìl hiện

mội kháng nguyên và được các tê bào Tc nhận ra Phân tích trình tự cùa A D N bo

sung cho nhiễm vào tê bào đối kháng, người la đã xác định được mót UCI1

MAGE-1 ịiiòng với gen bình thường nằm ở nhiễm sắc thê X Sán phám CII.I lì en

nà\ khỏnu bộc lô ỏ 'c ác mô lê bào bình thường, trù' mô tinh hoàn, đăc biòi bột’ li’

lói 4 0 % ỏ' ung thư hắc tô da và biếu hiện cao ở Ling thư vú, ung thư phổi DÒIIU ló

hào lympho Tc M Z 2 - E gây độc cho các tế hào có biếu hiện gen M A G E - I liên

kết với phấn tử HL A-A 1 Người ta đã xác định được cấu trúc cua sán phàm UCI)

miịi í hư MAGE-1 là một nonapeptit, có epitop T liên kết với H L A - A I

Gcn M A G E - I thuộc về một họ bao gồm 14 gen giỏ ng nhau hì 85-9(1'/

San phẩm cua chú ng hầu như chí bộc lộ ở các tế bào ung thư (khôi li) Tuy vặ\

các gen này ở (rạng thái "yên lặng" trong các tế bào hình thường Phái minh cùn

các nhà khoa học tiên tạo nên một giá trị áp dụ ng phán ứng hỗn hợp các lê bào

Ivmpho - khối 11 để nghiên cứu các kháng nguyên ung thư Tu y nhiên kỹ thun!

này ch o phép sàn xuất ra các dòng Tc nhận biêt các peplit kh án g nguyên cua đ;i

số các mô tè bào bình thường, nghĩa là không đặc hiệu

Những kháng nguyên ung thư khác có giá trị cũn g có thế được xác (.lịnh ro

nhờ các phương pháp miễn clịcli, nhưng cần được (hực hiện bầng lìluìng xéi

nghiệm miễn dịch đặc hiệu

1 J Các cơ chê trốn ílioát hệ m iễn dịch của các tê bào ung thu:

Các công trình nghiên cứu trong những năm gần đâ y trên các m ỏ hình

độ ng vật và trên các nghiên cứu Ĩ11 vitro ở người đã cho ta nh ữ n g lí giái vé cơ chè

trốn thoát của các tê bào ung thư đối với hệ miễn dịch Các nhà khoa học đã tổng

kèt và đua ra 3 khá năng cho cơ chè này là:

/ ỉ / C á c co'ché cua hán thân vật clni và tác dộiiiỊ cua môi ỊníờiiiỊ.

- Sư thiêu hụt miễn dịch của cơ t h ể do xử lý các thuốc kìm hâm micn (tu li (Ironụ trườim hợp cày ghép mô chẳng hạn), bị nhiễm các virus, trong dó dạc hiẹi

là các virus gáy ung thư như: EBV (gây ra khối u lym pho Buikitt, ung llui VIII11

họng), các virus HBV gây ung thư gan, HPV (papilloma virus ở người íiây IIIIU

thư cổ tử cung) Ngoài ra khi bị nhiễm xạ, người và loài vật cũ n g dể mắc bệnh

ung thư

- Yêu ló thứ hai là sự bất thường của cơ chè đi truyền hoặc do mắc phái SƯ lôi loạn các gcn chống ung thư (anti-oncogenes) như: RB, p53, W T -I ,N P - I APC'

- Do sự bât thường của hệ (hống sửa chữa ADN

- Sụ hộc lộ vượt trội quá mức của các chất gây ung thư hóa học và các t;íc nhân vậl lí (tin xạ Ỵ hoặc UV)

- Thiêu hụt khá năng nhận biết các kháng nguyên ung thư của các lê bào khôi II (cua phức hệ MliC kho dự trữ TCR)

1.3.2 C o 'c h ê vé MI'thiêu hụt tính sinh miên (Ìịcỉì cùa khôi II ( ó thê hiên liiộn:

- Không biểu hiện các peptit kháng nguyên của khối u hoặc các phân lử M1IC

- Tiết ra các phân tử kìm hãm miễn dịch như T G F p, IL-10, PGE-2

- Biếu hiện kháng ng uyên không có khá năng gây đá p ứng củ a Tc

- Tạo ra sự dung nạp bằng cách tiết ra các kháng n gu yên hòa (an

- V ắng mạt các phân lử kết dính (chẳng hạn CD 80 hay B7) do (tổ khóng

làm hoạt hóa các Tc và NK của hệ miễn dịch vật c h ủ

- Tạ o sự đột biên peptit "đích" cho sụ' đáp ứng miễn dịch cua Tc (cliãim hạn sư biên dổi lum' ' —> lu m(f>)

- Tao ra sự điều biên kh áng nguyên

- Gây cản trở đối với các chất gây hiệu quá miễn dịch (như kháng thè và Tc)

- Biểu hiện quá mức các thành phần cấu trúc tế bào (trường hợp các tò hào thán kinh) hoặc tạo ra cơ chê đối kháng apoptosis hoặc nh ữ ng "stresst oxy hóa",

ví dụ Bcl-2

- Bộc lộ các phân tử M D R làm giái thoát nhanh c h ó ng các thuốc chỏng ung thư ra khỏi tế bào II (cho phép exocytosis nhanh thuốc c h ố n g ung thư)

1 4 S ự b i ế u h i ệ n h ộ i c h ứ ĩ ỉ í ỉ m i ề n d ị c h t ế b à o v à t h ế d ị c h í r o i i ỉ Ị IIIIIỊ l i m

Hội chứng biểu hiện trong ung thư là sự tăng sinh quá mức và vỏ hạn đọ

cù a các dòng tê bào ung thư Người ta gọi đó là hội chứng tăiìiì sinh miễn (.lịch (Im m im op rol ií er ati ve synđrom) cua các tế bào lympho T hoặc d ò n g B

Su' lãnẹ sinh cua các dòng tê bào được thê hiện ớ tính châì don (lòn*:, nghía là ch 1 một d òn g lê hào lăng sinh vô hạn Có thê nêu ra nh ũ n g ví du vê MI táim sinh đon d ò n g của các tê bào B và T.

1.4 1 Bệnh (1(1 II lnỲ (m nltiplc Myeloma)

Đó là sự tăng sinh ác lính của dò n g tẽ bào B dưới d ạ n g plnsma ứ m o luv

\ ươn Si Bệnh này gây tổn thương xương và loãng xương ng h iê m Irọim Các imhiên cứu đã chứng mi nh các tế bào plasnia (B) đã thẩm lọt qua tuy xương ó' các d a n g hình thái khác nhau: 11 plasma tuỷ xương đơn độc và các II plasm a thoái bên ngoài xương Các biến chứng chủ yêu là gây tổn thương các ô ng thân vi mạch và tổn (hương tiểu cấu thận, tạo ra các đóng cặn của các m àn h khiíim thê bất Ihường (amyloidosis) và giảm tổng hợp các Ig bình thường Từ đó làm lanii quá m ứ c trao đổi chất của IgG, làm biến đổi dòng tế bào neutro phile gâ\ nhiem trùng nghiê m trọng

Ỉ A B ệnh iuií> thư b ạ ch cầ u m ãn tính dòiHỊ B.

