Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa Fe(II), khử nitrate trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘIBÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẮP ĐHQG Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ ô x y hóa FeII, khử nitrate trong một số môi trường sình

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN

ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẮP ĐHQG

Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ ô x y hóa Fe(II), khử nitrate

trong một số môi trường sình thái và khả năng ứng dụng của chủng

Chủ trì đề tài: TS Đinh Thúy Hằng

Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

tNJG TÁM THỎNG TIN THƯ VIỆN

Hà Nội, tháng ỉ năm 20ỉ 0

BÁO CÁO KÉT QUẢ THỰC H Ệ N ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CÁP DHQG

BÁO CÁO TÓM TẮT

1 Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vỉ khuẩn kỵ khí ôxy hoả Fe(II), khử nitrate trongmột số môi

trường sinh thái và khả nâng ứng dụng của chúng.

2 Mã số: QG.07.23

3 Thời gian thực biện: 2 năm (2007 - 2009)

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHNĐiện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: dthang@vnu.edu.vn

6 Cán bộ tham gia: CN Nguyễn Thị Tuyền

ThS Nguyễn Minh Giảng

7 Mục tỉêu và nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiền cửu:

- Mau trầm tích ở đáy hồ, mẫu đất ở ruộng lúa ngập nước và mẫu trầm tích ven biển sẽ được

lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ôxy), đưa về phòng thí nghiệm và giữ ở 4°c cho đến khi tiến hành phân tích vi sinh vật

- Số lượng vi khuẩn ôxy hoá Fe(II)/khử NO3- sẽ được xác định theo phương pháp MPN (MostPropable Number) trong môi trường dịch thể chứa Fe(II) làm nguồn điện tử và NO3- là chẩt nhận điện tử trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn Thành phần khoáng của môi trường đàm bào tương ứng với môi trường sinh thái tại địa điểm lấy mẫu

- Đa dạng về thành phần loài ttong các mẫu khác nhau sẽ được xác định thông qua phương pháp sinh học phân tử, tách DNA tổng số trục tiếp từ các lô thí nghiệm ở nồng độ pha loãng khác nhau trong dãy MPN và phân tích tính đa dạng cùa một đoạn gen 16S rARN cùa tập đoàn vi sinh vật thu được trong mỗi !ô bằng phưomg pháp PCR/DGGE

- Các chùng vi khuẩn ôxy hoả Fe(ÍI)/khừ NCV đại diện, chiếm đa số tại mỗi địa điểm lấy mẫu

sẽ được phàn lập từ ống pha loãng cao nhất có vi sinh vật phát triển cùa dăy MPN bằngphương pháp ống thạch bán lòng

- Các chùng vi khuẩn phân lập sẽ được nghiên cứu về đặc điểm sinh lý sinh hoá và phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA Ket quả cùa nghiên cứu này sẽ làm cơ sở để tuyển chọn các

chùng cỏ hoạt tính sinh học (khả năng chuyển hóa Fe(II) và NO3- ) cao và nghiên cứu khả năng ứng dụng của chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe(II), Mn(II), NO3- trong môi trường ô nhiễm.

8 Các kết quả đạt được

- Ba dạng môi trường khác nhau gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước và trầm tích ven biển được chọn để tiến hành nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn ôxy hoá Fe(II) khử NO3- Đây là những dạng môi trường trong đó vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hoá sắt và nitơ đóng vai trò quan trọng Mầu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) tại các môi trường sinh thái

kể trên được thu thập và sử dụng để phân tích nhóm vi khuẩn kỵ khí này

Sổ lượng vi khuẩn ôxy hoá Fe(II), khử NO3- đã được xác định bằng phương pháp MPN trong môi trường dịch thể nước ngọt (đối với mẫu ao và mẫu ruộng lúa) hoậc nước lợ (đối với mẫu trầm tích ven biển) chứa Fe(II) làm chất cho điện tử, NO3' làm chất nhận điện tử và acetate/C0 2 làm nguồn cacbon Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong các ống MPN được nhận biết thông qua thay đổi màu sắc của môi trường nuôi cấy sang màu vàng nâu do Fe(II) bị ôxy hoá thành Fe(III)

- DNA tổng số từ các ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển được tách chiết và sử dụng làm khuôn trong phân ứng PCR khuyếch đại đoạn gen I6S rDNA có độ dài 550 bp Phân tích điện đi biến tính đoạn gen trên cho thấy tính đa dạng khá cao của vi khuẩn trong các ống MPN Một số băng điện di đại diện được cắt và thôi gel để đọc trình tự, qua đó đã xác định được các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu, cụ thể là

Anaeromyxobacter, Pseudomonas và Paracoccus.

- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện oxy hoả Fe(II) khử NO3- trong các dãy MPN thông qua phương pháp lai in situ sử dụng các đầu dò huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuẩn a-, 0- và y-Proteobacterỉa.

12 chùng vi khuẩn kỵ khí được phân lập và tinh sạch (4 chùng đối với mỗi dạng môi trường sinh thái) Tính đa dạng cùa các chủng này về mật di truyền được xác định thông qua phân

tích ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA đài 1500 bp sừ dụng hai enzyme Mspỉ và Haeììl Các chùng đại diện cho các nhóm ARDRA được giải trình tự để xác định vị trí phân

loại của cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện

- Bằng phương pháp xác định lượng Fe(ll) và NO3" trong môi trường nuôi cấy theo then gian, chùng vi khuẩn IN 12 đã được chứng minh có khả năng chuyển hoá hai hợp chất này khá cao, như vậy chủng này có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực môi trường Bên cạnh đó khả năng sử dụng Mn(II) thay cho Fe(II) cũng đâ được nghiên cứu, tuy nhiên chùng IN 12 không thể hiện khả năng ửng dụng để loại bò Mn(IĨ) trong môi trường

- Các kết quả nghiên cứu đã được công bố trong 02 bài báo khoa học, 01 báo cáo Poster tham gia hội nghị về sinh thái sinh vật và 02 trình tự gen đăng ký trong GenBank.

- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học

9 Tình hình sử dụng kỉnh phí

- Tổng kinh phí của đề tài đã chi: 60.027.400, bao gồm các mục:

+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 29.522.400

+ Chi khác (lệ phí của đơn vị DT): 6.000.000

1 Project title: Diversity o f anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in

some ecological environments and their potential use.

3 Duration: 2007 - 2009

4 Organizer: Vietnam National University Hanoi (VNUH)

5 Project leader: Dr Dinh Thuy Hang

Institute of Microbiology and Biotechnology, VNUH

6 Key participants: BSc Nguyen Thi Tuyen

MSc Nguyen Minh Giang

7 Objectives and study contents

- Collect anaerobic mud samples from representative environments in Vietnam and keep at 4 °c

as the sources for microbiological studies

- Determine the number of Fe(II) oxidizing-nitrate reducing bacteria in these environments by using MPN method carried out in anoxic liquid media containing Fe(II) as electron donor,

N 0 3- as electron acceptor and trace acetate as corbo source Mineral content of the media would respect to the natural conditions where the samples have been collected

Species composition of the microbial communities in these environments would be analyzed via PCR-DGGE method applied for 16S rDNA of the samples of the MPN series

- Isolate representative strains from the MPN tube of the highest dilution by performing dilution series in semi-liquid agar tubes

Study physiology and phylogeny of the isolated strains, afterward select strains for the study

o f application potential in elimination of Fe(II), Mn(II) and NO3- in contaminated waters

8 The obtained results

- Samples from three ecological environments, namely mud sediment freshwater pond, flooded paddy soil and sediment from estuarine environment were collected for studying Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria These environments are known for significant

involvement o f bacteria in Fe and nitrogen cycles Samples at 10 cm depth below the sediment surface were used for this study.

Number o f Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria was enumerated via MPN method earned out in anoxic media with freshwater mineral content (for the samples from freshwater pond and paddy soil) or brackish water mineral content (for the sample from estuarine environment) These media contained Fe(II) as electron donor, NO3- as electron acceptor and trace acetate as carbon source Growth of bacteria in the MPN series was recognized by colour changing in the media, from white (Fell precipitation) to dark brown (Felll precipitation)

Total DNA from representative MPN samples was purified and used in the PCR experiments

to amplify 550 bp fragments of the V3 region o f the 16S rDNA and used for analyzing diversity of bacteria in the communities with DGGE method Most prominent DGGE bands were excised, reamlified and sequenced to determine the phylogenetic affiliation of the respective baterial groups

Diversity of the bacterial communities in the samples was also analyzed by using in situ hybridization (FISH) with fluorescent probes specific for the a-, P- and y-Proteobacteria.

12 bacterial strains were isolated and purified (4 strains for each studied environment) Genetic diversity of these isolates was studied via ARDRA analyzes of Ỉ6S rDNA with two

endonucleases Mspl and HaelU 16S rDNA of the strains represented for the RFLP groups

were sequenced and comparatively aligned with the database to identify the phylogenetic affiliation of the ARDRA groups

Quantitative analyzes of the amount of Fe(II) and N o r in growth media of the isolated strains allowed to select strain IN 12 as a candidate for application for simultaneous elimination of Fe(II) and NO3' in contaminated waters Besides that, the ability of strain IN12

in oxidation of Mn(II) with nitrate was also studied, however it was revealed that tis strain did not growth with Mn(II) as electron donor for nitrate reduction

MỤC LỤC

CHƯƠNG I TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.3 Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 4

1.3.3 Khả năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate 6

2.2.1 Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate 7

2.2.3 Tách DNA tổng sổ từ mẫu quần thể và từ chùng vi sinh vật 92.2.4 Phân tích đa dạng vi sinh vật bằng phương pháp ARDRA 9

