Nghiên cứu một số đột biến của virut viêm gan B tại Việt Nam nhằm tìm hướng phòng chống và điều trị

Kết quả giải trình tự và so sánh với các mẫu trên thế giới Đã phát hiện được 10 đột biến ừong các mẫu nghiên cứu.. Các đột biến có thể xảy ra tât cả các vùng trong genome đặc biệt đột bi

CHỦ T R Ì ĐỀ TÀI : PGS.TS.NGÔ GIANG LIÊN

CÁN B ộ THAM GIA : Th.S.Đỗ Thị Vinh An

Th.S.Trần Thu Hà Th.s Phạm Đức Ngọc Th.s Nguyễn Văn Tuấn

CN Le Xuân Thịnh

TAI HỌC Q UỐC GIA HA NỌI

TRUNG T â m t h ô n g tin T h ư v iê n

0 0 0 6 0 0 0 0 ^ 3

BÁ O CÁO TÓ M TẮT

1 Tên đề tài: Nghiên cứu một số đột biến của virut viêm gan B tại Việt

Nam nhằm tìm hưởng phòng chống và điều trị

2 Mã số : QG.09.17

3 Chủ trì để t à i: TS Ngô Giang Liên

4 Các cán bộ tham gia:

4 Th.S.NguyễnVănTuấn Khoa Sinh học Phân tử, Viện SR Hà

Nội

5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

5.1 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định các đột biến thuộc gen s của HBV

- Phân tích và tìm những đặc trưng của những đột biến thu thập tại Việt Nam

và so sánh với các đột biến khác trên thế giới

5.2 Nội dung nghiên cứu:

- Thu thập các mẫu nhiễm virut viêm gan B ở Việt Nam

- Bảo quản các mẫu trong điều kiện xác định để dùng cho phân tích ADN

- Tách chiết ADN của virut viêm gan B

- Khuếch đại vùng gen s (300 bp) bàng kỹ thuật PCR

- Xác định trình tự đoạn gen s

- Tìm đột biến và phân tích các đột biên đặc trưng cho các mâu tại VN.

- So sánh các đột biến của virut viêm gan B tại Việt Nam với các mấu trong khu vực và ừên thế giới

6.1.2 Khuyếch đại đoạn gen s

Cặp mồi được sử dụng để phát hiện và khuyếch đại đoạn gen s (300 bp) chứa vùng quyết định kháng nguyên:

HBV/F:5'-CAAGGTATGTTGCCCGTTTG-3'

HBV/R:5'-ATGTTGTACAGACTTCGCCC-3' được thiết kế theo nghiên cứu của Thoson và c s (1999) Đoạn ADN đích (300bp) sản phẩm của PCR

đã thu được sau 35 chu kỳ của phản ứng

6.1.4 Tinh sạch ADN-HBV (300bp) và giải trình tự

6.1.5 Kết quả giải trình tự và so sánh với các mẫu trên thế giới

Đã phát hiện được 10 đột biến ừong các mẫu nghiên cứu Các đột biến này có thể chia thành 3 nhóm

Nhóm 1 bao gồm các đột biến đặc trưng cho mẫu thu thập tại VN : Đột biến tại vị trí 876 với G biến đổi thành c, ở vị trí 1116 với G biến đổi thành A

và ở vị trí 1130 với c biến đổi thành G Nhóm 2 bao gồm các đột biến cho các mẫu thu thập tại VN và 1 số các nước khác: Đột biến tại vị trí 887 với A biến đổi thành G, ở vị trí 888 vói G biến đổi thành A, ở vị trí 942 với A biến đổi thành c , ở vị trí 1120 với T biến đổi thành A Nhóm 3 bao gồm các đột biến chung cho tật cả ở các mẫu trên thế giới kể cả mẫu từ Việt Nam: ở vị trí 891 với T biến đôi thành c, ở vị trí 897 với A biến đổi thành G và ở vị trí 898 với

G biên đôi thanh A Những đột biển phát hiện trong nghiên cứu này đều là các đột biên thay thê nucleotide Những nghiên cứu gần đây cho thấy tầm quan trọng của các đột biên ở gen s vì chứa vùng quyết đinh kháng nguyên “a” Do

I

2

vậy các nghiên cứu về những đột biên thuộc gen s cua HBV rat can cho viẹc thiết kế các vaccine cho nhiều đột biên và kit chân đoán HB V

6.2 Ket quả : 02 công bổ

6.2.1 Quốc tế: 01 báo cáo khoa học

N Giang Lien, B Khanh Hoa, T Thu Ha (2010), “ The survey of s gene mutation of Hepatitis B virus circulating in Vietnam” Poster presentation at

14 th International Congress of Infectious Diseases, March 2010, Myami, USA

6.2.2 Trong nước: 01 bài báo

Pham Due Ngoc, Tran Thu Ha, Tràn Thị Lien, Le Xuan Thinh, Nguyen VanTuan and Ngo Giang Lien (2010), “ Preliminary study on some s genemutation of HBV isolated in Vietnam” Journal of Science and Technology, Vol26,No.4S, 2010

6.3 Đào tạo:

-01 cử nhân sinh học: Trần Thị Thơ (2009)

-01 Nghiên cứu sinh : Trần Thu Hà (2012)

7 Tình hình kinh phí của đề tài:

1 Project title: Study on some mutations o f Hepatitis B virus in Vietnam fo r finding the way fo r prevention and treatment

2 Code number: QG-09-17

3 Principal investigator: Dr Ngo Giang Lien

4 List of project members:

1 MSc Đo Thi Vinh An Bach Mai hospital

2 MSc Tran Thu Ha Faculry of Biology, Hanoi University of Science

3 MSc Pham Due Ngoc Faculry of Biology, Hanoi University of Science

4 MSc Nguyen Van Tuan Faculty of Molecualar Bioiogy, Institute of

Malaria, Hanoi

5 BSc Le Xuan Thinh Ceter of Hematology and Blood transfussion

5 Goals of Objectives of the research project

+ Determination of mutations in the s gene region of HBV

+ To analyze these mutations and to compare mutations from samples collected in Vietnam to others regions in the world

5.1 Research content

+ To collect samples from blood donor group infected HBV

+ To keep the above samples in good condition for lab assays

+ To extract DNA-HBV

+ To amplify DNA (300bp) in s gene region

+ To sequence PCR product (DNA-300bp)

+ To analyze mutations on s gene

+ To determine the characters of these mutations circulating in VN

To compare mutations from VN with others in the world

nucleotide 942 with an A to c substitution, the point mutation at nucleotide

1120 with a T to A substitution, Group 3 refered to all mutations that found through out the world, such as a point mutation at nucleotide position 891 with a T to c substitution, the point mutation at 897 with an A to G and the point mutation at nucleotide 898 with a G to A substitution Recent studies have revealed significant diversity in sequence of HBV isolated, accounting for the point mutations among the four major HBV serotypes and they have found that mutations occurred at these nucleotide positions resulted in amino acid residues changed at the certain ‘a’ epitope region This study is nếcessary to design new vaccines to various HBV mutants and HBV diagnostic kit

