Kiểm tra hoạt tính chống ung thư trên động vật thí nghiệm của cisplatin tổng hợp tại Việt Nam

Khi chuột bị ung thư, hàm lượng albumin và globulin tổ n s số trong huyết thanh đều bị suy giảm, khi điều trị bằng CISPLATIN, hàm lượng globulin tổng số tăng lên 11% so với đối chứng.. -

Đ ẠI H Ọ C Q U Ố C G IA H À NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

KIỂM TRA HỌAT TÍNH CHốNG ƯNG THƯ TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM CỦA CISPLATIN TổN G

HỢP TẠI VIỆT NAM

(Dáo cáo tổng hợp đ ể tài nghiên cứu khoa học đặc b iệ t cấp

Đại học Q u ố c gia Hà Nội)

Mã số: Q G - 0 0 - 0 7

Những cán b ộ phối hợp:

GS TS TRẦN VÃN HANH PGS TS TRỊN H ĐÌNH ĐẠT PGS TS ĐỖ NGỌC LIÊN

TS NGUYỄN T H Ị QUỲ PGS TS TRẦN T H Ị ĐÀ

Hà Nôi - 2002

M Ụ C L Ụ C

Trang

GIẢI THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH SÁCH NHŨNG NGƯỜI THỰC HIỆN ĐỂ T À I 2

DANH MỤC CÁC BẢNG s ố L IỆ U 3

DANH MỤC CÁC HÌNH 3

B Á O C Á O T Ó M T Ắ T 4

SU M M A RY 8

BÁO CÁO TỔNG HỢP 11

I MỞ ĐẦU 12

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PH Á P N GH IÊN c ứ u 13

1 Đối tượng và nguyên l i ệ u 13

2 Mô hình thí n g h iệ m 13

3 Phương pháp nghiên c ứ u 14

4 Xác định liều tiêm C IS P L A T IN 14

5 Xác định tỷ số phát triển u và hiệu lực kháng u của t h u ố c 14

6 X á c đ ị n h c h ỉ s ố p h â n b à o u n g t h ư 14

7 Xác định m ật độ hồng cầu và bạch cầu của máu ngoại v i 15

8 Xác định số lượng TBUT di căn vào m á u 15

9 Xác định hàm lượng albumin và globulin tổng s ố 15

10 Phân tích hệ enzym esteraza trong huyết th a n h 15

11 Nghiên cứu hình thái học tế bào ung t h ư 15

12 Xác định thời gian sống t h ê m 15

13 Bảo quản tế bào ung thư trong ni tơ lỏ n g 16

14 Đ ịa điểm tiến hành các thí n g h i ệ m 16

15 Thời gian tiến hành các thí n g h iệ m 16

III KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ THẢO L U Ậ N 16

1 Tổng họp và tinh chế C IS P L A T IN 16

2 Duy trì mô hình ung thư thực n g h i ệ m 16

3 Xác định liều tiêm của CISPLATIN tổng hợp tại Việt N a m 18

4 Hiệu ứng ức ch ế sinh khối u của CISPLATIN tổ n s hợp tại Việt N a m 19

5 Khả năng ức chê phân bào của CISPLATEN tổng hựp tại Việl

N am 21

6 Ảnh hưởng của CISPLATIN lên một số chỉ tiêu sinh lý máu ngoại vi của chuột bị ung thư (xem thêm chi tiết ở phụ lục 5 ) 22

7 Ánh hưởng của CISPLATEN tới thành phần một số protein chủ yếu trong huyết thanh chuột bị ung thư 23

8 Kết quả điện di hệ enzym ESTERAZA 26

9 Sự gây độc tế bào (cytotoxic) của CISPLATTN trên hình ánh siêu cấu trúc của tế bào u báng Sarcoma 180 27

10 Tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột bị ung thư được điều trị bằne CISPLATIN (xem thêm chi tiết ở phụ lục 6 ) 30

11 Bảo quản tế bào uns thư trong nitơ lỏng 31

12 Cơ chế tác động của CISPLATIN lên tế bào uns thư và hiệu quá kháng u nói chun£ cúa nó 31

IV KẾT L U Ậ N 34

V ĐỀ N G H I 35

TÀI LIỆU TH AM K H Ả O 36

PHỤ LỤC 43

I NHỦNG b á o c á o B ổ SUNG: P h ụ lục 1- Liều tiêm thích hợp của CISPLA TIN tổng hợp tại Việt Nam cho chuột nhắt tráne Swiss. Trần CôiiiỊ Yén, Nguvển Thị Quỳ, Hoàng Tlụ M ỹ N h u n g 44

P h ụ lục 2 - Nghiên cứu ảnh hướne của CISPLATIN đến E n /y m E S T E R A Z A trone huyết thanh m áu ch u ộ t m an e u bánii Sarcoma 180. Trịnh Đình Đạt Nguyễn Thị Q u ỳ 4 Ọ P h ụ lục 3 - Báo cáo kết quả thí ngh iệm giữ e iố n s tế bào đ ộ n s vật Irone đône lạnh. N guyễn Tliị Quỳ Trần Cóng Yên H o à n ° Thị M ỹ N h u n g 52

Phụ lục 4 - Trần Còng Yên, H oàng Thị Mỹ N hung, Nguyền Thị Quỳ

(2001):

Bước đáu khảo sát hiệu ứns ức c h ế sinh khối u của CISPLATIN tổne

hợp tại Việt Nam.

Ts Sinh học, số đầu 2003 đã nhận b à i

Phụ lục 6 - Trần Công Yên, H oàng Thị Mỹ Nhung, Nguyễn Thị Quỳ, Trần Thị Đà, L ê Hải Đãng (2000):

Đ ánh giá hiệu ứne cúa CISPLATIN sản xuất tại Việt N am lên thời gian số n e thêm của chuột nhắt trắne Swiss m ane u báne Sarcoma 180.