Đó là bệnh tăng sinh dòng tế bào B có mật độ thấp các IgM và IgD trên màng

Ị 4 Bệnh 11/iíỊ rim' MturoíỊÌohiilin W(il(leiì stroni.

Biếu hiện của bệnh c ũ n g là tàng sinh dò ng tế bào B, tạo ra IgM do'11 dòn g trong huyết thanh, làm tăng độ nhớt của máu

ì 4 Cóc hệnh u ìympììo (lồng B, dụng Barkitt liên qu an đèn YÌHIS

Epslcin -Ban (EBV), các II lympho không Hodkin và Hodkin

Ỉ A , Lhìi> rlitf<lòiii> l ỵ n i Ị ỉ h o I' b ệ n h n ày c ũ n g thường x á y ra và được u ọ i ỉ;'i ung ihu' bạch cáu dò ng T (T Cell leukemia) Bệnh cũn g có thể do các vims

H T L V - I ( H um an T-Cell leukemia virus) gAy ra Biểu hiện củ a bện h là do lác

đ ộ n g tại chỗ của các xitokin do dò ng tế bào ung thư tiết ra ( G M , CSF, IFN Ỵ,

T N F a ) vào các lớp da biểu bì hay chân bì

1.5 Các biểu hiện đon dỏng rà bát thuồng của kháng thế trong ung thu:

Biểu hiện rõ nhất trong ung thư là hàm lượng các kh án g thể đơn d òn g trong huyết thanh tăng lên nhanh chóng ở nhiều bệnh ung thư Các kh án g thè dơn d ò n g biểu hiện thường là IgG và IgM, nhưng cũng có thê là IgA (ví tiu bệnh

đa 11 tủv, bệnh ung thu' cổ tử cung) Đôi khi sự lãng các kh án g thể đơn d ò n s cũn ị! dược lliấv đối với các lóp kháng thè IgD và IgE, nhưng rất hiêm Đối với C.IC dưới lớp IgG Ihì các đơn dòng tăng ưu thê là l g G I > IgG2> Ig G3 > igG4

Biêu hiện táng dơn dòn g cùa các kháng thê còn thấy rõ ớ tính bất Ihườni: Iroiiíi cấu trúc cua kháng the Đ ó là sụ' (ổng hợp quá mức các m ản h prolein chuoi nhẹ (V (lạng ciime là protcin Bence -Jones ( B.IP), có thế đirợc phát hiện đễ d;nm

t r o n g d i ệ n d i l ớ p m ỏ n g a g a r o s c

Tính bát thường trong câu trúc hóa học cua các kháng thế còn biếu hiọii ru

ớ những thay đối sau dây:

Biểu hiện bất thường thứ hai là sự thay đổi câu trúc đư ờn g cua phân III kháng, thể Viện nghiên cứu cấu trúc phán tử kháng thể trong bệnh ung thư (lànu sinh miễn dịch) cho phép hiểu được sự thay đổi cấu trúc đư ờng của các đơn đòn*:

ỉ Si A và IgCi Bệnh thè hiện rõ nhất là chuỗi nặng cx (của IgA) đoìi d ò n g bị tluoim hóa rất cao nghĩa là ỏ' chuỗi nặng được gắn thêm các gốc đ ư ờn g ( A u co ut u rie r et

al, 1996) Hậu quá của bệnh chuỗi nặng « của IgA trong, ung thư II tuy dã lạo ra

sư đ ó n g cặn nhiều chuỗi nặng hoặc các chuỗi nhẹ bất thường ỏ' mức độ liêu cáu thận, gây tốn thương thận nghiêm trọng Sụ' Ihay đổi cấu trúc đường cũn mộl so

U A ỉgG làm biên đổi đặc tính ái lực hóa học cùn kháng thể đôi với một sò hoai chất tự nhiên, dặc biệt là các leclin có nguồn gốc từ độ ng vật hoặc thực vãi Đo

là những nghiên cứu mới đây của Hiki và các cộng sự (1999) về sự thay doi càn trúc đường cùa phân tủ' kháng thế IgAI trong bệnh viêm cáu thận (Hiki.Y 0 1 al .1 Am Soc o f Nephrology 4/1999; Vol 10 (4) 40.45)

Sự thay đổi cấu trúc đường của các IgCì II tủy cũn g đã được chứ ng minh HÀU hết những người bị bệnh ung thư II tủy đều gắn thêm 2 phân tử đường trên chuồi nặng nhung thiêu hụt axit Sialic và k h ô n g có n hó m Glc NAc(3l Sụ' hiên đổi các chuồi đường này xáy ra ở protein Bence-Jone (BJP) bắt ngu ồn từ phân lử

I g G.

Nhu' vậy n hờ những biểu hiện của các kháng thể đơn d ò n g người la cùm:

có thê xét ngh iệm và theo dõi tình trạng bệnh ung thư và cũ n g có thè đ ó n u uóp cho việc phân biệt các loại bệnh ung thư khác nhau cũng như các bệnh tnivèn nhiễm khác

1.6 Các phưong pháp miễn dịch trong chấn đoán và tlìeo dõi UIIÍỊ thu.

Ị 6.1 Hhiứmạ/>//<//> /ìiỊỈnên cứu insitu:

Nuưừi ta sử dụ n g các phương pháp miễn dịch trong chấn đoá n và theo dõi ung thu' vì khá nàng phát hiện rất đặc hiệu và đo chính xác các dâu hiệu chI diêm ung thư (Tu m o rm a rk er ) của chúng Các phân lử dấu hiệu chỉ đi ểm mia thư cũng Ihường được cọi là các kháng nguyên ung thư vì chúng được nhận biêt ctãc hiệu bời kháng thế chố ng ung Ihư nhu' đã trình bày ở trên Tu y nhiên các kluíim

níiuyòn này nói chu ng không có khả nâng tạo ra đáp ứng miễn dịch ở bệnli nhãn

Vì vạy kh ôn g nên nham lần với các kháng nguyên ung thư đã mô tả trong phân1.4 Người la có thế tạo ra kháng thể đơn dò ng (hoặc đa dòng) c h ô n g lai cát- phan lử liên kết với khối II này đê có thê nhận biết sự xuất hiện cua khỏi II có nguồn gốc biểu mô hay có nguồn trung mò Các dấu hiệu biệt hóa liên kẽi với các khôi II có thc được pliáí hiện ở một số nhỏ các tế hào ỏ' một giai đo ạn chính xác cua MI hiệt hóa Vi dụ kháng nguyên CD 10 là một kháng nguyên ch m m cho ung thu' bạch cáu dạng nguyên bào lympho (CALLA: C o m m o n A c n k ’ lymphoblastic Lc uk em ia An(igen) tliirờng bộc iộ tiên các tế bào ức ( T h y m o ọ l c )

