Xử lí tín hiệu thời gian thực sử dụng TMS320C6416T DSK

Iron s khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi đã phân lập các chủno xạ khuẩn hiếm r đất runs nguvên sinh Trùng Khánh, Cao Bang, Nehiên cứu các đặc điểm hình thái, nh lý.. - Đã nghiên cứu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ộ ỉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ NHIÊN • • • •

'k'k'k'k'k'k'k'k'k

KHUẢN HIẾM PHÂN LẶP ò VIỆT NAM

MÃ SỐ: QT 07 -30

CHỦ T R Ì ĐẺ TÀ I: TS BÙI T H Ị V IỆ T HÀ CÁC CÁN B ộ T H A M GIA: Th.s Mai Đàm Linh

T h.s Phạm Đức Ngọc

HÀ NỘI - 2007

BÁO CÁO TÓM TẮT ĐÊ TÀI

Tên đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học cuả một số xạ khuân hiếm phân lập

ỏ Việt Nam

í Các cán bộ tham gia: Th.s Mai Đàm Linh

Th.s Phạm Đức Nççc

Xạ khuẩn hiếm (rare Actinomyces) là thuật ngữ chi các xạ khuẩn khônR thuộc chi 'treptomyces Mật độ xạ khuẩn hiếm trone tự nhiên ít hơn so với Streptomyces Vì

ậy, xạ khuẩn hiếm khó phân lập hơn và trước đây ít được quan tâm nshiên cứu hơn

liện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi Streptomvces, hơn 500 loài thuộc tất cả

ác chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm Tuy nhiên, ngày càns nhiều xạ huẩn hiếm được phát hiện nhờ các phương pháp phân lập đặc hiệu Hai phần ba số

háng sinh dùns trong y học là do xạ khuẩn sinh ra, chủ yếu thuộc chi Streptomyces

'uy nhiên, hiện nay tình trạng kháng thuốc trone các vi sinh vật aây bệnh ngày càns hát triển khiến cho các chất kháne sinh truyền thống không còn tác dụne nữa Điều

ày tạo ra nhu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là phải tìm ra các chất kháne sinh lới Vì vậy, xạ khuẩn hiếm trở thành nguồn sàne lọc chất kháng sinh mới có triển ọng nhất Neoài ra xạ khuẩn còn có khả nãns sinh nhiều chất hoạt độna sinh học hác như các loại vitamin, enzym, chất ức chế miễn dịch, hoocmon sinh trưởng Tuv hiên trong thời gian gần đây, tốc độ phát hiện các chất hoạt độne sinh học mới từ xạ huân giảm đi đáng kể Nhưng chúne ta tin rang việc tìm ra loài mới sẽ tăna khả năng

m kiếm các chất hoạt độne sinh học mới Trone khi đó Việt Nam đưọc đánh giá là lột trona các quốc gia có đa dạns sinh học cao nhất thế eiới Với khí hậu nóne ẩm rất luận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật nên Việt Nam có khu hệ vi sinh vậi rất hong phú Vì thế đa dạna xạ khuẩn hiếm ở Việt Nam rất đána được quan tâm nahiên

ứu và hứa hẹn nhữnơ đóns sóp mới cho khoa học.

Iron s khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi đã phân lập các chủno xạ khuẩn hiếm

r đất runs nguvên sinh Trùng Khánh, Cao Bang, Nehiên cứu các đặc điểm hình thái,

nh lý sinh hoá, hoá phân loại Phân tích trình tự ADNr 16S xây dựna câý phả hệ

Lia các chủns phân lập dược và nehiên cứu khả năns sinh hoạt chất sinh học: chất

háne sinh, enzvm

Các kết quả đạt đuọc

Iiúne tôi đã phân lập được 80 chủng, xạ khuẩn lổne, số Trona số các chúng phân lập irợc dựa vào đặc điểm tvp thành tế bào 43 chủng xạ khuẩn được xác định là xạ huân hiểm.

- Trong số 43 chủng xạ khuẩn hiếm thì tỷ lệ các chủng có hoạt tính kháng sinh là 81.1% Đây là một tỷ lệ khá cao so với các nghiên cứu trước 5 chủng xạ khuẩn trong

đó thể hiện khả năng đổi kháng với các vi khuẩn G(+) và vi nấm gây bệnh khá mạnh.

- Đã nghiên cứu khả năng sinh các enzym ngoại bào mạnh của 16 chủng xạ khuẩn hiếm Một đặc điểm dáng lưu ý là 16 chủng này đều có khả năng sinh cả 4 loại enzym ngoại bào với vòng phân hủy rất mạnh Đây là các chủng xạ khuẩn hiểm có nhiều đặc điểm quý nên cần được tiếp tục nghiên cứu để có thể ứng dụng trong thực tiễn.

- Đã nghiên cứu đặc điểm phân loại bằng sinh học phân tử của chủng xạ khuẩn

hiếm T K llb , chủng nàu có độ tương đồns, với chủng Micromonospora endolithica

Chi phí nghiệp vụ chuyên môn ( vật tư) :

Chi phí nghiệp thuê mướn:

f/Ut' ĩầ ' ty é M í

I Title: Study on biocharacteristics of rare-Streptomyces isolated in Vietnam.

I Project leader: Ph.D Bui Thi Viet Ha

Be Pham Due Ngoc

ị Aims and contents o f project:

Vietnam is a tropical country with hot and wet climate so microbial flora is /ery abundant Vietnam is recognized as one of the countries having the most biodiversity in t h e world Until now, we h a v e o n l y some researches o n Streptomvces, )ut rare Actinomycetes are not interested in It's something like an potential land for

;eeking new compounds and new species Recently, we have isolated many

ỉtreptomycete strains with antibiotic activities against many kind o f microorganisms:

>ram positive and gram negative bacteria, fungi and tumor cells Ratio o f antibiotic )roducinơ strains is very high, about 60 percent Moreover, typical actinomvcetes are

iivided into two groups; Streptomyces and non-Streptomyces (rare actinomycetes) ĩtreptomyces are the dominant bacteria in soil and this genus contains about 500 ipecies Rare Actinomycetes are divided into 50 genera which are including many

inpublished species, and are generally slow-growine and small colonv-forming Itrains.