Tc Dược học, số 296, 12, 2000: 16 - 1 8

68

Phụ lục 7 - Trần Công Yén, Nguyền Thị Quỳ (2001):

Một chạne đườnsỉ nghiên cứu une thư thực nghiệm (1987 - 2001 )

Toàn tập, Hội tháo quốc tế Sinh học, Hà Nội - Việt Nam

2 - 5/7/2001: 285 - 2 90 72

Phụ lục 8 - Nguvễn Thị Trâm (2002):

Điều trị una thư bằns thuốc nội: Hiệu quả rõ rệt qua thực niihiém

Báo Giáo dục & Thời đại, số 151, 1 7 /12/2002 79

ra KẾT QUÁ ĐÀO TẠO

Phụ lục 9 - Các khóa luận, luận văn và luận án đã hướng dán:

9.1 - Luận án Tiến sỹ H óa học: Dương Bá Vũ H0 9.2 - Luận văn Thạc sỹ Hóa học: N gu yễn Thị Thanh Chi XI

9 7 - K hóa luận Cử nhãn Sinh học: Khuất Thị K iều Oanh X6

IV PHIẾU ĐẢNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u KHOA HOC - CÒNG NGHỆ 87

L D 5 0 : 50% Lethal Dose (liều gây chết một nửa)

O D : Optical Density (Mật độ quang học)

T B U T : T ế bào ung thư

T D : Therapeutic Dose (Liều điều trị)

U T : U ng thư

U T T N : Ung thư thực nghiệm

Bộ môn Mô - Phôi Học viện Quân y

D A N H M Ụ C C Á C B Ả N G s ố L IỆ U

Bảng 1 - Số liệu tổng hợp các thí nghiệm khảo sát hiệu ứng kháng u báng

Sarcoma 180 của CISPLATIN

Bảng 2 - Kết quả thăm dò ảnh hưởng của CISPLATIN lên máu ngoại vi

chuột thí nghiệm

Bảng 3 - Mật độ quang học của dịch chiết albumin và globulin tổns số trong

huyết thanh chuột

Bảng 4 - Hàm lượng albumin và globulin tổng số trong huyết thanh chuột thí

nghiệm

D A N H M Ụ C C Á C H ÌN H

Hình 1 - Sơ đồ bố trí các thí nghiệin

Hình 2 - Mô hình UTTN trên chuột nhắt trắng Swiss

Hình 3 - Một ca mổ chuột để lấy mẫu xét nghiệm

Hình 4 - Đường cong biểu diễn tỷ lệ chết của chuột dưới tác động cứa

CISPLATIN với các liều lirợníĩ khác nhau

H ìn h 5 - Á n h h ư ớ ng củ a C I S P L A T I N lên tỷ s ố ph át triển u b á n g

H ìn h 6 - Sự thoái lui sinh khối u dưới tác đ ộ n s c ủ a C IS P L A T IN

H ìn h 7 - Á n h h ư ỏ n g của C I S P L A T I N lên chì s ố phán b à o UIIS thư.

Hình 8 - Ảnh hưởn£ của CISPLATIN lên các pha phân bào une thư

H ìn h 9 - T ế bào u n g thư di căn vào m á u chuột.

H ìn h 10 - Đ iện di đ ồ protein h u y ế t th a n h c h u ộ t th í n g h iệ m

H ìn h 11 - Sự biến đ ộ n c h à m lư ợng a lb u m in và g lo b u lin t ổ n 2 s ố tr o n 2 h u y ế t

thanh chuột thí nghiệm

H ìn h 12 - Đ iệ n di đồ hệ e n z y m E S T E R A Z A tro n g h u y ế t th a n h c h u ộ t th í

nghiệm

H ìn h 13 - Ả n h hiển vi điện tử t ế b à o u n g thư S a rc o m a 180 b in h thư ờim

H ìn h 14 - Ả n h H V Đ T c ủ a T B U T S a r c o m a 180 c h ế t th eo k iể u ho ại tứ ớ giai

D A N H M Ụ C C Á C B Ả N G s ố L IỆ U

Bảng 1 - Số liệu tổng hợp các thí nghiệm khảo sát hiệu ứng kháng u báng

Sarcoma 180 của CISPLATIN

Bảng 2 - Kết quả thăm dò ảnh hưởng của CISPLATIN lên máu ngoại vi

chuột thí nghiệm

Bảng 3 - Mật độ quang học của dịch chiết albumin và globulin tổng số trong

huyết thanh chuột

Hình 4 - Đường cong biểu diễn tỷ lệ chết của chuột dưới tác động của

C IS P L A T IN với c á c liều lư ợng k h á c nhau.

H ìn h 5 - Ả n h h ư ở ng của C I S P L A T I N lên tỷ s ố ph át triển u b á n g

H ìn h 6 - Sự thoái lui sinh k h ố i u dưới tác đ ộ n s c ủ a C IS P L A T IN

H ìn h 7 - A n h hư ờ ng của C I S P L A T I N lên chi số phán b à o 11112 thư.

H ìn h 8 - Ả n h hư ở ng củ a C I S P L A T I N lên các pha p h â n b à o u n g thư.

H ìn h 9 - T ế b à o un g thư di căn vào m á u chuột.

H ìn h 10 - Đ iệ n di đ ồ protein h u y ế t th a n h c h u ộ t thí n g h iệ m

H ìn h 11 - Sự biến đ ộ n s h à m lư ợ n s a lb u m in và g lo b u lin tổn í s ố tro n g h u y ế t

H ìn h 17 - Ả n h H V Đ T củ a T B U T c h ế t th eo c h ươn 2 trình ở c iai đ o ạ n cuối.

H ìn h 18 - Biếu đ ồ so sánh thời g ia n sốníi tru n g b ình củ a c h u ộ t ló đối c h ứ n g

và lô điều trị.