2.2.7 Phương pháp FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 11

3.1 Xác định sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại ] 5

các môi trường Dghiên cứu

3.2 Phân tích cấu trúc quần thể bằng điện di biến tính (DGGE) 163.3 Mức độ oxy hóa Fe(II), khử nitrate của vi sinh vật trong các mẫu 173.4 Phản lập vi khuẩn oxy hóa Fe(ll) khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 17

và đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập

3.5 Phân tích đa dạng vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu 21

bằng phương pháp FISH

3.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học 22

của các chủng vi khuẩn đại diện

Phụ lục 2 Tham gia đào tạo khoa học

Phụ lục 3 Các công trình khoa học đã công

DANH MỤC CÁC CHỬVIÉT TẮT

ALF968 Fluorescence probe against a -Proteobacteria

ARDRA Amplified ribosomal DNA restriction analyses

GAM42a Fluorescence probe against y-Proteobacteria

MỞ ĐẦU

Trong tự nhiên sát là một trong những nguyên tố cỏ mặt với hàm lượng đáng kể, sau carbon, nitơ, phospho và lưu huỳnh (Ehlich, 1996) Là một nguyên tố kim ioại, sất tồn tại ở các dạng ion với điện thế oxy hoá khử khác nhau, gồm Fe(II) và Fe(III) Trong hai dạng kể trên chi

có Fe(II) tồn tại ở dạng hoà tan trong nước Tuy nhiên, do có tính khử cao, Fe(II) nhanh chóng bị oxy hoá thành Fe(III) trong phản ứng hoá học với oxygen không khí Do vậy ion Fe(II) thường chỉ được tìm thấy trong các điều kiện môi trường không có oxygen, ví dụ như ở đáy các thuỷ vực, các tầng nước ngầm hay môi trường có pH thấp (Konhauser, 1997; Nealson, Saffarini, 1994)

Trong khi oxy hoá Fe(II) bằng oxygen theo con đường sinh học chỉ diễn ra ờ môi trường

có pH thấp thì oxy hoá Fe(II) bằng nitrate là quá trình diễn ra ở điều kiện pH trung tính (Ehrlich, 1996) Trong tự nhiên, quá trình oxy hoá sắt (II) với chất nhận điện từ là nitrate chủ yếu diễn ra ở ranh giới hiếu khí (có oxygen) và kỵ khí (không có oxygen) trong lớp trầm tích ở đáy các thuỷ vực Oxy hoá Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trò quan trọng trong môi trường ô nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxygen) và NƠ3- cao (đo chất hữu cơ bị phân huỳ tạo

thành) (Weber et aL, 2006b) Các loài vi khuẩn với khả năng tiến hành phàn ứng oxy hoá khử

này có thể cùng một lúc thực hiện được hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hoà tan trong nước về dạng Fe(III) kết tủa, và hai là loại bỏ NO3-, chuyền thành dạng N2 không độc hại

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự có mặt khá phổ biển của nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate với mật độ khá cao (106 tể bào/g trầm tích) trong các điều kiện môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa iý khác nhau trên thế giới (Straub, Buchholz-Cleven, 1998) Tuy nhiên ờ Việt nam cho đến này chưa có công trình nghiên cứu nào đề cập đến quá trình sinh học dùng Fe(II) để khử NO3” cũng như các

loài vi khuẩn đảm nhiệm quá trình này Do vậy, đề tài ' Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ k h í oxy hoả Fe(IĨ), kh ử nitrate trong một sổ môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng ’’ được đặt ra với mục tiêu nghiên cứu tính đa dạng của vi khuẩn khử nitrate sử dụng Fe(II)

là nguồn điện tử duy nhất trong một sổ dạng môi trường sinh thái đặc trung ở Việt Nam, đồng thời tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong việc xử lý các nguồn nước nhiễm ion sắt kim loại và nitrogen

1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn tham gia chu trình Fe

Sắt là một trong những kim loại phổ biến nhất và là nguyên tố có mặt trên trái đất với hàm lượng lớn thứ tư, sau carbon, oxygen và nitrogen Thông thường sắt tồn tại ờ đạng Fe2Ơ3 ít tan trong nước và có màu vàng nâu Trong môi trường pH trung tính, dạng hòa tan trong nước Fe(II) chi tồn tại ở điều kiện không có oxygen, ví dụ như ở đáy các thủy vực, nơi oxygen hòa tan trong nước đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử đụng đề phân hủy các hợp chất hữu cơ Quá trình oxy hóa - khử giữa Fe(II) và Fe(III) có vai trò thiểt yếu trong chu trình sinh địa hóa môi trưởng và là một trong những quá trình chuyển hoá vật chất quan ưọng có mặt từ rất sớm trên ưái đất Fe(II) là thành phần của các dạng khoáng phổ biến như siderite (khoáng chất có chứa FeCƠ3), vivianite (Fe3(PC>4)2.8H2 0) hoặc pyrite (Fe$2), trong môi trường kỵ khí có tính acid yểu đến môi trường

trung tính (Straub et ai, 2001) Oxy hóa sắt diễn ra theo cả hai con đường hoá học và sinh học,

trong đó các quá trình sinh học cỏ vai trò đặc biệt quan trọng tại nhiều dạng môi trường sinh thái khác nhau (hình 1.1) Với thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) là +770 mV đối với môi trường acid và +200 mV dối với môi truờng trung tính, Fe(II) có thể được sử dụng như chất cho điện tử

để cung cấp đương lượng khử cho các quá trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi khuẩn oxy hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, còn Fe(III) có thể được sử dụng như

là chất nhận điện tử cuối cùng trong điều kiện kỵ khí để oxy hoá các hợp chất hữu cơ (Weber et

a i, 2006a).

Hình 1.1 Chu trình chuyển hoá sắt trong tự nhiên (Ehrlich, Newman, 2008)

1 - Vi sinh vật trong môi trường acid; 2 - Vi sính vật kỵ khỉ ở môi tnxờng trung tính (khừ nitrate, quang hợp kỵ khi)'

3 - Quá trình hóa học trong môi trưcmg trung tinh với nồng độ oxygen cao; 4 - Quá trinh hóa học; 5 - Quá trình sinh học; 6 - H2S từ vi sinh vật; 7 - + 0 2, quá trình sinh học hoặc hóa học; 8 - -“-CO}2", quá trinh hóa học; 9 - chuyền H+ quá trình sinh học hoặc hỏa học; Í0 - Ọuá trình sinh học hoặc hóa học.

2.3

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) bao gồm nhiều nhóm có các đặc điểm sinh lý khác nhau, ví dụ như tự dưỡng và dị dưỡng, quang dưỡng và hóa dưỡng, ưa acid và trung tính, hiếu khí và ky khí Mặc dù vai trò của quá trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn trong môi trường là rất lớn nhưng những hiểu biết hiện nay về sinh lý cũng như sinh hóa của nhóm ví sinh vật này còn nhiều giới hạn Hầu hết các nghiên cứu và công bổ về quá trinh oxy hóa Fe(II) đều tập trung vào các vi

khuẩn hiếu khí ưa acid như Thiobacciỉlus ferrooxidans (Temple, Colmer, 1951; Ehrlich, 1996),

phát triển trong môi trường có pH 1-2, nơi có Fe(II) và Fe(III) ờ dạng ion hòa tan Tuy nhiên, ở

pH trung tính cơ chất và sản phẩm của quá trình chuyển hóa sắt lại ít hòa tan, điều này gây khó

khăn cho việc nghiên cửu sinh ]ý của các vi sinh vật tham gia (Straub et a i, 2001) Mặc dù vậy,

vi khuẩn tham gia chuyển hoá sắt ở điều kiện môi trường trung tính, bao gồm oxy hoá Fe(II) và khử Fe(III) lại rất đa dạng và đóng vai trò quan trọng hơn trong chu trình vật chất trong tự nhiên

1.2 Vi khuẩn oxy boá Fe(II) ở pH trung tính

1.2.1 Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II)

Mặc dù quá trình oxy hóa Fe(II) bằng oxygen không khí tại pH trung tính xảy rất nhanh, nhiều nghiên cứu cho thấy oxy hoá Fe(II) bằng còn đường sinh học hoàn toàn có thể cạnh tranh với quá trình hoá học Vi khuẩn hiếu khí oxy hoá Fe(II) ở pH trung tính được mô tả đầu tiên là

các đại điện thuộc ba chi Gaỉỉionelỉa, Leptothrix và Marinobacier (Kuetzing, 1919; Ehrenberg,

1919) Ngoài ra, theo các nghiên cứu gần đây, một số vi khuẩn oxy hoá Fe(II) hiếu khí mới tìm

thấy được xếp vào các phân lớp a-, p- và Ỵ- Proteobacterìa (Edwards et a l, 2003; Emerson, Weiss, 2004; Dhillon et a i, 2005; Rentz et a i, 2007) Nhu vậy cùng với sự phát triển của các

phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, bức tranh đa dạng của nhóm vi sinh vật này ngày càng trở nên phong phú hơn

1.2.2 Vi khuẩn quang họp ky khí oxy hỏa Fe(II)

Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có the cũng được tạo thành thông qua hoạt tính oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khà năng sử dụng Fe(II) như một nguồn điện tử để tạo

các đương lượng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô cơ (Weber et aỉ., 2006a) Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hỏa Fe(II) kỵ khí được biết đến đầu tiên (Widdel et aỉ., 1993) Hiện nay nhóm vi khuẩn này đã được mô tà với nhiều đại diện thuộc các chi Chỉorobium, Rhodobacier, Thiodictyon, Rhodovuỉum, Rhodomicrobium (Ehrenreich, Widdel, 1994; Heising, Schink, 1998; Heising et aì., 1999; Straub et a l, 1999; Kappler, Newman, 2004).