\ à tiên các tố bào B của tuv xương nhưng không biểu hiện ở các tế hào lympho máu ngoại vi Các phương pháp nghiên cứu m ô học và hóa miễn dịch mô được gọi là pluionu pháp nghiên cứu insitu, đã chứng minh rằng đa sô các khôi II cua người chứa một đ á m thăm nhiễm (iníiltrte) của các tê bào viêm cù n g vói các lô bào lympho các đại thực bào, đôi khi có cả các tế bào viền xẻ thùy, tế hào đa nhân và các tê bào mast

1.6 2 Phát hiện \'à (lịnh lưựiií> các chi (hèm ung thư (Tnm or u m rk crs).:

Các thành phán của một sô khối u được giái phóng trong tuần hoàn mau (huyết thanh và huyết tương) có thê được phái hiện và được định lượng bằn g mọt

sò phương pháp xét ngh iệm miễn dịch rất đặc hiệu và có độ nhạy cao Nhừnu chất chi điếm ung thư này có llìể là: các hooe môn nhu' HCG ỊMKXi Calxilonin ACTH, prolactin, có thế là các thành phán của các kh án g thò don

dò n g (mánh protein Bence Joiie), p2-microglobulin (một khôi chát cua II

m ye lo m a) , ư -ĩ et o protein (AFP) có xuất hiện trong ung thư biểu m ô tế bào gan ung thư phôi tinh hoàn Các kháng nguyên ung thư phôi CEA (Carc inom a

E m b r yo n Anligen), các kháng nguyên CA 19.9, CA50, CA 125 đều là sán phám cua các kiểu khối u khác nhau ở đường tiêu hóa như dạ dày, tụy, ống mật Kháim ngu y ên prostatic (PSA) là một chất chi điểm tốt nhất của ung thư tuyên tiền liệt, nêu được phát hiện sớm ở nồng độ tăng cao sẽ chẩn đoán sớm khá nâng xtiai hiện khối II tuyến tiền liệt và theo dõi sự chữa trị bằng hocmon

Đa số các dấu hiệu chi điểm ung thư có bản chất là các gi yco piotcin

c h ẳ n g hạn AFP CEA Vì vậy, người ta có thể sử dụng lectin một hoạt ch;ì! pho biên ờ th ế ai ới đô n g vAt, thưc vAt và vi sinh vât có khá năng liên kêt đ ăc hiên với các glycoprotein dể phát hiện các dấu hiệu chỉ điểm ting thư, bàng các phưoìm pháp miễn dịch liên kết đặc hiệu

2 ( ac ỉccíiìi dặc hiệu ỉiẽtì két vói các khátĩg thê và kháng nqnyén IIỈIÍ* lim:

Lectm theo Golstein ( l ()80) (lịnh nghĩa là những protein hoăc gly co p io ie m C(ó kha năn g ngưng kêt các lè b à o h ổn g cáu cùa độ n g vệt và tương tác đặc hiệu

v o i các loại đư ờng cun g như c ác h ợ p chất cộn g hợp với đường (glycocoiiju<\ìles)

Leclin dà dược Stiilmaik phát hiện lừ năm 1888, nh ư ng chỉ được nghiên cum m ạ n h mẽ từ những năm 5 0 cùa thê kỷ X X và ngày nay khá năng ung clung simh liọc.y học miễn dịch học của lectin ngày c à n g phát triển

Các lectin đã đuợc phát lìiện ả liÀu nỊnr tâ( cả các cơ thê đ ộ n g vật thực vât

vài VI s i n h vật, thẠm c h í c ó m ặ t ở c á c b à o q u a n q u a n t r ọ n g c ủ a n g ư ờ i nhu' màiiíT tê

b à t o , m à n g n h â n v à n h i ề u c ơ q u a n n ộ i l ạ n g q u n n t r ọ n < í k h á c n h ư t i m , ó c p h ô i ,

gam Tu y vây chức năng sinh học cùa các leetiiì cho đến nay, mặc du dà hièl lò kh;í nhiều, nhung cfing còn nhiều vân để đan g tranh ỉuận Mặc dù v ậ y Cik' ứng cỉụing cua ỉectin vẫn phái trièn và đ an g đua đến nhiều lợi ích (rong nghiên cứu SÌ! ìh h ọ c y h ọ c , l i o n g đ ó c ó n g h i ô n c ứ u u n g t h ư h ọ c

Các lectin được ứng d ụ n g nhiều trong y học và sinh học tnrớc liên là lcclin

từ nguồn gốc các cây họ dậu {Fabacea<>\ liếp theo đó là các câ y họ dâu lam { i \ íỉ <> i Ii('(’(fc’), họ tháu dâu hay ho ba mả n h vỏ {Eupììorhiaceae, T r ic o n eae) bới

VI khá năng luoìig tác đạc hiệu với các tô bào h ổn g cẩu thuộc các nh óm máu A

B o cùn người, kha năn g phản ứng chc hiệu vói các kháng lliể và kháng nguyên

cổ bân cliất glycoprotein, khả năn g kích thích phàn bào đặc hiệu và kìm hãm iiã\

d ộ c (lạc hiệu đối với bào quan riboxoni (RỈP)

2.1 n ặ c tính sinh học vâ r ũ v t dịch của Ịecíiỉt họ dậu:

Tr o n g so các lectin từ họt cùa các cAy họ clẠu, Coĩicanavalin A la lcclm (lược tóch và linh c h ế lừ cổy rtộu Cnnavalia en s ií o n n is , thường gọi tắt là Con A ciri c h o e nghiên cứu cấu tnìc hón học sAu sắc nhất và khá năn g ứng d ụ n g y học

c n.1 nó ch o đốn pay vãn dan g được khai thác m ạ n h mẽ nhai Vì thế, các chè

p h à m l c c t i n n à y d ã d ư ợ c t i nh c ỉ ^ ở m ứ c đ ộ s ạ c h rất c a o và d ư ợ c t h ư ơ n g m ạ i hói)

h ê n th ế giới, với piá trị cao r:hnpg hnn lg c h ế ph ẩm Con A cùa hãng S Ki M A

có độ sạch d ồn g nhấí trong 'liọ-ì di ::r.'S-PAGE, d ạ n g dông khô đã được bán voi giá I90USD

