Nghiên cứu sản xuất thang chuẩn ADN chất lượng cao

Định nghĩa và phân loại thang chuẩn ADN Thang chuẩn A D N được định nghĩa là m ột hỗn hợp chứa các phân tử ADN có kích thước khác nhau được sử dụng trong điện di nhằm đánh giá kích thước

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG đ ạ i• ’ h ọ c• k h o a h ọ c• TỮ • n h i ê n

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THANG CHUẢN ADN

Lời cảm ơn

Chủ nhiệm đề tài cùng toàn thể cán bộ tham gia thực hiện

đề tài QG 07-12 trân trọng cảm ơn Đại học Quốc gia Hà N ội đã tài trợ kinh phi Đề tài được thực hiện ở Phòng thí nghiệm Sinh Y-Khoa Sinh học và Phòng Công nghệ ứ n g dụng-Phòng thỉ nghiệm trọng điểm Protein-Enzym, Đại học Khoa học Tự nhiên.

Báo cáo tóm tắ t

a Tên đề tài: Nghiên cứu sàn xuất thang chuẩn ADN chất lượng cao

b Chủ trì đề tài: TS Võ Thị Thương Lan

c Các cán bộ tham gia: TS Lê Hùng

CN Phạm Anh Thùy Dương

d Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

Mục tiêu:Xây dựng qui trình thiết kế thang chuẩn ADN có chất lượng cao bầng kỹ thuậtADN tái tổ hợp nhàm mở ra triển vọng sản xuất thang chuẩn cung cấp cho nghiêncứu sinh học phân tử và xét nghiệm chẩn đoán hiện đại

5 Đào tạo một cử nhân tài năng và một học viên Cao học

6 Công bo I bài báo và 1 báo cáo trên tạp chỉ và hội nghị chuyên ngành

f Tình hình kỉnh p h í :

Thanh toán dịch vụ công cộng: 11.000.000 VNĐ

Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 45.500.000 VNĐ

*

Sum m arya) The title o f subject: Study on development o f new quality DNA Ladder

d) Objectives and contents

* Objectives'.

Development of new strategies to produce high quality DNA ladders which can be attributed to biotechnology and molecular biology laboratories with lower cost and quality assurance than commercial DNA ladders presently available

e) The obtained results:

> Optimazing the PCR conditions for amplification of DNA fragments o f 1 kb,1.5 kb and 2 kb

> Successfully cloning the DNA fragments o f 115 bp, 270 bp, 845 bp, 1 kb,1.5 kb, and successfully creating a recombinant DNA vector of 2 kb

> Successfully producing DNA PCR Ladders including 7 DNA fragments wich sizes from 199 bp to 2000 bp

> Successfully producing DNA Ladder by using recombinant DNA

technology, which consists 9 DNA fragments from 500 bp to 4634 bp

b) The g ran t holder: Dr Vo Thi Thuong Lan

c) The Participants: Dr Le Hung

B.Sc Pham Anh Thuy Duong

(ký và ghi rõ họ tên) (ký và ehi rõ ho tên)

PHÓ CHỦ NHIỆM KHOA

MỤC LỤC

MỞ ĐÀU 1

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 GIỚI THIỆU VÈ THANG CHUẨN ADN 2

1.1.1.Định nghĩa và phân loại thang chuẩn ADN 2

1.1.2.Các phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN 3

1.2 THỊ TRƯỞNG THANG CHUẨN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 6

1.2.1.Thang chuẩn ADN thương mại trên thế giới 6

1.2.2.Tinh hình sử dụng thang chuẩn tại Việt Nam 7

1.3 MỘT SÓ KỸ THUẬT SINH HỘC PHÂN T Ử 8

1.3.1.Kỹ thuật PCR- ! .8

1.3.2.Kỹ thuật tách dòng phân tử (molecular cloning) 9

1.3.3.Phương pháp giải trình tự 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 13

2.1 NGUYÊN LIỆU 13

2.1.1.Nguyên liệu của phản ứng PCR, 13

2.1.2.Các vector tách dòng vả chủng vi khuẩn 13

2.1.3.Hoá chất 13

2.1.4.Thiết b ị 13

2.2 S ơ ĐỎ NGHIÊN c ứ u 14

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 14

2.3.1.Tách chiết ADN genome cùa Arabidopsis thaỉìana 14

2.3.2.Kỹ thuật PCR 7. 15

2.3.3.Phưong pháp tách dòng sử dụng bộ kit của Fermentas 15

2.3.4.Phương pháp biến n ạp 15

2.3.5.Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn 16

2.3.6.Kỹ thuật xử lý plasmid bằng enzyme giới hạn 16

2.3.7.Kỹ thuật nối A D N 17

2.3.8.Kỹ thuật tinh sạch ADN : 17

2.3.9.Phương pháp điện d i 17

2.3.10.Phương pháp xác định nồng độ ADN 17

CHƯƠNG 3 KÈT QUA 18

3.1 GIEO TRỎNG HẠT A THALIANA VÀ TÁCH ADN GENOME 18

3.2 KHUÉCH ĐẠI CAC TRÌNH T ự 1 kb, 1.5 kb, 2 kb BẦNG PHẢN ỨNG PCR 19 3.3 TÁCH DÒNG VECTOR TÁI TÒ H Ợ P 21

3.3.1.Tách dòng vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN lk b 21

3.3.2.Tách dòng vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN 1.5 kb.,„ 22

3.3.3.Tách dòng vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN 2 kb 23

3.4 THIÉT KE BẢNG 2 kb 23

3.5 THIÉT KÉ CÁC BĂNG KÍCH THƯỚC N H Ỏ 24

3.5.1 Vector tái tổ họp mang đoạn chèn 850 bp 24

3.5.2.Vector tái tổ hợp mang đoạn chèn nhỏ hơn 500 bp 25

3.6 PHỘI TRỘN CAC SAN PHẨM TẠO THANG CHUẨN ADN 27

3.6.1.Phối trộn tạo thang chuẩn từ sản phẩm PCR 27

3.6.2.Xây dựng thang chuẩn tái tổ hợp 28

KÉT L U Ậ N 33

KIÉN N G H Ị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

*

M Ở ĐẦU

Công nghệ sinh học được định nghĩa là sự sản xuất hàng hoá và dịch vụ ở quy mô công nghiệp nhờ sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá trình sinh học N gày nay, công nghệ sinh học đã đạt được những tiến bộ vượt bậc nhờ sự hỗ trợ của công nghệ ADN tái tổ hợp Sự kết hợp này đã tạo ra một lĩnh vực nghiên cứu cỏ tính cạnh íranh cao đầy triển vọng, được gọi là công nghệ sinh học phân tử H àng loạt các công ty phục vụ sinh học đã, đang và sẽ tạo ra ngày càng nhiều các sản phẩm bằng công nghệ sinh học phân tử

Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học phân tử ở V iệt N am được quan tâm và ưu tiên phát triển Đây là yếu tố quan trọng giúp cho các cơ sở nghiên cứu sinh học phân tử trong cả nước cỏ điều kiện phát triển, tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại nhằm nâng cao chất lượng nghiên cứu, ứng dụng thực tế

và phục vụ cuộc sống N hiều phòng thí nghiệm về công nghệ sinh học phân tử

đã ra đời, được trang bị đầy đủ, đồng bộ cả về nhân lực và cơ sở vật chất Bên cạnh các trang thiết bị, máy m óc hiện đại, nghiên cứu sinh học phân tử yêu cầu các nguồn hoá chất, sinh phẩm có chất lượng Tuy nhiên, các hoá chấỉ sinh phẩm đa phần được nhập từ nước ngoài với giá thành cao và chất lượng không