Tuy nhiên quá trình oxy hóa Fe(II) bàng quang hợp trong môi trường tự nhiên bị giới hạn

ở độ sâu 200 um trong đất và trầm tích do hạn chế ánh sáng (Ciani et a l, 2005) Hơn nữa, những

nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rầng vi khuẩn quang hợp oxy hóa Fe(II) không có khả năng sử dụng Fe(II) ờ dạng khoảng mà chi có thể oxy hóa Fe(II) ở dạng hòa tan (Kappler, Newman 2004), do

đó, chúng không đỏng vai trò đáng kể trong chu trình chuyển hoá sắt trên cạn

3

1.2.3 Vi khuẩn khử nitrate, oxy hóa Fe(II)

Vi khuẩn oxy hoá Fe(II) kỵ khí đóng vai trò quan trọng trong chu trinh chuyển hoá sắt,

đặc biệt trong các lóp trầm tích nơi vi sinh vật bị hạn chế về oxygen hoà tan (Lack eí al., 2002; Weber et al., 2001; Senn, Hemond, 2002; Straub et al., 2001; Weber et a i, 2006c) Với hiệu điện

thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7 vào khoảng +200 mV, Fe(ll) có thể ừờ thành nguồn điện

tử cho quá ưình hô hấp kỵ khí, khử nitrate thành N2 do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Straub

et a i, 1996; Benz et a i, 1998; Weber et a i, 2006c) Quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate được

tóm tát theo phương trình phản ứng như sau:

10 Fe2+ + 2 N 0 3“ + 24 H20 = 10 Fe(OH)3 ị + N2 T + 9 H2 1

Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chù yểu diễn ra ở ranh giới hiếu khí (có oxygen) và kỵ khí (không có oxygen) trong lớp trầm tích ờ đáy các thủy vực Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate được phân lập đầu tiên từ các

lớp trầm tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen (Đức) năm 1996 (Straub et a i, 1996) Một số công

trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt phổ biển của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao (1 0 6 tế bào/g trầm tích) trong các điều kiện môi trường khác nhau, bao gồm cà nước ngọt, nước

lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub et a l, 1998) Các loài vi

khuẩn phổ biến nhất trong nhóm nảy được biết đến hiện nay lả các loài thuộc chi

Chromobacteríum và Klebsiella (Benz et aỉ.y 1998; Senko eí a i , 2005; Weber etaỉ., 2006b).

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phần lớn sinh trường dị dưỡng, phụ thuộc vào chất hữu cơ (vi dụ như acetate) để cung cấp nguồn carbon cho việc tổng hợp thành phần tế bào

(Straub et al., 1996; Benz et a l, Ỉ998) Bằng phương pháp MPN, người ta đã xác định được vi

khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn khử nitrate nói chung, trong đó

nhóm sinh trưởng dị dưỡng thường gặp hơn nhóm sinh trưởng tự dưỡng (Straub et a l, 1998) Vi

khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tự dưỡng mới chỉ được biết điến với hai đại diện là

Ferroglobus pỉacidus, một vi khuẩn cổ ưa nhiệt (Hafenbradl et a l, 1996), và một vi khuẩn ưa

ấm thuộc phân lớp p-Proteobacteria (Weber et a l, 2006b) Đối với lịch sừ tiến hoá, các sinh vật

sinh trường tự dưỡng vô cơ như nhóm vi khuẩn oxy hoả Fe(II) khử nitrate tự dưỡng đóng một vai trò quan trọng, góp phần tạo nguồn carbon hữu cơ ban đẩu để duy trì sự sống

1.3 Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate

1.3.1 Ảnh hưởng của nhiễm nitrogen trong các nguồn nước

Nước thải với nồng độ ammonium hay nitrate cao xả ra ngoài môi truờng có thề gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng liên quan đến môi trường sinh thái và sức khỏe cộng đồng

Ảnh hưởng tới môi trường sinh thái

- Ả n h hưởng độc hại: Nitrogen ammonia ở dạng ammonia rất độc hại đối vói các loài

thủy sinh, đặc biệt là cá Ở pH trang tính, 99% N-ammonia tồn tại ở dạng N Rị+, trong khi đó khi pH ở khoảng trên 9, dạng NH3 tăng đảng kể Do vậy mức độ độc hại của N- ammonia rất nghiêm trọng khi pH trong môi trường tăng, thường là hậu quả sau khi có lượng nước thải với độ kiềm cao đổ ra ngoài môi trường

- Giảm oxygen hòa tan trong các thủy vực: ammonia thường dẫn đến việc tăng nhu cầu

oxygen cho các quá trình sinh hóa ở các thủy vực Theo tính toán, 1 mg ammonia thải ra ngoài môi trường đòi hỏi lượng oxygen hòa tan tăng thêm 4,6 mg, chủ yếu do hoạt động của nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa Hậu quả của việc tăng nhu cầu về oxygen này là làm thiếu oxygen cho các loài thủy sinh khác cùng sống trong môi trường

- Gây hiện tượng p h ủ dưỡng trong các ao hồ: việc tăng hàm lượng nitrogen trong các

ao hồ kéo theo sinh trưởng rầm rộ cùa tảo và các thực vật thủy sinh, dẫn đến tâng nhu cầu oxygen về đêm và làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của các động vật thủy sinh

- Làm giảm hiệu quả của chỉorỉn: ammonium kết hợp với chlorin tạo hợp chất

chloramin có tác dụng kháng khuẩn kém hom so với chlorin ở dạng tự do

- Ầ n mòn: ammonium ở nồng độ trên 1 mg/L có thể gây ăn mòn cho các đường ống dẫn

nước và các công trình kim loại dưới nước

Ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng

- Gây bệnh thiếu máu: nitrate là nguyên nhân gây bệnh thiếu máu (Methemoglobinemia)

ở người do bị khử thành nitrite trong hệ đường ruột, sau đó liên kết với hemoglobin dưới dạng methemoglobin, không cỏ khả năng vận chuyển oxygen Ở người khỏe mạnh, hàm lượng methemogỉobin trong máu được giữ ổn định ở mức 1 - 2% nhờ enzyme

methemoglobin reductase Trè em dễ bị ảnh hường cùa bệnh này hơn so với người trưởng thành vì có độ pH trong dạ dày cao hom, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn khử nitrate sinh trưởng Vitamin c được biết đến với khả năng bảo vệ và giữ nồng độ methemoglobin ở mức thấp

- Gây bệnh ung thư: nitrite được tạo ra từ nitrate còn có thể kết hợp với các amine thứ

cấp để tạo thành nitrosamine, là tác nhân gây đột biến gen và một số bệnh ung thư như ung thư dạ dày, ung thư bàng quang (Tricker, Preussmann, 1991; Lundberg, 2004) Theo quy định quốc tế, giới hạn nitrate trong nước uổng là 10 mg/L

1.3.2 Ảnh hirởng của nhiễm sắt trong các nguồn nước

Sắt là nguyên tố phổ biến trong tự nhiên, là một thành phần quan trọng trong tồng hợp hemoglobin (chất vận chuyển oxygen cho các tế bào trong cơ thề) và myoglobin (chất dự trữ

oxygen cho cơ thể) Ngoài ra sắt còn tham gia vào thành phần một số enzyme oxy hoá khử như cataỉase, peroxydase vả các cytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể) Sắt đóng vai trò quan ưọng trong việc sản xuất ra năng lượng oxy hoá, vận chuyển oxygen, hô hấp của ty lạp thể và bất hoạt các gốc oxy hóa cỏ hại Tuy nhiên quá tải sắt trong cơ thể cũng gây

ứ đọng sắt tại các mô như tim, gan, tuyến nội tiết , dẫn đến rối loạn trầm trọng chức năng các cơ quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006)

Cơ thể hấp thu sắt ở dạng Fe(II) Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển thành dạng gắn với các acid amine hoặc đường Acid chlohydric khử Fe(III) thành Fe)II) để hấp thu Vì vậy nên lượng sắt dư thừa trong nước uống cho dù ở dạng Fe(II) hay Fe(III) đều gây nguy hiểm cho con người

Tác hại của thừa sắt trong cơ thể hiện nay vẫn còn đang gây nhiều tranh cãi Người ta cho rằng bộ não là mục tiêu chính của sự thừa sắt, sự tích lũy sắt trong mô não là một trong những nguyên nhân của các bệnh về thần kinh như Parkinson và Alzheimer, sắt còn được coi như là một chất gây ung thư rất mạnh, thường gặp nhất là ung thư gan sắt du thừa tích luỹ trong tim và các động mạch có thể gây nên các bệnh về tim hoặc phá vỡ động mạch, sắt thừa lắng đọng trong

lá lách sẽ phá vỡ sự bài tiết insulin và gây ra bệnh đái tháo đường nghiên trọng

1.3.3 Khả năng ứng dụng của vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

Với khả năng hô hấp kỵ khí bằng nitrate, vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate có thể tham gia vào quả trình loại bỏ nitrogen trong các nguồn nước thài hay nước sinh hoạt có nồng độ

nitrate cao (Straub et ai., 1996) Quá trình này diễn ra khi có mặt các hợp chất hữu cơ làm nguồn

điện tử thích hợp để khử nitrate, ví dụ như lactate, acetate hay methanol, là những sàn phẩm của quá trình phân giải chất hữu cơ cao phân tử Bằng các phương pháp sinh học phân tử người ta đã xác định được tỷ lệ khá cao của vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate trong các hệ thống xử lý nước thải nhiễm nitrogen (Bitton, 1999) Bên cạnh đó, khả năng sinh trường vô cơ sử dụng Fe(II) làm nguồn điện tử để khử nitrate là một ưu thế của nhóm vi khuẩn này so với các loài khử nitrate thông thường Do tác động của vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate, cùng một lúc ion Fe(II) vả nitrate dư trong nguồn nước có thể được loại bỏ Khả năng ứng dụng cùa nhóm vi khuẩn này đặc biệt có ý nghĩa đối vói việc xừ lý các nguồn nước ngầm dùng cho sinh hoạt bị nhiễm sắt và nitrogen ngấm xuống từ tầng nước mặt Ngoài ra, trong một số nghiên cứu gần đây, vai trò cùa vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate còn được tìm thấy trong việc cố định các ion arsen thông qua

khả năng tạo Fe(III) là sàn phẩm cùa quá trình trao đổi chất (Hohmann et a i, 2009).

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Dối tượng nghiên cứu

Mầu bủn vả trầm tích được thu thập ờ ba môi trường sinh thái đại diện khác nhau: mầu bùn đáy ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước được thu ở Từ Liêm, Hà Nội, mẫu trầm tích nước

lợ được thu ở ven biển Vân Đồn, Quảng Ninh Mâu chân ruộng và ữầm tích ven biển được thu thập ừong các ống thủy tính nút xoáy cho phép khoan sâu tới 60 cm dưới bề mặt trầm tích (hình2.1) Mẫu đáy ao được thu thập trong binh thuỷ tinh, sau đó bổ sung nước vào toàn bộ thề tích để giảm thiểu sự ảnh hường cùa oxygen trong không khí Mầu được bảo quản ở nhiệt độ 4 °c cho đến khi tiến bành các thí nghỉệm tiếp theo

Ỉ Hình 2.1 Mẫu bùn và trầm tích thu thập ngoài môi trường tự nhiên, được đảm bảo kỵ khí

nghiêm ngặt

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sừ đụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất có tiêu chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn nhu Merck (Đức), Sigma (Mỹ) Hoá chất và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas (Đức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cửu

Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng ừong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hoá phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế

2.2 Phirong pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate

Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate được xác định thông qua phương pháp MPN (American Public Health Association, 1969) trong môi trường dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành phần khoáng tương úmg với nước ngọt (dùng cho mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển) (bàng 2 1)

7

Băng 2.1 Môi trường kboáng kỵ khí nirớc ngọt và nước lợ cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate (Ratering, 1999).