6.2 Publication: 02 scientific presentation

6.2.1 International level: 01 scientific presentation

N Giang Lien B Khanh Hoa, T Thu Ha ( 2010), “ The survey of mutation

of the gene of hepatitis B virus circulating in Vietnam” Poster presentation

at 14 th International Congress of Infectious Diseases, March 2010, Myami, USA

6.2.2 National level: 01 scientific paper

Pham Due Ngoc, Tran Thu Ha, Tran Thi Lien, Le Xuan Thinh , Nguyen Van Tuan, Ngo Giang Lien (2010), “ Preliminary study on some s gene

mutation of HBV isolated in Viet Nam” VNU Journal o f Science, Natural Sciences and technology 26, No 4 S : 613-617

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU i

CHƯƠNG I : TỎNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Virut viêm gan ^

1 ỉ 1 Cấu trúc genom và các protein của HBV 2

ỉ 1.2.Chu trình nhân lên của HBV 4

1.1.3 Các marker chẩn đoán viêm gan B 5

1.2 Đột biến ở virut viêm gan B 6

1.3 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới 7

1.4 Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam 8

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 9

2.1 Đối tượng nghiên cứu 9

2.2 Phương pháp nghiên cứu 9

2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN 9

2.2.2 Phương pháp quang phổ kế (đo O D ) 10

2.2.3 Khuếch đại đoạn ADN (300 bp) vùng gen s của H BV 10

2.2.4 Giải trình tự đoạn gen s phát hiện đột biến 11

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12

3.1 Phát hiện và khuếch đại ADN (HBV) bằng P C R 1

3.2 Phân tích trình tự đoạn gen s của H BV 14

Bàn luận .15

K ết luận và kiến n g h ị 16

Tài liệu tham khảo 17

Phụ lục 1 18

Phụ luc 2 19

Phụ lục 3 20

Bảng 1 Tỷ lệ HBsAg dương tính tại 1 số nước lưu hành

Bảng 4 Tỷ lệ nhiêm HBV qua nghiên cứu của một số tác

giả trong nước

8

- ADN của virút viêm gan B

(Hepatitis B virus DNA)

- Kháng thể kháng kháng nguyên lõi của virút viêm gan B

(Antibody against Hepatitis B core Antigen)

- Kháng thể kháng kháng nguyên e của virút viêm gan B

(Antibody against Hepatitis B e Antigen)

- Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B

(Antibody against Hepatitis B surface Antigen)

- Axit ribonucleic

- ADN vòng đóng tương đương •

(convalently closed circular DNA)

- Kháng nguyên lõi của virút viêm gan B

(Hepatitis B core Antigen)

- Prôtein bề mặt của virút viêm gan B loại lớn (Large Hepatitis B surface Protein)

MHBs - Prôtein bể mặt của virút viêm gan B loại trung bình

(Medium Hepatitis B surface Protein)

(Polymerase Chain Reaction)

SHBs - Prôtein bề mặt cùa virút viêm gan B loại nhỏ

(Small Hepatitis B surface Protein)

MỞ ĐẦU

Việt nam là một nước có tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B cao, vói tỷ lệ mang

kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg) 10-25% HBsAg mang

các thụ thể trung hòa chủ yếu của virut viêm gan B và được sử dụng làm thành phần chính của vaccine viêm gan B hiện nay Bệnh này đã trở thành mối lo ngại đối với sức khỏe cộng đồng, thách thức lớn đối với nhiều quốc gia trong đó có Châu Á và Châu Phi Nhiêm virut HBV được xem là nguyên nhân chính của các bệnh viêm gan, sơ gan và ung thư gan Việc chẩn đoán, sàng lọc HBV hiện nay trên thế giới chủ yếu dựa vào việc phát hiện kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của virut được mã hóa bởi gen s

Genome của HBV có tốc độ đột biến nhanh, ước tính 2.104 thay thế điểm hàng năm, cao hem nhiều so với các virut ADN khác [1,5] Các đột biến có thể xảy ra tât cả các vùng trong genome đặc biệt đột biến thuộc vùng gen s đàm nhận chức năng tham gia tổng họp nên các kháng nguyên bề mặt HBsAg cũng thường xuyên đột biến giúp cho virut viêm gan B có thể vượt qua khả năng sàng lọc của các kít hiện đang được dùng và có rất nhiều khả năng trên vùng s này xuất hiện các đột biến giúp virut ‘trốn thoát’ khỏi các

cơ chế miễn dịch của cơ thể Các đột biển này này được biết dưới tên gọi là đột biến “trốn thoát” hay đột biến trốn thoát miễn dịch Điều này đẫn đến tình ừạng tăng nguy cơ mắc viêm gan B, tăng lây truyền HBV trong cộng đồng do tình ừạng mất hiệu lực của vaccine cũng như kít chẩn đoán chuyên dụng [9]

Chính vì các lý do trên mà các nhà sản xuất vaccine và kít sàng lọc luôn tìm cách đê đưa ra một loại vaccine cho tính hiệu quả cao cũng như kít chẩn đaons có khả năng phát hiện nhiều đột biến Nghiên cửu của chúng tôi hy vọng phát hiện được một số đột biến trong vùng gen s của virut viem gan B

ở Việt Nam nhăm cung câp một số thông tin ban đầu phuc vụ cho việc cải tiên các kít chân đoán cũng như hướng sản xuất các vaccine tái tổ hợp trong tương lai

Mục tiêu của nghiên cứu đặt ra là:

1 Giải trình tự vùng gen s

2 Phát hiện các đột biên đặc trưng cho các mẫu viêm gan B thu thập tại VN

và so sánh với các chủng trên thế giới

I

CHƯƠNG l.TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Virus viêm gan B

Năm 1885, Lurman đã thông báo 191 trường hợp viêm gan sau khi tiêm chủng vaccine đậu mùa Năm 1963, Blumberg đã nhận xét bệnh viêm gan B có tích chất vùng địa lý Năm 1970, nhà bác học Dane và cộng sự đã phân lập được virus viêm gan B hoàn chinh gọi là thể Dane Những năm tiếp theo các dấu ấn miễn dịch khác của virus viêm gan B như kháng thể HBs, HBeAg, kháng thể HBc, kháng thể HBe, HBcAg lần lượt được phát hiện [10]

ỉ 1.1 Cẩu trúc genom và các protein của HBV

Virus viêm gan B (thể Dane) có đường kính từ 40 - 42 nm, là virus thuộc nhóm có nhân DNA, họ Hepanaviridae cấu trúc của virus gồm các thành phần cơ bản sau:

- Phần vỏ: Gồm 2 lớp lipoprotein và các protein m àng

Hình 1 Cấu trúc virut viêm gan B

- Phân nhân: Bao gôm các protein được mã hồa bời các gen c (Core), lóp

này mang đặc trưng của kháng nguyên HBc

- Genome của virus HBV

Partially double-stranded DNA

2

Genom của vừut HBV chỉ có 3.200 cặp bazơ, được tổ chức đặc biệt dưới dạng vòng mờ dạng sợi kép không hoàn toàn gồm 2 sợi có kích thước khác nhau (hình) Sợi nằm bên ngoài là sợi âm mã hóa cho toàn bộ thông tin di truyền của HBV Genome của HBV chứa các gen mã hóa gối nhau (chồng lớp) gồm 4 khung đọc mờ s, c, p và X Các gen s (surface) mã hóa cho kháng nguyên bề mặt HBsAg bao gồm 3 phần: Tiền SI hay pre Sl, tiền S2 hay Pre S2 và s Vùng s và tiền S2 có chiều dài thay đổi tùy theo typ của virut Các gen s mã hóa cho 3 loại protein khác nhau là s, M và L [10J.

+ Protein s (small) là protein nhỏ nhất (24kD) trong số các protein bề mặt, chứa 226 axit amin Đây là protein chính hay còn gọi là SHBsAg được mã hóa bởi gen s và được sản xuất với số lượng lớn Các typ của virut được xác định dựa vào các typ của SHBsAg nhờ KT đơn dòng Vùng KN có mặt ở tất cả các typ gọi là

quyết định kh án g nguyên “a” B ốn phân typ chú yếu khác nhau là d hoặc y v à W

hoăc r Hai bô này đươc căp đôi trong đó thành viên của mỗi cãp loai trừ nhau tao nên 4 phân tvp K-N HBsAg lả adw, adr, ayw và ayr

+ Protein M (middle) cỏ kích thước trung bình (31kD), 228 axỉt amin do een tiền S2 và gen s mã hóa còn goi là MHBsAg Đây lả glycoprotein biểu hiên ờ

2 dang gp33 và gp36 tùy thuỏc vào mức đọ glvcosvl hỏa

+ Protein L (large) là proteinlowns nhất (39kD), chứa 390 axit amin do các gen tiền Sl tiền S2 và s mã hóa, còn đươc goi ]à LHBsAg Protein này tham gia vào quá trình gắn virut vào vật chủ, lắp ráp virion và giải phỏng virut ra khỏi tế bảo

G en c (Corel là vùng m ã hóa cho protein nucleocapsit G en này bao gồm

2 vùng : vùng lõi (C) và vùng tiền lõi (pre Cl

Protein lõi là chuỗi ngấn (21kD~) gồm 138 axit amin, có khả năng gắn với axit nucleic Đây là KN lõi vai trỏ chính là tham gia vào lắp ráp virut

Protein tiền lõi là chuỗi polipeptit dải (25kD), gồm 212 axit amin Protein tiền lõi có đoan tín hiẽu nằm ở đầu amin hướng chuỗi popypeptit tiền lồi mới đươc tồng hơp vào MLNC của tế bảo Tai đây, chủng đuơc xử lỵ sau đó dược tiết ra ngoài MLNC dưới dang HBeAg [6]

G e n p Ịà gen lớn nhất, chiếm 80% chiều dài của genom , m ã h ỏa cho

popvpẹptit lỏn f90kD Ì chứa 832 axit am in Protein nảy cỏ 2 hoat tính:

A D N - polym erase và enzym e phiên m ã n e ư a c (A D N -polvm eras phu thuôc

ARN1 Protein p (polvm eraza) đóng vai trò quan trong trong viêc đỏng gỏi A R N

tiền genom vào capsit cũng n hư đỏng vai trò làm m ồi phiên m ã ngươc A R N tiền

gemom thành A D N (-)' đồng thời làm nhiêm vu phân giải khuôn A R N v à tồng

hơp sơi A D N Í+Ì

G en X là gen có khung đoc m ờ nhỏ nhất (0,7kD ), m ã hỏa cho Protein X

hay H B x là m ỏt protein nhỏ (17 kD ), chứa 154 axit am in Protein X có nhiều chức

năng khác nhau n hư tham gia vào viêc truyè tín hiêu, điều hòa chu trình tế bào.

1.1.2.Chu frinh nhân lên của HBV

Trước hết virut HBV gắn đặc hiệu vào thụ thể nằm trên mặt tế bào

gan Sau khi cởi bỏ vỏ ngoài, nucleocapsit di chuyển vào vùng nhân Sau khi

cời vỏ capsit, ADN kép với 2 sợi không bằng nhau được chui vào nhân để

chuyển hóa thành dạng ADN kép khép vòng, siêu xoắn(cccADN) Dạng

này được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại ARN 3,5; 2,4; 2,1 và 0,7kb

Các mARN được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất

mARN 3,5kb gọi là ARN tiền genom dùng để tổng họp genom Các

mARN còn lại được gọi là dưới genom dùng để tổng hợp các protein khác

nhau trong đó có ADN- polimeraza(P), protein lõi c và tiền c, popypeptit X,

protein bề mặt s và proteinkinaza Protein lõi c tạo thành nucleocapsit

(HBcAg) Polypeptit tiền lõi được vận chuyể đến MLNC, từ đó chúng được

tiết ra ngoài dưới dạng KN tiền lõi (HBeAg) ARN tiền genom được đóng

gói cùng với ADN-polymeraza của virut và protein kinaza để thành hạt lõi

ở đây tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp các chuỗi ADN(-)sợi L

theo cơ chế sao chép ngược [10]

Polymeraza của HBV phân giải ARN tiền genom, chỉ để lại 1 đoạn

ngắn dùng làm mồi cho tổng hợp ADN (+) trên khuôn của ADN (-) Một số

genom trưởng thành sau khi được tổng hợp lại quay về nhân để chuyển

thành cccADN nhằm duy trì một lượng khuôn ổn định cho dịch mã, còn

4

i

phần lớn được lắp ráp hoàn chinh rồi nảy chồi ra ngoài để lặp lại chu kỳ nhân lên ở tế bào gan khác Trong quá trinh nhân lên, virut luôn tổng hợp thừa protein vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài virut hoàn chỉnh (hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu hoặc hình que.