ổn định do điều kiện bảo quản chưa đảm bảo, thời gian vận chuyển lâu Khó khăn trên đặt ra yêu cầu cho các đơn vị nghiên cứu sinh học phân tử trong nước sản xuất các sinh phẩm có chất lượng đảm bảo và giá thành phù hợp

Thang chuẩn A D N là m ột trong số các sinh phẩm được sử dụng phổ biến ở các phòng thí nghiệm sinh học phân tử Đây là công cụ không thể thiếu nhằm xác định kích thước và nồng độ của các phân tử ADN Ở V iệt N am hiện nay, tất cả các thang chuẩn sử dụng đều nhập ngoại Với m ong m uốn đáp ứng nhu cầu sử dụng thang chuẩn A D N cho các đơn vị nghiên cứu trong nước với chất lượng cao và giá thành rẻ, chủng tôi thực hiện đề tài “N ghiên cử u th iế t kế

th a n g ch u ẩ n ADN c h ấ t lượng cao” M ục tiêu của đề tài là tạo ra thang chuẩn

A D N 500 bp gồm 7-8 băng bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Đ ề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, K hoa Sinh học và Phòng Công nghệ ứng dụng - Phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ protein - enzym e, trường Đại học K hoa học T ự nhiên, H à Nội

1

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ THANG CHUẤN ADN

1.1.1 Định nghĩa và phân loại thang chuẩn ADN

Thang chuẩn A D N được định nghĩa là m ột hỗn hợp chứa các phân tử ADN

có kích thước khác nhau được sử dụng trong điện di nhằm đánh giá kích thước

và nồng độ đoạn A D N chưa biết [4, 24]

Người ta thường chia thang chuẩn ADN làm hai loại [4, 9, 33]

Loại 1 được thiết kế gồm một số băng ADN ( 7 - 1 5 băng) có kích thước chênh lệch nhau theo một bước nhảy nhất định gọi là ADN ladder Các bước nhảy này có thể thay đổi khác nhau, thường phổ biến là 10 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 500 bp và 1 kb (Hình 1)

Hình I Thang chuẩn ADN ladder [35]

Loại 2 được sản xuất theo kỹ thuật xử lý một phân tử ADN lớn (ADN genome của thực khuẩn thể lamda, 0 X 1 7 4 hay plasm id pBR322) với enzym e cắt giới hạn ở những vị trí nhất định Loại thang chuẩn này gồm các đoạn ADN kích thước khác nhau với bước nhảy không xác định, gọi là ADN m arker (Hình 2)

Ngoài cách phân loại trên, người ta còn phân biệt thang chuẩn theo nhiều tiêu chí khác nhau Dựa theo phương pháp thiết kế có các loại thang chuẩn như thang chuẩn PCR, thang chuẩn tái tổ hợp, thang chuẩn tổng hợp hoá học Dựa theo kích thước băng có các loại thang chuẩn 1 kb, 500 bp, 100

*■

bp hoặc thậm chí 5 bp Ví dụ thang chuẩn 1 kb gồm chủ yếu các băng có bước nhảy 1 kb; thang chuẩn 100 bp gồm các băng từ kích thước từ 100 bp đến 1 kb với bước nhảy 100 b p

Hình 2 Thang chuẩn ADN marker A: ADN của thực khuẩn thể X cất với

£coRI B: ADN của thực khuẩn thể X cắt với £coRI và Hindĩíl [28, 31]

Ngoài các loại thang chuẩn thông thường, một số kiểu thang chuẩn được thiết kế đặc biệt như thang chuẩn phát huỳnh quang nhằm phục vụ cho các kỹ thuật lai acid nucleic

1.1.2 C ác p h ư ơ n g p h á p sản x u ấ t th a n g ch u ẩ n ADN

Do thang chuẩn là một sản phẩm thương mại quan trọng nên các kỹ thuật liên quan đến thiết kế và sản xuất thang chuẩn A D N rất ít được công bố trên các ấn phẩm khoa học Hầu hết trong các tài liệu về thang chuẩn do các nhà sản xuất cung cấp chỉ đi sâu vào m ô tả sản phẩm và cách sử dụng N hìn chung, có

4 phương pháp chính được áp dụng để sản xuất thang chuẩn ADN

1.1.2.1 Phương pháp tổng hợp hoá học [2 7 ,1 0 ]

Tổng hợp hoá học sợi đơn ADN có trình tự xác định được thực hiện trên các thiết bị tự động Q uá trình tổng hợp ADN được lập trình để đưa các nucleotide, các hoá chất theo m ột thứ tự nhất định, cần thiết cho việc gắn từng nucleotide vào chuồi đang tổng hợp Tất cả các phản ứng được thực hiện theo

3

m ột trình tự kế tiếp nhau trong một cột phản ứng đơn Thời gian của mỗi phản ứng cũng như các bước rửa đều được kiểm tra bằng các chương trình tự động.

Do thực hiện tự động nên việc sản xuất oligonucleotide sợi đơn không quá phức tạp Sau khi được tổng hợp, các đoạn oligo có kích thước tính toán được phổi trộn theo tỷ lệ nhất định để tạo ra thang chuẩn Các oligo thường có kích thước từ 10 đến tối đa là 200 nucleotide Phương pháp này có ưu điểm nhanh, chính xác; máy móc dễ thao tác và cho sản phẩm tinh sạch, đạt chất lượng tốt Tuy nhiên, thang chuẩn sản xuất theo phương pháp này có giá thành cao; ADN được tổng hợp ở dạng sợi đom nên muốn tạo ra dạng sợi kép phải trải qua bước tạo cặp bổ sung Do vậy, phương pháp này thường sử dụng để tạo ra thang chuẩn có các băng kích thước nhỏ, như thang chuẩn 5 bp hay 10 bp (Hình 3)

Hình 3 Thang chuẩn 5bp và lObp của hãng Mbiotech [25]

1.1.2.2 P hương pháp x ử ỉỷ vật liệu A D N với enzym e giới hạn /29, 33]

Xử lý một phân tử A D N lớn bằng enzyme giới hạn để tạo ra các đoạn ADN có kích thước khác nhau là m ột phương pháp thiết kể thang chuẩn ADN khá đơn giản, được các hãng sản xuất quan tâm phát triển Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng các phân tử ADN đã biết bản đồ enzym e giới hạn như thực khuẩn thể X, 0 X 1 7 4 , plasm id pB R 322, để xử lý với m ột hoặc vài enzyme giới hạn (Hináỉỉỉ, £ c ớ R I, ) Sản phẩm thu được là các đoạn ADN có kích thước khác nhau phụ thuộc vị trí cắt của enzyme (Hình 2) Ưu điểm của phương pháp này là thực hiện dễ dàng, tận dụng được nguồn ADN có sằn trong

tự nhiên nên sản phẩm có giá thành rẻ Tuy nhiên, do sự phân bố ngẫu nhiên trình tự cắt cùa enzym e giới hạn nên không chủ động được trong việc tạo ra các băng có kích thước mong muốn cũng như bước nhảy giữa các băng

1 GENE CHOICE

a P E L I C A N L I F E S C I f N C E S C O K P A 'iY Band Stae (bp) ngfBand

Hình 4 Thang chuẩn PCR của hãng Gene Choice [30]