■ c.v.ìh đó, các Ịccíin ‘-Ỉ các cAy «b«.!Ộc chi Phaseolus, đ ặc biệt là lừ (lậu

ÍHận cỉò (rhtscohi.s v u ì ^ n s ) lỉ lườngÔIIỢC gọi là PHA (Phyto ỉỉacniaoo/unnnil iniỉiin 1,1

chai gây ngimg kết hổng cáu có nguồn gốc thực vật, đã được tinh chê lừ v;'n d ì t i r năm nay và dược thương mại hóa (lẽn thè giới, d ùn g làm chât kích thích phnn

h à o [ m i i o o c n ) đ i ê n h ì n h I t i y v ậ y c h í n h t r o n g h ạ t c ủ a c A y d ậ u I i ì i y I Ì I \ i h e o

nmiổn gốc giông trổng (Cullivar), nghĩa là sự phản loại ở mức dưới loài, leclin cùa ch ú n g có Ihê thê’ hiện ứ 5 loại I/.olectin khác nhau, với tý lệ khác nhau giống nhu kicti càu tnìc cua lzozym ỉaclatđehyđrogena/a (Rudiger el al, 1985) Một trong 5 loai l/olecíiiì dó là P HA -E 4 có khá năng liên kết chọn lọc, đặc hiệu với khánu nguyên AF P của khối II trong bệnh ung thư biểu mô tế bà o gan (HCC) Dua \ <1(1 lính chát liên kê! đặc hiệu cao này, Taketa và Cộng sự [32] dã nhiều năm imhièn cứu vổ ái lực liên kêt miền đích đặc hiệu giữa nhiều d ạn g A F P cùa một sổ díiiiu

un SI thu' ờ người, như ung thư biểu m ồ tế bào gan, ung thư noãn ho àn g và AFP

vòn sán có cùa bào thai của sán phụ bình thường C ùn g với các tác già trên, nlnéii nhà khoa học cũng đã chứng minh được tính khác biệt tinh vi trong cấu trúc đường cùa nhiều loại phân tử AFP có nguồn gốc khác nhau có ánh hườn SI đèn ái lực liên kết của chúng đôi với các loại lectin khác nhau [31] [32] Nho những phát minh ỏ' trên, Taketa và Cộng sự [32] đã đưa ra mộ t khái niệm vé dâu hiệu chi điểm ung thư AFP-lectin nghĩa là dấu hiệu A F P ái lực với lectin phán biệt với A F P không có ái lực với lectin

2.2 Đặc điểm cáu trúc của A F P và ái lực liên k ết A F P -lectiìi.

Đến đây, chúng ta cán tìm hiếu đặc tính của AFP AFP (Alphafoetoprolein) là mọt glycoprotein, có khối lượng phân tủ'70kDa, chứa 4% cacb ohy dr at liên kèt với phán protein qu a một gốc Asparagin (Asn) Đáy là kiểu liên kết N-glycozil cun phân

tử AFP Lán đắu tiên vào năm 1944, Pedersen K đã tìm thấy trong huyết Ihanh bào thai bé' một loại glycoprotein đirợc gọi là protein thai Foetuin Sau này vào năm 1956, Bergstranđ C.G và Cộng sự [20] đã phát hiện ra m ộ t glycoprotein m<í'i tương tự Foefnin nh ung là Alpha l-globulin ở huyết thanh bà o thai người, nhiriiu không có trong huyết thanh người trưởng thành, ở các loài đ ộ n g vật có vú khác, người ta cũng tìm thấy các phân tử Alpha Feto-protein trong huyết Ihanh hào ihni tương tự nhu' người Nhu' vậy A F P có thể coi là dạn g protein huyết thanh hào lh;ii phổ biến ở động vật có vú, không có mặt ỏ' huyết thanh cá thể trưởng thành Tuy nhiên, một phát hiện quan trọng của Abelev và Cộng sự I 16] là AF P có mội o' huyết thanh chuột trưởng thành bị ung thu' gan trong thực ng hiệm Tiếp llico Tatarinov YS và Cộng sự [33] đã tìm thấy AFP ở ung thu' biếu m ô lê bào gan (HCC) Từ dó nhiều nhà khoa học dã đi sâu nghiên cứu bán chất hóa học và sư biểu hiện cùa dâu hiệu chi điểm ung thư AFP này ở bệnh ung thư biếu m ỏ tè hào gan (HCC) và ỏ' các bệnh lý khác của người

Các kết quả nghiên cứu về AFP cho biết: AFP di c h u y ê n nhanh ở vùng ơ khi điện di trên giấy và tiên tâm thạch agar-agar, ngay bên canh phân tủ' Albumin huyết thanh Điếm dâng diện của AFP là 4,5 4- 5,2 Hệ sô tắt đặc tnrng cùa dung dịch

/ \ [ ;p 1% với chiêu dày lem ớ bước sóng 278mm là <'"'=5,3, thời gian hán huy lừ 3 ttèn 5 ngày (AlịXírl E 1985 116]).

AF P trong huyèí thanh của phụ nữ có (hai tăng lên nh an h ch ó n g vào Ihiinii thứ 2 và thứ 3 (từ tuần thứ 12 - 14) và đạt cực đai trong các tháng tiếp theo Đãc biệt là ờ dây rốn cùa trẻ sơ sinh, hàm lượng AFP có thể đạt lới I0.(XX) -

l(.X).(XX)mg/lít và sẽ giám ngay lập (ức dưới I Oị.un/1 san khi sinh 10 tháng

AFP cluợc tổng hợp ở nhu m ô của gan HC C và ở gan bào thai khá tiiống nhau về câu trúc hóa học cũng như đặc tính phản ứng m iễn dịch ([Alpcrl H

19 8 5 1[ 16])

Nống độ A F P có thể thay đổi trong các trường hợp bệnh lí khác cùa gan như các bệnh viêm ga n mạn tính, cấp tính do siêu vi trùng HBV, HCV Hàm lượng A F P lớn hơn 20j.tm/l (nghĩa là 20ng/Kt/có thê được coi là d ư ơng tính đối với các bệnh nhân viêm gan cấp tính, viêm gan mãn tính, xơ gan và chiếm ly lệ tương ứng là 31%, 15% và I 1% Hàm lượng AFP huyết thanh củ a bệnh viêm gan mãn tính (Chronic hepatiíies) rất hiếm khi vượt quá 500ng/ml Tu y nhiên, (rong