1.1.3 Các Marker chẩn đoán HBV

Thời kỳ ủ bệnh của nhiễm HBV thay đổi tùy thuộc vào từng bệnh nhân,

phụ thuộc vảo số lượng virus xâm nhập, cách lây truyền và các yếu tố của vật chủ Trong giai đoạn ủ bệnh, người bệnh không có bất cứ triệu chứng lâm sàng nào, các triệu chứng như m ẩn ngứa, sốt, vàng da thường chỉ gặp trong thời kỳ viêm gan cấp, thời kỳ này thường kéo dài từ hai tuần đến ba tháng.

Để chẩn đoán nhiễm HBV người ta dựa chủ yếu vào các dấu ấn miễn dịch

được phát hiện trong huyết thanh của bệnh nhân, thường phải sau nhiễm H B V 56 ngày C ác dấu ấn m iễn dịch của nhiễm H B V bao gồm:

- H B sA g (Hepatitis B surface Antigen): là kháng nguyên bề mặt viêm gan

B, là dấu ấn m iễn địch xuất hiện sớm nh ất khi bị nhiễm HBV ( m ột đến hai tuần sau khi bị nhiễm virus), giảm dần sau bốn đến tám tuần và thường h ết sau khoảng bốn tháng nhiễm bệnh H B sA g có m ột thành phần quyết định kháng nguyên chung được ký hiệu là a bao gồm a l , a2, a3 Phả hệ của H B sA g từ a sẽ được phân thành các dưới nhóm ad, ay Rồi từ ad, ay lại được phân nhóm tiếp thành: adw , adr, ayw,

ayr Các vùng khác nhau có các phân loại HBsAg khác nhau như phân loại adw

hay gặp ở C hâu M ỹ, C hâu  u, vùng Đ ịa Trung Hải hay gặp phân loại ayw Trong viêm gan cấp hay gặp ph an loại adw, ayw Tại A nh phân loại ad gặp ở người đồng

tính luyến ái và phân loại ay gặp ở người nghiện chích ma túy

- A nti H B s (A nti H epatitis B surface): Là kháng thể chống lại kháng nguyên bề m ặt cùa virus viêm gan B, thường xuất hiện sau khi m ất H B sA g m ột tháng Sự x uất hiện của kháng thể H Bs có nghĩa ỉà cơ thể đã có khả năng bảo vệ chống lại sự tái nhiễm của bệnh.

- H B eA g (H epatitis B e A ntigen): L à m ột kháng nguyên hòa tan, xuất hiện ngay sau H B sA g vài ngày, nồng độ của H B eA g tồn tại cùng với nồng độ của

H B sA g trong huyết thanh, giảm sau khoảng m ười tuần nhiễm bệnh và thường m ất

5

ở vùng ngoài của quyết định kháng nguyên này Những NC về huyết thanh học ở trẻ em Thái Lan có ADN- HBV dương tính, tỷ lệ các trường hợp mang đột biến trên vùng quyết định kháng nguyên (QĐKN) ‘a’ năm 1984 là 7,8% , năm 1989 là 19,6%, năm 1994 tăng cao là 28,1% Điều dáng lưu ý là tỷ lệ các trường hợp xuất hiện đột biến ừong vùng QĐKN “a” của HBsAg ở các trường hợp đã tiêm phòng vaccine cao hơn so với các trường hợp không tiêm phòng vaccine Một lần nữa, vấn đề này lại hạn chế sự thành công của các chương trình tiêm phòng mờ rộng.

Tuy vậy đột biến trên gen s còn chưa được nghiên cứu chi tiết, vì vậy tầm quan trọng của đột biến virut viêm gan B đối với sức khỏe cộng đồng đang là một vấn đề gây nhiều tranh cãi Những nghiên cứu và quan sát sâu hom về các điểm nổi bật của loại virut này là yếu tố cốt lõi để đánh giá chính xác hiệu quả của các chiến lược chủng ngừa bệnh viêm gan B hiện nay [7,9]

1.3 Tìuh hình nhiễm HBV trên thế giới

Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới, hiện có tới 5-6% dân số toàn thể giới mang virus viêm gan B (khoảng 400 triệu người), phần lớn số người nhiễm HBV này thuộc các nước đang phát triển Dựa vào tỷ lệ HBsAg dương tính và

kháng thể HBs dươ ng tính trong cộng đồng m à tổ chức Y tế thế giới đã chia thành

ba khu vực lưu hành HBV như sau [5,10,6]

+ K hu vực lưu hành H B V thấp: Tỷ lệ H B sA g dương tính: 0,1 - 0,5% ,

kháng thể H B s dương tính: 4 - 6% (bảng 1)

Bảng 1 Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV thấp

+ Khu vựa lưu hành HBV trung bình: Tỷ ỉệ HBsAg dương tính: 2-7%, kháng thể HBs dương tính: 20-55% (bảng 2)

7

sớm hơn HBsAg Khi HBeAg, tồn tại trong máu có nghĩa là virus đang được nhân

lên rất manh, lây nhiễm ở thời kỳ này là khá cao.

- Anti HBe (Anti Hepatitis e): Là kháng thể chống lại HBeAg, kháng thể này thường xuất hiện ngay sau khi HBeAg mất đi Khi có mặt kháng thể HBe là

dấu hiệu tố t của đáp ứng miễn dịch, khả năng lây truyền ờ thời kỳ này rất thấp.

- Anti HBc (Anti Hepatitis B core): là kháng thể chống lại H B cA g, là dấu

ấn m iễn dịch xuất hiện thứ ba sau khi nhiễm HBV K háng thể H B c gồm hai loại:

Kháng thể HBc thường tồn tại trong giai đoạn nhiễm cấp và mất dần ữong giai

đoạn hổi phục, kháng thể H B c IgG tồn tại nhiều năm trong huyết thanh của bệnh nhân đã bị nhiễm HBV[4,2,3].

Các xét nghiệm huyết thanh học phát hiện kháng nguyên và kháng thể của v ứ u t VGB có độ nhạy v à độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiệnH B sA g với nồng độ thấp Xét nghiệm có độ nhạy cao nhất trong chuẩn đoán V G B hiện nay là kỹ thuật PC R

cho phép phát hiện ADN với chỉ 10-3 pg - ml Kết quả của các xét nghiệm sinh

học phân tử trong chuẩn đoán virut V G B là phương tiện hữu ích để xác định tình trạng nhiễm virut viêm gan B cấp tính, m ãn tính, tiên lượng bệnh, theo dõi điều trị

và đánh giá tình trạng m iễn dịch với virut.