1.1.2.4 Phương pháp tạo A D N tải tổ hợp [1 2 ,1 4 ]

Nguyên tắc của phương pháp này là tạo ra các phân tử ADN tái tổ hợp từ hai hay nhiều đoạn A D N có nguồn gốc và kích thước khác nhau Các phân tử ADN tái tổ hợp thường gồm một phân tử ADN plasm id (vector) chèn m ột đoạn ADN lạ Kích thước các đoạn ADN lạ được tính toán trước nên khi xử lý vector tái tổ hợp với enzym e giới hạn sẽ cho ra các băng có kích thước như mong muốn Bên cạnh đó phân tử ADN tái tổ hợp có khả năng tái bản trong các tế bào nhận nên dễ dàng thu được lượng lớn ADN Vì vậy, m ột khi đã có các dòng tế bào chứa vector ADN tái tổ hợp thì việc tạo các băng trong thang chuẩn trở nên đơn giản, nhanh chóng; qua đó giá thành của sản phẩm được giảm xuống Với phương pháp này, chúng ta có thể chủ động tạo ra thang chuẩn với kích thước và bước nhảy mong muốn Các băng thu được rõ ràng và sắc nét Phương pháp tạo A D N tái tổ hợp không đòi hỏi trang thiết bị và hoá chất hiện đại, đắt tiền Đây là phương pháp được các hãng sản xuất sử dụng chủ yếu hiện nay

12 THỊ TRƯỜNG THANG CHUẨN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 T hang chuẩn ADN thương mại trên thế giới

Thang chuẩn A D N được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học phân tử Do nhu cầu sử dụng rất lớn nên thang chuẩn ADN được sản xuất bởi nhiều công ty cung cấp sản phẩm cho công'nghệ sinh học Đổi với các công

ty này, thang chuẩn được xem là một trong những sản phẩm quan trọng cho chiến lược kinh doanh

Bon • *

lK lBE.SW on.1h

ũ 5u)*n& 8on t a # DBỈ 1X1S.5W Bn.1li

a b & m * tem f i

1* HỄ 5W an Iti

Hình 5 Một sổ loại thang chuẩn trên thị trưcmg A: thang chuẩn của hãng Fermentas [28]; B: thang chuẩn của hãng New England Biolabs [32]; C: thang chuẩn cùa hãng Promega [34],

p

6

Trên thế giới, có nhiều loại thang chuẩn khác nhau Trong đỏ, số lượng các băng cũng như kích thước, nồng độ từng băng trong mỗi thang chuẩn tuỳ thuộc vào loại thang v à hãng sản xuất Cùng m ột loại nhưng thang chuẩn của các hãng khác nhau có số lượng băng cũng như kích thước các băng khác nhau Ví

dụ như thang chuẩn 1 kb của hãng Fermentas có 14 băng, kích thước từ 250 bp đến 10000 bp trong khi thang chuẩn 1 kb của hãng N ew Englands Biolabs có

10 băng, kích thước từ 500 bp đến 10000 bp M ỗi hãng sản xuất đều có nhiều loại sản phẩm thang chuẩn tạo ra m ột thị trường thang chuẩn ADN đa dạng, phong phú và đáp ứng mọi yêu cầu của người sử dụng (Hình 5)

Các bãng trong thang chuẩn có giới hạn từ 10 bp lên đến 30000 bp tương ứng với các thang chuẩn có kích thước nhỏ, kích thước trung bình và kích thước lớn Thông thường các thang chuẩn có kích thước trung bình gồm các băng khoảng 100 bp - 10000 bp được sử dụng phổ biến nhất

1.2.2 Tình hình sử dụng thang chuẩn tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học phân tử được đầu tư mạnh

và phát triển rất nhanh ờ Việt Nam Tuy nhiên hiện nay thang chuẩn sử dụng ờ nước ta đều nhập khẩu từ nước ngoài (Bảng 1, 2) Việc nhập khẩu tạo ra tình trạng bị động N goài ra, người sử dụng phải bỏ ra m ột khoản chi phí lớn hơn nhiều so với giá thành hãng sản xuất niêm yết do phải chịu phần thuế nhập khẩu [9, 13, 17, 18] Bên cạnh đó, sản phẩm thang chuẩn nhập khẩu phải trải qua quá trình vận chuyển lâu dài, điều kiện bảo quản có thể không đảm bảo nên khi về tới V iệt N am không đạt được chất lượng tốt nhất

Bàng 1 Giá thành một sổ thang chuẩn do hãng Fermentas sản xuất

băng

Dải kích thước (bp) Đóng gói

ĐơnGiá(EUR)

2 Lambda DNKIEcoRI+///wd111 Marker 13 125-21126 5x50 ng 41.57

3 0X174 DNA/fisuRI (HaeIII) Marker 11 72 - 1353 50 ng 75.27

5 GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder 15 75 - 20000 5x50 ng 99.99

7 GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder 14 100-3000 50 Mg 47.19

9 O’RangeRuler™ 500 bp DNA Ladder 12 500 - 6000 25 MS 82.02

10 O’RangeRuler™ 200 bp DNA Ladder 15 200 - 3000 25 ng 82.02

G iả d o c ô n g ty C ô phản K h oa h ọ c K ỹ thuật T hái Bình )ương cung cap I 1/2008

7

Bảng 2 Giá thành một sổ thang chuẩn của hãng New England Đỉolabs

băng

Dải kích thước (bp) Đóng gói Giá (USD)

1.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ÁP DỤNG CHO SẢN XUẤT THANG CHUÂN ADN

1.3.1 K ỹ th u ậ t P C R

PC R (Polym erase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp ADN in vitro được Kary M ullis tìm ra năm 1983 [10] Đây là phương pháp đom giản, hiệu quả cho phép khuếch đại m ột đoạn A D N lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn A D N đó đã được biết

M ột phản ứng PC R bao gồm nhiều chu kỳ, m ỗi chu kỳ gồm ba bước [1] Đầu tiên, A D N khuôn được xử lý nhiệt độ gây biến tỉnh thành hai sợi đom Bước tiếp theo, nhiệt độ giảm xuống cho phép các mồi liên kết tạo cặp bổ sung với hai sợi A D N khuôn Bước cuối cùng, đoạn A D N được tổng hợp nhờ enzym e A D N polym erase và 4 loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Các chu kỳ thường được lặp lại nhiều lần Sau mỗi chu kỳ, số lượng phân tử ADN tạo ra tăng gấp đôi so với chu kỳ trước và chúng trở thành khuôn cho chu kỳ sau

M ồi dùng cho phàn ứng PC R là các đoạn oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo thường có chiều dài từ 10 đến 40 nucleotide Trong đa số trường hợp, các m ồi phải thoả mãn các yêu cầu: tỷ lệ GC chiếm khoảng 40 - 75% để đảm bảo liên kết mồi và khuôn bền vững và nhiệt độ biến tính của hai m ồi xuôi và

8

i

ngược không quá chênh lệch nhau nhằm đạt được sự bắt cặp tổi ưu giữa mồi và khuôn trong cùng một nhiệt độ gắn mồi [2] Ngoài ra, khi thiết kế mồi cần tránh các trình tự bổ sung nằm ở cuối đầu 3 ’ tạo nên sự bắt cặp giữa các mồi, dẫn đến sự hình thành cấu trúc kẹp tóc làm mất ổn định cho việc gắn mồi [6].Mồi gấn với khuôn A D N nhờ liên kết tạo cặp bổ sung giữa chúng Liên kểt này phụ thuộc thời gian, nhiệt độ, nồng độ mồi cũng như nồng độ sợi khuôn Khi nồng độ mồi rất lớn so với nồng độ khuôn, thời gian gắn mồi không cẩn thiết quá lâu Khi đó nhiệt độ gắn mồi đóng vai trò quan trọng cho liên kết mồi