Hình 19 - Cấu trúc khôns gian của CISPLATIN

Hình 20 - Anh hướng của các chế phẩm đã thử lên chi số phát triển u báng

Sarcoma 180 (G R 9 f)

3

BÁO CÁO TÓM TẮT

IV MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

1 Tổng họp, tinh chế và cung cấp ổn định CISPLATIN cho các thí nghiệm

2 Duy trì mô hình ung thư thực nghiệm trên chuột đê thử thuốc thường xuyên

3 Tìm liều tiêm thích hợp CISPLATIN cho chuột bị u n s thư

4 Bước đầu khảo sát hiệu ứng ức c h ế sinh khối u của CISPLATIN

5 K hả năng ức chế phàn bào ung thư của CISPLATIN

6 Khảo sát hiệu ứng của CISPLATIN lên một sô chì tiêu miễn dịch và

9 Công bố 4 bài báo trên các tạp chí khoa học quốc gia và quốc tế.

10 Đào tạo 1 Tiến sỹ, 02 Thạc sỹ, 03 Cử nhân

H ITOKAAVA (1989)

5 CISPLATIN đã ức chế 50% khả năng phân bào của u báng Sarcoma

180, nhưng không ảnh hưởng rõ nét tới tỷ lệ phần trăm các pha phân bào

6 CISPLATIN đã làm giảm 25,59% số lượng hồng cầu và giảm 36,17% số lượng bạch cầu, nhưng hạn chế suy giảm bạch cầu lympho, ỏ'

m áu ngoại vi chuột ung thư được điều trị so với chuột ung thư không điều trị

7 Khi chuột bị ung thư, hàm lượng albumin và globulin tổ n s số trong huyết thanh đều bị suy giảm, khi điều trị bằng CISPLATIN, hàm lượng globulin tổng số tăng lên 11% so với đối chứng

8 Số lượng tế bào ung thư di căn vào máu ngoại vi của chuột unơ thư

9 Điện di hệ enzym esteraza trong huyết thanh chuột bị ung thư cho thấy ba băne Rf9, R f l0 , Rf 11 đã hòa lẫn vào nhau tạo thành dải liên tục

Đ iều trị b ằ n s CISPLATIN không có ảnh hưởng rõ nét tới thành phần esteraza nói trên

10 Hình ảnh hiển vi quang học và hiển vi điện tử cho thấy tế bào ung thư Sarcoma 180, dưới tác động của CISPLATIN, đã tăng tý lệ chết lên gấp 6,5 lần so với đối chứng CISPLATIN còn làm tăng tỷ lệ tế bào ung thư chết theo chương trình (apoptosis) so với kiểu chết hoại tử (necrosis).

11 CISPLATIN đã có tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột

bị ung thư có điều trị lên 40% so với đối chứng (20,3 ngày/14,5 ngày) Đặc biệt ở lô điều trị có 4/10 số chuột bị tiêu biến u và sống sót qua thí nghiệm

12 Đã bảo quản thành công dòng tế bào u báng Sarcoma 180 trong nitơ lỏng để làm đối tượng nghiên cún lâu dài Ngoài ra còn bảo quản thêm được 5 dòng TBUT khác phục vụ cho các thí nghiệm in vitro trong thời gian tới, đó là: tế bào Hella, TBUT gan Hep G2, TBUT phổi A459, TBUT dạ con SKOV 3 và TBUT tuyến tiền liệt PC3

13 Đề tài công bố 5 bài báo trên các tạp chí khoa học trong nước và quốc tế (đặc biệt trong đó có công trình tổng kết 15 năm nghiên cứu ung thu' thực nghiệm 1987 - 2002)

14 Đã đào tạo được 1 Tiến sỹ, 2 Thạc sỹ và 4 cử nhân khoa học thuộc lĩnh vực nghiên cứu của đề tài

7

S U M M A R Y

I PROJECT TITLE

T est for an tican cer activity on the experim ental anim als o f C ISPL A T IN

m ade in V iet nam

(The special scientiýic proịect o f Hanoi N ational Universityì

N umerical Code: GQ 00.07 (2000 - 2002)

II MAIN RESPONSIBLE PERSON

Ass Prof Dr T R A N CONG YENIII COORDINATORS

1 Dr Nguyên Thi Quy

2 Ass Prof Dr Tran Thi Da

3 Prof Dr Tran Van Hanh

4 Ass Prof Dr Trinh Dinh Dat

5 Ass.Prof.Dr Do Ngoe Lien

IV T H E TARGETS OF THE P R O JE C T

1 CISPLATIN made in V ietnam is vvell provided for anticancer experiments

2 The experimental cancer pattern (Sarcoma 180 ascitic turnor cell line

in mice) is ahvays maintained for drug trials

3 Search a suitable injection dose of CISPLATIN for cancer mice

4 Study on the antitumor effects of CISPLATINon Swiss mice carrying SarcomalBO ascitic tumor cells

5 Inhibitive possobility of CISPLATIN regarding tumor cell division

6 Effects of CISPLATIN on sorne immiinolosiiatl and molecular genetic indexes

7 Possiblitv of CISPLATIN for prolonsiation of liíc span of cancer mice

8 Preserve Sarcoma 180 ascitic turnor cell line in nitrogen liquid.

9 Publication: 4 articles on the scientiíic revievvs

10 Training: 01 doctor, 02 masters and 03 bachelors

V RESULTS

1 1500mg CISPLATIN have been synthesized and puriíied in Hanoipedagogical Institute, whith the íorm ula is Cis [Pt (N H 3C1)2J

2 The Sarcoma 180 ascitic tum or in Swiss mice was always maintained

in our laboratory for drug trials

3 LD 50 of CISPLATIN m ade in Vietnam on Swiss mice is 15mg/kg.corp The effective anticancer dose of CISPLATIN on the

(O.lómg/animal)