V vãn đã có 1 úc liêu trường hợp cá biệt đạt lới 1000-^3000ng/ml, thậm chí có khi

là 7 l 9 0 n g / m l (Taketa và Cộng sự [32J), nhưng vẫn không thấy xuất hiện ung thư gan ờ bệnh nhân này A F P huyết thanh của bệnh nhân viêm gan thường liinu lừ

từ hoặc có thế tăng nhanh đổng thời với một số enz ym transnminnza, ch ẳnu han Cilutamal oxaloacetat T ra ns am in aza và Glutamal pymval limisaminazn cún hiiNòi (hanh (ký hiệu tương ứng là SGOT, SGPT) Sự xuất hiện A F P íăng dột ngộ! irdiiii bệnh viêm gan cấp thường liên quan đến sự tổn thương các tế bào gan ciần đèn húy hoại tè bào gan, được phán ánh rất rõ bằng sự tăng lên m ạ n h m ẽ hoạt dộ ng của các transaminaza Nồng độ AF P huyết thanh cũng tăng m ạ n h trong các bênh ung thư gan thứ phát và ung thư ngoài gan Đối với ung thư dạ dày, ung thu' tuy

và ung thư gan thứ phát, tý lệ A F P dương tính tương ứng với các bệnh đã nêu là18%, 23 % và 8,6% 0 bệnh ung thư túi noãn hoàng của người ( hu m a n yolk sac Tutnor) người ta c ũ n g tìm thấy sư tăng lên nồng độ A F P huyết thanh Tất c;i những phân tích ỏ' trên đều cho thấy, không thê dựa vào sự tăng lên về nóim ctộ

A F P đê phân biệt các bện h lí khác nhau ở người, đặc biệt là kh ô n g thê phíìn biẹi giữa bệnh ung thư biêu m ô tế bào gan với các bệnh viêm gan và các bọnh mm thu khác Vì lẽ đó, căn cứ vào ái lực liên kết hóa học giữa các d ạ n g A F P bệnh li với các lectin khác nhau để phAn biệt các loại AF P bệnh lí khác nhau Bán chai của cơ c h ế liên kết ái lực AFP-lectin được quy định bằng sự khác nhau cua cáu trúc đường tiên các kiểu phân từ AFP

/• 1

Từ nam 1980, yoshđn và Cộng sự đã đưa ra cấu trúc (lường cua AFT cỉi;i

bệnh nhân n c c Cấu trúc đường cùa AF P bệnh HC C đã đirực so sánli với câu Irúc cĩirò'ii«i của AF P trong bênh 1111« thu' lúi noãn hoàng do Y a m a s h i ta K và Cónu

sự lìm ra năm 1983 [31,32] có sự khác nhau?èhí m gôc đư ờn g Glc N A e / T m n ũ khi đó câu trúc đường của AFP của bệnh nhan viêm gan m ãn tính do Takcla YÌt

Cộng sự lìm ra [32] hoàn toàn không chứa gốc Fucoza và Glc NAc, nhưng lại có

thêm 2 gốc Neu Ac

Sau đáy là câu trúc đường của 3 loại A F P k h á c nhau:

N c u A c a 2 —>6Cìiil(ĩ 1 —> 4 G l c N A c ị 3 1 —>2Man ơ.l

Câ u trúc đường của AM* bệnh gan m ăn tính

Dựa trên những nghiên cứu về cấu trúc phân tử A F P người ở những bệnh

lý khác nhau và dựa trên kết quả nghiên cứu ái lực củ a A F P với nhữn g leclin

khác nhau, các tác già (30,32) đà cho biết:

- Phân tử A F P ỏ' UT BM TBG (hình 1) ngoài cấu trúc ch ung , còn có mặt cùa nh ó m Pucose ( F u c a i —> 6) và nhóm này đóng vai trò q uyế t định ái lực của

A F P với lcctin, mà nó được thể hiện bằng dải AFP-L3

Phân íử AFP ờ UT N H , llìi Cấu trúc phàn tử giống như phân lử AFI’ o'

UT BM TB G , nhưng có thêin N- Acetylglucosamina (CilcNAc) và nhóm nà\ có ái

lực (rung gian với AFP, mà I1Ó thè hiện bằng dái AFP-L2

- P h í m t ứ A F I ’ ở b ệ n h g a n m ạ n t í n h thì k h ô n g c ó m ặ t c ủ a n h ó m P u c o s e và nhóm N- Ac et y lg lu co sa m in e nhưng lại có thêm hai pliủn tử Nen Ac Do váv no

klìóng có ;íi lực với lectin và được thê hiện bằng dái A F P - L I

Su' có mặt và sự thay đối các thành phân caibohydrate, mà cụ thó là su

(ha\ dổi các nhó m Fncose và N- Ace tylglucosamine có trong chuỗi đườnu cu;i

A P I ’ sẽ quyèí định lới ái lực của nó với leclin 0 những tình trạng bệnh gan khác

n h a u sự chu y ến biến từ bệnh gan lành tính (ví dụ: như viêm gan mạn) sang bệnh

gan ác tính (U TB MT BG ) có liên quan chặt chẽ tới biến đổi cấu trúc phán tử AFP

và có ánh hưởng tới ái lực của A F P với lectin Do vậy, đây là cơ sở đế chắn đoán

phân biệt giữa UTBMT BG với các bệnh gan mạn tính, thông qua cấu trúc phân

lư của A F P bằng các kỹ thuật điện di ái lực lectin và chu yển tham miễn dịch

kháng thể [32]

2.J D anh ph áp của AI' I* liên kết vói lecliii,

Do có nhiều lectin được ứng dụ ng trong điện di, vì vậy hệ llìónu đanh

pháp (cách trọi lên) của AF P liên kết với những lectin được viết dưới nhiêu tlạng

khác nhau, lùy thuộc vào cách đặt lên và cách gọi tên của từng tác giá [ 3 2 ,3 3 1

Tu y nhiên Taketa K và Cộng sự [32] đã đưa ra hệ thống danh pháp hợp lý

và dấy dù nhất Hệ thống danh pháp này có thể sử dụng cho tát cà các loại leclin

và kh ô n g phụ thuộc vào sô lượng của các dải AFP (heo lectin Có thể tóm lãl như

sau: Các dài chính của ÀFP được đánh số liên tục theo số nguyên dương và số

dấu tiên của dài bao gi ò 'c ũn g là sô I Hậu tố tiếp nối với A F P là lectin được viết

b ã n s ch ữ sô in hoa và lấy chữ đầu tiên Ví dụ: khi điện di AFP với concavalin A

(Con A), kết quả cuối cùng sẽ phân tách được 2 dải: AFP-CI và AFP-C2 tron”

đó: c là chữ đau cùa concavalin A

Tuy nhiên, trong một sô trường hợp có một sô dái trung gian.Ví du: (J;ii

(rung gian giữa AFP -L2 và AFP-L3 thì được diễn tá bằng: AFP-L2-3 Sau dâ\ 1.1

các dài (band) của AF P ái lực với các loại lectin đã được phân loại theo hệ ihõnu

d an h pháp Taketa K và Cộng sự [32]

C Á C DAI A M ’ ẢI L ự c VỚI C Á C L O Ạ I L E C T I N Các (lái (banđ) của AM* với lectin Lectin (iìing tronỊí điện (li