In frame o f this project, we were

J-DNA16S o f some strains having bioactive compounds.

strains.

5 Obtained results

- From 20 soil samples Trung Khanh - Cao Bang, 80 strains o f Actynomvcetes

vere isolated Based on type o f peptidoglycan, 43 strains are determined rare- itreptomyces.

- T h e r a tio o f s t r a i n s h a v i n s a n t i b i o t i c a c ti v it y is 8 1 1 % T h i s is v e r y h i g h r a t i o

:ompared with former research Among them 5 strains are against stronslv bacteria G + ) and mold causing plant diseases.

- Investigated extracellular enzymes activities o f 16 strains These are such a

irecious rare-Streptomyces that is necessary to further research.

- Systematic characteristics ol’TK.] lb strain by using molecular biology methods

vere studied The similarities o f T K llb train with Micromonospora endolithica

U560635 are 99%.

- The optimal fermentation conditions were studied.

M u e lu e • » Trang

ặc điểm hệ sinh thái vùng T rù n g Khánh Cao Bằng 11

l Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 15

ì 2 Đặc điêm sinh /ý sinh hoá

L - — -— - - —

16

3 Các phuong pháp sinh học phân tử 17

3.1 Tách chiết A D N theo phư ơn g pháp của Saito Mura 17

3.3 Phân tích trìnlĩ tự A D N r 16S theo phương pháp của Sanger 2 0

H oạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn hiếm 24

K hả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng xạ khuẩn hiếm 25

N G H IÊ N C Ử U C Á C Đ Ặ C Đ IẺ M S IN H H Ọ C V À Đ Ậ C Đ IẺ M P H Â N

Bảng, hình Trang

g 1 Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes

ì 5 Khả năns đối kháng với các vi sinh vật kiểm định

Ị)t Số chủng xạ khuẩn hiếm

24

] 7 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S,

ìiện mối quan hệ siữa chủne xạ khuẩn TK11B và các đại diện có quan hệ

gũi thuộc chi Micromonospora

28

Ị 8 Anh hường của nhiệt độ đên khả năng hình thành CKS của chủrm

ì 9 Dộnc, thái của trình sinh trường và sinh tône, hợp CKS cùa chùnR

]b

33

M Ở Đ Ầ U

Côna nehệ sinh học ngày nay đang phát triển như vũ bão, đạt được những thành

to lớn và naày càng chứng tỏ vị thế quan trọne của mình trong nền kinh tế quốc dân Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển cùa vi sinh 'VSV) và đây được coi là một kho tàng vô siá về neuồn sen trong tự nhiên Với mục tìm kiếm những nguồn gen giá trị có khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học,

Ìg tôi đã t i ế n h à n h bước đầu nghiên cứu sự phân bố của các c h ủ n e xạ khuẩn hiếm

ị thời tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học (chất kháng sinh và các enzvm naoại

I từ các c h ủ n g này để góp p h ầ n cho nhừns, n s h i ê n cứu cơ bản và ứna dụng tiếp theo

hu hệ xạ khuẩn hiếm ở Việt Nam.

Việc định tên các loài xạ khuẩn trưóc đây chủ yếu theo phương pháp truyền thống trên một sổ hữu hạn các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, nên trons một số

ns hợp có thể gặp khó khăn vì v s v là những sinh vật rất dễ bị biến dị, do đó dễ đi các kết luận thiếu chính xác Ngày nay, bên cạnh phương pháp phân loại truyền g, phương pháp phân loại phân tử dựa trên việc phân tích trình tự gen mã hoá ARN Kom 16S đã được các nhà khoa học trên thế giới sử dụng phổ biến cho kết quả nhanh

ền thốna Đối với nhữne chủng có ý nehĩa trong nghiên cứu và thực tiễn thì điều này àng được củne cố thêm bởi các đặc điểm truyền thốna.

Việc phân loại chính xác các chủne xạ khuẩn đến tên loài sẽ tạo cơ sỏ' khoa học việc tuyển chọn định hướns các chủna xạ khuẩn trone nahiên cứu rút nsắn thời eian ône sức.

Xạ khuẩn hiếm là nhóm xạ khuẩn ít được quan tâm nehiên cứu trona, nước (trừ

số nahiên cứu đã được tiến hành ở nước neoài) do đó trong phần này chúna tôi trình một số nshiên cứu về khu hệ xạ khuẩn hiếm được phân lập tại Trùnơ Khánh Cao 0

Ạ KHUẨN

Xạ khuẩn và sự phân bổ của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộno rãi và đónẹ vai trò quan trọng

a tự nhiên Chúna tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá hợp chất trone đất,

29.000-0.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45 % tổng số vi sinh vật Nhữns đặc tính quan trọne

của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất

hả năne sinh chất kháng sinh.

N h ữ n g khái niệm CO’ bản về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn G(+), đặc biệt khác với vi sinh vật nhân sơ

j tỷ lệ G + x cao (>70 %) , trong khi đó ở vi khuẩn là 25- 45 %, đựoc phân biệt với

vi sinh vật khác bởi 2 đặc điểm cơ bản.

Có khoảng 17.000 chất kháng sinh được phát hiện từ vi sinh vật trona đó 2/3 là do

huẩn sinh ra và chủ yếu là thuộc chi Streptomyces Theo quan điểm sinh thái học thì

huẩn đón2 vai trò quan trọng trons, chu trình phân hủy các chất và có thể sử dụng hữu cơ khó phân giải là axit humic.

Gần đây, xạ khuẩn (Actinomycetes) được xác định thuộc bộ Actinomycetales dựa trình tự ADNr 16S Taxon này có khoảns 100 chi với 1.000 loài Một nửa trong số chi này thuộc vi khuẩn điển hình như dạna cầu dạna que khône tạo thành khuẩn ty

Xạ khuẩn không điển hình thuộc bộ Actinomycetales gồm: Micrococcus, irobacter, Mycobacterium, Propionibacterium khônẹ s in h ra chất khánạ sinh )1H dạng vòng, kích thước 3-4 Mbp.