4 The Inhibitive effect of CISPLATIN OI1 the Sarcoma 180 ascitictuinor is 93.4% It’s efficacy is (+++) accordine to H rrOKAVVA range of antitumor activity

5 CIPLATIN has capacity to inhibit 50% mitotic index of tum or cells

6 CISPLATIN makes the num ber of red blood cells in the treatedcancer mice decrease 20.59%, the total num ber of \vhite bloocl cells decrease 36.17% (but percentage of lymphocytes is slowly decrease) in comparison white the Controls

7 The total content of albumin and globulin has been decreased in

se rum of mice carrying tumor But CISPLATIN icreased 11% of the total globulin content in serum of treated mice

8 CISPLATIN reduces the rate of metastatic cancer cells into theperiferical blood in the treated mice up to 93.25% in comparison

9 CISPLATIN has not clear effect on the com ponents o f esterase in serum of cancer mice

9

10 Microscopic and electronomicroscopic images showed that thepercentage of tumor cell death by CISPLATIN increased up to 6.5 times more than control In that the proportion of the apoptosis is larger than necrosis.

11 The prolongation of life span of the treated mice was 40% morethan the Controls (20.3 days and 14.5 days respectively) Especially, there were 4 o f 10 cancer mice were survived

12 The Sarcoma 180 ascitic tum or cell line was well preserved innitrogen liquid Other 5 tum or cell lines were preserved too, such as: Hella cells, Hep G2, A459 SKOV 3 and PC3 These cell lines will provide for in vitro and in vivo experiments in the next time

13 5 articles vvere published on the scientiíic reviews

14 1 doctor, 02 master ADN 4 bacheloís have received theyer degree

XÁC NHẬN CỦA ĐẠI HOC QUỐC GIA

HÀ NỘI (C ơ QUAN CHÚ QUẢN)

CS.T

BÁO CÁO TỔNG HỢP

I M Ở Đ Ẩ U

Tinh hình bệnh ung thư trên th ế giới cũng như ở Việt N am ngày càng gia tăng và tỷ lệ tử vong ngày càng nhiều Bệnh nhân ung thư chủ yếu là đang ở tuổi lao động và đặc biệt là những người lớn tuổi có kinh nghiệm trong lao động sản xuất hoặc có trình độ chuyên môn cao ở mọi ngành nghề,

m ọi lĩnh vực khoa học - công nghệ

Chủ trương của Đảng và N hà nước ta là cố gắng phát huy nội lực, tự túc các dược phẩm trong nước, thay thế thuốc nhập ngoại để trị bệnh cho nhân dân, nhất là những bệnh nhân nghèo

Trong những năm qua, ở nước ta đã bào chế được nhiều loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư có hiệu quả như: G A C A V IT (Bệnh viện Trung ương

Q u â n đ ộ i 1 0 8 ), F I L A M I N ( H ọ c v i ệ n Q u â n y ), A S L E M ( T r ư ờ n c Đ ạ i h ọ c Dược Hà Nội), PANACRIN (Viện Dược liệu trung ương) và CA DEF (viện công nghệ sinh học, TTKHTN và CN Quốc gia), trong đó có 3/5 loại thuốc được sự phối hợp nghiên cứu của phòng thí nghiệm chúng tỏi

Phức chất CISPLATIN (II) là một ch ế phẩm có hoạt tính chỏng ung thư cao mà nhiều nước trên thế giới đã bào ch ế thành thươns phẩm là CISPLATIN để điều trị ung thư Thuốc này có phổ điều trị khá rộng: các ung thư vùng đầu - cổ, ung thư gan, ung thư buồng trứng, dạ con, tinh hoàn và ung thư tuyến tiền liệt Hàng năm, nước ta phải nhập hàng chục ncàn lọ CISPLATIN loại lOmg với giá cao (khoảng 60.000VNĐ/lọ), mỗi đọt điều trị cho bệnh nhân phải tốn hàng triệu đồng, m à không phải chỉ điều trị một đọt

N ăm 1998, lần đầu tiên ở nước ta, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tổng hợp thành công phức chất CISPLATIN (II) Đây là một chế phẩm có nhiều hứa hẹn đóng góp tích cực vào việc bào ch ế thuốc chôn" un 2 thư ở nước ta

Từ giữa năm 2000, được Đại học Quốc Gia Hà Nội tài trợ kinh phí,

c h ú n g tô i đ ã t i ế n h à n h n g h i ê n c ứ u đ ề tài:

K iể m tra hoạt tính cliếng ung th ư trên độ n g vật thí nghiệm của

C IS P L A T IN tổng hợp tại Việt N am

Với các mục tiêu sau:

- Duy trì mô hình UTTN Sarcoma 180 ascitic Tum or trên chuột nhắt trắng Swiss (đã gây tạo được từ năm 1987) để thử thuốc

- Kiểm tra hoạt tính kháng u của CISPLATIN tổng hợp tại Việt Nam

- Khảo sát một số chỉ tiêu cận lâm sàng trên chuột bị ung thư có điều trị bằng CISPLATIN để làm luận cứ khoa học cho việc thí nghiệm trên lâm sàng trong thời gian tới

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

1 Đ ối tượng và nguyên liệu

- Chuột nhắt trăng Svviss, giống đực, trọng lượng trung bình 20g được

m ua từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Hà Nội

- Dòng tế bào ung thư Sarcoma 180 ascites xuất xứ từ Viện nghiên cứu

U T quốc gia Nhật Bản, đã được cấy truyền và bảo quản tại phòng thí nehiệm của chúng tôi từ năm 1987 [15]

- CISPLATIN có công thức Cis [Pt (N H ,C l): j được tổnc hợp và tinh

c h ế tại phòng thí nghiệm Hóa vô cơ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội |7 |