1.2.Đột biến ở virut viêm gan B

Gần đây người ta đã phát hiện thấy có rất nhiều thay đổi xảy ra m ột cách ngẫu nhiên trên protein vỏ, protein tiền lõi và polim eraza của virut viêm gan B

M ột số đột biến điểm xảy ra trên vùng gen tiền lõi ngăn cản quá trình tổng hợp HBeAg được quan sát thấy ở người có H B eA g âm tính Đ ột biến điểm có tần sổ

cao nhất là đột biến thay thế G = A tại vị trí nucleotit 83 trên vùng gen tiền lõi Đột biến tiền lõi không những gặp thấy ở nhũng bệnh nhân bị viêm gan B cấp tính

và m ãn tính m à còn thấy ở cả người m ang virut không có triệu chứng N gười ta

phát hiện ờ vùng s có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên của HBsAg mà quyết

định kháng nguyên này là tác động đích của kháng thể trung hòa sinh ra trong quá trình m iễn dịch tự nhiên cũng như sau khi tiêm phòng vacine M ột điều thú vị từ những N C gân đây cho thây các đột biến trên kháng nguyên bề m ặt liên quan đên vaccine không những được phát hiện ở vùng quyết định K N m à còn thấy xuất hiện

6

ở vùng ngoài của quyết định kháng nguyên này Những NC về huyết thanh học ờ

trẻ em Thái Lan có ADN- HBV dương tính, tỷ lệ các trường hợp mang đột biến

trên vùng quyết định kháng nguyên (QĐKN) ‘a’ năm 1984 là 7,8% , năm 1989 là 19,6%, năm 1994 tăng cao là 28,1% Điều dáng lưu ý là tỷ lệ các trường hợp xuất hiện đột biến trong vùng QĐKN “a” của HBsAg ở các trường hợp đã tiêm phòng

vaccine cao hơn so với các trường hợp không tiêm phòng vaccine Một lần nữa,

vấn đề này lại hạn chế sự thành công của các chương trình tiêm phòng mờ rộng

Tuy vậy đột biến trên gen s còn chưa được nghiên cứu chi tiết, vì vậy tầm quan trọng của đột biến virut viêm gan B đối với sức khỏe cộng đồng đang là một vẩn đề gây nhiều tranh cãi Những nghiên cứu và quan sát sâu hơn về các điểm nổi

bật của loại virut này là yếu tố cốt lõi để đánh giá chính xác hiệu quả của các chiến

lược chủng ngừa bệnh viêm gan B hiện nay [7,9],

1.3 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới, hiện có tới 5-6% dân số toàn thế giới mang virus viêm gan B (khoảng 400 triệu người), phần lớn số người nhiễm HBV này thuộc các nước đang phát triển Dựa vào tỷ lệ HBsAg dương tính và kháng thể HBs dương tính ừong cộng đồng mà tổ chức Y tế thế giới đã chia thành

ba khu vực lưu hành HBV như sau [5,10,6]

+ K hu vực lưu hành H B V thấp: Tỳ lệ H B sA g dương tính: 0,1 - 0,5% ,

kháng thể HBs dương tính: 4 -6 % (bảng 1)

Bảng 1 Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV thấp

+ Khu vựa lưu hành HBV trung bình: Tỷ lệ HBsAg dương tính: 2-7%, kháng thể HBs dương tính: 20-55% (bảng 2)

7

Bảng 2 Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV trung bình

+ Khu vực lưu hành HBV cao: Tỷ lệ HRsAg dương tính: 8-20%, kháng thể HBs dương tính: 70-95% (bảng 3)

Bảng 3 Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV cao

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới mỗi năm có khoảng 2 triệu người chết liên quan đến viêm gan B, 70% - 80% các trường hợp ung thư gan là do viêm gan virus B, 25% người mang mạn HBV chết vì xơ gan và ung thư gan Những người nhiễm HBV thỉ có nguy cơ bị ung thư gan gấp 100 lần so với những người không bị nhiễm HBV

1.4 Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng lưu hành HBV cao, tỷ lệ viêm gan B trong quần thể từ 10-15% và có những vùng trên 20% Bảng 1-6 dưới đây cho biết tỷ lệ HBsAg dương tính trong quần thể người khỏe mạnh qua nghỉên cứu của một số

tác giả [2,3].

Bảng 4 Tỷ lệ nhiễm HBsAg qua nghiên cứu của một số tác giả trong nước

Ngô Quang Lực, Đỗ Trung Phẩn (Quần thể) - 1995 16,5

ề

8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u

2.1 Đổỉ tượng nghiên cứu

Tổng số 25 mẫu bệnh phẩm đã được chẩn đoán nhiễm virut viêm gan B bằng huyết thanh học HBsAg theo nguyên lý miễn dịch gắn men (ELISA) thu nhận từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương phục vụ cho nghiên cứu này

- Bộ sinh phẩm giải trình tự AND (BigDye Applied Biosystem terminator V3.1 Cycle Sequencing kit)

- Thang ADN chuẩn (ladder 100 bp) New England Biolab

- Máy nhân gen (Thermo cycle PCR)

- Máy giải trĩnh tự ADN

- Bộ điện di (mini electrophoretic analysis)

- Pipeman ( 20|il, 20|jl„ 200(il, lOOOịaĩ)

- Các loại ống đong

- Eppendorf tuýp (1,5.,0,5 và 0,2 ml)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.2 ỉ Phương pháp tách chiết ADN

Có nhiều phương pháp tách chiết ADN, mỗi phương pháp có những lợi thê riêng, nhưng điều quan trọng nhất là phải tách được phân tử ADN còn nguyên vẹn, mức độ đứt gãy ADN không đáng kể và ADN phải đủ sạch Chúng tôi đã dùng kit QIAGEN để tách chiết ADN

EppendorfABI Applied Biosy 3.100

Eppendorf Pirex, Đức

ệ

9

v ề nguyên lý: Dùng một đệm phá vỡ màng virut, sau đó đưa dung

dịch này qua i mang dạng silicagel liên kết chon lọc giữ lại ADN Tiếp

đo ADN trên mang được rửa bằng đệm và cuối cùng đẩy ADN ra bằng 1 đệm thôi gen Các bước tiến hành theo chỉ dân của nhà sàn xuất:

- Cho 20ịi\ dung dịch proteinase K vào tube 15 mi

- Thêm vào tube 200 JJ.1 mẫu huyết thanh trộn đều

- Thêm 200 Jil dung dịch dệm ly giải (AL) trộn kỹ trong 15 giây sau đó

- ly tâm nhanh và ủ 56 ° c (10 phút)

- Sau khi ủ, ly tâm nhanh, cho thêm 200 [li ethanol vào trộn đều

- Cho toàn bộ hỗn dịch trong tube vào cột ly tâm QIA amp và ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút

- Cho tiếp vào cột 500 ịil đung dịch đệm rửa (AW1) đã có ethanol, ly tâm 14.000 vòng phút trong 3 phút

- Thêm 60 fil nước cất vô trùng hoặc dung dịch (AE) vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút sau đó ly tâm 8000 vòng phút trong 1 phút Lúc này ADN đã được tách chiết và sử dụng cho phản ứng PCR

