Nghiên cứu đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) liên quan đến ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ở người Việt Nam

Mục tiêu: Xây dựng được quy trình phân tích nhằm phát hiện đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai hỗ trợ chấn đoán và sàng lọc ung Ihư đại trực tràng không polyp di truyền và đánh giá các độ

DẠI IIỌ C QUỐC GIA HÀ NỘI

T R Ư Ờ N G Đ Ạ I MỌC K H O A H Ọ C TỤ N H IÊ N

B Á O C Á O T Õ N G H Ợ P

T r ê n d ể t à i :

NVGIiIÊN CỨU ĐỘT BIÉN GEN SỬA CHỮA BA I CẶP SAI ( M M R )

LIIÊN QUAN ĐẾN ƯNG THU ĐẠI T R ự C TRÀNG KHÔNG POLYP

DI TRUYỀN Ở NGƯỜI VIỆT NAM

M ã số: Q G 1 1 1 5

C hủ trì Đ ề tài: TS N guyễn T hị H ồn g Vân Các cán bộ tham gia: ThS Trần Thị Thùy Anh

ThS Lê Văn Quảng

CN Hoàng Hải Yến

BS Hà Hải Nam

H à N ộ i , 2 0 1 3

1 Mục tiêu: Xây dựng được quy trình phân tích nhằm phát hiện đột biến gen

sửa chữa bắt cặp sai hỗ trợ chấn đoán và sàng lọc ung Ihư đại trực tràng không polyp

di truyền và đánh giá các đột biến ở gen sửa chữa bắt cặp sai (MSH2) liên quan đến ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ở người Việt Nam.

2 N ội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tỏng quan tài liệu và thu thập mẫu nghiên cứu

đề tài, viết phần tổng quan tài liệu.

- H oạt động 2: Thu thập 50 mẫu máu, 50 mẫu mô bệnh phẩm từ các bệnh nhân được chẩn đoán m ắc ung thư đại trực tràng đến khám, điều trị tại Bệnh viện K, Bệnh viện Đại học Y H à Nội và 10 mẫu đối chứng (người khỏe mạnh, tuổi trên 60).

Nội dung 2: Nhân bản một số trình tự mã hóa của gen bằng PCR

- H oạt động 1: Tách chiết A D N tổng số từ các mẫu máu và mô bệnh phẩm đã

thu thập được

- H oạt động 2: Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân bản một số phân đoạn gen MSH2

- H oạt động 3: Tối ưu hóa và thực hiện phản ứng nhân bản m ột số exon thuộc

Nội dung 3: Phát hiện các đột biến ở gen nghiên cứu bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

- H oạt động 1: Phân tích PCR-SSCP

- H oạt động 2: Phân tích PCR-RFLP

- H oạt động 3: Giải trình tự m ột số phân đoạn gen MSỈỈ2

Nội clung 4: Phân tích so liệu, viết báo cáo nghiêm thu.

V Các kết quả đ ạt đuọc

] Kết quả khoa học

- Đ ã t h u t h ậ p đ ư ợ c 50 m ẫ u b ệ n h p h ẩ m ( m á u v à m ô b ệ n h p h ẩ m ) t ừ c á c b ệ n h

nhân được chấn đoán mắc ung thư đại trực tràng, dạ dày đến khám, điều trị tại Bệnh

\ iện K, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và 10 mẫu đối chứng.

- Đ ã t á c h c h i ế t t h à n h c ô n g A D N tổ n g số từ c á c m ẫ u m á u và m ô b ệ n h p h ẩ m thu

th ậ p đ ư ợ c

- Đã nhân bản thành công 9 phân đoạn gen MSH2 (exon 2, 3, 6 , 7, 8 , 12, 13, 14

và 15) băng các cặp mồi đặc hiệu.

thư cửa người bệnh so với người bình thường Cụ thể là 1 mô hình của người bệnh số

35 (exon 2), 1 mô hình người bệnh sổ 14 (exon 3), 1 mô hình người bệnh số 30 (exon

4 (exon ] 5).