- khuôn G iá trị này phụ thuộc vào chiều dài mồi và hàm lượng GC trong mồi

Rõ ràng nhiệt độ và thời gian ở giai đoạn gắn mồi đặc biệt quan trọng, nhiệt độ quá cao gây biến tính còn nhiệt độ quá thấp sẽ tạo ra các liên kết không đặc hiệu [2]

Nguồn A D N sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR rất đa dạng Chúng có thể là ADN genom e tách từ tế bào, ADN từ ngân hàng genome hay ngân hàng ADNc hoặc plasm id Đổi với phản ứng PCR, ADN dùng làm khuôn không đòi hỏi phải tinh sạch hay điều kiện bảo quản lạnh và lượng ADN cần rất ít Bên cạnh đó, m ột sổ ion cũng như nồng độ dNTP trong môi trường đều ảnh hưởng tới phản ứng PCR Ví dụ, ion M g2+ kích thích phản ứng tổng hợp ADN trong khi muối KC1 lại ngăn cản tổng hợp các đoạn ADN dài [2] Tuỳ thuộc trình tự ADN được tổng họp, người ta thiết lập các điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR

để thu được nồng độ tổi đa của các đoạn ADN đó

1.3.2 K ỹ th u ậ t tá ch dòn g p h ân tử (m olecular cloning)

Từ những năm 1970, nhờ những kỹ thuật hiện đại, gọi chung là kỹ thuật tách dòng và tái tổ hợp, m ột gen bất kỳ có thể được phân lập tách ra khỏi genome, được biến đổi theo ý muốn và được đưa trở lại tế bào nuôi cấy [10]

Kỹ thuật tách dòng liên quan đến việc tạo ra phân tử ADN tái tổ hợp từ các nguồn khác nhau N guyên vật liệu chỉnh dùng cho kỹ thuật tách dòng liên quan đến enzyme giới hạn, enzym e ligase và vector Các phân tử A D N tái tổ họp được đưa vào tế bào, có khả năng tự sao chép trong tể bào chủ Khi đó đoạn ADN hay đoạn gen mong muốn xem như đã được tách dòng

Enzyme giới hạn là các endonuclease cắt tại một vị trí bên trong sợi ADN Các enzyme này có hai đặc tính: 1 - nhận biết m ột trình tự đặc hiệu trên sợi ADN (hay còn gọi là trình tự giới hạn), 2 - cắt phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu

9

Vị trí cắt có thể nằm xa trình tự giới hạn như các enzyme loại I, III và IV hoặc năm ngay tại trình tự giới hạn như các enzyme loại II [10] Trong kỹ thuật phân

tử, các enzyme giới hạn loại II được dùng phổ biến hom cả vì trình tự cat ADN

và trình tự nhận biết giổng nhau Các trình tự giới hạn của nhóm enzyme này gồm 4 - 8 nucleotide, có tính đối xứng Ví dụ: enzyme EcoRX tìm thấy ở E coli

có trình tự giới hạn là 5’-GỊAATTC-3’ với vị trí cắt ờ giữa G và A Các enzyme giới hạn thường có nguồn gốc từ vi khuẩn

Các enzyme giới hạn không chỉ khác nhau về trật tự và số lượng nucleotide trong đoạn trình tự giới hạn mà còn khác nhau về cách cẳt phân từ ADN Một số enzyme cắt tạo ra các đoạn ADN đầu bàng, một số khác tạo ra đoạn ADN có đầu 5’ hoặc 3’ nhô ra, gọi chung là đầu dính [3] Sở dĩ chúng được gọi là đầu dính vì hai đầu phân tử ADN sau khi cẳt có trình tự bổ sung với nhau, vì vậy chúng có xu hướng dính lại với nhau hoặc dính với các phân

tử ADN khác được cắt bởi cùng enzyme giới hạn Tính chất này được dùng trong tách dòng phân tử và tạo ADN tái tổ hợp

Việc sử dụng các enzyme giới hạn rất đơn giản Một lượng enzyme được trộn với ADN đích trong dung dịch đệm, sau đó phản ứng diễn ra ở nhiệt độ thích hợp Hoạt tính enzyme được tính theo đơn vị Unit (U) Một đơn vị hoạt

độ (1 U) enzyme được xác định tương đương với lượng enzyme cần thiết để cắt

1 |ig ADN trong 1 giờ ở điều kiện phản ứng Mặc dù phần lớn thí nghiệm đòi hỏi phải cắt hoàn toàn ADN đích, tuy nhiên có một số trường hợp cần sử dụng những nồng độ enzyme và thời gian ù khác nhau để đạt tới hiệu quả cắt bán phần

* Enzyme nối A D N ligase

ADN ligase làm nhiệm vụ hàn gắn những chỗ gián đoạn trong chuỗi đường - phosphate xuất hiện trong các quá trình ừao đổi chéo, sao chép ADN hoặc do các tác nhân khác nhau Trong kỹ thuật tách dòng, ADN ligase được

sử dụng để nối các đoạn ADN có nguồn khác nhau tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp.Vì vậy, ADN ligase được coi là chất keo phân tử ADN dùng để dính các mẩu ADN với nhau Do chức năng hết sức quan trọng này mà ADN ligase được coi là enzyme chủ chốt trong kỳ thuật tách dòng, quyêt định sự thành công của thí nghiệm

ADN ligase của thực khuẩn thể T4 được sử dụng nhiều nhất Mặc dù enzyme này có hiệu quả nhất khi nối các đoạn ADN được giữ với nhau băng đầu dính, nó cũng có thể nối các phân tử ADN đầu bàng trong những điều kiện thích hợp Enzyme T4 ADN ligase thường hoạt động tốt nhất ở 37°c nhưng có

thể sử dụng ở nhiệt độ thấp hơn nhiều (4°c - 22°C) để ngăn ngừa sự biến tính nhiệt của những đầu kết cặp ngắn, dính các phân tử ADN với nhau.

Sau khi được cắt bởi enzym e giới hạn, một đoạn ADN được cài vào vector

để có thể nhân lên với số lượng lớn trong tế bào vật chủ [ỉ] Các vector sử dụng vào mục đích này được gọi là vector tách dòng Các vector tách dòng ADN thường có 3 đặc điểm:

- Có m ột trình tự khởi đầu sao chép giúp phân tử ADN tái tổ hợp tự sao chép độc lập với nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ

- Có m ột dấu chuẩn (gen chọn lọc) cho phép phân biệt được các tể bào mang vector tái tổ hợp và các tế bào không mang vector tái tổ hợp

- Có vị trí cắt của m ột hay nhiều enzyme giới hạn khác nhau Đây chính là

vị trí cài đoạn A D N cần tách dòng vào vector Vị trí này được gọi là vị trí đa điểm

Tuỳ thuộc vào kích thước của các đoạn ADN cần lưu giữ mà người ta chọn các vector khác nhau, phổ biến nhất là các plasmid, genome của thực khuẩn thể, cosmid, các vector BAC, YAC Trong đó plasmid là vector tách dòng thông dụng nhất