2.4 M ột sỏ dặc diêm leclin các loài mít được dùng cho y học - miễn dich

Tro ng hai thập kỷ 80 và 90 của thê ky này nhiều c ô n g trình khoa học nghiên cứu vổ lectin các loài mít thuộc chi mít (Artocarpus) được thực hiện theo l-iai hnó ng cơ bàn: nghiên cứu cấu trúc phân tử và ngh iên cứu đặc tính miền dịch cùa lectin

Từ năm 1988 sau khi phát hiện những giá trị lo lớn của iectin các loài mít [rong việc ngăn chặn bệnh AIDS và nghiên cứu k h á n g thê trong huyết lh.mil người, nhiều công trình n g h i ê n cứu về lectin mít được c ô n g bỗ: Hagiw;n;i (1988), Pineau và Cộng sự (1989), Aucouturie và C ộ n g sự (1990), Brugier và Cộng sự (1990), Nicolas và Cộng sự (1993), Corbea u và C ộ n g sự (1994), Đỗ Ngọc Liên, Johan Hoebeke, Briliard và Cộng sự (1993, 1995, 1996) Các công tlình khoa học này đều tập trung nghiên cứu sáu cấu trúc bộc nhất và câu 1 rúc khô ng gian của phân tử lectin mít có nguồn gốc từ châu Phi và Nam Mỹ (Bra/.in), và Việt Nam

The o thứ tự thời gian, những vân đề về cấu trúc phàn tử lectin các loài mít chi Aitocarpus dã dần dần được sáng tỏ và được đ ôn g đá o các nhà khoa học llnìa nhận

Những nghiên cứu về đặc tính cấu trúc phân tử và mi ễn dịch học của lcclin mít cùa Viộl Nam, có nguồn gốc Đô ng Nam châu Á (Jarette, 1959) chI mới bál dắn từ những năm 1991-1992 Khi đó, Đ ỗ Ngọc Liên và các đ ồ n g tác già IILIIIÓI Pháp [22,23,24,25] đã tiến hành tách tinh c h ế và so sánh câu trúc phân tử (lình lu' sãp xốp đau N của các lectin từ 3 loài mít của Việt Na m là mít mật, mít to mì

Á t' (t I ụ ị' luỷilll í }

ị/\.ch(/in/>('<I('n) và (A.toììkinrsis) trồng lại iniền Bắc Việt Nam Kết quá nghiên

cứu ch o thấy giông như các tác già của Canada Young N.M và Cộng sự ( l ()()l ) phàn lích trôn lcctin của mít Bra/.in, lectin mít ciia Việt Nam cũng bao gố m 2 chuồi polypeptit là chuồi (X gồm 133 axit am in và chuỗi Ịì gồm 20-21 axil ;nnin Tuy n h i ê n (r ìn h l ự s ã p x ế p c á c axit a m i n t r o n g c h u ỗ i p o l y p e p t i t c ủ a chuỗi u c o một sô sai khác từ 5 đến 7 gốc axit amin và ở chuỗi p có 3 đến 4 gốc axit am in sai khác nhau Trong năm 1994 Đ ỗ Ngọc Liên và Cộng sự [24,25] cũng đã tièp tục phân tích trình tự đầu N của 2 chuỗi polypeptit a và p ở 2 loài mít dại cua Việt N am là A.masticatn, A.asperulus Tiếp theo đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu một sô đặc tính hóa sinh miễn dịch, đặc biệt là khả năng tương tác dặc hiệu cua các lectin này đối với các dòng kháng thê đơn dòng và đa dòng IgA lgD Kôl quà ch o thây các lectin của một sô loài mít của Việt Nam có kha nang liên kết đặc hiệu chủ yếu với ỉ g A I , một sô loại lectin liên kết với IgAI và IgD Iiliuim không liên kết với IgA2, IgE, IgM Rõ ràng là nhờ những nghiên cứu co ban sáu săc, các ứng dụng y học và miễn dịch của lectin mít đã đạt được nhũ ng kêl qu;t

có ý nghTa khoa học và thực tiễn cao

II N í ỉ U Y Ê N L I Ê U VẢ P H Ư Ơ N G P H Á P N ( Ỉ H I Í ; N c ứ u

l N(; UYÊN LIỆU

1.1 l l o dâu tăm (Moraeeae)

Chi mít (Arlocarpus) thuộc họ dâu tằm (Moraceae), có tlèn 50 loài Theo larrctt (1959) chi mít có nguồn gốc lừ An Độ và Đô n g Nam Á ' sau c'() nh.inli chóim có mật ỏ' Cháu Phi Mít được nhập vào Brazin, Bổ Đào Nha vào giữa thô k\ 17 Các loài mít đều có đặc điểm ch u n g là loại cảy lâu năm, thân gồ, hoa mọc thành cụm tlên cành quả phức nhiều múi, mỗi múi ứng với một hoa Mít Ihuộc lớp hai lá m á m , hạt chứa nhiều chất d ự trữ Chú ng tôi đã chọn các loài míl ỉhi ngh iệm gốm: mít mật (Artocarpns heterophyllns),thay (Artocarpus t(>nkui(’\i.\)

míl dại (.Artocarpus masticata) và mít tô nữ {Artocưrpus champeden) Các loai

mít này được thu hái tại Hà Nội và các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Tây Nguyên Mầu được định loại theo Lecompt m ô lả (1910), Jaret.t (1959) và được Phạm

1 ỉoànu Hộ tổng kết [ 4 j

1.2 Họ đậu (Kabaceac)

Họ dậu (Fabaccae) là cây trồng thực phẩm rất quan trọng cua nước la

T h e o các tài liệu đã công bố họ đậu ở các tỉnh phía Bắc nước ta gồm có 58 chi với 209 loài nhưng được trồng phổ biên có 49 chi với 105 loài, trong đó hao uôm các loại đậu đỗ (Nguyễn Đãng Khỏi, 1989) Đặc biệt trong thử nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn hai loài đậu dại mọc trên rừng Yên Bái, Lao Cai, Ba Vì-Sơn T;ìv

Đ ó ià đậu kiêm hoặc đâu gươm (Canavalia gladiata) và đậu rựa (Canavalia ensiĩormis) Các mẫu đậu này đã được chu yê n gia về cây đậu đồ cua Việi Nam dịnh loại là tiên sT Nguyễn Đ ăn g Khôi

1.3 Huyết thanh ngưòỉ.

Huyết thanh người bình thường d o Viện Huyết học và Truyền máu lniim ương cun g cáp, được đảm bảo qua k h á m tuyển

Các bệnh nhân viêm gan siêu vi (rùng và bệnh nhân ung thư gan dược khoa Sinh hóa và khoa Nội tiêu hóa bệnh viện quân y 108 kh ám và kết luận là

m ắ c bệnh cấp tính Một số bệnh nhân m ắc bệnh là đôi tượng thí nghiệm cũng (lo khoa Ngoại tiêu hóa bệnh viện Việt Đức khám và kết luận là mắc bệnh Htivci thanh của các bệnh nhân viêm gan siêu vi trùng và bệnh nhân ung thư g;m tlo bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và bệnh viên K cung cấp

Độ tuổi những bệnh nhân là dôi tượng nghiên cứu trong độ tuổi lao dộng tù' 15-60 đôi với nam, từ 15-55 đối với nữ

í)c r (/"Ó C ^

10.000 vòng tròn phút) trên máy của Mỹ, lấy dịch trong bỏ cặn tua Mòi mầu chiết rút lectin được l ập lại 31À11

:|: Xac (lịnh hoạt (lô lecíin.