2 M ô hình thí nghiệm

\OỨÌÉHÚN6

3 Phương pháp nghiên cứu

Chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu ung thư học định lượng (Quantitative Oncology) và ung thư học so sánh (Comparative Oncology)

4 X ác định liều tiêm C ISPL A T IN

Liều gây chết 50% (LD 50) và liều tiêm điều trị thích hợp (TD) của CISPLATIN cho chuột nhắt trắng Swiss được xác định theo phương pháp giảm liều dần từ liều gây chết 100% số chuột của CISPLATIN (tham khảo của nước ngoài - xem phụ lục 1)

5 X ác định tỷ sỏ phát triển u và hiệu lực kháng u của thuốc

- T ỷ số phát triển u được tính theo công thức:

-6 X ác định chỉ sở phân bào ung thư

Trên tiêu bán hiển vi dấu quét tế bào ung thư, nhuộm máu bằng GIEM SA, đếm số tế bào ung thư đang phân chia (cá 4 pha) trên tổng số

1000 tế bào quan sát được, ta có M I%0

7 X ác định m ệt độ hồng cầu và bạch cầu của máu ngoại vi

Theo các kỹ thuật thường quy với buồng đếm Thoma

8 X ác định sô lượng T B U T di căn vào máu

Trên tiêu bản hiển vi dấu quét tế bào máu ngoại vi, nhuộm màu bằng

G IEM SA, đếm số TBUT có mặt trên 1000 tế bào máu (hổna cầu và bạch cầu) Kết quả tính bằng phần nghìn

9 X ác định hàm lượng album in và globulin tòng sô

Sau khi tách được một số protein chủ yếu của huyết thanh máu chuột ung thư đối chứng và có điều trị CISPLATIN bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 10%, tiến hành tách chiết albumin và globulin rồi đo mật

độ quang học (OD) của chúng ở bước sóng 280nm trên máy Ultropec 1000E Sau đó dùng công thức tính hàm lượng protein theo phương pháp quang phổ đế xác định hàm lượng tổng số của albumin và globulin

10 Phân tích hệ enzym esteraza trong huyết thanh

Theo phương pháp điện di trên cel polyacrylamiđe 7.5% (phương pháp của Steiner - Joslyn (1979) và C.A Green (1990)

11 N ghiên cứu hình thái học tê bào ung thu

- Hình ảnh hiển vi quang học được nghiên cứu dưới kính hiến vi

- Hình ảnh hiển vi điện tử được nghiên cứu dưới kính JM 1010 cùa Nhật tại Viện Vệ sinh dịch tễ học Trung ương

12 X ác định thời gian sống thêm

Thòi gian sống thêm của chuột ung thư có điều trị được tính theo công thức của Norio N asam oto (1988) [43]

với chuột khònsi điểu trị ( r f )

15

Ts: Thời gian sống trung bình của lô có điều trị

Cs: Thời gian sống trung bình của lô không điều trị

13 B ảo quản tê bào ung thư trong nitư lỏng

Dòng tế bào u báng Sarcoma 180 đã được bảo quản trong nitơ lỏng cùng 5 dòng TBUT khác theo kỹ thuật thường quy (xem phụ lục 3)

14 Đ ịa điểm tiến hành các thí nghiệm

- Bộ m ôn T ế bào - Mô phôi và Lý sinh, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN

- Bộ môn Hóa Sinh, Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN

- Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN

- Bộ môn Hóa vô cơ, khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

- Bộ môn Mô - Phôi, Học viện Quân y

- Phòng Hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ươn2

15 Thời gian tiến hành các thí nghiệm

Từ tháng 7 năm 2000 đến tháng 12 năm 2002

1 T ổn g hợp và tinh chê C ISPL A T IN

CISPLATIN đã được tổng hợp và tinh c h ế tại Bộ môn Hóa vô cơ, Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Đây là sản phẩm tiếp theo của

đề tài k hoa học đặc biệt cấp Đại học Quốc gia mã số QS.96.07 do PGS.TS

Trong hai năm qua, đã tổng hợp và tinh chế được 150()mg CISPLATIN để phục vụ cho các thí nghiệm của để tài

2 Duy trì m ỏ hình ung thư thực nghiệm

D òng tế bào 11 bán 2 Sarcoma 180 trên chuột nhất trắnc Swiss đã được duy trì trong suốt thời gian thực hiện đề tài (h.2 )

Hình 2 Mô hình ư ri'N trẽn chuột nliắt Sniss

-3 Xác định liều tiém của CISPLATIN tổng hợp tại Việt Nam

% sô' chếl

H ìn h 4 - Đ ư ờ n e c o n e b iêu d iễ n tý lệ c h é t c u a c h u ộ t dưới lác d ôn g cua

CISPLATIN với các liều lượnt: khác nhau

T ừ c á c số liệu thực n e h iệ m và đ ồ thị trê n đ ã xác đ ịn h dược:

IX

4 H iệu ứng ức chê sinh khối u của C ISPL A T IN tổng hựp tại Việt Nam

H ìn h 6 - Sự thoái lui sinh kh ố i u dưới tác đ ộ n g của C IS P L A T IN

I : 106 T B U T cấy tru y ề n ban đáu

19

B ả n g I - Sô liệu tổng hợp các th í nghiệm khảo sát hiệu ứng kháng

u báng Sarcom a 180 của C IS P L A T IN

Các số liệu thực nghiệm ở b ả n s 1, hình 5 và 6 cho ta thấy CISPLATIN tổng hợp tại Việt Nam có hiệu lực kháng u báng Sarcoma 180

là 93,4% , đạt hoạt tính kháng u (+++) theo thang đánh giá của ITOKAW A (xem chi tiết ở phụ lục 4 và phụ lục 7)