Plasm id là những phân tử ADN dạng vòng, tồn tại trong tế bào vi khuẩn và nằm ngoài nhiễm sắc thể Plasm id có kích thước thay đổi khoảng 1 kb đến vài trăm kb Trong tự nhiên, plasm id có thể tái bản đồng thời hoặc độc lập với nhiễm sắc thể Thông thường, các plasm id tái bản độc lập thường có kích thước nhỏ và có số lượng bản sao lớn trong m ột tế bào vi khuẩn Plasm id thường mang những gen chống chịu khảng sinh, vì vậy những gen này được sử dụng

để chọn lọc tế bào chứa plasmỉd H iện nay có nhiều loại plasmid mang hai hoặc nhiều gen chọn lọc và vị trí đa điểm gồm nhiều trình tự nhận biết của các enzyme giới hạn Đặc biệt, vị ư í đa điểm của plasm id thường nằm trong trình

tự của một gen chỉ thị N hờ vậy, khi có đoạn ADN lạ chèn vào vị trí đa điểm, sản phẩm của gen chi thị đó không được biểu hiện N hư vậy, gen chọn lọc (thường là gen kháng kháng sinh) cho phép phân biệt được các tế bào mang vector tái tổ hợp và các tể bào không m ang vector tái tổ hợp còn gen chỉ thị giúp nhận biết các tế bào nhận plasm id chèn đoạn ADN lạ với các tế bào chỉ nhận plasm id không m ang đoạn ADN chèn

Các plasm íd kích thước nhỏ tái bản độc lập và có số bàn copy nhiều hay được sử dụng trong các kỹ thuật A D N tái tổ hợp Chúng thích hợp với các đoạn ADN không dài quá 7 kb Khi đoạn ADN có kích thước lớn, trải qua một số lần

11

nhân bản, đoạn này bị ngắn dần hoặc bị loại khỏi plasmid do tế bào có xu hướng đào thải ADN không cần thiết [2].

Biến nạp là quá trình tế bào chủ có thể tiếp nhận phân tử ADN ngoại lai hoặc theo cơ chế tự nhiên hoặc nhờ các kỹ thuật chuyển gen Trong tự nhiên, một số vi khuẩn như Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilỉs, Haemophilus influenzae và Neisseria gonorrhoeae có các cơ chế tiếp nhận ADN từ môi trường ngoài Chúng được gọi là các vi khuẩn khả biến tự nhiên Mặc dù trong

tự nhiên E coli không có tính khả biến, nhưng khi được xử lý với ion Ca2+, vi khuẩn này có thể tiếp nhận ADN từ môi trường ngoài [10] Các tế bào qua xử

lý như vậy được gọi là tế bào khả biến Để tìm ra và phân lập các tế bào khả biến mang vector tái tổ hợp, người ta nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường có chất kháng sinh tương ứng với gen chọn lọc có mặt trong vector

Nhìn chung, hiệu suất của quá trình biến nạp không cao [3], Chi một tỷ lệ nhỏ các tế bào được xử lý biến nạp có thể tiếp nhận plasmid tái tổ hợp Tuy nhiên, chính hiệu quả thấp như vậy giúp cho mỗi tế bào chi nhận duy nhất một vector tái tổ hợp Thuộc tính này giúp cho mỗi tế bào biến nạp và dòng tể bào

do chúng sinh ra chỉ mang một vector ADN tái tổ hợp duy nhất Do vậy, các nhà nghiên cứu có thể phân lập và tinh sạch được đễ dàng các gen hoặc sản phẩm của các gen một cách riêng rẽ từ hỗn hợp biến nạp vốn chứa nhiều đoạn trình tự ADN khác nhau

1.3.3 Phương pháp giải trình tự

Bản chất của phân từ ADN trước hết được thể hiện ở trình tự nucleotide

Từ cuổi những năm 1970, các phương pháp phân tích trình tự đã được hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới

Có hai phương pháp chính để giải trình tự ADN Phuơng pháp đầu tiên do Allan Maxam và Walter Gilbert đề xuất, sử dụng các hoá chất để phá huỷ nucleotide tại các vị trí xác định tạo ra các đoạn ADN chênh lệch nhau chỉ 1 nucleotide Phương pháp tiếp theo do Fred Sanger và Alan Couỉson đưa ra sử dụng enzyme để tổng hợp các đoạn ADN Đặc điểm cùa các đoạn ADN là có đầu 3’ mang một dideoxynucleotide đã biến đổi Vì thể phương pháp này còn gọi là phương pháp dideoxynucleotide và được áp dụng trong các máy xác định trình tự tự động Trên các máy tự động, acrylamide được nhồi trong các mao quản và các thông số của quá trình điện di như điện thế, nhiệt độ, thời gian cũng như lưu cất dữ liệu đều được kiểm soát tự động

12

CHƯƠNG 2 NG UYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

0.5F ccc ggg ttt tat ctt agc gtt gtt tta atg ct

0.5R ccc ggg aaa agc ttt aat taa aca tct tga cg

1F ccc ggg ctt tgc agg ata act aat agt cat gc

1R ccc ggg ỉta gag aga cga cga aga taa tgt ta

- Chủng Escherichia coli D H 5a, F- <D80/ứcZAM15 A(lacZYA-arg¥) U169

recA \ endA l h s d R ìl (rK - mK+ )phoA supE44 X- thi-ỉ gyrA96 relA l [36]

2.1.3 Hoá chất

- Taq A D N polym erase (Fermentas - Đức);

- dNTP m ix 2m M (Takara - Nhật);

- Các enzym e cắt giới hạn (Ferm entas - Đức, N ew England Biolabs - Anh);

- Các kit tách dòng gen, tinh sạch ADN, tinh sạch plasm id của Ferm entas - Đức, Qiagen - M ỹ; A m ersham Biosciences - Mỹ

- Thang chuẩn 100 bp và 1 kb của các hãng Fermentas - Đức, N ew England Biolabs - Anh, Inviữogen - Mỹ

- Các hoá chất khác đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử

2.1.4 Thiết bị

Các máy mỏc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng Công nghệ ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ protein và enzym

2.2 S ơ ĐÒ NGHIÊN c ứ u

Toàn bộ quá trình nghiên cửu được tóm tắt theo sơ đồ mô tả trên Hình 6

Mâu lá Arabíơopsis thaliana

Sản phầm PCR từ plasmid

Hình 6 Sơ đồ nghiên cứu tạo thang chuẩn ADN PCR và thang chuẩn ADN tái tổ hợp

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.3.1 Tách chiết A D N genom e của Arabidopsis íhaỉiana

Quy trình gieo trồng Arabidopsis thaliana được tham khảo trên trang web http://w w w arabidopsis.org [26] Hạt giống Arabidopsis thaliana được khử trùng bằng cồn 70% Sau đó hạt được trồng trên môi trường thạch MS Sau bốn tuần, lá cây Arabidopsis thaliana được thu hoạch để sử dụng cho việc tách chiết ADN genome

Quá trình tách ADN genome được tiến hành theo phương pháp của Saghai-M aroof và cộng sự [20] gồm các bước như sau:

- Nghiền 200 mg lá non 4 tuần tuổi trong Nitơ lỏng

- Bổ sung 900 nl CTAB 2% và 1 % p-mercapto ethanol, ủ 90 phút ở 65°c

- Bổ sung 450 nl C hloroform :Isoamyl (24:1), giữ 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 13000 vòng/phút ờ 4°c trong 10 phút

- Hút phần dịch phía trên sang ống mới

14

- Hút phần dịch phía trên sang ổng mới

- Bổ sung 2 lần thể tích cồn tuyệt đối, trộn đều, ủ ở -20°c

- Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4°c trong 10 phút, thu tủa ADN