- Phân tích so sánh trình tự ADN của một số mẫu máu và mô ung thư cho thấy chủng tôi đã phát hiện được 4 đột biến bao gồm: một đột biến mất nucleotide A tại vị trí 73331 trên exon 3 của mô bệnh phẩm số 1, một đột biến mat nucleotide A tại vị trí

5293 (vùng intron nằm trước exon 2 gen MSH2)\ một đột biến thay thế nucleotide tại

vị trí codon 199 nucleotide G bị thay thế bởi T (c.199 G>T) ở exon 3 dẫn tới thay đổi axit amin prolin (CCG) thành axil amin glutamin (CAG) trong chuỗi polypeptide do

trên exon 15) thuộc gen MSH2.

2 Kết quả ứng dụng: 1 quy trình phân tích nhằm phát hiện đột biến gen sửa

chữa băt cặp sai có khả năng ứng dạng trong sàng lọc và chẩn đoán ung thư đại trực tràng mang khuynh hướng di truyền ở người Việt Nam.

3 K ế t q u ả d à o tạ o

- Đ ã đ à o tạ o đ ư ợ c 02 c ử n h â n k h o a h ọ c (n g à n h C ô n g n g h ệ S in h h ọ c ) v à 01 thạc

sĩ khoa học chuyên ngành Di truyền học.

4 Kết quả công bố: 02 bài báo đăng trên tạp chí Khoa học của Đại học Quốc

gia Hà Nội.

1) Nguyễn Thị Hồng Vân Trần Thị Thùy Anh, Nguyễn Văn Đoài, Lê Văn Quảng (2012) Sàng lọc đột biến trên các gen MLH1 và MSH2 từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng Tạp chí Khoa học, tập 28, số 2S, 2012, tr 209-2015

2) Trần Thị Thùy Anh, Nguyễn Văn Đoài, Lê Văn Quảng, Nguyễn Thị Hồng Vân (2012) Phát hiện đột biển trên gen MSH2 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng rải rác ở Việt Nam Tạp chí Khoa học, tập 28, số 2S, 2012, tr 62-67

S U M M A R Y

with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) in Vietnamese

C o d e : QG 11.15

P r in c ip a l In v estig ato r: PhD N guyen Thi Hong Van

M.Sc Le Van Quang B.Sc H oang Hai Yen Doctor H a Hoai Nam

I O b j e c t s a n d c o n t e n t s o f p r o j e c t

Objectives To analyze the m utations in a m ism atch repair gene associated with

hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) and establish the protocol for identification o f polym orphism s in the studied gene that can be used for assistance o f the diagnosis and screening o f HNPCC in Vietnam.

Contents:

C o n t e n t I : D e v e lo p m e n t o f r e s e a r c h b a c k g r o u n d a n d m a t e r ia l c o ll e c t i o n

W riting the research background.

diagnosed as colorectal cancer patients at K hospital and Hospital o f Hanoi

M edical University and 10 controls.

Content 2: Amplification o f coding sequences (exons) o f one o f MMR genes by PCR

- A ctivity 1: Extraction o f total genom ic DNA from blood and tissue samples.

- A ctivity 3: D N A sequencing some exons and sequence com parison.

Content 4: Data analysis, writing the final report for final evaluation.

n u c l e o t i d e A a t p o s i t io n 52 9 3 (in in tr o n b e f o re e x o n 2 o f MSH2 g e n e ); 01 s u b s titu tio n

m u t a t io n G > T at c o d o n 199 in e x o n 3; a n d 01 s u b s t it u t i o n m u t a t i o n C > A at p o s i t io n

77942 of exon 15 of MSH2 gene

2 Applied results: 01 p r o c e d u r e fo r g e n e ti c te s t i n g o f H N P C C b a s e d o n d e te c tio n o f g e r m l i n e

3 Training results: 01 MSc and 2 BScs

1) N g u y e n T h i H o n g V a n , T r a n T h i T h u y A n h , N g u y e n V a n D o a i, L e V a n Q u a n g

(2 0 1 2 ) M u t a t i o n s c r e e n i n g o f MLH1 a n d MSH2 g e n e s in c o lo r e c ta l c a n c e r p a tie n ts J o u r n a l o f

S c ie n c e 2 0 1 2 , V ol 2 8 , N o 2 S , p 2 0 9 - 2 0 1 5

2) T r a n T h i T h u y A n h N g u y e n V a n D o a i, L e V a n Q u a n g , N g u y e n T h i H o n g V a n (2.012), I J e te c tio n o f m u t a t ion in HMSH2 g e n e fr o m V i e t n a m e s e s p o r a d ic c o lo n c a n c e r p a tie n ts