2.2.2 Phương pháp quang phổ kế (đo OD)

Đe xác đinh nồng độ và độ sạch của ADN tổng số tách chiết được chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế Nguyên tắc của phương pháp này

là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sang tử ngoại ở bước sóng 260nm của các bazơ purin và Pyrimidin, đồng thời cũng kiểm ừa độ sạch của dung địch ở bước sóng 280nm Các bước tiến hành như sau:

1 Pha loãng đung dịch ADN thu được trong nước siêu sạch

2 Chuyển dung dịch ADN đã pha loãng sang ống thạch anh nhỏ của máy quang phổ kế và đo ở bước sóng 260nm-280nm

3 Nồng độ ADN của mẫu đo sẽ được tính theo công thức:

Trong đó: CADN là nồng độ ADN tính bằng ịig/nrtl

A260 là chỉ số hấp thụ ánh sáng ở bức sóng 260 ran

d là độ pha loãng của mẫu cần đo

Sau đỏ xác định độ sạch của mẫu bằng tỷ số A260/A280 Khi tỉ số A260/A280

n ă m ữ o n g k h o ả n g 1,8 - 2 ,0 A D N tá c h c h iế t đ ư ợ c đ ạ t tiê u c h u ẩ n (x e m

phần phụ lục 1)

2.2.3 Khuếch đại đoạn ADN 300 bp vùng gen s của HBV

Cặp mồi sử đụng để ichuéch dại vùng gen s chứa quyết định kháng nguyên ađược thiết kế theo nghiên cứu của Thomas và Carman (1999) có trình tự:

HBVF- 5-CAAGGTATGTTGCCOGTITG-3’

HBVR- 5'-ATGTTGTACAGACITCGCCC-3'

Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 25 |il trong đó 2 |il ADN template với chu trình PCR như trong bảng 5

Bảng 5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Để thu nhận ADN khuôn dùng trong giải trình tự chúng tôi cũng tiến hành phản ứng PCR với thành phần và chu kỳ như trên, tuy nhiên tổng thể tích cho một phản ứng là 50 |il và sản phẩm được điện di trên agarose 0,8%

2.2.4 Giải trình tự vùng gen s dài 300 bp, phát hiện đột biến.

Chọn các mẫu ADN(HBV) có các băng gọn, sáng cho tinh sạch trước khi giải trình tự (các bước tinh sạch ADN( phụ lục 2)

Chúng tôi sử dụng bộ kit sinh phẩm và máy của hãng Applied BIO (USA) Phản ứng giải trình tự nucleotide dựa trên phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy sử dụng Big Dỵe terminator(các bước tiến hành xem phần phụ lục 3) Kêt quả được xử lý bằng phần mềm sequencing nalysis MEGA 4.0

I

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Phát hiện và khuếch đại ADN (HBV) bằng PCR

Sau khi tách chiết, ADN được xác định nồng độ và độ sạch bằng phương pháp quang phổ kế Chúng tôi chon những mẫu ADN có kết quà đo OD nằm trong khoảng 1,8-2,0 là những mâu đạt tiêu chuẩn và sử dụng như ADN

template cho phản ứng PCR Đoạn gen có kích thước 300 bp thuộc gen s

(chứa vùng quyết định kháng nguyên “a” được khuếch đại sau 35 chu kỳ phản ứng (hình 2)

1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10

Hình 2 Ảnh điện di sản phẩm PCR

M: Thang ADN chuẩn (lOObp) Giếng 1,2,4,5,6,7,9,10: ADN (HBV)

Sản phẩm PCR sau khi thu lại từ gel agarose qua kiểm tra độ tinh sạch

sẽ được sử dụng làm khuôn giải trình tự Qua phân tích trình tự một số các đột biến đã được phát hiện Dưới đây là bảng so sánh trình tự ADN các mẫu HBV Việt Nam với trình tự của một số mẫu từ ngân hàng gen:

12

3.2 Phân tích trình tự đoạn ADN thuộc gen s của HBV

Mẫu số 1 chủng kiểu dại (từ ngân hàng gen)

Mẫu từ số 2 đến số 18 từ ngân hàng gen

Mẫu số 19,20,21,22 của Việt Nam

Các nucleotide có mầu đỏ đậm là các vị trí đột biến đặc chưng của mẫu Viêt Nam cụ thể như sau:

1 Vi trí 876 (thứ tư trên hê sen) đôt biến G thành c (Các mẫu trên ngân hàns sen không thấy dôt biến, chỉ có ở mẫu của Viêt Nam).

2 VỊ trí 887 đột biến A thành G (Như một số mẫu ở ngãn hàng gen)

3 Vị trí 888 đột biến G thành A (Như một số mẫu ở ngân hàng gen).

4 VỊ trí 891 đột biến T thành c (Tất cả các mẫu ở ngân hàng gen đều có).

5 Vị trí 897 đột biến A thành G (Tất cả các mẫu ở ngân hàng gen đều có)

6 Vị trí 898 đột biến G thành A (Tất cả các mẫu ở ngân hàng gen đều có)

7 Vi trí 942 đồt biến A thành c (Chỉ có môt số trên ngân hàns sen có đôt biến này).

8 Vi trí 1116 đôt biến G thành A (Các mẫu trên neân hàng gen khôm thấy

đồt biển, chỉ có ở mẫu của Viêt Namì.

9 Vị trí 1120 đột biến T thành A (Tất cả các m ẫu ở ngân hàng gen đều có).

10 Vỉ trí 1130 đôt biến c thành G (Các mẫu trên mân hàns sen không thấy

dôt biến chỉ có ỏ mẫu của V iêt Nam)

13

1 8 H B V _ is o la c e 0 1 6 6 0 s _ g e n e _ c o m p le t e d

19.nu»u_8o_9 Viet_Mai — *

-20.mau so 13 Viet Hom * * c

■C A A M c A c G A -C A T T c G A C G A

21.mail BO 14 Viet Ham c GA , c G A

22 mau~so l 9 _Viet^Kajn c GA c G A

I Hav_wild_type_completed_geno«e GCT CAA GGA ACC TCT ATG TTT ccc TCA TGT TGC TGT ACA AAA CCT ACG GAC GGA AAC TGC ACC TGT ATT ccc ATC <

10.HBV strain l2145_coiBplete_genoii»e c A T T

11.HBV^Strain 42l20_complete_genome c A T

17.H0V_isolate 02694_s_gene completed A

18 HBV_isolate_01660 s_gene completed A , „

19.mau so 9 Viet_Nam ™ .A .h G .

20.m au~so~13_V iet_N an\ r .A , A G .

21 mau_so_14_Viet_Nam A A -Q ,.r

22.mau_so 19_Viet_Nain .A G .

G.

-G-.G.