Streptomyces và xạ khuẩn hiếm

Xạ khuẩn điển hình được phân chia thành 2 nhóm: Streptomyces và xạ khuẩn

Xạ khuẩn hiếm lại được chia thành hơn 50 chi khác nhau và sồm nhiều loài chưa

ị bố, chúng thườne sinh trường chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ, thường khó bảo quản uôi cấy tron® môi trường dịch thể Trong khi đó, Streptomyces lại rất thuận tiện cho

p diaminopimelic acid, Alanin và glutamic đều có mặt ờ +

Glyxin là amino axit duy nhất không chứa carbon đối xứns tronc phàn tử của húng Do đó elvcin khône có cấu hình dans D hay L.

* Trong họ Micromonospora thì L-alanin tại vị trí sổ 1 của phần pcptit đòi thành ịlyxin ( tức là loại mất nhóm -C H3)

** Trone nhóm xạ khuân có chứa axit mycolic như Norcadia và Mycobacterium, thì

hành tể bào có chứa arabinogalactan (cấu tạo bởi arabinoza và galactoza)

Theo Lechevalier và Lechevalier, 1967, dựa vào 5000 chủng phân lập từ 16 mẫu

dã chia ra khu hệ xạ khuẩn trong đất như sau: Chi Streptomvces chiếm 95.43%, chi

cadia chiêm 1,98%, M icromonospora chiếm 1.4% Thermomonospora 0.22%, noplanes 0,2%, Microbispora 0,18%, Streptosporangium 0.1%, Actinomadura 0,1%.

Năm 1970, Lechevalier và Lechevalier đã đưa ra tiêu chuẩn phân chia thành tế bào

xạ khuẩn điển hình ra làm 4 typ Vào những năm 1980, cấu trúc hóa học của ydoalycan đã được làm sáng tỏ và typ thành tế bào lại được xác nhận lại lần nữa.

ì Thành tế bào íyp I

Có chứa LL-DAP và glyxin Đại diện của typ này là chi Streptomvces có khoảng loài Streptomyces là chi lớn nhất Hầu hết các chủns thuộc chi này đều sinh trưởng

ìh tạo thành khuẩn ty khí sinh và tạo bào tử Chúna sinh ra nhiều chất kháns sinh

12 chu trình sốne của xạ khuẩn, chúng thể hiện sự biệt hóa về hình dạng rất phức tạp

? Thành tế bào typ II

Chứa meso-DAP, glycin và axit N-glycolyl muramic Một số chủne thuộc họ này hứa 3 ’ OH-meso-DAP Hầu hết các chi này thuộc họ Micromonosporaceae Họ này

các đại diện: Micromonospora, Actinoplones, Dactylosporangium, Catenulopỉanes

n thay thế DAP) Hầu hết các chủns thuộc họ này đều khôna tạo khuẩn ty khí sinh,

sổ chủns tạo thành nang bào tử và bào tử động.

-Tliành tế bào typ III

Chứa meso-DAP Loại này aồm rất nhiều họ như Streplosporansiaceae

donocardiaceae Xạ khuẩn có dạne mcso-DAP và tạo thành khuân ty khí sinh thườne,

ns dễ dàng xá định được Họ này được phân biệt với các họ khác nhờ thành phần

ng trone toàn bộ tế bảo.

4 Thành tế bào typ IV

Chứa meso-DAP, arabinoza và galactoza Những vi khuẩn thuộc nhóm này gồm:

'obacterium, Nocardia, Gordonia và Rhodococcus Chúng đều có axit mycolic,

'inogalactan và axit N-gỉycolyl muramic trone thành tế bào Một số loài gây bệnh

i ho gà về hình dạng thì thường hình que hoặc đa hình, có dạne sợi đơn giản hoặc

u thế tạo thành các mành nhỏ hình que.

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

> Khuẩn lạc

Khác với các vi sinh vật khác, khuẩn lạc xạ khuẩn thườne chắc, xù xì có dạna da,

ị vôi, dạne, nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc có ba lớp: lớp vỏ ngoài có dạng

3ện chặt, lóp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi

có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như:

ỉ, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế

xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trườne lên men Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sấc : nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại

t Các loài xạ khuẩn có thể tạo các loại sắc hoà tố tan trong môi trường nuôi cấy

na sinh Irưởna của khuẩn ty vào phía trona hoặc ra naoài mặt môi trường tạo thành

in ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh của khuẩn lạc xạ khuẩn Khuẩn ty khí sinh phát

ra nsoài khôna khí, thườna phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuốna sinh bào

> Khuẩn ty

Khuẩn tv của xạ khuẩn trôna siổna hệ sợi của vi nấm, phân nhánh và khône có

I ngăn Xạ khuân phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh, khoảng 30fim một

ih Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trons eiai đoạn phát triển là 1 l|im , “nhân" tế bào xạ

in phát triển đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty Do vậy, mỗi đoạn khuân ty hoặc bào tử xạ khuẩn Gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên sau l-2h xuất hiện quá trình hợp ADN nhân các cen cần thiết từ genom và tiến hành tổns họp protein Cứ như khuẩn ty hình thành và phát íriên.

Xạ khuẩn thuộc nhóm cơ thể dị dưỡne, thường sử dụng neuồn cacbon như đường, bột rượu, axil hữu cơ polysacarit Nauon nitơ vô cơ thirờnu là nitrat, muối amon.

311 nitơ hữu cơ là: pepton, protein, cao ngô, cao nấm men Khả năng đồng hóa các

0' các loài xạ khuẩn khác nhau là khác nhau Phần lớn chúng ưa khí, ưa ẩm, phát tốt ở môi trường trunẹ tính hoặc hơi kiềm.

> Cấu trúc tế bào

khoảns 60-120A0, khi già có thể là 150A°; lóp giữa rắn và chấc hơn dày khoảns

°, lớp trone dày 50A° được cấu tạo chủ yếu từ các lớp elycopeptit gồm các sốc N- vlslucozamin (NAG) liên kết với các axit N-axetylmuramic (NAM) bởi các liên kết

[- glycozit Khi xử lý bàng lizozim các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá hủy

ại màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào eọi là thể sinh chất :oplast) Màng tế bào xạ khuẩn chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi

và quá trình vận chuyển chất qua màng.

Màna sinh chất của xạ khuẩn chủ yếu bao gồm hai thành phần là photpholipit và ĩin Một trons những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về

di truyền và thường xảy ra sự tái sắp xếp lại các phần tử ADN Điều này gây ra một

ện tượng lạ như : tạo ra tính đa hình thái, tính kháng thuốc Hơn nữa, sự tự nhân lên :ác đoạn ADN còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền của xạ khuẩn.

> Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Hình thái, cuốns, sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọna nhất trona phân

Kạ khuẩn Cuốna sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóns (RF), dạns

iò so (S), chuồi bào từ khôns phát triển hoặc xoắn đơn giản, có hình móc câu (RA),

tử hình thành đồns thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai cách: kết hay cất khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhằn hoặc xù xì, có sai eai phát triển dài thành dạna lông Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường ciầu dinh dưỡng

hi quá trình sinh bào tử thườne, bị kìm hãm Trons nhiều trườna hợp khi kích thích

nh thành bào tử hiệu suất sinh tông hợp CKS RÍảm đi.

Mặc dù xạ khuẩn có hình thái aần eũi với vi khuẩn thật về một mặt nào đó và về mặt khác thì lại eiốnc nấm nhưng neười ta vẫn chẳng nghi neờ gì khi đặt chúne vào phân nhánh dòns, vi khuẩn Trong quyển hệ thống vi khuẩn học Bergey's 1989,

fi ta dã thực hiện một phân loại trên loài với xạ khuẩn dựa trên cơ sỏ' so sánh rRNA phương pháp cüa Woese và cộne sự ).

Tuy nhiên ngay đầu tiên phần lớn xạ khuân được nẹười ta xác định đặc điếm và

loài và kiểu hình đôi khi cũng gây lúng túns, cho các nhà nghiên cứu Bất chấp sự : biệt lớn về nhữne dấu vết di truyền, rõ ràng là hình thái học của chúng rất eiống với

I bậc cao Nhiều xạ khuẩn hình thành bào tử đốt, khuẩn ty cơ chất (sinh dườna) và

ẩn ty khí sinh, conidi, bào tử nang (sporangiospore) eiống như ờ nấm bậc cao.

Đặc điểm của xạ khuẩn hiếm

Xạ khuẩn hiếm (rare Streptomyces) là thuật ngữ chỉ các xạ khuẩn khôna thuộc chi ptomvces Mật độ xạ khuẩn hiếm trong tự nhiên ít hơn so với Streptomyces Vì vậy,

±uẩn hiếm khó phân lập hơn và trước đây ít được quan tâm nghiên cứu hơn Xạ

In thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales 10 phụ, 35 họ, 110 chi và 1000

Hiện nay, 478 loài đã được công bổ thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc

ả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm Tuy nhiên, ngày càng nhiều huẩn hiếm được phát hiện nhờ các phương pháp phân lập đặc hiệu như phương pháp (Rehydration and Centrifugation) và các môi trường đặc hiệu như môi trườne HV mic acid- Vitamin) Hai phần ba sổ kháng sinh dùng trong y học là do xạ khuẩn sinh

hủ yếu thuộc chi Streptomyces Tuy nhiên, hiện nay tình trạng kháng thuốc trong các

ính vật gây bệnh ngày càng phát triển khiến cho các chất kháng sinh truyền thống

1 2, còn tác dụne nữa Điều này tạo ra nhu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là phải

ra các chất kháng sinh mới Vì đã được nghiên cứu kỹ lường nên khả năne tìm được

chất khána sinh mới từ Streptomyces là rất hiếm Vì vậy, xạ khuẩn hiếm trở thành

311 sàne lọc chất kháne sinh mới có triển vọng nhất Nsoài ra xạ khuẩn còn có khả

Ị sinh nhiều chất hoạt động sinh học khác như các loại vitamin, enzym, chất ức chế

1 dịch, hoocmon sinh trưởng Tuy nhiên trong thời aian 2ần đây, tốc độ phát hiện các hoạt đ ộ n s sinh học mới từ xạ khuẩn eiảm đi đáne kể Nhưng chúna ta tin rằns việc

ra loài mới sẽ tăns khả năng tìm kiếm các chât hoạt động sinh học mới Trone khi đó nam đưọc đánh giá là một trons các quốc 2.ia có đa dạne sinh học cao nhấl thế giới, khí hậu nóne ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật nên Việt Nam có khu

i sinh vật rất phone phú Vì thế đa dạns xạ khuẩn h i ế m ở Việt Nam rất đáng được

ên cứu xạ khuẩn hiếm là một miền đất trổng chưa dược khai phá Trừ một vài loài

c chi Micromonospora còn lại tất cả các chi còn lại cho đến nay chưa có ai nghiên

Đây chính là neuồn tài nguyên vô cùng giá trị bị bỏ quên.

Năm 1959, theo Pridham, đã có hơn 100 chi và 1500 dưới chi, loài và dưó'i loài,

ne theo Waksman các đặc điêm hình thái đónạ vai trò quan trọns nhất trong phân

ở mức độ chi Nhưng cho đến nay, có rất nhiều công cụ đáne tin cậy để phân loại xạ

m hiếm đến mức độ loài như trình tự ADNr 16S, lai ADN, tiêu chuẩn hình thái, hoá

1 loại, sinh lý sinh hoá Vì thế, số lượng chi và loài vẫn đang tăng dần Tuy nhiên, có

t các nghiên cứu được công bố về đa dạng sinh học của xạ khuẩn hiếm ở vùns nhiệt Wang và cộng sự cônR bố về đa dạng xạ khuẩn ở các khu rừng nhiệt đới thuộc

;apore Các nhà khoa học đã xác định được 36 chi sau khi phân loại 5000 chủng phân ỉược Neoài ra, đại diện chi mới cũng được tìm thấy Gần đây Muramatsu và cộne sự hành nehiên cứu so sánh đa dạng sinh học của xạ khuẩn ở vùng nhiệt đới và ôn đới nhà khoa học đã phân loại được 790 chủns từ Malaysia và 981 chủng từ Nhật Bản ehủne từ Nhật Bản thuộc về 9 họ, 22 chi và 207 loài Chỉ 14% số chi và 50% số loài

Ìg tỏ đa dạng xạ khuẩn ở vùng nhiệt đới là rất phong phú và cần được quan tâm

ên cứu Khi mà ngày càng nhiều chất kháng sinh được tìm ra thì cơ hội để người ta

lể tìm thấy các kháng sinh lạ trong các chủng xạ khuẩn truyền thốne dường như ngày