J o u r n a l o f S c i e n c e 2 0 1 2 , V ol 28, N o 2 S , p 6 2 -6 7

I I I B u d g e t: O n e h u n d r e d a n d s e v e n ty m i l l i o n d o n g

M Ụ C L Ụ C

D A N H M Ụ C C H Ữ V I Ê T T Á T 1

MỞ DÂU 2

CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN TÀI LIỆU 4

] T ổ n g q u a n v ề u n g t h ư đ ạ i tr ự c t r à n g k h ô n g p o l y p di t r u y ề n ( H N P C C ) 4

2 Tổng quan về gen sửa chữa bắt cặp s a i 6

3 M ộ t s ổ k ỹ t h u ậ t di t r u y ề n p h â n t ử p h â n tích đ ộ t b i ế n 11

4 T ì n h h ì n h n g h i ê n c ứ u tr o n g n ư ớ c và trên th ế g i ớ i 14

5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứ u 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17

] Vật liệu nghiên cứu 17

2 Phương pháp nghiên c ứ u 17

2.2 Tách DNA í ổng s ố 17

2.3 Kiếm tra độ tinh sạch và chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR 18

2.4 Nhân bản các phân đoạn gen (exon) quan tâm bănq PCR 18

2.5 Các kỹ thuật phân tích đột biển sử dụng trong nghiên cứu 19

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THÀO LU Ậ N 21

1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 2 ì 2 Nhân bản các phân đoạn gen MSH2 bằng PC R 21

3 Phân tích đột biến ờ gen MSH2 bằng một số kỹ thuật sinh học phân tử 24

3.1 Kết quá phân tích đột biến bong PCR-RFLP 24

3.2 Ke í quà phân tích đột biến bằng SSCP và giải trình tự 29

KÉT LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị 35

TÀI LIỆU THAM K H Ả O 36

PHỤ LỤC 38

0

D A N H M Ụ C C H Ử V I É T T Ấ T

v i ế t t ắ t

2 Kháng nguyên ung thư biểu mô

phôi

4 Sinh polyp 11 tuyên theo dòng họ Familial A d e nom a tous Polyposis F A P

5 Ung th ư đại trực tràng không

polyp di truyền

Hereditary nonpolyposis colorectal cancer H N P C C

8 Khuếch đại đa m ẫu dò phụ thuộc

phản ứng gắn nối

Multiplex ligation-dependent probe amplification

M L P A

12 Phàn ứng chuỗi polym erase Polymerase chain reaction P C R

13 Gen m ã hóa e ndonuc le ase sửa

chữa bát cặp sai

Postmeiotic segregation increased 2 PMS2

14 Đa hình độ dài đoạn giói hạn Restrition fragment length polymorphism R F L P

15 Phản ứng chuỗi polym erase nhò' Reverse transcriptase - Polymerase chain R T

16 Đa hình câu hình sợi đơn Single strand conform ation polymorphism S S C P

1

á p d ụ n g p h ổ biến C h o tớ i n a y , h ầ u n h ư c h ư a có n g h iê n c ứ u n à o đi s â u tìm hiểu các

đ ộ t b iế n ở n h ũ n g g e n s ử a c h ữ a b ẳ t c ặ p sai liên q u a n tới u n g t h ư đại t r ự c tr à n g k h ô n g

p o l y p di t r u y ề n ở n g ư ờ i V i ệ t N a m D o v ậ y , việc tìm h i ể u s ự b i ế n đổi di tr u y ề n ỏ’ m ộ t

s ố g e n liên q u a n đ ế n c á c d ạ n g u n g t h ư k h á c n h au , tr o n g đó c ó u n g th ư đ ạ i trự c trà n g ở

n g ư ờ i V i ệ t N a m là m ộ t v ấ n đ ề c ó tín h c ấ p b á c h x u ấ t p h á t từ t h ự c tế.