5 K hả năng ức ch ế phán bào của C ISPL A T IN tổng họp tại Việt Nam

Các thí nghiệm cho thấy CISPLATIN đã ức chế 50% khả năng phân bào của u báng Sarcoma 180, nhưng không ảnh hướng rõ rệt tới tỷ lệ phần trăm các pha phân bào (xem bảng 1 và các hình 7, 8)

6 Ảnh hưởng của C ISPL A T IN lên m ột sỏ chỉ tiéu sinh lý m áu ngoại vi

của chuột bị ung thư (xem thêm chi tiết ở phụ lục 5)

Báng 2: Kết quả thăm dò ảnh hưởng của CISPLATIN lên máu ngoại

6 N g ày m ổ xét n g h iệ m sau cây

17,95 + 0 6 S 10,73 + 0.6,s

4 1 1 5 ± 0.55

9 2 ± 0.52

(*) theo Dobresco D (1967)

Qua bảng trên ta thấy:

- CISPLATIN đã làm giảm 20,59% số lượng hồng cầu và giảm

36 17% số lượn” bạch cầu ở máu ngoại vi của chuột bị uim thư có điều trị so với chuột ung thư không điều trị

- CISPLATIN chốne siảm đáng kể bạch cẩu lympho ớ lô có diều trị

Tỷ lệ bạch cầu lympho ỏ' lô điều trị tuy có cao hơn ớ ló unu thư khỏ n s điều trị, nhưng vẫn chưa bằn 2 ở chuột khỏe mạnh

- CISPLATIN đã làm giảm 93,25% số tế hào ung thư di căn vào máu ngoại vi (từ 89%0 xuống còn 6%0 ) Xem hình 9.

Hỉnh 9 TỂ bào u báng Sarcoma 180 di căn vào máu chuột

TBUT - tế bào ung thư

HC - Hồng cầu, N - Bạch cầu trung tính

7 Ảnh hưởng của CISPLATIN tới thành phán một sô protein chủ yếu trong huyết thanh chuột bị ung thư.

Sau khi điện di phàn đoạn protein trone huyết thanh của chuột đối chứng và chuột điều trị trên eel polyacrylamide, hai loại protein chú yếu là Albumin và Globulin đã được tách chiết để đo mật độ quaniỉ học (OD) Kết quá như sau:

Bàng 3 - M ật độ quang học của dịch chiết ciỉbumin và ẹlobulin tông sô

trong huyết thanh cliuột.

H ình 10 Đ iện di đổ pro tein h u y ế t th a n h c h u ộ t thí n e h i ệ m

I Lô dối chứng sinh học

II Lô đối chứng ung thư

IV Lô u n 2 thư tiêm CISPLATIN

Từ kết quả đo OD ở bảng 3, áp dụng công thức tính hàm lượng protein theo phương pháp quang phổ, hàm lượng albumin và globulin tổng số của chuột thí nghiệm được ghi trong bảng 4.

Bán í? 4 - Hàm lượng albumin và globitlin tong s ố trong huyết thanh

chuột thí nghiệm.

Hàm lượng

Lô chuột

A LBU M IN(mg/ml)

GLOBULINTổng số (mg/ml)

Hệ sô K( Al b )'■Glolv

CISPLATIN

Các kết quả trên được minh hoạ trên biểu đổ ớ hình 11

H ìn h 11 Sự biến đ ộ n a h à m lượng a lb u m in VỈ 1 s lo b u lin tổne số t r o n s hu y ết

thanh chuột thí nehiệm

lượng của albumin và slobulin tổng số Điều đó chứng tó việc tổim hợp protein của chúng bị giám sút và đặc biệt là suy giám đáp ứnc miễn địch Hệ

số K là một chì số phán ánh trạng thái sinh lý vù bệnh lý cua cư thó ơ độim

T ừ kết quả đo OD ở bảng 3, áp dụng c ô n s thức tính hàm lượng protein theo phương pháp quang phổ, hàm lượng albumin và globulin tổng số của chuột thí nghiệm được ghi trong bảng 4.

Bảng 4 - Hàm lượng albumin và globulin tổng s ố trong huyết thanh

chuột thí nghiệm.

Hàm lượng

Lô chuột

ALBU M IN(mg/ml)

GLOBULIN Tổng số (mg/ml)

Hệ số K( Al b )

\Glob'

Hình 11 Sự biến động hàm lượng albumin và qlobulin tổne số trong huyết

thanh chuột thí nshiệm

lượng của album in và globulin tổng số Điều đó chứng tỏ việc tổne hợp protein của chúnc bị eiáni sút và đặc biệt là suy giám đáp ứng miễn địch Hệ

số K là một chi số phàn ánh trạng thái sinh lý và bệnh lý cua cư tho ơ dộng

vật có vú khoẻ mạnh hệ số K dao động từ 1,2 đến 2,0 Khi chuột bị ung thư không điều trị, hệ số này giảm xuống dưới 1,2 (bảng 4).

- Khi chuột ung thư được tiêm CISPLATIN (lô IV) các chỉ số nói trên đều được hồi phục, đặc biệt là hàm lượng globulin tổng số Điều này cũng tương đồng với kết quả phan tích thành phần máu ngoại vi (bảng 2, mục 6) cho thấy CISPLATIN đã giúp hồi phục tỷ

lệ % tế bào lympho ở chuột ung thư (từ 17, 95% lên 41,15%)

8 K ết quả điện di hệ enzym E ST E R A Z A

(Xem thêm chi tiết ở phụ lục 2)

u báng Sarcoma 180 đã làm cho 3 băng Rf9, R fl0 , R fl 1 trên điện di

đồ hoà lãn vào nhau thành dải liên tục CISPLATIN không ảnh hườn? rõ rệt tới các thành thành phần của ESTERAZA trong huyết thanh của chuột ung thư (xem hình 12)

Hình 12 Điện di đồ hệ enzym ESTERAZA trong huyết thanh chuột thí

nghiệm

III Lô u n s thư tiêm dung môi IV Lô ung thư tiêm CISPLATIN

26

9 Sự gây độc tế bào (cytotoxic) của CISPLATIN trên hình ảnh siéu cấu trúc của tẻ bào u báng Sarcoma 180.

Hlnh 13 Ánh hiển vi điện tử của TBUT Sarcoma bình thườne, phóne đại 5400'.

a T ế hào tnrớno thành, b T ế hào dane phán chia nhân (nhân bị thái lai), N - nhãn,

h - hạch nhân, Li - Lipit, L - Lòne tơ (Lipit và lône tơ giúp tố hào u báne thích íỉhi đời sôYití trỗi nổi).