Vì thế người ta đang chuyển sự chú ý đến các chủna thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm

Aciinopìanes, Dactyỉosporangium, Micromonospora, Acỉinomadura, Microbispora, Oosporangium, Kibdeìosporangium và các chi khác đế phục vụ cho sản xuất kliáne,

Xạ khuẩn vẫn được xem như là một neuồn tiềm năng chính cho các chất có hoạt sinh học mới

Phần lớn CKS là do xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh ra, song khả năng sinh

; của các chi thuộc “ xạ khuẩn hiếm” ngày càn? được đặc biệt chú ý Dưới đây là đồ dểu diễn tỷ lệ các vi sinh vật sinh các chất kháng sinh theo khảo sát năm 1982-1999 ở

t Bản và mục đích tuyển chọn các chất kháng sinh được ứng dụng trone thực tiễn Những năm vừa qua, sổ lượng các chất kháng sinh do nấm sinh ra tăng lên nhiều 0%-40% và tỷ lệ các chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra giảm đi đáns kể từ 80%

Các chất có hoạt tinh sinh học khác

Hình 2 Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học

( Japanese patent 1982-1999) Nhìn vào đồ thị, chúne ta cỏ thể thấy việc sử dụng chất kháne sinh trona nôn a

ệp và thú y không có sự biến độna lớn lắm Tuy nhiên, vài năm gần đây xu thế này

ỉ giảm đi dôi chút.

Phân loại xạ khuẩn hiếm bằng phưong pháp sinh học phân tử

Tù' nửa cuối thế kỷ 20 trờ lại đây và đặc biệt từ thập niên 80, sự phát triên mạnh

ùa sinh học phân tử đã mở ra một phươne pháp nghiên cứu cho phân loại học đó là loại học phân tử Phân loại học phàn tử là sự phát hiện, mô tả và eiải thích đa dạnc, học ờ mức độ phân tử eiĩra các loài và trone phạm vi loài Nó ứns dụne các kỹ thuật dại của sinh học phân tử và công nghệ gen vào mục đích nghiên cửu đa dạnu, sinh nghiên cứu mối quan hệ tiến hoá dừa các loài, xây dựng cây cluiim loại phát

I Mặc dù mới ra đời nhưng nó đã sớm trở thành một phương pháp nchiên cứu rất có

Cho đến nay đã có hànç loạt các kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụns trong iên cứu chủng loại phát sinh ở v s v , nó bao gồm các kỹ thuật như phân tích trình tự amin, thành phần bazơ nitơ của ADN, lai axit nucleic, phân tích đoạn ADN dựa trên

đa hình về độ dài các đoạn giới hạn (RJFLP) Tuy nhiên phổ biến nhất vẫn là kỹ

it phân tích trình tự een mã hoá ARNr 16S.

Hiện nay phần lớn các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằns mức độ tương đồng rình tự ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể v s v Tất cả các loài / trong sinh giới đều sử dụne cùng một cách tone hợp protein nhờ các riboxom Vi người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hóa ARNr ờ các v s v : nhau để xác định mối quan hệ tiến hoá giữa chúng ARNr là phân tử lý tưởng cho nshiên cứu về tiến hoá của v s v và mối quan hệ giữa chủng bởi vì chúng là thành

1 cơ bản có trone mọi tế bào v s v Vai trò và chức nănơ của chúns là eiốns nhau ở

ã các riboxom Người ta nhận thấy cấu trúc khône gian của phân từ ARNr rất eiốna,

J giữa các loài v s v khác nhau Nghĩa là cấu trúc của chúng thay đồi rất chậm theo gian hay nói cách khác các gen mã hóa chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình hoá Tốc độ thay đổi của chúng trong quá trình tiến hoá là rất chậm có lẽ là bởi vì sự tịnh là tính chất quan trọng của chúng Nói chune các een mã hoá ARNr rất bảo thủ nhiên trons bản thân các een bảo thủ cũng chứa nhừns vùna có mức độ bảo thủ cao hữna vùna có mức độ bảo thủ thấp hơn (vùns biến đổi) Điều nàv có lẽ do các vùng

đó mã hoá cho những vùng khône eian khác nhau của phân tử ARN riboxom Trona trình tiến hoá các vùng een đó có thể bị nhữne đột biến nhất định nhưne chọn lọc tự

n chỉ eiừ lại nhừna đột biến truna tính ít làm thay đổi cấu trúc khôns eian của ARNr

ih hường đên sự tons hợp protein của sinh vật còn những dột biến tron *— • V— • ỉ 1 • ^ 2 nhữna vùnaw W

1° 2Ìan quan trọne, làm ảnh hưởna đến quá trình sinh tồng hợp protein cua cơ thể , lập tức sẽ bị chọn lọc tự nhiên đào thải.

Dựa vào nhữne vùna bảo thủ trons een mã hoá phàn tử ARNr các nhà khoa học đã

kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đôi So sánh sự khác siữa các vùng này người ta có thể chỉ ra được nhừna sự khác biệt siữa các loài Rần Theo Robert w Bauman nếu hai loài vi khuẩn có sự khác biệt vè trình tự Ren ARNr lớn hơn 3° 0 thì có thể xem là hai loài khác nhau.

Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23 s là lớn

so với phân tử A R N r 16S Tuy nhiên trình tự đã được xác định hoàn chỉnh của gen

Nr 23s là rất ít trone khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phona phú và được

g bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế Chính vì vậy phương pháp giải trình tự gen hoá ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng loại của v s v vẫn là lý

Ìg nhất Lần xuất bản thứ tư của cả “Bergey’s Manual o f Systemmatic Bacteriology”

T he Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuẩn ARNr 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài

Ìg ứng của v s v Chính vì vậy có thể nói phương pháp xác định trình tự sen A R N r

ỉà phương pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại thuận lợi vi khuẩn Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảne cách đã toán Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại ở các cấp độ hơn chi Sự tươne đồng giữa phép phân loại dựa trên các đặc điểm kiểu hình :notypic) và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng rãi Nhìn chung đặc điểm hoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương quan tốt với cây phát chủng loại