N h ư t r ê n đ ã n ê u , c á c g e n s ử a c h ữ a b ắ t c ặ p sai đ ư ợ c c h o là liên k ế t c h ặ t với hội

c h ứ n g I Ĩ N P C C , liê n q u a n đ ế n n h i ề u loại u n g th ư t h u ộ c hội c h ứ n g H N P C C , t r o n g đó có

u n g t h ư đại t r ự c t r à n g C á c c ô n g trìn h n g h i ê n c ứ u đ ã k h ẳ n g đ ịn h , c á c đ ộ t b iế n d ò n g

m ầ m ở c á c g e n s ử a c h ữ a b ắ t c ặ p sai M LH1 , MSH2 , MSH6 v à PMS2 liên k ế t k h á ch ặ t

v ớ i I I N P C C [5, 10], T ại V i ệ t N a m , h iệ n c h ư a có n g h iê n c ứ u n à o đi s â u tìm hiểu vê

n h ó m g e n này T r o n g m ộ t n g h i ê n c ứ u g ầ n đ ây , gen M L H l, m ộ t t r o n g c á c g e n M M R

c ũ n g đã b ư ớ c đ ầ u đ ư ợ c p h â n tích v à p h á t h iệ n độ t b iế n t ừ b ệ n h n h â n u n g th ư đại trực

t r ả n g tại V i ệ t N a m [13, 22J T r ê n CO' sỏ' đó, c h ú n g tôi th ự c h iệ n đ ề tài “N ghiên cứu (lột biến gen s u 'd ch ild bat cặp sa i (M M R ) liên quan đến ung llnr đại trự c tràng không

p o ly p di truyền ở n g ư ờ i Việt N a m ”. Đ e tài này s ử d ụ n g m ộ t s ố k ỹ t h u â t p h â n tích đột

b iế n g e n n h ă m p h á t h iệ n m ộ t sô đ ộ t b iên ở g e n MSH2, m ộ t t r o n g ba g e n đ ư ợ c ch o là

C H Ư Ơ N G 1 T Ỏ N G Q IJA N T À I L IỆ U

1 Tống quan về ung thư đại trự c tràn g không polyp di truyền (IÍNPCC)

U n g t h ư đ ạ i t r ự c tr à n g là m ộ t loại u n g th ư b iế u m ô c h i ế m tỷ lệ k h á cao, đ ứ n g t h ứ

b u t r o n g c á c b ệ n h u n g t h ư ở n a m g iớ i v à th ứ tư tr o n g c á c b ệ n h u n g t h ư ở p h ụ nữ

T r o n g s ố c á c d ạ n g u n g t h ư đ ư ờ n g tiê u h ó a, u n g th ư đại tr ự c tr à n g đ ứ n g t h ứ hai về

n g u y ê n n h â n d ẫ n đ ế n tử v o n g d o u n g t h ư [4],

B c n c ạ n h các y ế u tố là m t ă n g n g u y CO' u n g t h ư đại trự c tr à n g n h ư c h ế đ ộ ă n n h iề u

I lội c h ứ n g L y n c h - đ ư ợ c đ ặ t tê n th e o tê n nhà ung thư h ọ c đã có c ô n g đ ầ u nghiên cứu bệnh này - được mô tả lần đầu vào năm 1913 Đây là hội chứng về khuynh hướng

k h ô n g c h ỉ u n g t h ư đại trự c t r à n g m à c ả c á c d ạ n g u n g t h ư ở ít n h ấ t 7 c ơ q u a n k h á c n h a u (n ộ i m ạ c tử c u n g , d ạ d à y , b u ồ n g tr ứ n g , ru ộ t n o n , b iế u m ô g a n m ậ t, b iế u m ô n i ệ u đ ạ o

t h ư ruột, d ễ bị b ỏ sót lúc t h ă m k h á m nội soi, n h ư n g d ễ trở t h à n h u n g t h ư n h ấ t T r o n g

lòng ruột có những tổn thương bàng phẳng thường có kích thước nằm trong giới hạn

n h ì n th ấ y đ ư ợ c c ủ a m a t t h ư ờ n g , c ó c ù n g m à u sắc n h ư p h ầ n c ò n lại c ủ a n iê m m ạ c ruột