- Rửa tủa lần lượt bằng các dung dịch rửa I (800 nl) và dung dịch rửa II (100|il) trong 5 phút, Đ ể tủa khô, hòa tan trong 100 |il đệm TE

2.3.2 Kỹ thuật PC R

Các phản ứng PCR được thực hiện với thành phần và điều kiện tối un như trình bày trên Bảng 4

Bảng 4 Thành phần và điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Thể tích (jil) Điều kiện

Biến tính: 94°c trong 30 giây Gắn mồi: 57°c trong 1 phút Tổng hợp: 72°c trong 2 phút Chu trình trên được lặp lại 40 lần

dNTP mix (2 mM mỗi loại) 2

Đệm Taq polymerase lOx 2

Taq polymerase (1 u/|il) 1

Phản ứng PC R sử dụng khuôn ADN genome của Arabidopsis thalỉana

và các cặp mồi (Bảng 3) nhàm khuếch đại các đoạn ADN có kích thước 1.0 kb,1.5 kb và 2 kb Việc lựa chọn khuôn, thiết kể mồi và sử dụng vector có trình nhận biết của Smaỉ giúp tạo ra 7 - 8 băng ADN trong phản ứng cắt bán phần

2.3.3* Phương pháp tách dòng sử dụng bộ kỉt của Fermentas

Sản phẩm PC R được đưa vào vector p J E T l.l dựa trên quy trình của Fermentas cho bộ sản phẩm GeneJET™ PCR Cloning Kit [8]

2.3.4 Phương pháp biến nạp

Sản phẩm của phản ứng nối được biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt [21] Thể biến nạp được chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh

Các bước tiến hành:

a) Tạo tể bào khả biển

- Nuôi 50 mi dung dịch tế bào E coli D H 5a trong môi trường LB lỏng đạt tới ODÓOO = 0.4 - 0.6; đặt mẫu trên đá khoảng 30 phút

- Ly tâm dịch nuôi cấy 2700g, 4°c trong 20 phút, thu cặn tế bào

- Hoà cặn trong 15 ml dung dịch MgCỈ2 80 mM, CaCl2 20mM ; ly tâm thu cặn

- H oà cặn trong CaCl2 100 m M sao cho m ật độ tế bào đạt OD6OO = 1 Bổ sung glycerol 100% đến nồng độ 15%.

- Chia hỗn hợp vào các ống nhỏ (50 - 100 ^1 mỗi ổng) bảo quản ở -80°c

b) Biến nạp

- Lấy tế bào khả biến từ -80°c, để trên đá 5 phút

- Bổ sung 5 |il hỗn hợp ligate, ủ trên đá 20 phút

- Sốc nhiệt hỗn họp ở 4 2 °c trong 45 giây, để lại trên đá 1 - 2 phút

- Bổ sung 1 m l LB, ủ 3 7°c ở 15 phút, lắc 200 vòng/phủt 3 7 °c trong 20 phút

- Trải dung dịch vi khuẩn trên đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh

2.3.5 Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn

a) Tách chiết plasm id sử dụng môi trường kiềm có chứa SDS [21]

Dung dịch kiềm có chứa chất tẩy SDS được sử dụng để tách chiếtplasmid từ E coli. Các bước tiến hành cụ thể như sau:

- Ly tâm 1.5 ml dung dịch vi khuẩn chứa plasmid (nuôi cấy qua đêm) ở 14000 vòng/phủt trong 5 ’ ở 4 °c, loại bỏ phần dịch nổi, để cặn tế bào khô

- Hoà cặn trong 100 nl dung dịch I (50mM Tris-HCl pH =8, 50 mM glucose, 10

mM ED TA p H8), ủ trên đá 5 phút

- Thêm 200 (li dung dịch II (0.2 N NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ, ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút

- Thêm 150 fil đung dịch III (3 M Potassium acetate pH5.2), đào nhẹ, ủ trên đá

5 phút Ly tâm 14000 vòng/phút ở 4°C15 phút, thu dịch nổi phía trên

- Bổ sung 1 thể tích phenol:chloroform :isoam yl (25:24:1), trộn đều Ly tâm

14000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên

- Thêm 0.6 thể tích isopropanol, đảo 3 - 5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 - 1 0 phút

- Ly tâm 14000 vòng/phút ở 4 ° c trong 15 phút

- Rửa tủa với 1 ml ethanol 70%

- Hoà tan tủa trong 20 - 30 ịil TE có bổ sung RNase (20 Jig/ml) và ủ ở 37°c trong 30 phút

- Plasmid được bảo quản ở 4 °c

b) Tách chiết plasm id sử dụng kit tỉnh sạch của Qiagen

Quy trình tinh sạch plasm id bằng bộ sản phẩm Q IAprep® Spin Miniprep Kit của Q iagen được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất [19]

2.3.6 Kỹ thuật xử lý plasm id bằng enzym e giới hạn [9]

Các bước tiến hành: m ột phản ứng cắt ADN bàng enzym e giới hạn được tiến hành trong tổng thể tích 20 |il với các thành phần như sau:

Buffer 10x (của enzyme) : 2 nl

2.3.10 Phương pháp xác định nồng độ ADN [21]

Nồng độ ADN được đánh giá qua phương pháp điện di và được xác định chính xác bằng phương pháp đo quang phổ Nồng độ và độ sạch của ADN đuợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm Nồng

độ ADN được tính theo công thức:

[ADN] = A260 X n X 50 (ng/ml)

Trong đó A260 : độ hấp thụ cùa ADN ở bước sóng 260 nm

n : số lần pha loãng mẫu

50 : nồng độ ADN ứng với độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm là 1.A280 là độ hấp thụ của protein ở bước sóng 280 nin ADN được xem là tinhsạch khi tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1.8 đến 2.0

L J U 0 1 1

Hình 7 Arabidopsis thaiỉiana được gieo trồng trong điều kiện phòng thí

nghiệm A: sau 2 tuần; B: sau 4 tuần;C: mẫu cây tham khảo trên trang web

Mau lá Arabidopsis thaỉiana bốn tuần tuổi được dùng để tách ADN genome theo phương pháp của Saghai-Maroof có cải tiến [20] Sản phẩm ADN genome sau đó được kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 8)

1 M

N :

Hình 8 Điện di sản phẩm ADN genome trên gel agarose 1%

Đường 1: ADN genome Đường M: thang chuẩn ADN Ikb

Băng ADN to, rõ chứng tỏ ADN genome được tinh sạch tốt, thích hợp làm khuôn cho các phản ứng PCR tiếp theo

3.2 KHUẾCH ĐẠI CÁC TRÌNH T ự 1 kb, 1.5 kb, 2 kb BẰNG PHẢN ỨNG PCR

Hai cặp mồi 0.5F/0.5R và 1F/1R được thiết kế dựa vào trình tự ADN genome của Arabidopsis thaỉiana trên trang web www.arabidopsis.org Hai cặp mồi cho phép khuếch đại các đoạn có kích thước 1 kb, 1.5 kb và 2 kb có chứa trình tự nhận biết của enzym e Smal ở giữa Các cặp mồi được thiết kế cũng chứa trình tự này ở đâu 5’ nhăm tận dụng các điểm cắt sẵn có trên vector và tạo

ra các băng trong thang chuẩn chính xác tới từng nucleotide Vị trí gẳn cùa các cặp mồi trên khuôn ADN genome và vị trí cắt của enzyme Smaì được minh hoạ trên Hình 9

Vi tri nhận biết của SmaI

Hình 9 Sơ đồ minh hoạ vị ừí gắn của hai cặp mồi nhằm nhân lên trình tự 1 kb,1.5 kb và 2 kb

Điều kiện của phản ứng PCR cho từng cặp mồi được tối ưu hoá về nồng độ mồi, nồng độ khuôn, nồng độ ion M g2+, số đợn vị Taq ADN polymerase, nhiệt

độ và thời gian gắn mồi (Bảng 4) Sàn phẩm của phản ứng PCR điện di trên agarose 1% được trình bày trên Hình 10

19

Hình 10 Điện di sàn phẩm PCR 1 kb, 1.5 kb và 2 kb trên gel agarose 1% Đường 1 - 3: sản phẩm PCR có kích thước I kb, 1.5 kb, 2 kb Đường M: thang chuẩn ADN 1 kb.