ẶC ĐIẺM HỆ SINH THÁI VÙNG TRÙNG KHÁNH CAO

Khu Trùng Khánh - Cao Bằng nằm ở trung tâm của Tiểu vùng địa lý thực vật (hệ : vật) Nam Trung Hoa, thuộc Miền địa lý thực vật Đône, Dương, Dưới xứ địa lý thực 4n Độ-Mã Lai, xứ địa lý thực vật c ổ nhiệt đới Vùng nghiên cứu này nằm ở cực đôna của Việt Nam sát ngay biên giới với Trung Quốc Cảnh quan đặc biệt nhất của vùng

ác dãy núi đá vôi cổ, cứng, kiểu đá cẩm thạch, bị bào mòn mạnh, chủ yếu tuổi ôzôi muộn và Mêzôzôi sớm Đó là kết quả của sự bào mòn sâu đến hơn 900 m của bồi tích (lẳne, đọng) phủ lên các khối đá vôi Cảnh quan này chiếm một diện tích rất :ủa vùng và về mặt địa lý là phần kéo dài của Cao neuyên Quý Châu Cành quan hiện :ủa vùng đã được hình thành bởi nhiều đợt nâne địa chất mạnh mẽ vào kỷ Truna sinh zôzôi), kết quả đã nâna các lớp bồi tích biển cổ biến chất lên đến độ cao lớn so với nước biển (Schzeglova, 1957; Fridland, 1961; M Baker & Ch Baker, 1990: Fowlie I) Khối đá cứns đã bị xẻ do quá trình bào mòn thành nhiều đình và đườne đinh biệt Những dã)' núi đá vôi đó có nhiều vách dựne, đứng và sườn dốc Các đỉnh và đường núi đá vôi cao nhất của vùng nghiên cứu thường có độ cao 800-900 m Chúng vượt lên thung lũng sông Quy Sơn ít nhiều bằng phẳng hoặc lên các thềm cổ được nâng /à được phù sa trẻ lấp đầy.

Các khu đất bằng phẳng ỏ' đất thấp của vùng nghiên cứu được sử dụng đế trồng cây hàns, năm Đó là các khu đất ở thung lũne sône Quy Sơn và nhiều thềm được

2 lên giữa các dãy núi đá vôi Ở đó thảm thực vật nsuvên sinh đã bị biến mất từ lâu )ài thảm cây trồng là các thảm cỏ dại có nguồn aôc tại chỗ hay di cư Thường eặp là

trảng cỏ thứ sinh cao trung bình (chủ yếu là Co tranh Imperata cylindrica) và các

e câv bụi thưa thứ sinh với vài cây aỗ mọc đơn độc.

Thảm thực vật ở sườn và đường đỉnh núi đá vôi chịu ảnh hưởns; xấu của con neười 2 vài chục năm ơần đây Rừng nauvên sinh cây lá rộng ở các thune lûnç và sườn núi nất đi cấu trúc đặc trưne do bị khai thác mạnh mẽ ở toàn bộ vùng nghiên cứu loại

l này được thay thế bới rừng thứ sinh nghèo kiệt Mức độ tàn phá cao hơn đổi với

l nguyên sinh của vùng lấy mẫu ghi nhận được ở phần trên của sườn, đặc biệt ở sườn

n Lửa rừng do khai thác gỗ và các hoạt độne khác của con người là các yếu tố bổ

l cho sự thoái hoá của môi trường sống ở đai núi này Rừng ở đây thường rất thưa

v à m a n g nhiều tính thứ sinh

Trước đây rừng Thông neuyên sinh rậm và giầu đã từng bao phủ toàn bộ đỉnh và

ng đỉnh của vùng nahiên cứu ở độ cao 700-900 m Ngày nay chúng đã bị tiêu diệt

:1 toàn do bị khai thác gỗ đến cạn kiệt và nạn lửa rừng diễn ra thườna xuyên Vài

ih nhỏ và nçhèo kiệt của loại rừng này chỉ đôi khi 2ặp ở vách và đường đỉnh hiểm trở lui tới.

Mùa hè nóng ẩm với các cơn mưa rào nặng hạt từ tháng 5-6 đến 9-10 là đặc trưns vùng nghiên cứu Mùa đône khô và khá lạnh từ tháns 10 đến tháns 4 năm sau Nhiệt rung bình năm thường thav đổi trons khoảns 25-30° c vào mùa đôna thườn» 15° c

ộ cao 200-300 m trên mặt biển) Vào những đêm lạnh nhất, ờ độ cao 800-900 m nhiệt

1 chỗ quans có thể xuốns sần 0° c Mây và sương mù vào ban đêm gặp phổ biến ờ

và thung lũng có độ cao 700-900 m.

Tất cà nhừnc đặc điểm về hệ sinh thái của MÌ ne láy mầu đều có ảnh hườns tới khu

i sinh vật mà ở đó chúng tôi chỉ tập trune nghiên cứu về xạ khuẩn hiếm.

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

NGUYÊN LIỆU

1 Chiing giống

80 chủng xạ khuẩn sinh CKS phân lập từ 20 mẫu đất được lấy ở các địa điểm khác

u tại rừng nguyên sinh Trùng Khánh - Cao Bằng.

- Rhizoctonia solani nhận được từ Bộ môn Bệnh cây và Trung tâm Bệnh cây

Ẹ't đới, trườne Đại học Nônơ Nghiệp I Hà Nội.

c c 1228, Klebsiella pneumoniae ATCC 31488, Ralstonia solanacearum ATCC

96, Candida albicans ATCC 10231, Scỉerotium rolfsii ATCC201126, Pyricuỉaria zae, Staphylococus aureus ATCC 9347, Fusarium oxysporum ATCC 695, nhận được

ìảo tàng giốns chuẩn Truns tâm Công nehệ Sinh học, ĐH Quốc eia Hà Nội và Viện liễu, Bộ Y Tế.

0 flavin 10 mg

10 mg

10 me

Ca-Pantothenate Acid p-Aminobenzoic Biotin

Môi trườnơ ISP4 để giữ giống cần có thêm pepton 5g/l.