N h ữ n g tô n t h ư ơ n g n à y đ ư ợ c gọ i là n h ữ n g tổ n t h ư ơ n g “ k h ô n g p o l y p ” ( n o n p o l y p ) C á c

tò n t h ư ơ n g n à y h o ặ c hơ i n h ô c a o lê n h o ặ c n h ư n h ữ n g h ố n h ỏ n ô n g , k h á c h ẳ n vớ i c á c

p o l y p ru ộ t x u â t h iệ n d ạ n e n ấ m c ó c u ố n g v à dễ nhìn th ấ y M ặ c d ù v ậ y , các h ố p h a n g

4

I.ày lại có nguy cơ biến đối thành ung thư nhanh hơn so với các polyp có cuống [9],

N h ữ n g b ệ n h n h â n H N P C C p h á t triển t h à n h u n g t h ư khi c ò n trẻ, đ iể n h ìn h ở lứ a tuổ i

t-.iCra 40, cá biệt có trường hợp sớm ỏ' tuổi thanh thiếu niên Tuổi trung bình của người

m ắ c b ệ n h u n g t h ư đại tr ự c tr à n g rải r á c là 61 tuổi, tr o n g khi c á c b ệ n h n h â n H N P C C

H N P C C d ò n g m ầ m c ũ n g d ễ bị u n g th ư ỏ' các b iể u m ô n h ư t ử c u n g , r u ộ t n o n , b u ồ n g

trứng, dạ dày, ống tiết niệu, tụy, ống mật và não Đối với phụ nữ, 20-60 % bệnh nhân

J INPCC có nguy CO' mắc ung thư nội mạc tử cung Tuổi trung bình của chẩn đoán ung

th ư nội m ạ c tử c u n g là 4 6 - 6 2 tuổi T r o n g s ố n h ữ n g p h ụ n ữ có H N P C C p h á t triể n t h à n h

cả u n g t h ư r u ộ t k ế t v à u n g t h ư nộ i m ạ c t ử c u n g , k h o ả n g 5 0 % x u ấ t h iệ n u n g t h ư nộ i

m ạ c tử c u n g t r ư ớ c [10].

Being I Thông kê c á c b ệ n h u n g thư liên q u a n đ ế n HNPCC [10]

Ung th ư liên quan dên H N PCC Tỷ lệ mắc HNPCC Nguy CO' mắc bệnh Tu ôi phát bệnh

n h â t m ộ t t h à n h v i ê n c ủ a d ò n g h ọ bị u n g t h ư đại trự c tr à n g đ ư ợ c c h ẩ n đ o á n bị m ắ c b ệ n h

ở l ứ a tu ổ i t r ư ớ c 50 v à 5) s ự h ì n h t h à n h p o ly p t u y ế n th e o d ò n g h ọ c ầ n đ ư ợ c loại trừ

C á c vị trí b a n đ â u k h á c n h a u đ ã đ ư ợ c m ô tả tr o n g cá c d ò n g họ đ ã đ ư ợ c c h ẩ n đ o á n m a c hội c h ứ n g L y n c h : nội m ạ c , d ạ d à y ru ộ t non, n iệ u đ ạ o , v ù n g c h ậ u , n ã o và ố n g m ậ t

T r o n g sô c á c k h ố i u ở vị trí này, u n g th ư nộ i m ạ c tử c u n g , n iệ u đ ạ o , v ù n g c h ậ u v à ru ộ t

n o n th ê h iệ n n g u y c ơ c a o nhất, v à vì v ậ y là n h ữ n g d ạ n g đ ặ c th ù n h ấ t c ủ a hội c h ứ n g

L y n c h S a u đ ó c á c tiê u chí n ày đ ư ợ c coi là q u á h ạ n c h ế c h o c á c m ụ c đ íc h lâm s ả n g v à

đ ư ợ c s ử a đôi đ ê p h ù h ợ p với c á c b ệ n h u n g th ư k h á c có liên q u a n đ ế n H N P C C ( tiê u

c h u â n A m s t e r d a m II) V à o n ă m 1998, c á c n h à k h o a h ọ c đ ã th iế t lậ p m ộ t hê t h ô n g ti ê u

chuân lâm sàng mới, được gọi là tiêu chuẩn Amsterdam II: 1) ít nhất ba người trong

d ò n g họ m ắ c u n g t h ư liên k ế t vớ i I 1 N P C C (đại trự c t r à n g , nội m ạ c tử c u n g , d ạ d ày ,

khói II tuyến nhờn); 2) Một người trong ba người đó phải có quan hệ một đời với hai

n g ư ờ i cò n lại 3) It n h ấ t hai th ế h ệ liên tiế p bị ả n h h ư ở n g c ủ a b ệ n h này; 4 ) ít n h ấ t m ộ t

t r o n g những n g ư ờ i bị u n g t h ư đại trự c tr à n g p hải đưọ'c p h á t hiện t r ư ớ c tuổ i 50; 5) S ự