1 HBV_wild_type_completed_genoine TAC AAC AT

2 HBV_isolate_MOD_4 607_^coraplet ed_genome

3 HBV isolate_MOD_4 614_compl*ted genome

4 HBV^i so 1 ate_MOD 45 90 cotnpleted_genome

Trình tự đoạn đầu gen s của 4 mãu HBV ở Việt Nam có tổng số 10 vị trí bị đột

biến (ít đột biến hơn các mẫu trên ngân hàng gen) Trong dó, có 3 vị trí đột biến đặc chung cho các mẫu HBV của Việt Nam, không_ thấy có ở các mẫu từ ngân hàng gen Một số vị trí đột biến có chung cả ở các mẫu từ ngân hàng và Việt Nam đều có Các đột biến này có thể chia thành 3 nhóm Nhóm 1 bao gồm các đột

biến đặc trưng cho mẫu thu thập tại VN : Đột biến tại vị trí 876 với G biến

đổi thành c , ở vị trí 1116 với G biến đổi thành A và ở vị trí 1130 với c biến đổi thành G Nhóm 2 bao gồm các đột biến cho cả mẫu thu thập tại VN và các nước khác: Đột biến tại vị trí 887 với A biến đổi thành G, ở vị trí 888 với G biến đổi thành A, ở vị trí 942 với A biến đổi thành c và ở vị trí 1120 với T biến đổi thành A Nhóm 3 bao gồm các đột biến có tất cả ở các mẫu trên thế giới: ở vị trí 891 với T biến đổi thành c , ở vị trí 897 với A biến đổi thành G và ở vị trí 898 với G biến đổi thành A Tuy nhiên trong khuôn khổ của một đề tài quá nhỏ vì vậy những kết quả còn rất khiêm tốn, các đột biến phát hiện được trong nghiên cứu của chúng tôi mới chỉ dừng lại ở mức đột biến thay thế các nucleotide, chưa thể biết được có đẫn đến thay thế các axit amin hay không Những nghiên cứu gần đây của nhiều tác giả từ nhiều quốc

g ia trê n to à n th ể g ió i c h o th ấ y tầ m q u a n trọ n g c ủ a c ác đ ộ t b iế n ở c á c v ị trí

này vì chúng thuộc vùng quyết định kháng nguyên “a” [6,8,10]

Bên cạnh những hiệu quả tích cực của chương trình tiêm phòng vắc xin VGB, một vấn đề đặt ra được nhiều các nhà khoa học trên thế giới quan tâm

đó là hiện tượng đột biến trong vùng quyết định kháng nguyên “a” của HBsAg Đột biến này đầu tiên phát hiện ở Ý, cách đây 10 năm và hiện nay

đã có thông báo ở nhiều quốc gia trên toàn thế giới như Tây Thi, Đài Loan, Trung Quốc, Anh, Singapore, Thái Lan, Mỹ Quan điểm về sự liên quan của những đột biến này đến hiệu quả tiêm phòng còn gây nhiều tranh luận Một

số cho rằng các vắc xin VGB hiện đang sử dụng có khả năng dự phòng cho

cả các chủng đột biến Tuy nhiên trên cả lý thuyết và thực tế cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến trong cộng đồng hiện đang tăng dần theo thời gian triên khai tiêm phòng vắc xin và điều đáng chú ý là lại gặp nhiều hơn ở nhóm được tiêm phòng đầy đủ so với nhóm không được tiêm phòng Xu hướng hiện nay được nhiều nghiên cứu đề cập đến đó là sản xuất các vắc xin có hiệu quả phòng bệnh cao đối với các chủng đột biến bằng cách cải tiến vắc xin hiện có Vì vậy việc phát hiện các đột biển, hiểu rõ cấu trúc của chúng

hy vọng sẽ đáp ứng được mục đích này

Đ â y là m ộ t h ư ớ n g n g h iê n c ứ u c ò n rấ t m ớ i c ầ n c ó n h ữ n g n g h iê n c ứ u tiếp

theo ở một quy mô lớn với số lượng mẫu nhiều hơn được thu thập trên phạm

vi rộng của cả nước bao gồm cả những đổi tượng đã tiêm phòng

15

Từ những kết quả trên chúng tôi xin đưa ra một số kết luận sau:

1 Đã phát hiện một số đột biến tại vùng gen s của virut viêm gan B tại VN Các đọt biến này có thể chia thành 3 nhóm: Nhóm 1 bao gồm những đột biến chi có ở các mẫu thu thập tại Việt Nam., nhóm 2 bao gồm các mẫu ở

Việt Nam và 1 số các nước khác và nhóm 3 bao gồm các đột biến cho tất cả

các mẫu trên thế giói

2 Các đột biến phát hiện được đều là các đ ộ t biến thay thế nucleotide, chưa phát hiện các đột biến khác như mat nucleotide, thêm nucleotide hay đổi đoạn nucleotide

3 Ngoài những đột biến như các mẫu ở các nước khác đã phát hiện những đột biến đặc trưng cho mẫu tại Việt nam Các đột biến này là các đột biến thay thế nucleotide: G biến đổi thành c, G biến đổi thành A và c biến đổi

thành G

KIẾN NGHỊ

Từ những kết luận trên chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:

1/ Cần tiến hành các nghiên cứu về đột biến của virut viêm gan B với số mẫu lớn trên phạm vi cả nước vả tìm hiểu các đột biến liên quan đến thuốc điều trị viêm gan B

2/ Cần tiến hành các nghiên cứu về đột biển của virut viêm gan B ở đối tượng đã tiêm phòng vaccine để có thể phát hiện nhanh được các đột biến trốn thoát

#

16

TIẾNG VIỆT

TÀI LEỆƯ THAM KHẢO

1 Vũ Hồng Cương (Ỉ998), Điều tra tỷ lệ HBsAg, tỷ lệ antiHBs và hiệu lực đáp ứng miễn dịch cỏa v ắ c xin viêm gan B do Việt Nam sản xuất, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

2 Trịnh Thị Ngọc (2001), Tình trạng viêm gan A, B, c , D, E ở các bệnh nhân viêm gan virut tại một số tỉnh phía Bắc, Luận án Tiến sĩ Khoa học Y Dược, Viện Vệ sinh Dịch tê Trung ương Hà Nội.

3 Phạm Ván Ty (2005), Vừut học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

TIẾNG ANH

4 Brown.J.L., Carman U.F., Thomas H.C (1992), The ckinical significance of

molecular variation within the hepatitis B vims genom Hematology vol 15:144-

9 Oon C.J., Chen.W.N (2009), “ Identification o f hepatitis B surface antigen

variants with alteration outside the ‘a ’ determinat in immunized Sigapore infants”,] Infect Die 179, pp259-263

TRUNG TÂM THÔNG TIN THU VỈỀN

~~ỎOO fc 0 0 0 0 X ^ 3

* 17

TIẾNG VIẸT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Vũ Hồng Cương (1998), Điều tra tỷ lộ HBsAg, tỷ lệ antiHBs và hiệu lực đáp ứng miễn địch của v ắ c xin viêm gan B do Việt Nam sản xuất, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

2 Trịnh nũ Ngọc (2001), Tình trạng viêm gan A, B, c, D, E ờ các bệnh nhân viêm gan virut tại một số tỉnh phía Bắc, Luận án Tiến sĩ Khoa học Y Dược, Viện Vệ sinh Dịch tê Trung ương Hà Nội.