Mẩu được bổ sung vào ống MPN đầu tiên với tỷ lệ 10% thể tích Thí nghiệm được ủ tại

28 °c trong 8 tuần, sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN được ghi nhận thông qua đổi màu môi trường từ trắng đục (màu của Fell) sang vàng nâu (màu cùa Felll)

2.2.2 Phân lập vỉ khuẩn kỵ kh ío xy hoả Fe(IỈ) kh ử nitrate

Ống MPN ờ nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phát triển được sử đụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn Việc phân lập được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dãy ổng thạch bán lỏng (1%) với môi trường có thành phần tương tự như môi trường dùng trong phương pháp MPN (Widdel, Bak, 1992) Ống thạch bán lòng sau khi

bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống MPN (nguồn phân lập) được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo

ngược đầu tại 28°c trong bóng tối Khuẩn lạc đom phát triển trong các ổng pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể thích hợp (nước ngọt hay nước lợ).

2.2.3 Tách DNA tồng sổ từ mẫu quần thể và chủng vi sinh vật

DNA tổng số của quẩn thể vi sinh vật từ các ống MPN được tách chiết theo phương pháp

do Zhou và cộng sự (1996) mô tà với cải biến về nồng độ đệm phosphate là 120 mM thay cho

100 mM và nồng độ proteinase K là 14 mg/ml thay cho 10 mg/ml DNA genome của các chủng đom được tách theo phương pháp cùa Marmur (1961) Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được hoà tan trong nước và bảo quản tại - 2 0 °c

2.2.4 Phân tích đa dạng vi sinh vật bằng phương pháp AKDRA

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) đuợc sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng về di truyền của vi sinh vật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng

enzyme giới hạn (Ravenschlag et a i, 1999) Gen 16S rDNA của các chủng đơn được khuếch đại

trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27 F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) và 1492R

(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T), sau đó được xử lý bàng hai enzyme giới hạn Mspỉ và HaeIII (Fermentas) (bảng 2.2) Sản phẩm DNA sau khi đã xử lý enzyme được phân tách bằng

điện đi trên gel agarose 2% tại 100 V trong thời gian 30 phút Các chủng vi khuẩn sẽ được xếp nhỏm đựa trên sự tương đồng về phổ các băng điện di

Bảng 22 Phản ứng cắt gen Ỉ6S rDNA bằng các enzyme giói hạn Mspl và Haeìll

Trộn đều và ly tâm nhanh, sau đó ủ hỗn hợp phản ứng tại 37 °c trong 3 giờ

2.2.5 Phương pháp điện di biến tính DGGE

Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA: Vùng V3-V5 của gen I6S rDNA với độ dài 550 bp (hình 2.2) được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG)

và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer et a i, 1993) “Touch-down” PCR được

sừ dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sàn phẩm phụ trong phản ứng khuyeechs đại Đẻ tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC khoảng 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) được gắn vào đầu 5’ cùa mồi GM5F

Hình 2.2 Vùng V3-V5 và vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillusplantarum

Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại đoạn V3-V5 ờ vi khuẩn như sau:Bảng 2.3 Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại vùng V3-V5 của

gen 16S rĐNA

Thành phần phản ứng Thể tích (jil) Chu kỳ nhiệt (touch-down PCR)

IO x Taq b u ffe r 5 bước biến tính đầu tiên ờ 94 °c trong 1 phút

dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 thuyết (tức là 65 °C) Sau mỗi chu kỳ nhiệtMồi GM5F-GC (50 pmol/nl) 1 độ gắn mồi giảm đi 0,5 °c cho tới khi đạtMồi 907R (50 pmol/fi.l) 1 tới 55 °c, ờ nhiệt độ này phản ứng tiến hành

DGGE: Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60% Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di Dcode™ System (BioRad) ở nhiệt độ 60 °c tại 200 V trong 3,5 h Sau khi điện di, gel polyacrylamide được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh duới tia u v trên máy GelDoc (BioRad) Băng điện di được cắt và thôi trong nước qua đêm tại 4 °c Dịch thôi DNA được dùng lảm khuôn để thục hiện phản ứng PCR như chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R Sàn phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch và giải trình tự

2.2.6 Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại

Gen 16S rDNA cùa các chủng đơn (1500 bp) hoặc sản phẩm PCR từ các bãng điện di biến tính (550 bp) sau khi tinh sạch bằng kít (Bioneer - Hàn Quốc) được tiến hành phản ửng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động

3110 Avant Appied Biosystems Trinh tự gen sau đó được phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saítou, Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985).

2.2.7 Phương pháp F ISH (Fluorescence In Situ Hybridization) (Amann et al., 1992)

Nguyên lý: FISH là phương pháp lai sử dụng các đầu dò thích hợp bắt cặp với rRNA nhàm xác định phả hệ cùa vi sinh vật trong quần thể một cách trực tiếp, không qua bước phân lập và nuôi

Bảng 2.4 Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.5 Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa

SDS 10% (bô sung cuối

Các bước tiến hành:

Cố đinh mẫu:

- Hoà 0,5 g mẫu đất/bùn ưong 1,5 ml PBS lx

- Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ 2 - 4% và cố định ở 4 °c trong thời gian ít nhất

ỉà 30 phút nhưng không quá 24 h

- Ly tâm, loại phần dịch và rửa lại cặn tế bào bàng PBS IX

- Ly tâm, loại PBS lx và bổ sung 1,5 ml hồn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1)

- Bảo quản tế bào đã cố định tại -2 0 °c

Lai với đầu dò:

- Lấy 15 - 20 mẫu hoà vớí 2 ml nước cất vô trùng vả đưa lên màng polycarbonate (0 , 2 ịim)

- Để khô mẫu trong không khí và bảo quản trong hộp kín tại -2 0 ° c cho đến khi sử dụng

- Chia màng thành các phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đường kính 25 mm có thể chia làm 6 - 8 phần sử dụng cho các đầu dò khác nhau) Dùng bút chì đánh dấu mẫu (bằng số)

- Chuẩn bị 2 ml đệm lai trong ổng eppendorf (bảng 2.5)

- Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn 2 fil đầu dò (2 ng/|il) với 18 jnl đệm lai trong ống eppendorf0,5 ml, giữ trong đá, tránh ánh sảng

- Đặt một miếng giấy thẩm vào ống Falcone 50 ml, đổ phần đệm lai còn lại vào ống

- Đặt mảnh màng polycarbonate lên lam kính, mặt có mẫu lên trên Các mẫu lai với cùng một đẩu dò có thể đặt cùng trẽn một lam kính

- Nhỏ hỗn hợp đầu dò lên các mẫu và đặt toàn bộ lam kính vào ổng falcon có miếng giấy lọc thấm đệm lai đã chuẩn bị trước (ở tư thế nằm ngang) và lai ờ 46°c trong thời gian ít nhất là

90 phút (nhưng không quá 3 h)

- Chuẩn bị 50 ml đệm rửa trong ống falcon 50 ml

- Chuyển nhanh mẫu sau khi lai vào đệm rửa đã được làm nóng trước đó trong bể ổn nhiệt tại

48 °c trong 15 phút Gạn bớt đệm và đổ mẫu ra đĩa Petri Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua

nước cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khô (mật có mẫu ở trên).

Nhuôm đối chửng và quan sát:

- Đe nhuộm đối chứng, nhỏ 50 nl dung dịch DAPI lên mồi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó rửa nhanh trong nước cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khô trong không khí (đặt trong hộp tối) Mầu có thể được bảo quản trong -2 0 ° c trong vài ngày mà tín hiệu huỳnh quang không bị thay đổi

- Phủ một lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

2.2.9 Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate

Định Iưựng Fe(II) bằng thuổc thử phenanthroiin {DIN 38406 E1-], 1983)

Nguyên lý: O- phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3 -9,

đo được ở bước sóng 510 run Nồng độ Fe(II) cho phép là 0,01 - 5 mg/L Ket quà của phép đo có thể bị ảnh hưởng bời ion Mn và Cu

Chuẩn bị:

Dung dịch HC1 25% (rửa dụng cụ): dụng cụ thủy tinh thí nghiệm phải được rửa qua dung dịch HC125% sau đó tráng bằng nước cất trước khi sử dụng

Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = 1 : 4

Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):

- Sau khi thu mẫu, ngay lập tức hạ pH tới 1 bàng dung dịch H2SO4 loãng (1% thể tích)

- Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate, trộn đều bàng vortex Hỗn hợp phải có pH nàm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5)

- Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều

- Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Đo OD tại bước sóng 510 nm

- Đường cong chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(C) trong khoảng từ 5 - 50 ỊiM

Định Iưọng nitrate bằng tbuổc thử acid disulfofemic (Lê Đức, 2004)

Nguyên lý: ĩon NƠ3~ tác dụng với acid disulfofemic tạo thành nitrodisulfofemic, phàn ứng vớiammonia (NH3) đặc tạo thảnh phức có màu vàng, xác định được ở bước sóng 410 nm Nồng độ

NO3- cho phép là 0,5 - 5 mg/L

Chuẩn bị:

Dung dịch acid disulfofemic:

Phenol tinh khiết không màu 25g

CHClj lml

Tiến bành:

- Mầu nước (chúa không quá 5 mg/L NO3) lấy vảo ống nghiệm, trung hòa đến pH 7

- Chuyển mẫu sang chén sứ, cô cạn bằng đun cách thủy

- Thêm 2 ml dung dịch acid disulfofemic, hòa tan phần cặn bằng đũa thủy tinh

- Thêm 20 ml nước cất, 6 ml NH3 đặc hoặc 6 ml KOH 12N

- Thêm nước cất cho đủ 50 ml (trong bình định mức)