T r o n g số c á c g e n liên q u a n tới u n g th ư , p h ả i k ể đ ế n c á c g e n s ử a c h ữ a b ắ t cặ p sai

(VIMR genes) Đây là những gen chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa những sai sót

s ửa chữa các sai SÓI trong D N A bằng cách xác định các nucleotide bị bắt cặp sai M ộ t

s >0 enzyme xác định được vị trí bắt cặp sai hoặc có thể trực tiếp sửa chữa chúng Hệ

t h ố n g này có t h ể x á c đ ị n h đ ư ợ c b a s e n à o bị bắt c ặ p sai n h ờ p h â n b iệ t m ạ c h D N A làm

k h u ô n có trìn h t ự đ ú n g v ớ i sợi m ớ i t ổ n g h ọ p m a n g t r ìn h t ự đ ộ t b iế n , t h ô n g q u a h o ạ t đìộng m e th y l h ó a b a s e A d e n i n e ( A ) v à C y to s in e (C ) c ủ a m ạ c h k h u ô n E n z y m e D N A

m e t h y l tr a n s f e r a s e th e o s a u c h ạ c sa o c h é p k h o ả n g v à i n g à n n u c l e o t i d e và đ á n h d ấ u

n n ạ c h làm k h u ô n nhò' h o ạ t đ ộ n g m e th y l hóa P h ả n ứ n g m e th y l h ó a x ả y ra vớ i các

niucleotide c và A ở các trình tự tương ứng là GmATC và C m C ( A / T ) G G Cơ chế sửa

c.hfra bàt c ặ p sai d iễ n ra n g a y tr o n g q u á trìn h sao c h é p D N A D o v ậ y , cá c g e n sừ a c h ữ a

biắt cặp sai (mã hóa các protein MMR) có các chức năng liên quan đến sự ổn định di

tiru y ên đ ả m b ả o đ ộ c h í n h x á c c ủ a tái tổ h ợ p di tr u y ề n h a y v iệ c t h a m g ia v à o cá c b ư ớ c nnỏ' đ ầ u c ủ a c á c đ á p ứ n g c h ế t th e o c h ư ơ n g trìn h đối v ớ i n h i ề u n h ó m tổn t h ư ơ n g D N A lch ác n h a u [5],

K h i c á c g e n m ã h ó a c á c p ro te in n à y bị đ ột biến, p r o t e i n đ ư ợ c m ã h ó a tạ o t h à n h bị biất ho ạt, k h iế n h ệ t h ố n g k h ô n g c ò n k h ả n ă n g đ ọ c s ử a c á c b a s e b ắ t c ặ p sai, d o đó làm

n n ất tính ổ n đ ị n h di t r u y ề n c ủ a tế b à o C á c tế b à o có đ ộ t b iế n ỏ’ c á c g e n M M R có tỷ lệ đtội biến t ă n g 2 - 4 lân s o vớ i c á c tế b à o b ìn h th ư ờ n g Đ ố i vớ i b ệ n h u n g t h ư đại trự c

6

trà n g rái rác, c á c đ ộ t b iế n ở c á c g e n M M R n ày c ó th ể x u ấ t h iệ n d ư ớ i c á c tác n h â n độ t

b iế n từ m ô i tn r ờ n g Vó'i c á c t r ư ờ n g h ọ p u n g t h ư m a n g k h u y n h h ư ớ n g di tru y ề n , cá c đột b iế n d ò n g m ầ m đ ư ợ c tr u y ề n l ừ b ổ m ẹ s a n g th ế h ệ c o n , d ẫ n tới là m t ă n g n g u y cơ