[ trường ISP6 (g/1) : Pepton - 10, cao nấm men - 1, xitrat sẳt - 0,5, thạch -18 nước -

pH 7 - 7.2,

trường ISP-9 ( g/l): (NH4)2S 0 4 - 2,64; KH2P 0 4- 2,38; K2H P 04 - 5,65: M g S 0 4- 1:

2 dịch muối B - 1 ml; nơuồn cacbon - 10; thạch - 20; nước - 1 lit; pH 6.8 - 7

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

1 Phuong pháp phân lập xạ khuẩn tổng số

ơn g pháp SDS-YE (Sodium dodecyl sulfate - Yeast extract method)

- Mầu đất được nghiền nhỏ, phơi khô tự nhiên trone 3 đến 5 neày.

- Lấy 1 sam mẫu đã được phơi khô cho vào 10 ml nước cất vô trùrm (bắt đầu tính

ĩ độ pha loans là 10'1)

- Trộn đều rồi lấy 1 ml dịch trên cho vào 9 ml duna dịch SDS-YE trona đệm

;phat (10 ) (bao £ồm SDS 0.05% cao nấm men 6% đệm phosphat 5mM, pH 7.0).

- Cho ổna nshiệm chứa mẫu ở nồng độ 10'2 vào bể ổn nhiệt, sốc nhiệt ớ 40°cV w • • •

mix for 2 min

stand for 1 min.

Pha loãng bằng nước vô trùng

ÎO '^ IO '5

SDS-YE

Hình 3 M ô hình phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn hiếm

2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

2.1 Đặc điểm hình thải

a) Quan sát hình thái cuống sinh bào tủ'

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trườns Gauze 1 có săm lamen nahiêne 45° trên nặt môi trường Sau 7-9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòne lấy ra quan sát hình dạns chuồi ) bào tử trên lamen dirói kính hiển vi quang học Chuỗi sinh bào tử có các dạne thẳng

hơi lượn sóne, kí hiệu là RF (Rectiýỉexibiles) hình móc câu hav hình xoan khône

11 toàn ký hiệu là RA {Retinoculiaperti) và xoấn hoàn toàn ký hiệu là s (Spirales).

Bề mặt bào tử

Dùne màng cacbon.đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào từ, sau đó

n sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét.

) tử có hình dạng: tròn, ovan elip, hình que

mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhằn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký

1 là Wa (Warty), dạng gai kỷ hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairv).

2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá

a) Nhiệt độ tối ưu

Xạ khuẩn cấy trên môi trường thạch nehiêne Gauze I và nuôi ờ các nhiệt độ:

2 28°c, 37°c Khả năng sinh trưởng được xác định sau 7-10 neày nuôi.

b) Khả năng sinh enzym ngoại bào

định hoạt tính các enzym ngoại bào bàng cách nuôi xạ khuẩn trên môi trường chứa :hất dùng để xác định hoạt tính enzym.

c) Khả năng chịu muối

xạ khuẩn trên môi trườrm thạch nghiêne IS P -1 có bổ suns thêm NaCI với các nồng

; 3; 5; 7 (%), sau 7-10 neày lấy ra quan sát sự sinh trưởna.

d) Khả năng sử dụng các nguồn cacbon

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trườne ISP-9 có bổ suns 1% các neuồn đườne,: coza, manitol, maltoza, raffinoza, arabinoza inostol fructoza lactoza sacaroza )za, xitrat natri, rhamnoza.

h lùm: cân la đường, thanh trùn2, bằng đèn u v rồi bổ sung vào 100 ml môi trườn ỉi -9 còn nóns Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy xạ khuẩn, sau 14

y quan sát sự sinh trường.

ne đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi trườna không lường được coi là đối chứng âm (-).

eu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dươne một ít: có khả

IS sử dụns loại đường đó, kí hiệu là (+).

ếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứne dương, kí hiệu là (++).

ếu xạ khuân sinh trưởng bane đổi chứng âm hoặc không mọc: khône; có khả năns sử

1° loại đườnơ đó , kí hiệu là (-).

íếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đối chứns m2 nhiều, kí hiệu là (±).

e) Xác định axit diam inopim elic (DAP) của xạ khuẩn

uyên tắc: Ninhydrin phản ứng với nhóm -NH2 của axit diaminopimelic ơ 100°c tạo ra

phẩm là các vệt mầu tím đỏ.

n hành' Cho khoảng 50mg tế bào ướt vào ống íhuỷ tinh có nút vặn (cỡ

mxlOOmm) Thuỷ phân tế bào bằng lm l 6N HC1 ở 100°c trong 16 aiờ tại nồi ổn nhiệt

» Làm lạnh dịch thuỷ phân tới nhiệt độ phòng.

sung 2ml nước cất vô trùng Loại bỏ phần cặn cùng giấy lọc Chấm chừna 3 (li dung

ỉmical Co., St Louis, MO USA) làm dung dịch chuẩn Đặt giấy sắc ký bản mỏne

Ig bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp metanol - nước - 6N HC1 - pyridine (80:26:4:10, ) irons 3 eiờ hoặc lâu hơn Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (tronc nước bão hoà n - anoỉ) lên giấv sắc ký bản mỏng, đặt trone tủ sấy ở nhiệt độ 100°c trona 5 phút), v ế t DAP tách rời xuất hiện từ TLC như là các vết màu tím đỏ LL-DAP (R f 0.29),

;o-DAP (R f 0.24).

3 Các phuong pháp sinh học phân tử

3.1 Tách chiết A D N theo phư ơng ph áp của Saito Mura

lyên tắc: Thảnh tể bào của vi sinh vật được phá vỡ nhờ lyzozvm và các chất tẩy

ill như SDS-Tris-HCl giúp ADN được giải phóng Protein và ARN được lách ra khỏi

N nhờ các enzym ARN-aza, proteaza K và các duns, môi Chloroform: isoamyl )hol (24:1) Cuối cùne ADN được tủa bane etanol tuyệt đối (lạnh -22) và xác định

a độ ADN trong dịch mẫu.