Hoai độ leclin dược gọi là hoạt độ ngưng kết h ồ n g cáu, viết la! là HAA (Hnemaggkit inating Activity) Hoạt độ HAA được xác định theo phương pháp Alecxancier A Kott trên bán nhựa đáy nhọn (microplates)

Mọt đơn vi hoạt độ lectin được tính là giá trị Iighich đ á o của độ pha loãng lớn nhát của chc phẩm lectin mà ở đó vẫn còn khá năng gây ngư ng kêt liồim cãu

Có hai chi số xác định hoạt độ lectin

HĐT S được tính theo công thức:

r 2"

HĐTS (dv H A A ) =

/'/

Trong đó V là thể tích dịch chiết của mẫu thí ng h iệm tính b ằn g f.il

n là sò giêng có hoại tính lecíin

H Đ R được tính theo côn g thức:

Bước I: Dựng đổ thị chuẩn (Dùng BSA pha với nồ n g độ nhất định đè

dự ng đồ thị), biêu diễn môi quan hệ giữa mật độ qu ang O D với h àm lượng BSA trong 1 ml dung dịch

Bước 2: Đo mẫu thí nghiệm trên m áy quang phổ k ế với bước sóng 62 0nm Bước 3: Dựa vào mật độ quartaOD tính h àm lượng protein lan có (rong

m ầ u thí nghiệm theo công thức:

B : là nồng độ pha loãng dung dịch

* Tinh chê lectiĩĩ từ các loài m ít và hai loài dậu.

Đối với các lectin mít chúng tôi đã sử dụng cột sắc ký ni lực Sepharose-

4 B - M n x i n đè tinh chế Cộl có chiều cao lOcm, đư ờng kính cột lem D ù n g ciuim

Iỉìn li ỉ : Ảnh chụp mẫu nguyên liệu đậu và mít đã được nghiên c ứ u

1 - Quà và hạt đậu rựa Canavalia ensiíoimis

2 - Quá mít dại (Aĩtocarpus masticata)

3 - Qua chay (Aitocnipus tonkinensis)

dịch a D-galactoza 0 , 5 M (hoặc Mety la- gai act ozi t) để đẩy i "tin ra khỏi cột ái

lực Mucinc-sepharo.se 4B

Đối với các lectin tư hai loài đâu Canavalia e n s ií o i m is và Canav;ili;i

glađiatn c h ú n g lói sử dụi CỘI sephanex G50 hoặc sephadex G 7 5 đè tinh chó

theo kỹ thuật cua G l o s le i n e l al (1976) nhuìig đã dược hoàn thiện và cái tiòiì I I I I

2.2 1 liiêt kê cột ái lực M u d n e - se p h a r o s e 4IỈ.

N guy ên liệu đ iề u chè cột ái lực ở trên là sepharose 4B m u a của hãng LKB

và BiCN cua hãng Proiabo Chúng tôi đã tiên hành điều chê cột Miicine-

s cph arose 4B theo phương pháp cùa March et alv (1989) và đã được hoàn thiện

như đã I11Ô t a trong tài liệu [22 23]

- Thiết lè các cột á lực công hợp lectin-Jacalin-Sepharose 4B và ConA hoặc Co n G -se p h ar os e 4B theo kỹ thuật của March et al (1989) và đã được hoàn

thiện Ị 14 22 23]

S ơ ĐỒ TINH CHÊ LECTIN B/\N(; s ắ c k ý Ải L ự c

2.3 Xét nghiệm IgAị huyết thanh bằng cột ái lực công hợp lectin-sepharose 4IỈ.

X ứ lý huyết thanh.

- Máu cùa người bình thường, người bệnh, để đô ng tự nhiên, tlui lấy dịch trong (màu vàng nhạt), đây là huyết thanh sử dụ ng trong ngh iên cứu IgA I

- Huyết thanh thu được pha loãng 5 lân băng đệm PBS pH7,4 Sau dó dùnịi (NH;),SO,, 4 1 % bão hòa để kết tủa protein troiìg du ng dịch huyêt thanh, ỏ' điỏu kiện 4"C Sau 30 phút, tiên hành li tâm lạnh với tốc độ 6 0 0 0 - 7 0 0 0 v ò n g trcn phúl thu phán kết tủa.

- Hoà tan kết lúa trong đệm PBS pH7,4 tới thể tích ban đáu T h â m tích (lung dịch protcin 4 lán qua đệm PBS trong 48 giờ ở nhiệt độ 4"C Sau dó lai li tàm trong lanh với 60 0 0 - 7 0 0 0 vòng/phúl Thu dịch trong Đ áy là dịch lên CỘI xét nuhiệm nồng độ lgA| của huyết thanh người bình thường và bệnh nhân

:|: Phán tícli ĩ gA/ cùa huyết thanh.

- Mầu huyết thanh cluiắn bị ỏ' trên đirợc cho qua cột hấp thụ ít nhất 10 lânlập lại

- Rửa cột loại bỏ protein không hấp phụ

- Giai hấp phụ băng d un g dịch M eth y la -g al ac to s id e 0,0 5 M

- Đ o nông độ protein IgAị ở bước sóng 280nm, tính toán n ồ n g độ IgA, theo đó thị tiêu chuẩn hoặc hệ sô tắt cùa IgA,

* Đ ánh giá mức độ tinh khiết của lgA| xét nghiệm b ằn g kỹ Ihuật diện di tròn gel polyacrylamit (SDS-PAGE), theo Laemmli

:i: Xác định bán chấl IgAị của huyết Ihanh bằng kỹ thuẠI XÓI imhiỌm

kh uy ếch tán kép miễn dịch Ouchlerlo Ịiy, với kháng ng uyê n lectin mít và kháng thế IgA, tiêu chuẩn của người

* Xél nghiệ m kháng thể IgA, từ huyết thanh người k ho ẻ và bệnh nhân ung thư gan, ung thư vòm họng bằng kỹ thuật miễn dịch ELISA đã hoàn thiện và cài biên nhu' đã m ô là [8, 23]

2.4 Xét ng hi ệm kh á n g ng uy ên chỉ điểm ung thư A F i \

Ch ú n g tôi dã sử dụng cột ConA -sepharose 4B (hoặc Con G -sepha ios e 4B) dế bát giữ miễn dịch A F P nhu' đã mò tá [ 14]