u n g t h ư ở đ ờ i c o n c h á u Ở c á c c á th ể dị h ọ p tử v ề c á c đ ộ t b i ế n , khi a l e n k iể u dại bị độ t

b iế n s o m a ở m ộ t tế b à o đ íc h , c h ă n g h ạ n b iêu m ô đại trự c trà n g , u n g t h ư c ó thê h ìn h

base băt cặp sai

Hình 1 Cơ chê sửa chữa bắt cặp sai ờ E c o li

(Nguồn: http://m m r.m ed.ohio-state.edu/rfishel/R F2.htm n

♦ Các gen sủa chữa bắt cặp sai trong ang thư đại trự c tràng nhóm HNPCC

V iệ c s ử a c h ừ a D N A b ẳ t c ặ p sai đ ó n g vai trò q u a n t r ọ n g d o n ó d u y trì tín h o n định

n g u y ê n v ẹ n c ủ a h ệ g e n , b ở i v ậ y , nó c ũ n g liê n kết vớ i s ự h ì n h t h à n h n h ữ n g đ ộ t b iế n liên

q u a n đến u n g th ư , t r o n g đ ó c ó H N P C C Đ ã có n h iề u n g h i ê n c ứ u c ô n g b ố rằ n g n h ữ n g

sa i h ỏ n g t r o n g s ử a c h ữ a b ắ t c ặ p sai d ẫ n đ ế n h à n g loạt c á c t r ư ờ n g h ợ p u n g t h ư di tru y ề n

h o ặ c k h ô n g di tr u y ề n C á c d ạ n g đ ộ t b iế n c h ủ y ế u đ ư ọ ’c p h á t h iệ n là đ ộ t b iế n n h ầ m

7

chữa MSH2/MSH6 - MLH1/PMS2 tạo nên sản phẩm DNA ở phía dưới của hình.

C ó h ơ n 4 5 0 đ ộ t b iế n g e n M M R k h á c n h a u v à h ơ n 100 đ a h ìn h t r o n g gen, tác đ ộ n g

đến hầu hết các gen MMR, bao gồm MLH1, MSH2, và MSH6 đã được nêu trong dữ liệu

b i ế n d ò n g m ầ m tr o n g c á c g e n M M R n à y có thể ch o p h é p x á c đ ịn h c á c d ò n g họ H N P C C ,

g i ú p c h o việc đ iề u trị s ớ m h ơ n v à g i ả m tỷ lệ chết D o dó, v iệc s à n g lọc c á c đ ột b iế n g en

M M R có ý n g h ĩ a lâ m s à n g q u a n tr ọ n g c h o việc tư v ấ n và g iá m sát y tế n h ữ n g gia đình

H N P C C C á c đ ộ t b iế n d ò n g m ầ m tại ít n h ấ t một tr o n g các g e n sử a c h ữ a đã đ ư ợ c p h á t

h i ệ n t r o n g h ơ n 8 0 % c á c c á th ể m ắ c hội c h ứ n g L y n c h C á c đ ột biến ở c á c g e n M M R này

c ũ n g đ ư ợ c t ì m th ấ y ở k h o ả n g 1 5 % c á c khối u ác tính đại trực trà n g k h ô n g di tr u y ề n (rải

r á c ) x u â t h i ệ n liên q u a n với n h ữ n g b ấ t ổ n đ ịn h vi vệ tin h [8].

MSII3) Dạng protein phức h ợ p này sẽ x ác định chính xác vị trí xảy ra n h ữ n g sai hỏng trong quá trình sao chép D NA Cuối cùng, domain tương tác với dạng tương đồng mut

L (từ exon 13 đến exon 16) mã hóa phần protein có nhiệm vụ tương tác với dạng tương đông mutL (Hình 4) V à việc sửa chữa những lỗi sai hỏng sẽ chỉ diễn ra khi có

thành phần của tập hợp các gen sửa chữa bắt cặp sai M M R [26].

MutL homo logs interaction _iiiunajji

Hình 4 Sơ đô protein được mã hóa bởi MSH 2

Các hộp màu đỏ, vàng và xanh đại diện cho các vùng chức năng khác nhau của protein MSH2.

(nguồn: http://atlasqeneticsoncoloqy.orqi

K hoảng 40% các trường hợp bị hội chứng Lynch với một đột biến được xác

nucleotide (50 - 80%), mất hoặc sắp xếp lại trình tự các nucleotide (17 - 50%) (Hình 5).