Hình 14 Anh hiển vi điện tử của T BUT Sarcoma 180 dưới tác đ ộ n e của

CISPLATIN, phóng đại 5000'.

a T ế bào bị hoại tứ (necrosis) ớ eiai đoạn sớm, b - tế bào bị hoại tử ớ eiai đoạn muộn, N - nhãn, c- chất nhiễm sắc tản mát, m ộ t số ch ỗ của m àn e nhân bị phá huý, chuẩn bị tan nhân, tế bào chất có các ty thê (T) bị trươnu phổníi, Ióne tơ (L) phình

ra, tế bào chất bắt đầu bị tách ra từne mẩu (m).

Hình 15 Ánh hiển vi điện tử của TBUT Sarcoma 180 dưới tác động của

CISPLATIN, phóng đại 5000'

Tế bào bị hoại tử (Nerosis) ở giai đoạn cuối, nhân tế bào đã bị tan biến, tế bào chất chứa nhiều giọt lipit (Li) và nhiều ty thể trương phồng (T), tế bào tan rữa và tróc từng mảnh vào môi trườns (m) thường gây viêm nhiễm

Hình 16 ảnh HVĐTcủa TBUT Sarcoma 180 dưới tác động của CISPLATIN

phóng đại 8000'

Tế bào bị chết theo chươns trình (apoptosis) ỏ giai đoạn sớm Nhân (N) bị phân cắt thành nhiều phần, có màng nhân bao bọc riêng, chất nhiễm sắc (c) đều bám vào mặt tronc màng nhân, các bào quan như ty thể (T) và golui (G) đểu bị teo lại h (hạch nhân)

28

H ìn h 17 Ả n h H V Đ T c ú a T B U T S a rc o m a 180 dưới tác đ ộ n g của C IS P L A T IN ,

p h ó n g đại 1 6 0 0 0 '

T ế b à o bị c h ế t th eo c h ư o n s trình ở giai đ o ạ n cuối, toàn tế bào bị co lại, i n à n s tế

b ào lồi lõ m c h u ẩ n bị tách ra các thể a p o p to s e rơi v à o m ôi trư ờ n s vù bị thực b à o bắt giữ; c á c m ẩ u n h â n (N ) teo đặc lại, các b à o q u a n c ũ n g teo lại (G,T ) m à khỏnti tan rữa, k iể u c h ế t n à y k h ô n e gây viêm n h iễm

Theo sô liệu thống kê ở bủng 1 ta thấy CISPLATIN đã làm tăns tý lệ chết của TBU T lên gấp 6,5 lần so với đối chứ ns không điều trị (3,9% 4-

0,6%)

T ế bào ung thư nói chung khi bị già cỗi đểu có thể chết theo hai kiêu: hoại tử (nerosis) (hình 14,15) và chết theo chương trình (apoptisis) (hình 16,17)

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, ỏ' ló đối chứne sô lượn2 tế bào chết theo chươns trình chỉ bằng 30% số lượng tế bào chết theo kiếu hoại

Dưới tác động của CISPLATIN, tỷ lệ chết của TBUT theo chương

trọng tro n s điều trị, vì kiêu chết theo ch ươn 2 trình cua TBUT khỏiiii <zúy ó

nhiễm môi trường quanh u, xác tế bào không tan rữa gây viêm nhiễm mà chúng bị các thực bào của cơ thể bắt giữ, tiêu đi, cơ thể bệnh ít bị nhiễm độc.

10 T ác dụng kéo dài thời gian sông thêm của chuột bị ung thu được điều trị bằng C ISPL A T IN (xem thêm chi tiết ở phụ lục 6 )

Thời gian sống thêm của chuột u n s thư được điều trị so với chuột đối chứng là một chỉ tiêu có ý nghĩa tổng hợp và quyết định khi đánh giá hiệu lực chống ung thư của một ch ế phẩm

Theo nhật ký thí nghiệm của chúng tôi, lô chuột ung thư đối chứng không điểu trị có thời gian sống trung bình là 14,5 ngày, còn lô chuột ung thư có điều trị bằng CISPLATIN có 60% số chuột sống trung bình 20,3 ngày Tính theo công thức của N agam ôtô (1998) [43] ta tính được phần trăm thời gian sống thêm của chuột điều trị là:

Đặc biệt có 4/10 (40%) số chuột còn lại của lô điều trị bằng CISPLATIN đã tiêu biến u và sống sót qua thí nghiệm

Các kết quả nói trên được trình bày trong bảng 1 và hình 18

11 B ảo quản té bào ung thư tron g nitư lỏng

Đề tài đã bảo quản thành công trong nitơ lỏng dòng TBUT Sarcoma

180 cùng 5 dòng tế bào khác là: T ế bào Hella, TBUT gan HepG2, TBUT phổi A 459, TBUT dạ con SKOV 3, TBUT tuyến tiền liệt PC3, để phục vụ cho các nghiên cứu ung thư thực nghiệm lâu dài

(xem thêm chi tiết ở phụ lục 3)