Kết quả điện di trên gel cho thấy các sản phẩm PCR đều cho một băng duy nhất, sáng rõ nét, có kích thước đúng như tính toán Điều này chứng tỏ các cặp mồi đã được thiết kế với độ đặc hiệu cao và chương trình chạy PCR là phù hợp

Để khẳng định m ột lần nữa tính chính xác của sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành cắt sản phẩm với enzyme Smaĩ. K ết quả trình bày trên Hình 11

Hình 11 Điện di sản phẩm PCR được cắt bởi Smal điện di trên gel agarose

1% Đường 1, 3: sản phẩm PCR 1 kb và 1.5 kb Đường 2, 4: sản phẩm PCR 1

kb và 1.5 kb xử lý với Smal Đường M: thang chuẩn ADN 1 kb.

Do đoạn 1 kb và 1.5 kb khi thiết kế có trình tự nhận biết của Smaỉ nằm ở giữa nên khi cắt không hoàn toàn với enzyme này đoạn 1 kb cho hai băng 1 kb và

20

0.5 kb (H ình 13, Đ ường 2); đoạn 1.5 kb cho ba băng 1.5 kb, 1 kb và 0.5 kb (Hình 13, Đ ường 4) K êt quả trên Hình 13 cho thấy các băng xuất hiện đúng như tính toán ban đầu Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR hoàn toàn thoả mãn yêu câu đặt ra N hư vậy, các thành phần, điều kiện của phản ứng PCR đã cho kết quả chính xác, khả năng lặp lại thí nghiệm cao Các sản phẩm PCR sau đó được sử dụng đưa vào vector p J E T l 1.

Để thu được các vector tái tổ hợp, chúng tôi thực hiện một chuỗi các thí nghiệm; sản phẩm của thí nghiệm trước được đùng cho thí nghiệm tiếp theo Sàn phẩm PCR được đưa vào vector đầu bằng pJET 1.1 trong phản ứng nối sử dụng A D N T4 ligase Sản phẩm của phản ứng nối được biến nạp vào chủng tế bào D H 5a bằng phương pháp sốc nhiệt sử dụng CaCl2 Các khuẩn ỉạc được sàng lọc trên môi trường LB đặc bổ sung ampicilin 50 ng/ml Sau đó đoạn ADN chèn trong vector được kiểm tra nhờ xử lý với enzyme giới hạn

3.3.1 T á c h d ò n g v e c to r tá i tổ hợ p chứ a đoạn ADN 1 kb

Đoạn A D N 1 kb được đưa vào vector p J E T l.l, tiếp đó vector được biến nạp vào tế bào D H 5a Plasm id được tách chiết từ 5 khuẩn lạc để xử lý với hai loại enzyme Xhoì và Ncoỉ có trình tự cắt nằm trong vector, ở hai đầu của đoạn chèn Kết quả sau khi xử lý enzym e được thể hiện trên Hình 12

ụ -3 kb

■4— 1 kb

Hình 12 Điện di sản phẩm cắt plasmid pJE T l.l chèn đoạn 1 kb với Xhoì và

Ncoĩ trên gel agarose 1% Đường 1 —5: plasmid của 5 khuân lạc Đường M: thang chuẩn ADN 1 kb

21

Plasm id tái tổ hợp xử lý hoàn toàn với hai enzyme Xhoỉ và Ncol cho sản phẩm gôm 2 băng: m ột băng cỏ kích thước của đoạn chèn và một băng cỏ kích thước của vector K êt quả trên Hình 12 cho thấy đã tách dòng thành công vector p J E T l.l tái tổ hợp chèn đoạn 1 kb (Hình 12, Đường 2, 3) Bên cạnh 2 khuân lạc m ang đúng đoạn chèn 1 kb còn có khuẩn lạc sổ 1 và sổ 4 cỏ đoạn chèn khoảng 850 bp, khuẩn lạc số 5 có đoạn chèn khoảng 350 bp Với các khuẩn lạc m ang đoạn chèn kích thước nhỏ này, chúng tôi dự định sẽ sử dụng cho thang chuẩn PCR.

3.3.2 Tách dòng vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN 1.5 kb

Tương tự đoạn 1 kb, đoạn 1.5 kb được đưa vào vector p J E T l.l Chúng tôi chọn 5 khuẩn lạc, nuôi cấy riêng rẽ để thu plasmid tái tổ hợp Plasm id tách chiết được x ử lý với enzym e Smal để kiểm tra kích thước của plasm id tái tổ hợp và kích thước đoạn chèn K ết quả được trình bày trên Hình 13 Do trong vector có chửã m ột vị trí nhận biết của Smal nên sản phẩm thu được sau khi cắt hoàn toàn với enzym e sẽ bao gồm băng 1 kb, hồn hợp băng 500 bp - 532 bp và băng 2.6 kb (kích thước còn lại của vector)

2.6 kb

1 kb

500 - 532 bp

H ình 13 Điện di sản phẩm cắt plasmid pJE T l.l chèn đoạn 1.5 kb với Smal

trên gel agarose 1% Đường 1 - 5 : plasmid của 5 khuân lạc Đường M: thang chuẩn ADN 1 kb

K ết quả Hình 13 cho thấy plasm id của 5 khuẩn lạc khi xử lý với Smaỉ đều văng ra các băng có kích thước như tính toán N hư vậy chúng tôi đã tách dòng thành công vector p JET 1.1 tái tổ hợp mang đoạn 1.5 kb

22

3.3.3 Tách dòng vector tái tổ họp chứa đoạn ADN 2 kb

San phẩm PCR 2 kb được đưa vào vector pJET 1.1 và biến nạp vào tế bào vi khuẩn Chúng tôi chọn 7 khuan lạc để tách plasmid Sau đó các plasmid được cãt với hai enzym e Xhoỉ và Ncoỉ nhằm kiểm fra kích thước đoạn chèn Sản phẩm phản ứng cắt được điện di trên gel agarose 2% (Hình 14)

thang chuẩn ADN 100 bp

Kết quả ở Hình 14 cho thấy các đoạn chèn vào đều có kích thước nhỏ hơn 0.5

kb N hư vậy, vector pJET 1.1 không có khả năng mang đoạn 2 kb Tuy nhiên các khuẩn lạc chứa các plasm id này vẫn được lưu giữ với m ong muốn tạo ra các băng có kích thước nhỏ cho thang chuẩn

3.4 THIẾT KẾ BĂNG 2 kb

Do không thu nhận được vector p J E T l.l mang đoạn 2 kb, chúng tôi đã sử dụng m ột phương pháp khác để có được băng này cho thang chuẩn N hận thấy vector pPolylII có kích thước 2117 bp, gần với kích thước mong muốn, chúng tôi đã xử lý plasm id nảy với m ột số enzyme giới hạn có trên bản đồ vị trí cắt giới hạn K ết quả xử lý enzym e được thể hiện trên Hình 15