- Đo OD tại bước sóng 410 tun

- Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn trong khoảng từ 0-10 mM.Định lượng M n(n) bằng thuốc th ử formaldoxime (Brewer and Spencer, 1971)

Nguyên lý: Mangan phản ứng màu với formaldoxime (formaldehyde oxime) trong môi trường kiềm tạo thành phức có màu cam đò đậm, xác định ờ bước sóng 450 nm Để không hình thành các kết tủa hydroxiđ, pH tối ưu cùa phương pháp này lả 8 , 8 - 8,9

Dung dịch chuẩn (100 )ag mangan/ml):

Hòa tan 0,2876 g permanganate kali (KMn04) trong 100 ml nước cất, thêm 3 ml dung dịch H2SO4 đầm đặc, dẫn acid sunfurous (SO2 trong nước) cho đán khi dung dịch mất màu Đun sôi dung dịch để loại bỏ SO2 thừa sau đó iàm lạnh Bổ sung nuớc cho đù 1 lít

Tiến hành:

- Đưa 35 mi mẫu về pH = 8 , 8 - 8,9

- Thêm 3 ml hỗn hợp Formaldoxime/Ammonia vào lắc xoay tròn, đều

- Sau 2 - 30 phút đo quang phổ hấp thụ ờ bước sóng 450 nm

- Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung địch chuẩn trong khoảng từ 0 - 10 mM

CHƯƠNG IU KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xấc định số lưọng vi ldraẩn oxy hỏa Fe(]I), khử NO3' tại các mỏi trưừng nghiên cứu

Ba môi trường đại diện được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu gồm có bủn đáy ao nước ngọt, chân ruộng lúa ngâp nước và trầm tích nước lợ ven biển Đây là những môi trường có hoạt động vi sinh vật trong chu trình chuyển hoá sắt và nitrogen cao (Ratering, Schnell, 2000) số

pbưcmg pháp MPN sử dụng môi trường địch thể chứa FeSC>4 làm chất cho điện tử và NaNƠ3 làm chất nhận điện tử cuối cùng Thành phần khoáng trong môi tnrờng tương ứng với điều kiện nước ngọt (đối với mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (đối với mẫu bùn ven biển)

Sự phát triển của vi sinh vật sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(n) trong các ống MPN được nhận biết thông qua biến đổi màu sắc của môi trưởng từ ừấng xanh (màu của Fe(II)) sang màu vàng nâu (màu của Fe(ni)) (hình 3.la)

Hình 3.1 Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử N O3- trong các môi trưởng

sinh thái khác nhau, (a) - Nhận biết sự có mặt của vĩ khuẩn trong các ống MPN thông qua biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (Fell) sang vàng nâu (Felll) (b) - Sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(n), khử N (V xác định thÔDg qua phương pháp MPN

Kết quả cùa thí nghiệm MPN (hình 3.1b) cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử

NO3 cao nhất trong mẫu bùn chân ruộng ngập nước (9,3 X 103 tế bào/g bùn), cao hcm hẳn so với mẫu trầm tích nước lợ ven biển (4,3 X 103 tế bào/g trầm tích) và mẫu bùn đáy ao nước ngọt (1,5 X

1 0 3 tế bào/g bùn) Mật độ và mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NCV với các điều kiện môi trường tại mỗi vùng sinh thái như trên cũng đã được tìm thấy ữong một số

nghiên cứu trước đây (Weber et al., 2006b,c; Ratering, Schnell, 2000; Hauck et al., 2001; Ratering, 1999; Straub et a i, 1996).

15

3.2 Phân tích cấu trú c quần thể bằng điện di biến tính DGGE

Để Xác định các nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II)/khử NO3- chiếm ưu thế tại các môi trường

nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc quần thể trong các ống MPN ở độ pha loãng

10" 3 (là nồng độ gần tới hạn cùa dãy MPN đối với cả 3 mẫu) bẳng phương pháp PCR-DGGE

đoạn gen 16S rDNA (hình 3.2) Các băng điện di đuợc cắt từ gel và sử dụng lảm khuôn cho phản

ứng PCR tiếp sau để xác định trình tự và so sánh với các trình tự 16S rDNA đã công bố trong

ngân hàng đữ liệu GenBank

•+• Pseudomonas sp.

Paracoccus SD -►

Anaeromvxobơcter

SV.+-Hình 3.2 Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn gen Ỉ6S rDNA của quần thể vi

sinh vật trong các ống MPN của các mẫu nghiên cứu A - Bùn ao nước ngọt; R

- Bùn chân ruộng ngập nước; B - Bùn trầm tích ven biển

Cỏ thể thấy rằng các loài Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trường nghiên

cứu Đây là nhóm vi khuẩn nằm trong phân lớp h-Proteobacteria, hiện mới chi có một loài duy

nhất được công bố là A dehaỉogenans cùng với một sổ đại diện chưa định đanh đến loài Các

chủng Anaeromyxobacter đã công bố đều sinh trường kỵ khí khử Fe(III), chưa có chùng nào 4được nghiên cứu về khả năng sinh trưởng khừ NO3”, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude

et ai., 2003; Straub, Buchholz-Cleven, 1998; Straub et al., 1996) Trong môi trường nuôi cấy sử

dụng ờ đây (cũng như trong điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn tại với Fe(II) đo kết quả

chuyển hoá Fe(II) bằng con đường hoá học (phàn ứng với lượng nhò oxygen trong môi trường)

và con đường sinh học (đo các vi sinh vật oxy hoá Fe(II) khử NC>3_) Do vậy, sự có mặt cùa các

loài sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) như Anaeromyxobacter trong điều kiện môi trường nghiên

cứu trên (cũng như trong tự nhiên) là mắt xích khép kín chu trình chuyển hoá sẳt tại đây

Hai nhóm vi khuẩn Paracoccus và Pseudomonas tương ứng chiếm ưu thế trong các mẫu

bùn ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước Đây là hai chi thuộc lófp Proíeobacteria, có nhiều đại

diện sinh trưởng kỵ khí khử NOj", bao gồm cả các loài có khả nãng sử dụng Fe(II) làm chất cho

điện tử (Weber et aỉ., 2006b,c; Ratering, Schnell, 2000) Như vậy có thề kết luận ràng trong môi

trường nước ngọt tại Việt Nam (đại diện là ao nước ngọt và ruộng ngập nước), Paracoccus và

Pseudomonas là các nhóm vi khuẩn đóng vai trò chính trong việc oxy hoá Fe(II) bằng NO3 Tuy

nhiên, trong môi trường nước lợ (và nước biển) bàng phương pháp điện di biến tính hiện chưa xác định được nhỏm chiếm ưu thế Nguyên nhân có thể do sự kém cạnh tranh của vi khuẩn khử

NO3- nói chung so với các nhóm kỵ khí khác, đặc biệt là khử sulfate trong môi trường này (Schlafleigh, 2000)

3 J Mức độ oxy hoá Fe(II) và khử NƠ 3 ~ của vi sinh vật trong các mẫu nghiên cứu

Nồng độ Fe(II) và NO3” ưong môi trường nuôi cấy được xác định theo thời gian để đánh giá khả năng sinh trưởng của vi sinh vật trong các mẫu làm giàu (hình 3.3)

£3

$

Thời gian (ngày)

Thời gian (ngày)

Hình 3.3. Hoạt tính oxy boá Fe(II) (A) và khử N O3 (B) của các quần thể vi sinh vật tại

ba môi trường nghiên cứu sau khi làm giàu bằng phưong pháp MPN Ký

hiệu: o đối chứng không có vi sinh vật; ■ mẫu bùn đáy ao nước ngọt; •m ẫu bùn chân ruộng ngập nước; A mẫu trầm tích nước lợ ven biển

Như vậy các quần thể vi sinh vật được làm giàu thể hiện khả năng sinh trường với Fe(II) và

NO3- khá cao Ở cả 3 mẫu, lưọng nitrate trong môi trường bị khử gần hoàn toàn sau 4 ngày (hình 3.3B), tuy nhiên lượng Fe(II) không giảm tương ứng (hình 3.3A) Hiện tượng này cỏ thể lý giải

bằng sự có mặt của nhóm vi khuẩn Anaeromyxobacter trong cà 3 mẫu phân tích, làm chuyển hoá

Fe(III) ngược lại thành Fe(II)

3.4 Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3- tử các mẫu nghiên cứu và đánh giá tính đa

dạng của các chủng phân lập

Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3" được phân lập theo phương pháp pha loâng trong dãy ống thạch bán lòng (1%) (Widdel, Bak, 1992) (hình 3.4a) Các khuẩn lạc đom được phân lập dựa trên sự khác nhau về hình dạng và kích thước khuẩn lạc Mồi khuẩn lạc được tách riêng và nuôi cấy kỵ khí trong môi trường dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) và NƠ3“ (5 mM) trong binh serum có nút cao su và kẹp nhôm (hình 3.4b) 12 khuẩn lạc đơn được phân lập từ các ống MPN ở độ pha

V** h ỌC tìU O C GIA HM NỤI

‘VỤNG TÂM THÒNG TIN THỰ VIỆN

loãng cao nhếỉ có vi sinh vật phát triển (bảng 3.1) là đại diện cho vi khuẩn oxy hoá Fe(n), khừ

NO3" chiếm đa số tại ba môi trưởng nghiên cứu

cứu (a) Phân lập chủng đơn thông qua phương pháp ống thạch kỵ khí bán lỏng; (b) Nuôi cấy chủng đơn vi khuẩn oxy hóa Fe(n), khử NO3” trong môi trường dịch thể

ở điều kiện ky khí hoàn toàn

Bảng 3.1 Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khửNC >3 phân lập được từ các môi tnròug nghiên cứu

Chân ruộng lúa

ngập nước (Tù

Liêm, Hà Nội)

INI Hình tròn, bề mật nhẵn, kích thước 1 -2 mmEN2 Hình tròn, bề mặt không nhăn, kích thước 0,25-0,5 mm

IN 3 Hình tròn, bể mặt xù xi, kích thước 0,25-0,5 mmIN4 Hình tròn, bề mặt xù xi, kích thước 1 -2 mm

IN10 Hình tròn không đều, kích thước 0,5-1 mmINI 1 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thước 0,2-0,3 nun

INI 2 Hình đĩa lồi hai mặt, kích thước 2-2,5 mm

Tính đa dạng cùa 12 chủng vi khuẩn đã phân ỉập ờ trên được phân tích bầng phương pháp