12 C ơ c h ế tác động của C IS P L A T IN lên tê bào ung thư và hiệu quả kháng u nói chung của nó.

CISPLATIN có cấu trúc không gian như sau:

Hình 19 Cấu trúc không gian của CISPLATIN Cis [pt (NH,C1): |

CISPLATIN, khoảng cách giữa hai phối tử C1 xấp xỉ bằng 3,4 A°, tươnc ứng khoảng cách giữa hai base nitơ k ế tiếp trong chuỗi xoắn kép ADN của tế bào Phản ứng th ế ái nhân của CISPLATIN với ADN xảy ra bằng cách các ion c r từ CISPLATIN thay thế các base nito' cùa ADN, do đó đã tạo nên những liên kết mới tron" một sợi xoắn đơn cũng như liên kết mới giữa hai sợi xoắn kép, làm cho ADN không thể tự tách đôi để tái bản Mặt khác, CISPLATIN đã phá huỷ cấu trúc bình thườn2 của ADN Hai sự kiện nói trên

đã dẫn tới các hậu quả sau:

+ Sinh tổng họp ADN bị ức c h ế dẫn tói ức ch ế phân bào ung thư (xem mục 5)

+ C ấ u t r ú c A D N bị c h ặ t đ ứ t n h i ề u đ o ạ n d ẫ n tớ i c á i c h ế t t h e o c h ư ơ n g trình (apoptosis) của TBƯT (mục 9, hình 16,17)

- Do CISPLATIN ức chế mạnh phân bào un<j thư đóiiíi thòi làm chốt

tế bào ung thư (theo cà hai kiểu necrosis và apoptosis, đặc hiệt là apoptosis )

nên đã làm giảm mạnh sinh khối u (chỉ còn 6 ,6 % so với đối chứng) đạt hiệu

lực kháng u (+ + +).

- Do khối u bị tiêu giảm mạnh, số tế bào ung thư di căn vào máu giảm nhiều, hệ lympho trong máu ngoại vi của chuột điều trị được phục hồi (mục6), hàm lượng globulin tổng số trong huyết thanh tăng so với đối chứng (mục7), các tế bào ung thư chết nhiều theo kiểu apoptosis (kiểu tự sát theo chương trình, kiểu chết “sạch” không gây viêm nhiễm) (mục 9) cho nên đời sống của chuột ung thư được điều trị đã kéo dài thêm 40% so với đối chứng, đặc biệt

có 4/10 chuột ung thư được điều trị đã tiêu biến u và sống qua thí nghiệm

- Tuy nhiên, CISPLATIN tổng hợp tại Việt Nam, cũng như hầu hết các hoá chất khác ức chế tế bào (Cytostatic) làm thuốc điều trị ung thư, đều gây những phản ứng phụ cho cơ thể như sau:

Ngoài TBUT, CISPLATIN còn tác động mạnh tới các quấn cư tế bào luôn đổi mới của cơ thể như các cơ quan tạo máu, sự mọc lông, tóc (chuột

U T đ i ề u trị b ằ n g C I S P L A T I N bị r ụ n g l ô n g n h i ề u ) , s ự tái s i n h n i ê m m ạ c r u ộ t

và biểu mô của thận, vv

tổng hợp tại Việt Nam đã thể hiện hoạt tính kháng u mạnh nhất trong số nhiều c h ế phẩm m à ch úns tôi đã thử sàng lọc trong 15 năm qua (hình 20) Vì vậy, việc nchiên cứu tổns hợp tinh chế, và thử nghiệm các chỉ tiêu Sinh - Y - Dược học cận lâm sàng và lâm sàng của CISPLATIN trong thời gian tới là vó cùng cấp thiết

Việc tự túc thuốc chống ung thư CISPLATIN của nước ta, thay thế nhập ngoại, là việc làm trong tầm tay và đầy hứa hẹn

32

IV K Ế T L U Ậ N

Q ua hơn hai năm nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư trên động vật thí nghiệm của CISPLATIN tổng hợp tại Việt Nam.Chíing tôi có những kết luận như sau:

4 V ề C IS P L A T IN tổng hợp tại Việt N am

1 Liều gây chết 50% (LD 50) đối với chuột nhắt trắng Swiss là 15 mg/kg

2 Liều điều trị thích hợp cho chuột bị ung thư là 8mg/kg

4 V ề h o ạ t lực chông ung th ư của C ISP LA T IN

3 CISPLATIN đã ức chế phát triển u báng Sarcoma 180 là 93,4% so với đối chứng, đạt hiệu lực kháng u (+++)

4 CISPLATIN đã ức chế 50% khả năng phân bào của u báng Sarcoma

180, nhưng không ảnh hưởng rõ nét tới tỷ lệ phần trăm các pha phân bào

4 Vê ảnh hưởng của C IS P L A T IN lên máu ngoại vi của chuột ung thư có điêu trị so với chuột ung th ư k h ôn g điều trị.

5 CISPLATIN làm giảm 25,59% số lượng hồng cẩu và giảm 36,17%

số lượng bạch cầu, riêng bạch cầu lymphô đưọc hồi phục từ 17,95% lên 41,15%

6 CISPLATIN làm giảm 93,25% số lượng TBUT di căn vào máu

7 CISPLATIN làm tăng 11% hàm lượng globulin tổng số trong huyết thanh chuột ung thư được điều trị, nhưng không ảnh hưởng rõ nét tới thành phần hệ enzym ESTERAZA

Ạ Tác dộ n g của C IS P L A T IN tới siêu cấu trúc và các kiểu chết của

t ế bào un g thư.

8 CISPLATIN làm tăng tỷ lệ chết của TBUT lên gấp 6,5 lần so với đối chứng và thúc đáy mạnh quá trình chết "tự sát" theo chương trình (apoptosis) của TBUT

34