23

Hình 15 Điện di sản phẩm pPolylII xử lý với các enzyme giới hạn trên gel agarose 1% Đường 1: pPolylII cất với Xmal. Đường 2: pPolylII cắt với Noú

Đường 3: pPolyllI cắt với Pvu\. Đường M: thang chuẩn 1 kb

Vector pPolylII cắt với enzyme Not\ cho đoạn ADN có kích thước 2 kb đủng như tỉnh toán theo bản đồ Đoạn này được tinh sạch từ gel agarose, được đóng vòng và biến nạp vào vi khuẩn DH5a Thể biến nạp chứa plasmid pPolylII kích thước 2 kb được xử lý với enzyme đầu bằng Seal cho đoạn ADN có kích thước chỉnh xác 2 kb Như vậy, khó khăn khi thiết kế băng 2 kb đã được khắc phục

3.5 THIẾT KẾ CÁC BẢNG KÍCH THƯỚC NHỎ

Các khuẩn iạc mang các đoạn chèn nhỏ hơn kích thước mong muốn được sàng lọc để chọn ra một số khuẩn lạc nhằm đưa các đoạn này vào thang chuẩn PCR

3.5.1 Vector tái tổ họp mang đoạn chèn 850 bp

Kết quả trên Hình 14 cho thấy một số thể biến nạp nhận vector pJET 1.1 mang đoạn ADN có kích thước khoảng 850 bp (Hình 14, Đường 1) Nhẳm mục đích sử dụng đoạn này trong thang chuẩn PCR, kích thước chỉnh xác của đoạn được xác định bằng giải trình tự tự động Kết quả cho thây đây là đoạn có kích thước 845 bp (Hình 16)

*20 430 J40 450 -160

T T c T T A A T T TAT T ĩ TAC T c T T CT TI c G I GT T 11T I T T TC.i G CA T G C I C.AA I

Hình 16 Minh hoạ trình tự đoạn chèn 845 bp A: trình tự chiều xuôi B trình

tự chiều ngược

Dùng cặp mồi 0.5F/0.5R cho phản ứng PCR với khuôn là plasmid tái tổ hợp, chúng tôi đã nhân lên một băng kích thước 845 bp (Hình 17) Băng ADN trên gel điện di to, sáng, rõ ràng, thích hợp cho việc tạo thang chuẩn

Hình 17 Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 0.5F/0.5R với khuôn là plasmid tái tồ hợp trên gel agarose 1% Đường M: thang chuân ADN Ikb Đương 1: plasmid pJETl 1 chèn đoạn 845 bp Đường 2: plasmid pJETl 1 chèn đoạn 1 kb

3.5.2 Vector tái tổ họp mang đoạn chèn nhỏ hơn 500 bp

Như đã trình bày ở m ục 3.3.3., mặc dù đoạn ADN chèn đầu tiên có kích thước 2 kb nhưng các vector tái tổ hợp mang các đoạn chèn có kích thước đeu

k

nhỏ hơn 2 kb Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 1F/1R cho thấy các đoạn chèn đều mât VỊ trí găn m ô i (Phụ lục 03) Sử dụng cặp mồi của vector p JE T l.l nằm ngoài đoạn chèn, kích thước các đoạn chèn được thể hiện trên Hình 18.

Đường M: thang chuẩn ADN 100 bp

Sản phẩm PCR với 6 plassm id tái tổ hợp gồm các băng có kích thước khoảng

150 bp, 200 bp, 350 bp và 500 bp Trong số các băng này chúng tôi quyết định chọn băng khoảng 200 bp (Hình 18, Đường 3) và băng khoảng 350 bp (Hình 18, Đường 1) để xác định kích thước chính xác bàng máy giài trình tự tự động (Hình 19)

K ết quả cho thấy các đoạn này có kích thước tương ứng là 115 bp và 270

bp Khi đưa vào thang chuẩn PCR, các băng này cỏ kích thước lần lượt là 199

bp vả 354 bp do cộng thêm 84 bp kích thước của vector

3.6 PHỐI TRỘN CÁC SẢN PHÁM TẠO THANG CHUẨN ADN

3.6.1 Phối trộn tạo thang chuẩn từ sản phẩm PCR

Cac đoạn A D N có kích thước 199 bp, 354 bp được nhân bản với cùng một cặp môi của vector p J E T l.l, trong khi các đoạn 845 bp, lkb và 1.5 kb được nhân bản bởi các cặp môi 0.5F/0.5R và 1F/1R Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng các vector tái tổ hợp này để xây dựng thang chuẩn PCR gồm 5 băng Ngoài ra, băng 0.5 kb được tạo ra khi cắt đoạn 1 kb với Sma\ và băng 2 kb được tạo ra khi cắt vector pPolylII đã cải biến với enzyme đầu bàng Seal. Nồng

độ ADN của 7 băng được xác định bằng phương pháp điện di và đo quang phổ Sau đó các bãng được phối trộn theo tỷ lệ như trong Bảng 5 để tạo ra sản phẩm thang chuẩn A D N PCR như trình bày trên Hình 20

Bảng 5 Tỷ lệ các băng trong thang chuẩn ADN PCR

Kích thước băng (bp) Tỷ lệ trong thang chuẩn ng/đường chay

Hình 20 Thang chuẩn ADN PCR A: Đường 1 - 7: các đoạn ADN riêng rẽ

trong thang chuẩn PCR B: Thang chuẩn PCR sau phôi trộn Đường M l: thang chuẩn ADN 1 kb của hãng Invitrogen Đường M2: thang chuân ADN PCR thiết ké Đường M3: thang chuẩn ADN 1 kb cùa hãng Fermentas

27

3.6.2 X ây dựng thang chuẩn tái tổ hợp

Theo thiết kế ban đầu, đoạn 1.5 kb mang 3 trình tự cắt của enzyme Smaĩ. Bên cạnh đó vector p J E T l.l cũng mang trình tự cắt của enzyme này, cách vị trí chèn là 529 bp D o vậy chúng tôi hi vọng ràng khi xử ]ý vector p JE T l.l tái tổ họp mang đoạn 1.5 kb với Smal bằng kỹ thuật cắt bán phần sẽ thu được các băng trong thang chuẩn với bước nhảy là 500 - 600 bp (Hình 21)

-2600 bp

Ví tri nhận biết cùa Smtri

Hình 21 Các băng dự kiến có trong thang chuẩn tái tổ hợp khi cắt không hoàn toàn vector tái tổ hợp với Smaỉ.

Theo định nghĩa, 1 đon vị (IU ) enzyme giới hạn cắt hoàn toàn 1 |ig ADN trong tổng thể tích 50 |il (tương đương 20 ng/fil), trong vòng 60 phút Căn cứ theo định nghĩa này, để cắt không hoàn toàn plasmid p J E T l.l chèn đoạn 1.5 kb chúng tôi tăng nồng độ ADN và giảm thời gian ủ phản ứng Lượng enzyme sử dụng cố định là 1 đơn vị Nồng độ ADN và thời gian ủ được tối ưu hoá nhằm thu được thang chuẩn A D N với các băng rõ ràng, sắc nét

a) Chuẩn nồng độ ADN

Để chuẩn nồng độ A DN, chúng tôi ủ các phản ứng trong 60 phút, nồng độ ADN thay đổi từ 500 ng/fil đến 5000 ng/jnl Kết quà thể hiện trên Hình 22

28