ARDRA sử đụng hai enzyme giới hạn Haelỉỉ và Mspì (hình 3.5) Kết quả thu được cho thấy các

chủng này có thể xếp vào 5 nhóm đi truyền khác nhau (bảng 3.2)

Hue III \Isp\

Hình 3.5 Phổ điện di gen 16S rDNA của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NC> 3 ~

sau khi xử lý bằng các enzyme giới hạn HaeIII và Mspl INI - IN 12: Kỷ hiệu

cùa 12 chùng đơn phân lập được từ các mẫu nghiên cứu; M: Marker 1 kb (Bioneer, Hàn quốc)

Từ kết quả phân nhóm ở bảng 3.2 kết hợp với nguồn gốc phân lập 12 chủng này (bảng3.1), có thể nhận thấy tính đa dạng di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NCV phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu ban đầu Mầu trầm tích nước lợ ven biến thể hiện mức độ đa dạng di truyền cao nhất với 4 chủng phân lập từ mẫu này (IN5, IN6, IN7, ĨN8) thuộc vào 4 nhóm ARDRA khác nhau (nhóm 2, nhóm 3, nhóm 4 và nhỏm 5) Tiếp đến ỉà mẫu bùn đáy ao nước ngọt với 4 chủng (IN9, IN 10, INI 1, IN 12) thuộc vào 3 nhóm ARJDRA khác nhau (nhỏm 1, nhổm

2 và nhóm 4) Thể hiện tính đa dạng di truyền thấp nhất !à mẫu bùn chân ruộng ngập nước với 4 chủng (INI, IN2, IN3, IN4) thuộc vào 2 nhóm ARDRA khác nhau (nhóm 1 và nhóm 2)

Bàng 3.2 Tính đa dạng về di truyền của 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate đã

phân lập (INI - IN 12) dựa trên phân tích ARDRA

19

riêng biệt (ARDRA-5), chi tìm thấy ở môi trường nước lợ ven biển Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của các chùng nảy với ngân hàng dữ liệu GenBank cho thấy chủng IN2 có độ tương đồng

cao nhất với Anaeromyxobacter dehalogenans (99%), chùng IN7 với Pseudomonas stutzeri (98%) và chủng IN 12 với Paracoccus ferooxydant (97%) (hình 3.6).

Hình 3.6 Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa các chủng IN2, IN7, IN12 và các

loài gần gũi dựa trên trình tự gen 16S rDNA Cây được dựng theo phương pháp neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Knuc trong trình tự nucleotide Các số hiển thị ờ các vị trí phân nhánh là kết quả phân tích bootstrap đối với 1 0 0 0 phép so sánh (chì

có các giá trị trên 50% được trình bày trên hình) B subtiỉis là loài vi khuẩn được

chọn làm outgroup Các ký hiệu hiển thị trong ngoặc kép iả mã của trình tự gen 16S rDNA tại các ngân hàng gen

Như vậy nhóm ARDRA-4 vói chủng IN 12 làm đại diện là các loài Paracoccus và được tìm thấy trong hai dạng môi trường nước lợ ven biển và ao nước ngọt Paracoccus là chi vi khuẩn nằm trong phân lớp a -Proteobacteria, gồm các loài sinh trường kỵ khí tuỳ tiện, hô hấp bàng

nitrate hoặc oxygen (Schapleigh, 2000) Kết hợp với kết quả phân tích PCR-DGGE ở trên có thể

thấy rằng Paracoccus và Pseudomonas là hai nhóm chính oxy hoá Fe(II) khử NO3” chiếm ưu thế

trong ba dạng môi trường được nghiên cứu, trong đó Paracoccus có vai trò quan trọng hom ờ ao nước ngọt và Pseudomonas ở ruộng ngập nước Đại diện cùa cả hai nhóm này được tìm thấy ờ

môi trường nước lợ ven biển, có thể là đo ảnh hường của nguồn nước ngọt từ đất liền

Dựa trẽn kết quả so sánh trình tự 16S rDNA ở trên, các chủng ĨN2, IN7 và IN 12 được

định danh lần lượt 1 à Anaeromyxobacter sp ĨN2, Pseudomonas sp ÍN7 và Paracoccus sp ĨN12

Trong ba chủng được nghiên cửu chi tiết ở trên chỉ có chùng IN7 là đại diện được phân lập từ môi trường nước lợ ven biển Bầng phương pháp PCR-DGGE trình bày ờ trên {xem phần 3.2), nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế trong môi trường nước lợ chưa xác định được Tuy nhiên việc phân tích các chủng đại diện phân lập được tử cà ba môi trường nghiên cứu cho phép kết luận cả

Paracoccus (đại diện là chủng IN6 ) và Pseudomonas (đại diện là chủng IN7)cũng có mặt trong

dạng môi trưởng náy.

3.5 Phân tích đa dạng vỉ khuẩn trong các mối trvờng nghiên cứu bằng phưong pháp FISH

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) là phương pháp trực tiếp xác định mối liên quan phả hệ của vi kHiiẩn trong môi trường sống của chúng thông qua các đầu dò đánh dấu huỳnh quang có thể bắt cặp với RNA ribosome Theo kết quả so sánh trình tự gen 16S rDNA, các chủng đại diện cho các nhóm ARDRA c hính được xếp vào các phân lớp a-, p- và y-Proteobacteria

(hình 3.6), vì vậy trong thí nghiệm FISH chúng tôi sử dụng ba đầu dò ALF968, BET42a và GAM42a tương ứng bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn thuộc ba phân lớp trên (hỉnh 3.7)

Hình 3.7 Hinh ảnh hiển vi của tế bào vi khuẩn ưong các mẫu nghiên cứu bắt cặp với các

Tỷ lệ vi khuẩn mỗi nhóm được tính theo tỷ lệ số tế bào bắt cặp với đầu dò tương ứng trên tổng số tế bào được nhuộm DAPI Phần không bắt cặp với một trong ba đầu dò được sử dụng ở đây được gọi là phần không xác định (KXĐ) Thí nghiệm lai với các đầu dò chi cho kết quả đối với mẫu từ hai môi trường nước ngọt là ruộng ngập nước và bùn đáy ao, mẫu trầm tích ven biển không cho kết quả dương tính đối với cả 3 đầu dò Kết quả thống kê số tế bào bắt cặp với các đầu

dò trên tổng số tế bào nhuộm DAPI được trình bày trên hình 3.8

Kết quà thu được cho thấy số vi sinh vật không bắt cặp với một trong ba đầu dò sử dựng ờ thí nghiệm FISH chiếm một phần khá lớn trên tổng số tế bào nhuộm DAPI trong các mẫu ruộng

đầu dò huỳnh quang

ALF968

20%

ALF968 _ 30%

ngập nước (60%) và bùn đáy ao (50%) Trong phần tế bào có bắt cặp với các đầu dò, nhóm a -

Proteobacteria chiếm 20% và 30% (trên tổng số tế bào nhuộm DAPI) tương ứng trong các mẫu

ruộng ngập nước và ao Theo kết quả nghiên cứu bằng PCR-DGGE gen I6S rDNA (phần 3.2), vi

khuẩn thuộc phân lớp a -Proteobacteria với đại diện là chi Paracoccus đâ được tìm thấy chiếm

đa số trong môi trường ruộng ngập nuớc, nhưng lại không được tìm thấy ờ môi trường bùn đáy

ao Tiểp theo, đầu dò BET42a (p-Proteobacteria) cho kết quả dương tính với 20% tổng số tế bào

nhuộm DAPI trong mẫu bùn đáy ao nhưng không có tín hiệu với mẫu ruộng ngập nước Điều này cũng phù hợp với kết quả phân tích PCR-DGGE (phần 3.2), vi khuẩn thuộc phân lớp y-

Proteobacíeria với đại diện là chi Pseudomonas được tìm thấy chiếm ưu thế trong môi trường

ruộng ngập nước, nhưng không tìm thấy trong mẫu bùn đáy ao Cuối cùng, đầu đò GAM42a (y-

Proteobacterià) cho kết quả duơng tính với 20% tổng sổ tế bào nhuộm DAPI trong mẫu ruộng

ngập nước nhưng lại không cỏ tín hiệu đối với mẫu bùn đáy ao, tuy nhiên đại diện cùa phân lớp

p-Proteobacteria lại không được xác định trong phân tích PCR-DGGE ở trên Như vậy việc bổ

sung thông tin từ thí nghiệm phân tích FISH đã góp phần làm rõ nét hơn bức tranh đa dạng của vi khuẩn oxy hóa Fe(II)/khù nitrate ở các môi trường nghiên cứu

Đối với mẫu trầm tích nước ]ợ ven biển, cả hai phương pháp phân tích đa đạng không phụ thuộc bước phân lập là PRC-DGGE và FISH đều không đem lại thông tin về tính đa dạng của vi

sinh vật oxy hóa Fe(II)/khử nitrate tại đây Tuy các đại diện thuộc chi Paracoccus (a- Proteobacteria) và Pseudomonas (y-Proteobacteria) đều đã được tìm thấy trong môi trường này

(phân tích ARDRA, phần 3.4), nhưng vai trò ưu thế cùa chúng trong môi trường không được xác

định Sự có mặt của các chủng Paracoccus và Pseudomonas trong môi trường trầm tích ven biển

nhiều khả năng do ảnh hường của nguồn nước ngọt từ đất liền Nhóm vi sinh vật thực sự chiếm

ưu thế trong môi trường này có thể vẫn nằm ngoài giới hạn đặc hiệu của các đầu dò đã sử dụng trong nghiên cứu F1SH cũng như cặp mồi sử dụng trong PCR-DGGE

3.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân hoại và hoạt tính sinh bọc của các chủng vỉ khuẩn đại diện

Hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các

môi trường nghiên cứu là Anaeromyxobacter và Paracoccus (phần 3.4) Hơn thế, trong quá trình

thí nghiệm có thể nhận thấy rầng đây là hai chùng thể hiện khả năng sinh trường cao nhất trong

số các chủng đã phân lập được Để tìm hiểu khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý cùa hai chủng này

Kết quả nghiên cứu cho thấy hai chùng IN2, IN 12 rất khác nhau về đặc điểm sinh lý (bảng 3.3) Trong khi chủng IN2 là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc thỉ chủng IN 12 là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có khả năng hô hấp bằng oxygen (sinh trưởng hiếu khí) Ngoài NO3" được sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng, chùng IN2 còn có khả năng sử dụng Fe(III) làm chất nhận điện từ còn chùng IN 12 không cỏ khả năng này, thể hiện trong kết quà thí nghiệm xác định sự biến đồi

của hàm lượng protein tổng số theo thời gian ưong dịch nuôi vi khuẩn với Fe(III) làm chất nhận điện tò cuối cùng (hỉnh 3.9) Cả hai chủng đều không sinh trường bằng khử SO42".