3 Phạm Văn Ty (2005), Vứut học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

TIẾNG ANH

4 BrownJX., Carman U.F., Thomas H.c (1992), The ckinical significance of

molecular variation within the hepatitis B virus genom Hematology vol 15:144-

9 Oon C.J., Chen.W.N (2009), “ Identification o f hepatitis B surface antigen

variants with alteration outside the ‘a ’ determinat in immunized Sigapore infants’’,] Infect Die 179, pp259-263

O A t H Ọ C Q U Ọ C G IA H A N Ọ I TRuN G ĨÁ M T H Ô N G TIN THU VIỀN

6 0 0 fc 0 0 0 0 / 4 3

* 17

PHỤ LỤC 1

Bảng 6 Kết quả đo OD của các mẫu ADN (HBV) đã tách chiêt

PHỤ LỤC 2• ■

TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR BẰNG KÍT QIAGEN

Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất:

• Thêm 5 thể tích Buffer (Buffer PB) vào tube chứa 1 thể tích sản phẩm PCR (Ví dụ thể tích sản phẩm PCR là 50 fil thì thêm 250^1 Buffer 1) Vortex 15 giây.

• Chuyển hỗn hợp vào cột ADN binding đã được cung cấp sẵn trong bộ kít

• Ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút

• Đổ bỏ dịch lọc

• Chuyển cột sang một tube khác

• Rửa bằng thêm 750 Jil Buffer PE vào cột và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút

• Bỏ phần dịch lọc và ly tâm cột ở 13.000 rpm/1 phút

• Chuyển cột sang một tube ỉ 5 ml mới

• Thêm 50 |il Buffer EB vào chính giữa cột để nhiệt độ phòng/1 phút và ly tâm 13.000 rpm/1 phút

• Kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch bằng đo OD ở bước sóng 260/280 nm.

PHỤ LỤC 3* »XÁC ĐỊNH TRÌNH T ự GEN BẰNG MÁY T ự ĐỘNG

STT Các bước tiến hành

1 Tinh sạch sản phẩm PCR

2 Chạy PCR gắn BigDye

3 Tinh sạch BigDye

4 Biến tính ADN trong HiDi Formamid

5 Chạy máy giải trình tự tự động ABI 3100 Avant

6 Phân tích trình tự gen

20

CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

Quốc tế: 01 báo cáo khoa học

N Giang Lien, B Khanh Hoa, T Thu Ha (2010), “ The survey of s gene mutation of Hepatitis B virus cừculating in Vietnam” Poster presentation at

14 th International Congress of Infectious Diseases, March 2010, Myami,

USA.

Trong nước: 01 bài báo

Pham Due Ngoe, Tran Thu Ha, Tràn Th| Lien, Le Xuan Thinh, Nguyen Van Tuan and Ngo Giang Lien (2010), “ Preliminary study on some s gene

mutation of HBV isolated in Vietnam” VNƯ Journal o f Science, Natural Sciences and technology 26, No 4 S : 613-617

TWCLVC DISEASES THAT CHAU GEO OUR

ViOfiCO Si.9»

http://w w w docstoc.coni/docs/44320628/14th-Intem ational-C ongress-on-Infectious-D iseases 3/13/2011

From: Doris steỉnbach <DorisiStenTbacn@t3L<loig>

> Date: 06 Dezember 2009 18:20:56 MEZ

> To: Ngo Giang Lien <haquananinh2Q0i £gỵaỊ]go ^m >

> Subject: 1 4th I C I D -p o ste r acceptance notification

> was accepted for POSTER presentation at the 14th International Congress

on Infectious Diseases which will be held in Miami, FL from March 9 to 12,

> Location: Poster & Exhibition Hall (Ground Level / Hyatt Regency Miami)

> Please be advised of the following guidelines:

>

> • SIZE OF POSTER: width 90 cm (-36"), height 130 cm (-51") Format: Portrait

> * The poster must be mounted BEFORE 09:45 am and removed in the

afternoon

of the same day Posters not removed by 5:45 pm will be dismantled by the congress staff and we cannot guarantee the poster's condition.

circulating in Vietnam

Nqo Giano Lien1 B Khanh Hoa2, T Thu Ha , Pham Due Ngoc

r ’ ’4 Hanoi University o f Science, Biology, Ha N oi/V N , Bach Mai Hospital,

Hematalogy, Ha Noi/VN

AbsractN°1173

Section: Hepatitis

Date/time: March 11,2010

Location: Poster & Exhibition Hall (Graund Level/Hyatt Regency Miami)

According to the report of the Vietnam Ministry of Health, in the years from 1987-

2000, the cases of HBV infection reported per year was more than 25.000 and the mortality rate about 1,2% Although the efficacy of HBV immunization is well proven, in some cases,' anti-HBs neutralization- resistant mutants or naturally occurring ‘escape’ mutants have been identified It is, therefore, paramount to establish not only prevalences of HBsAg in endemic areas, but also to focus on the type of mutants emerging This will help future policy decisions relating to vaccine components as well as diagnostic assay design.

In this study, we detected some mutations in the s gene that we have found

recently by of the use new molecular approaches The presence of HBV DNA was determined by PCR using forward and primer for amplifying a part of gene

s, containing “a” determinant region: 5’- CAAGGTATGTTGC-CCGTTTG -3’ (position 301-320) and 5'-AAAGCCCTGCGAACCACTGA -3’ (position 450-559)

The PCR was performed by GeneAmp PCR system 9700 in a 25 jj I volume Sequencing of 219bp of gene s.

We found some mutations at some position of the gene s All these mutations

were belonging to nucleotide change In this investigation we have not found mutations such as: deletion, nucleotide exchange and other kind of mutations.

The gene s region of the hepatitis B virus (HBV) is responsible for the expression

of survace antigen and include the “a" - determinat region Thus, mutations in

this region would afford HBV variants a distinct survival advantage, permtting the mutant virus to escape from immune system.

Recent studies have revealed significant diversity in sequence of H B V isolated, accounting for the point mutations occurred at these nucleotide position resulted in amino acid change residues changed at the certain “a" epitope region.

Acknowledgem ents: The work was funded by VNU Scientific research project ID QG09-

17 and DelPHE project.