'ĩ liànlĩ ADN được chiết xuất và tách từ sinh khối ướt Iheo phưone pháp cua Sailo và

ira Lay 3 vòne que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuôi, ly tâm lạnh ỡ 4"c với tốc dộ )() vòng tronc 15 phút và rửa 2 lần bằna 300|il dune dịch muối EDTA pỉ l 8.0 (0.5M

ÚẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRUNG TÂM THÔNG TIN THƯ VIỆN

ịEDTA, 0,15M NaCl) Sau đó tạo dịch huyền phù trở lại trong 200f.ll đệm lOxTE

mM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm, 1: 2) Bổ sung 1 Op.1 lysozym ìina lmg/ml lysozyme), giữ ờ 3 7 °c trong nồi cách thuỷ trona 15 phúl Bô sung dung

1 Tris-SDS (0.1M Tris-HCl pH 9,0 và 1% SDS) với thể tích bans thể tích mẫu Dịch

1 được giữ ở 60° c trons nồi cách thuỷ khoảng 10-30 phút Sự tan tế bào được xác

li bằne độ trone của dung dịch cùne với sự tăng độ nhót tươna ứne Dịch tan tế bào

>'C làm lạnh trons đá 10 phút, bổ sung 150fj.l cloroform-isoamyl alcohol (24:1, siữ ở ) với thể tích bằnơ 1 / 3 thể tích mẫu Ly tâm lạnh ở 4°c với tốc độ 10.000 vòng trona phút để phân lóp Sau đó chuyển phần nhớt ở pha đầu sang eppendorf mới và ADN

ic tách nhờ bổ suns etanoỉ lạnh (etanol 95,5% giữ Ở-22°C) với thể tích gấp đôi thể tích

J và 2|il của 3M axetat-natri (pH=4.5) Ngâm ADN trong 100|il etanol 70% trong 30

t và sau đó ngâm liên tiếp trong etanol 80 90, 95% cho mỗi nồng độ trons 5 phút Sợi

N làm khô ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và được làm tan trờ lại trong 20fil đệm

<TE (lOxTE) ở 4 °c qua đêm Dịch đem phân tích bàng máy quang phổ kế ở các bước

2, 230, 260 và 280nm ADN hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260nm Ở bước sóng

nm chứng tỏ sự cỏ mặt của prôtêin Bước sóng 230nm biểu hiện sự có mặt của chất

1, các muối như EDTA và của ARN Các tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở các bước

g 230 : 260 : 280nm là 1,0: 0,45: 0,515 Hàm lượn» ADN được tính như sau: 1 đơn vị (mật độ quang Optical Durity) ở 260nm tương đương với 50|ig/ml ADN.

Cách tính: Đơn vị mẫu X độ loãng X chỉ số/1000 = ADN |ig/|il.

Neu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bang enzym proteaza K và ARNaza

3.2 Plíản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

tyên lắc: Phươns pháp này sử dụng ADN polymeraza và các oligonucleotit tổng hợp

n tạo một đoạn ADN dùns làm khuôn được nhân lên nhanh chóng với số bản sao eấp

2 tỷ lần mà khôns cần đến nhiều tế bào vi khuẩn Nhờ phản ứne này một đọan sen bất

sẽ được khuyếch đại khi biết được trình tự nucleotit ỏ' hai đầu ta đã tone hợp được

mồi bổ suns với trình tự của hai điểm từ đầu 5' tới đầu 3' của sợi bổ suns và nhờ cỏ

ym ADN polymeraza mà ADN khuôn được tổne hợp khi đã có sẵn dNTP.

7 hành: Mỗi chu kỳ của phản ứng đòi hỏi 3 bước:

n tính (dénaturation) sợi ADN bang nhiệt độ ADN được tách thành hai sợi đơn Nhiệt giảm xuổne cho phép mồi bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn Hỗn hợp

N và mồi dược ủ với enzym Taq polymeraza và dNTP giúp cho việc tông hợp ADN

I bổ sung với sợi ADN gốc Khi các chu kỳ đirợc lặp lại, các doạn ADN vừa mới được

ị hợp ở các chu kỳ trước trở thành khuôn cho chu kỳ sau số chu kỳ lặp lại trone mỗi

n ứng PCR thường khône quá 30 chu kỳ và mỗi phản ứna PCR thườns kéo dài ảna 2-3 eiờ Khi thực hiện phản ứng PCR, một số yếu tố ảnh hưởnẹ đáne kể đến kết của phản ứna như nồng độ mồi, nhiệt độ và thời gian ủ mồi, nồng độ ADN khuôn,

g độ một số ion như M e2+.

4- Chuẩn bị m ẫu cho phản ứng PCR.

lìĩ tự mồi' Mồi xuôi 27 5 ’-agagtttgatcctggctcag-3’ 27-47

rp (2,5mM) 2nl

[ 1 JJ.1 (lOpmol cho mỗi loại mồi (ngược và xuôi)

n tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agaroza

đệm

1 hành pha duno dịch đệm 10 X TAE

12, quá trình chạy điện di dùnç dung dịch đệm lxTAE (của 10 X TAE pha loãne dịch 'One 100 ml nước cất đã khử trùng).

i- Đố get.

- Cân 0,8- 1.2 g asaroza cho vào 100ml duns dịch đệm lxTAE đun sôi cho đến khi iroza tan hết.

- Lắc đều để nguội đến 40-50°C.

- Đổ sel vào khay đã cài sẵn lược.

- Để 30 phút cho tới khi bản gel cửne, rút lược và đặt khay gel vào máy điện đi.

4- Tra mẫu:

- Dùng pipet hút 2ịiỉ dung dịch ADN trộn với 2ịú 6 X loading buffer.

- Tra lịil của 1 kb ADN ladder (Takara) trộn với 2fil của 6 X loading buffer dùng

r ADN chuẩn.

- Tra mẫu vào từng eiếns.

4- Chạy điện di với dòng điện 100V trong thời gian 20-30 phút cho tới khi vạch m àu đến 2/3 bản gel.

í- Soi bản g e l trên mảy soi ư v của Bio-rad.

Kết quả ADN mới được nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình dưới những

Tinh sạch sản phẩm PCR: Dùno Spinfilter unit (bộ kít làm siêu sạch sản phẩm

l) lấy 20f.ll sản phẩm PCR cho vào Eppendorf lọc qua spiníìller unit có bổ sune, 50|.il

[ dệm spinbind sau đó loại bò duna dịch bằne siêu lv tâm tốc độ 13.000rpm trona 30 Spinfilter unit được rửa bằng 20|il chất đệm spinclean, đem ly tâm 2 lần với tốc độ )()() vònc/phút trong 30 giây Sau đó spiníìlter unit được cài vào một Eppendorf mới.