Thời gian (ngày)

Hình 3.9 Khả năng sinh trưởng bằng khử Fe(III) cùa hai chủng IN2 (■) và IN 12 ( • ) thông

qua xác đinh hàm lượng protein tổng số trong dịch tế bào biến đổi theo thời gian.Băng 3.3 Đặc điểm sinh lý của hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12

oxy hoá bởi hai chủng IN2 và IN12 Trong trường hợp benzoate, một acid hữu cơ chứa vòng thơm và thường khó bị oxy hoá hơn các hợp chất còn lại, chủng INI 2 thể hiện khả năng oxy hoá kém hơn hẳn so với chủng IN2.

Độ mận lả một Ưong các yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh lý cùa vi sinh vật trong tự nhiên, do vậy ở đây chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hường của nồng độ muối trong môi trường đối với khả năng sinh trưởng của hai chủng vi khuẩn quan tâm Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng IN2 có nhu cầu về muối để sinh trưởng, chủng INI2 thi không Trong khi chủng IN I2 có thể sinh trưởng trong môi trường không cần bổ sung NaCl thì chủng IN2 chi phát triển khi NaCl có mặt ở nồng độ 1% trở lên Tuy nhiên, chủng IN2 lại có khả năng chịu muối cao hơn IN12, chủng này vẫn phát triển tốt ở nồng độ muối 5% trong khi đó tốc độ sinh trường của

IN 12 bị ảnh hưởng đáng kể ở các nồng độ muối cao hom 3% Điều này cũng phù hợp với đặc điểm phân bố của hai chùng vi khuẩn trong tự nhiên, cụ thể là chủng IN2 đại diện cho nhóm vi khuẩn được tìm thấy ở nhiều dạng môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt và nước lợ, trong khi đó chùng IN 12 đại diện cho nhóm chi tim thấy ở bùn đáy thuỷ vực nước ngọt

SaciiầíS subttito (FJ544 386) AnMTomyivbacter clone (AB2933Ổ7) Anotromyxìbacter dehabgtnans (EP067314)

■Paracoccus aminovorans (D3224Q) 'aracoccus sp (AM989037)

■Paracoccus marịms (AB185959) _'Pơracoocus denUrựkans (AI288159) iÓÕÕÍParacoccus jimoxydant (AY954687)

Hình thái tể bào và vị trí phân loại của hai chủng IN2 và ĨN12 Hình thái tế

bào được quan sát trên kính hiển vi quang học, độ phóng đại 1 0 0 0 lần (đơn vị = 5 Jim) Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbor-joining, đom vị = 0 02 Knuc trong trình tự nucleotide Các số hiển thị ở các vị tri phân nhánh là kết quả phân tích bootstrap đối với 1 0 0 0 phép so sánh (chi có các giá trị trên 500 được

trình bày trên hình) B subtilis là loài vi khuẩn được chọn làm outgroup.

Chủng IN2 gồm nhừng tế bào dạng trực khuẩn, kích thước 1x4-5 um, chuyển động tích

GenBank cho phép xếp chùng IN2 vào chi Anaeromyxobacter (!oài gần gũi nhất là A dehaỉogenans, 99% tương đồng) Như vậy chùng IN2 được bổ sung vào danh sách chi Anaeromyxobacter với tên khoa học là Anaeromyxobacter sp IN2 và mã trình tự gen 16S rDNA trong GenBank là FJ939131 (hình 3.10) Anaeromyxobacter là một chi được biết đến với các đại diện sinh trưởng kỵ khí bắt buộc bàng oxy hoá các hợp chất hữu cơ để khử Fe(III) (Treude et aỉ., 2003) Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên vi khuẩn Anaeromyxobacter mà đại diện là chùng ĨN2

thể hiện khả năng sinh trưcmg bằng oxy hoá Fe(II)/khử nitrate, tuy nhiên hình thức sinh trưởng này không vượt trội so với sinh trường kỵ khí khử Fe(III),

Chủng IN12 gồm những tế bào hình oval có kích thước 1,5x1.5-2 um, chuyển động chậm So sánh trình tự gần đủ của gen 16S rDNA với ngân hàng dữ liệu GenBank cho phép xếp

chúng IN 12 vào chi Paracoccus (loài gần gũi nhất là p aminovorans, 98% tương đồng) Paracoccus là chi vi khuẩn nằm trong phân lớp a -Proteobacíeria, gồm nhiều loài có khả năng hô

hấp bằng oxygen (sinh trưởng hiếu khí), đồng thời hô hấp bằng khử nitrate (Shapleigh, 2000)

Nhiều đại diện của chi Paracccus được tìm thấy trong các điều kiện tối ưu cho khử nitrate, như

đáy các thuỷ vực (Shapleigh, 2000) hay trong các hệ thống xử lý nước thải loại bỏ nitrogen, ví dụ

như P denitrificans, p ferooxygendans (Bitton, 1999) Chùng IN 12 được định danh khoa học là Paracoccus sp IN 12 và có mã trinh tự gen 16S rDNA trong GenBank là GU084390 (hình 3.10).

Mặc đù cùng được phân lập thông qua bước làm giàu bàng dãy MPN với chất cho và nhận điện tử tương ứng là Fe(II) và nitrate, hai chủng IN2 và IN 12 lại đại diện cho hai nhóm vi khuẩn khác nhau tham gia chu trình sắt ở môi trường trung tính, cụ thể là oxy hoá Fe(II) thành Fe(IlI) bằng nitrate và khử Fe(III) thành Fe(II) bàng các hợp chất hữu cơ Tuy cũng có khả năng sinh trường cao trong môi trường có Fe(II) và nitrate nhung chủng IN2 sẽ khỏ có khả năng úng dụng vào mục đích loại bỏ Fe(II) và nitrate trong các nguồn nước ô nhiễm vì bị ảnh hưởng bởi khả năng sừ dụng Fe(III) làm chất nhận điện từ cuối cùng để tạo năng lượng Khác với IN2, chủng IN12 là một vi khuẩn chi sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(ll) bằng nitrate, không có khả năng khử Fe(III) Hơn thế nữa, chủng vi khuẩn này có khả năng sinh trường trong nhiều đều kiện môi trường khác nhau như có mặt hay không có mặt oxygen, thích nghi với nhiều loại nguồn điện tử khác nhau (như Fe(II), các acid hữu cơ, rượu) và sinh trường tốt trong môi trường có độ mặn dao động trong dải 0-3% (đặc trưng cho cả môi trường nước ngọt và nước lợ) Với những ưu điểm kể trên, chùng IN 12 hứa hẹn có tiềm năng ứng dụng vào việc loại bò nitrogen và Fe(II) trong các nguồn nước ô nhiễm

25

độ các chất cho và nhận điện từ trong môi trường biến đổi theo thời gian cho thấy sự giảm nồng

độ Fe(II) và nitrate diễn ra song song với tốc độ đáng kể (hình 3.11)

Bên cạnh đó khả năng sử dụng Mn(II) làm chất cho điện tử để khử nitrate cũng được kiểm tra, tuy nhiên chủng IN 12 không thể hiện sinh trưởng rõ rệt trong điều kiện nuôi cấy này Theo một số nghiên cứu đã công bố, hoạt tính oxy hoá Mn(II), khử nitrate bằng con đường sinh học được xác định trong một số quần thể vi sinh vật ở đáy các thuỷ vực, nhưng cho đến nay chưa

có chủng vi sính vật nào được phân lập trong phòng thí nghiệm với hoạt tính kể trên

(Vandenebeele eí a l, 1995; Gounot, 1994).

- Phân tích thành phân loài bằng phương pháp PCR-DGGE đối với gen 16S rDNA cho thấy

Anaeromyxobacter là một trong những nhóm chiếm ưu thế có mặt cả ở ba dạng môi

trường sinh thái trên, đóng vai trò khép kín chu trình chuyển hoá sẩt trong các môi trường

nghiên cứu thông qua khả năng sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) Hai nhóm Paracoccus và Pseudomonas được tìm thấy tương ứng ở mẫu bùn ao và ruộng, là hai nhóm vi khuẩn

chính thực hiện quả trình oxy hoá Fe(II) khử NƠ3- trong hai dạng môi trường sinh thái kể

trên Ngoài ra, các chủng vi khuẩn thuộc chi Paracoccus (ÍN6) và Pseudomonas (IN7)

còn được tìm thấy ở môi trường nước lợ ven biển, chứng tỏ các nhóm vi khuẩn này cũng đóng vai trò nhất định trong môi trường nước lợ

- Vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NCV tại các môi trường nghiên cứu có tính đa dạng khá cao Mười hai chủng đom phân lập từ các mẫu MPN được xếp vào 5 nhóm ARDRA khác nhau

trong phân tích sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII và Mspỉ Ba chủng đại diện là IN2,

ĨN7 và IN 12 có ưình tự gen 16S rDNA có độ tương đồng cao với các loài vi khuẩn

Anaeromyxobacíer dehaỉogenans (99%), Pseudomonas stutzeri (97%) và Paracoccus ferrooxydant (98%).