Các loại hóa chất được sử dụng trong các nghiên cứu có độ linh khiè! hó;i học, được mua cua các hãng SIGMA, BIORAD, LBK Thụy Đièn BDH-Engiancl

M áy điện di bán mỏ n g được mua của hãng Hoe íĩ er SaníYancisco (M ỹ) \ à cùa liãn« BIORAD.c

X : Giá trị trung bình của mẫu

X, : Giá trị của mẫu tại i

n : Sổ lượng cá thể của mẩu

X a : Giá trị trung bình cộng của mẫu A

X B ; Giá trị trung bình cộng của mẫu B

s c : Là phương sai chu ng của m ẫu A và m ẫu B

11A : Số lượng cá thể mẫu A

lìB : SỐ lượng cá thể mầu B

Giá trị của t so sánh với tcx tra từ bảng phân phối student với nA+nB-2 bậc

lự do T ừ dó xác đinh được mức độ tin cậy của hai giá trị trung bình cộng

- Nêu t>t«, hai giá trị trung bình khác nhau có ý nghĩa với mức ý nulìĩa <7

- Nèu t > t a , hai giá trị trung bình không khác nhau, kêt luận này Im t á \ thông kê ứ mức ý nghía a

III K Ế l Q U Ả VẢ T H Ả O L U Ậ N

I 1 inh ché leetin tu loai (lậu c cnsiíbrmis va ( ’ gladiatn

H ạ t c ù a hai loài d ậ u n à y đ ư ợ c b ó c vỏ lúc c ò n tươi , t h á i lát m ó n g n g h i ê n nhó trong cối cháy sứ với bột thuý tinh và dược chiết rút ít nhất ba lán lặp lai với đệm PBS pH 7,4 như đã được mô tá trước đây [12] Dịch nổi trong đirợc két lua báng 70% ( N H 4)2S 0 4, thẩm tích đôi với đệm và được h ấp phụ trên CỘI Sephađex G50, nhu' đã trình bày ỏ' sơ đồ trong phần phương pháp Sau khi phàn lìâp phulectin từ cột băng dung dịch PBS chứa 0,5M glucose, các phân đo ạn có hoạt línhngưng kết hổng câu được thu gom lai và thẩm tích nhiều lần trong đ ệ m PBS pl l7,4 Duna, dịch lectin dã tinh sạch làm đ ôn g khô và được đán h giá mức độ tinh khiết bằng kỹ thuật SDS - P A GE của Laemmli Kết qua kiểm tra điện di (SDS 1’AGE ) háu như chi cho một băng Prolein kh oáng 26-27 kDa

Kết qũa tinh ch ế lectin dược tóm tắt ỏ' báng I

Khi so sánh quá trình tinh chê 2 loại lectin từ hai loài đậu, c ùn g chi nàV.chún g tôi thây hiệu suất thu hồi dạt rất cao từ 80 - 9 4 % hoạt độ tổng số, với lí đo clon gián là quá trình tinh c h ế ngán gọn, chì qua 2 giai đoạn Đ iề u CỊiian Irọng là chê phẩm Con A và Con Ci tiều có độ tinh khiết tăng lên từ 10,4 đến i 1,5 lấn so với dịch chiết thô Các tính chất của hai loại lectin này đã được kiểm tra lại nhu

dã được mô tá trong các nghiên cứu tnrớc đây của c h ú n g tôi [12] Ch ú n g lỏi đã dùng các c h ế phâm này để thử nghiệm tóm bắt (Capture) ái lực m iễ n dịch dối với

AF P trong các bước nghiên cứu tiếp theo bằng cách điều c h ế chát c ộ n g hợp lcctin - Sepharose 4B

Hàng 1 TỎI 11 tắt kết quá tinh c h ế Con A và Con (ỉ tù Canava li a

ensỉíbrniis và Cana val ia gladiata.

1 ( a n a v a l i a e n s i t o r m i s

tổng số, mg

HĐTS đơn vi

H Đ Rđ/v m g Pi

Đ ộ sạch tăng

2 Tinh chẽ lectin lừ 3 loài mít khác nhau thuộc chi Artocarpus.

Qua nhiều năm nghiên cứu các qui trình tinh chê lectin lừ chi Artocarpus

chtìnu lỏi đã hoàn thiện một phương pháp linh c h ế lectin mít đon gián và chI cán

hai bước:

* Chiêt rút lcciin từ hạt của các loài mít bằng đệm sinh lý PBS pll 7.4 \.I két lua thu phân đ o ạ n ờ 6 5 % (NH.ị)2S 0 4 bão h o à

Sắc ký tiên cột ái lực Mucine sepharose 4B

Trước khi tinh chê lectin, chúng tôi đã tiên hành sàng lọc và lựa chọn cóc

loài m í t ờ V i ệ t N a m t h e o hai t iêu c h u ẩ n là: c ó h o ạ t t í nh n g ư n g k ê t h ổ n g c á u c a o

và có tính dặc hiệu bát giữ miễn dịch IgAị từ huyết thanh của người Nhu' liong

phán tốim quan tài liệu, ỏ' Việt Nam có khoáng gán 20 loài mit thuộc chi

■Artocarpus |4 | Tro n g 6 loài đã nghiên cứu, chúng tôi chọn đuợc 3 loài mít dại

các tiêu chuán yêu cáu Đ ó là các loài A heterophillus, A Champedcn A

masticata đã m ỏ ta ỏ' phán phương pháp nghiên cứu Sơ đồ tinh chê 3 loai leclin

mít đã hoàn thiện, được tóm tát sau:

S O Đ ổ T I N H C H Ê ẢI Lực L E C T I N M ÍT

Quá trinh tinh chê các loại lcctin Iiiít (.lacaiin) được trình bày ó ỉ>án^ 2.

HĐK đ/v nig Pr

Đ ộ sạch tăng

, D ung dịch qua cột (sau tủa (N H4)2S 0 4)

%100

là, sự thu hồi hoạt độ qua các lán tinh c h ế ái lực đều đạt tỷ lệ cao, từ 70 đến 80%

Các chê phẩm iectin sau khi được tinh chê qua cột ái lực đều được dông

khô ỏ' -40°c v ẫ n đ á m b ả o h oạt t í nh ngưng k ế t h ổ n g c ầ u v à t ư ơ n g tá c với k h á n g (hè lgA| từ huyết thanh của người Điều này đã được chứn g minh bán g các xét nghiệm miễn dịch Ouchtei lony

Các lectin sau khi linh c h ế đã được kiểm tra băng kỹ thuật SDS-PACiíỉ Kèt quá cho thấy, các chê phắm leclin mít hoàn toàn tinh khiết, chi có 2 baim protcin là 14 và 17 kDa như chúng tỏi đã tiến hành nghiên cứu trước đ â y [ 2 2 2 3 1-