- Hai chùng vi khuẩn IN2 và IN 12 đại điện cho hai nhóm tham gia chu trình chuyển hoá sắt tại một số môi trường sinh thái khác nhau ờ Việt nam, trong đó chủng IN2 tham gia khừ Fe(III) thành Fe(II) bằng các hợp chất hữu cơ và chùng IN 12 tham gia oxy hoá Fe(IÍ) thành Fe(III) bằng nitrate Vai ưò sinh thái của hai chủng này được khẳng định thông qua các đặc điểm sinh lý của chúng, cụ thể là khả năng sinh trưởng với các chất cho và nhận điện tử khác nhau và mức độ sinh trưởng tại các nồng độ muối khác nhau trong môi trường

- So sánh trinh tự gần đủ cùa gen 16S rDNA với các loài đã công bố trên GenBank cho

phép định danh hai chủng vi khuẩn này là Anaeromyxobacter sp IN2 (mã trình tự đăng

ký trên GenBank là FJ939131) và Paracoccus sp IN 12 (mã trinh tự đăng ký trên

GenBank là GU084390)

- Với hoạt tính cao trong việc oxy hoá Fe(II) và khử nitrate, chủng IN 12 có tiềm năng úng đụng thực tế trong việc xử ]ý các nguồn nước nhiễm nitrogen và ion kim loại Fe(II)

27

KIẾN NGHỊ

- Nghiên cứu tìm giá thể phù hợp để tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate

- Nghiên cứu thử nghiệm áp dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử nitrate để xử lý nước ngầm nhiễm sắt và nitơ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1 Lê Đửc (2004) Một sổ phương pháp phân tích môi trường NXB ĐHQGHN.

2 Trần Thị Kiều My, Nguyễn Hà Thanh (2006) Chuyền hóa sắt trong cơ thể và quá tải sắt ở

một số bệnh máu Hội nghị Khoa học ngành Huyết học - Truyền máu Quốc gia

Tiếng Anh

3 Amann RI, Stromley J, Devereux R Key R, Stahl DA (1992) Molecular and microscopic

identification of sulfate-reducing bacteria in multispecies biofilms Appl Environ Microbiol 58: 614-623.

4 American public health association (1996) Standard methods for the examination of water and waste water including bottom sediments and sludge 604-609

5 Benz M, Brune A, Schink B (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at

neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria Arch Microbiol 169: 159-165.

6 Bitton G Wastewater Microbiology Willey-Liss, Inc Toronto, Canada, 1999.

7 Brewer PG, Spencer DW (1971) Colorimetric determination of manganese in anoxic waters

Limnology and Oceanography 16: 107-110

8 Ciani A, Goss KU, Schwarzenbach RP (2005) Light penetration in soil and particulate

minerals Europ J Soil Sci 56: 561-574.

9 Dhillon A, Edwards K, Webb E, Roger D, Sogin M (2005) Marinobacter aquaeolei gene expression studies for clues to neutrophilic iron oxydation NAỈ 2005 biannual meeting o f the NASA Astrology Institute.

10 DIN 38406-EỈ-1 (1983) German standard methods for the examination of water, waste water and sludge; cation (group E); determination of ừon (El)

11 Edwards KJ, Rogers DR, Wirsen CO, McCollom TM (2003) Isolation and characterization

of novel psychrophilic, neutrophilic, Fe-oxidizing, chemolithoautotrophic a - and p-

Proteobacteria from the deep sea Appl Environ Microbiol 69: 2906-2913.

12 Ehrlich H.L (1996) Geomicrobiology, 3rd Ed, revised and expanded, Marcel Dekker Inc

New York

13 Ehrenberg (1919) Microbiology o f the iron - depositing bacteria, “Gallionella ferruginea"

Ellis D, Methuen & Co Ltd.

14 Ehrenreich A, Widdel F (1994) Anaerobic oxidation of ferrous iron purple bacteria, a new

type o f phototrophic metabolism Appl Environ Microbiol 60 (12) 4517-4526.

15 Ehrlich HL, Newman DK (2008) Geomicrobiology, 5th Edition, CRC Press.

16 Emerson D, Weiss JV (2004) Bacterial iron oxidation in circumneutral freshwater habitats:

findings from the field and the laboratory Geomicrobiol J 21:405 - 414.

17 Felsenstein J (1985) Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap

Evolution 39: 783-791.

18 Gounot AM (1994) Microbial oxidation and reduction of manganese: consequences in

groundwater and applications FEMS Microbiol Rev 14: 339.

19 Hafenbradl D, Keller M, Dirmeier R, Rachel R, Rossagel p, Burggraf s, Huber H, Stetter

KO (1996) Ferroglobus placidus gen nov., sp nov., a novel hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions Arch Microbiol 166: 308-314.

20 Hauck s, Benz M, Brune A, Schink B (2001) Ferrous iron oxidation by denitrifying

bacteria in profiindal sediments of a deep lake (Lake Constance) FEMS Microbiol Ecol 37:

127-134

21 Heising s, Schink B (1998) Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodomicrobium vannielii strain Microbiol 144: 2263-2269.

22 Heising s, Richter L, Ludwig w , Schink B (1999) Chlorobium ferrooxidans sp nov., a

phototrophic green sulfur bacterium that oxidizes ferrous iron in coculture with a

“Geospirillum" sp strain Arch Microbiol 172:116-124.

23 Hohmann c , Winkler E, Morin G, Kappler A (2009) Anaerobic Fe(II)-oxygendizing

bacteria showAs resistance and immobilize As during Fe(III) mineral precipitation Environ Sci Technol.

24 Kappler A, Newman DK (2004) Formation of Fe(III)-minerals by Fe(II)-oxidizing

photoautotrophic bacteria Geochim Cosmochim Acta 68:1217-1226.

25 Konhauser KO (Ỉ997) Bacterial iron biomineralisation in nature FEMS Microbiol Rev 20'

28 Lundberg JO, Weitzberg E, Cole JA, Benjamin N (2004) Nitrate, bacteria and human health

Nature' 593-602

29 Lovley D.R (1991) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction Microbiol Rev 55: 259.

30 Lovley D.R (1997) Microbial Fe(III) reduction in subsurface environments FEMS Microbiol Rev 20: 305.

31 Marmur Ỉ (1961) A procedure for the isolation of deoxygenribonucleic acid from microorganisms JM o l Biol 3: 208-218.

32 Muyzer G, De Waal EC, Utterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial population

by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified

genes coding for 16S rARN Appl Environ Microbiol 59: 695-700.

33 Nealson K.H, Saffarini D (1994) Iron and manganese in anaerobic respiration:

environmental significance, physiology and regulation Annu Rev Microbiol 48: 311.

34 Ratering s (1999) Iron cycle in Italian rice field soil: localization of the redox processes and

charactarization of the involved microorganisms PhD Dissertation Department of

Microbiology, University of Marburg (Germany)

35 Ratering s, Schnell s (2000) Nitrate-dependent iron(II) oxidation in paddy soil Environ Microbiol 3: 100-109.

36 Ravenschlag K, Sahm K, Pemthaler J, Amann R (1999) High bacterial diversity in

permanently cold marine sediments Appl Environ Microbiol 65: 3982.

37 Renz JA, Kraiya c , Luther GW, Emerson D (2007) Control of ferrous iron oxydation within circumneutral microbial marts by cellular activity and autocatalysis Environ Sci Technol 41: 6084-6089

38 Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing

phylogenetic trees Mol Biol Evol 4: 406-425.

39 Shapleigh JP (2000) The Denitrifying Prokaryotes In Dworkin M, Falkow s, Rosenberg E Schleifer KH, Stackerbrandt E, eds The prokaryotes: an evolving electronic resource fo r the microbiological community Springer-Verlag, New York.

40 Senko JM, Dewers TA, Krumholz LR (2005) Effect o f oxidation rate and Fe(II) state on

microbial nitrate-dependent Fe(III) mineral formation ,4/?/?/ Environ Microbiol 71: 7172-

7177

41 Senn DB, Hemond HF (2002) Nitrate controls on iron and arsenic in an urban lake Science

296: 2373-2376

42 Straub KL, Benz M, Schink B, Widdel F (1996) Anaerobic, nitrate-dependent microbial

oxidation of ferrous iron Appl Environ Microbiol 62: 1458-1460.

43 Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998) Enumeration and detection o f anaerobic ferrous

ừon-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments Appl Environ

Microbiol 64:4846-4856.

44 Straub KL, Rainey FA, Widdel F (1999) Rhodovulum iodosum sp nov and Rhodovulum

robiginosum sp nov., two new marine phototrophic ferrous-iron-oxidizing purple bacteria Ị

45 Straub KL, Benz M, Schink B (2001) Iron metabolism in anoxic environments at near '

neutral pH FEMS Microbiol Ecol 34: 181-186.

46 Temple KL, Colmer AR (1951) The autotrophic oxidation of iron by a new bacterium:

Thiobacilỉus ferrooxidans J Bacteriol 62: 605-611.

47 Treude N, Rosencrantz D, Liesack w , Schnell s (2003) Strain FAcl2, a dissimilatory iron-

reducing member of the Anaeromyxobacter subgroup of Myxococcales FEMS Microbiol

E co l44:261-269.

48 Tricker AR, Preussmann R (1991) Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence,

formation, mechanisms and carcinogenic potential Mut Res 259: 277-289.

49 Vandenebeele J, De Beer D, Germonpre R, Van De Sande R, Verstraete w (1995)

Influence of nitrate on manganese removing microbial consortia from sand filters Wat Res.

29: 579

50 Weber KA, Picardal FW, Roden EE (2001) Microbially catalyzed nitrate-dependent ■

oxidation of biogenic solid-phase Fe(II) compounds Environ Sci Technol 35: 1644-1650.

51 Weber KA, Achenbach LA, Coates JD (2006a) Microorganisms pumping iron: anaerobic

microbial iron oxidation and reduction Nature 4: 752-764.

52 Weber KA, Pollock J, Cole KA, O’Connor SM, Achenbach LA, Coates JD (2006b)

Anaerobic nitrate-dependent iron(II) bio-oxidation by a novel Lithoautotrophic

Betaproteobacterium, strain 2002 Appl Environ Microbiol 72: 686-694.

53 Weber KA, Urrutia MM, Churchill PF, Kukkadapu RK, Roden EE (2006c) Anaerobic

redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms Environ Microbiol 8: 100-

113

54 Widdel F, Schneil s, Heising s, Ehrenreich A, Assmus A, Schink B (1993) Ferrous iron

oxygendation by anoxygengenic phototrophic bacteria Nature 362: 834.

55 Widdel F, Bak F (1992) Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria In Balows A

Trilper HG, Dworkin M, Harder w, Schleifer KH eds The Prokaryotes, 2nd ed Springer

Berlin Heidelberg New York: 3352-3378

56 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA recovery from soils of diverse composition

Appl Environ Microbiol, 62: 316-322.

31