Đột biên HIMPCC

Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến làm cho con người bị ung thư đại trực tràng và các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC N hững đột biến này có

hoạt và không thể thực hiện chức năng bình thường của nó Khi các protein do gen

MSH2 tổng hợp bị thiếu hụt hoặc hoạt động không hiệu quả sẽ dẫn đến những sai hỏng

tăng lên đáng kể trong quá trình phân chia tế bào mà không được sửa chữa N ếu các tế bào này tiếp tục phân chia, các lỗi được tích lũy trong DNA ngày càng nhiều sẽ làm cho các tế bào không thể hoạt động hiệu quả và có thể tạo thành khối u trong ruột kết

năng làm gia tăng m ột sổ khối u hiếm gặp trên da ngoài bệnh ung thư đại trực tràng Đây là m ột sự kết hợp gọi là hội chứng M uir - Torre N hững khối u da hiếm gặp này

PMS2 gây nên hội c h ứ n g Lynch, với độ th â m nhập khoảng 80% đối v ớ i ung thư đại trự c

MIH2 và được coi là hiếm gặp ở MSH6 [15, 16] Sự định vị các đột biến trong các gen

này không ảnh hưởng đến độ thâm nhập của chúng hay độ biểu hiện, cho thấy rằng hầu hết các đột biến này là những đột biến không (null) hoặc mất chức năng mà không phải

là làm mất một phần hoặc giành chức năng mới của protein Tuy nhiên, sự tồn tại các alcn ẩn này không cho thấy sự thay đổi nào về trình tự nhưng dẫn đến sự biểu hiện giảm sút đã được ghi nhận Tác động hạn chế với cùng alen trong tất cả các tế bào, những thay đổi trình tự trong các intron hoặc vùng điều hòa gây nên sự biểu hiện khác thường hoặc sự thoái hóa của bản mã sao chắc chắn gây nên những tác động này.

thước khoảng 80,10kb (Hình 3) Protein M SH2 đóng vai trò cơ bản trong việc nhận

Hình 3 Sơ dô gen MSH2Ờ người

Hộp màu xanh biếu thị các exon, khoảng trống biểu thị các intron.

(nguồn: http://atlasQeneticsoncoloQy.org)

Đây là gen quy định tổng hợp một loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa DNA c ấ u trúc gen gồm 3 domain mã hóa cho 3 phần protein với chức năng các phần khác nhau K hi DNA sao chép để chuẩn bị cho tế bào phân chia,

phần protein có chức năng bám vào vị trí bắt cặp nhầm của các đơn nucleotide Riêng

-b a o g ồ m u t u y ế n -b ã n h ờ n v ả u n g t h ư da N g u y ê n n h â n là d o tại c á c t u y ế n d a (tu y ế n -bã

n h ờ n ) s ả n x u ấ t m ộ t c h ấ t n h ờ n gợi là s e b u m C h ín h d ạ n g c h ấ t n h ờ n n à y đã g â y n ên c á c

k h ố i II trê n da C á c k h ố i u n à y c ó t h ể p h á t triể n n h a n h c h ó n g g â y ra h i ệ n tư ợ n g gai

b ư ớ u s ừ n g k h i tiế p x ú c tr ự c tiếp v ớ i á n h n ắ n g m ặ t tròi.

nàng MMR Tuy nhiên, số lượng đột biến MSH6 được phát hiện ở hội chứng HNPCC

là t ư ơ n g đ ố i th ấ p v à c h ư a đ ư ợ c n g h i ê n c ứ u th ấ u đáo H i ệ n nay, đ ộ t b iế n ỏ' g e n MSH6

đ ã (tư ợ c p h á t h iệ n ỏ' m ộ t s ổ t r ư ờ n g h ợ p hội c h ứ n g L y n c h k h ô n g đ i ể n h ìn h v à c h iế m

1 0 % t r o n g s ố c á c d ạ n g đ ộ t b iến g e n ở n h ữ n g n g ư ờ i m ắ c hội c h ứ n g L y n c h C á c đ ộ t

b iế n d ò n g m ầ m ở g e n n à y c ũ n g đ ư ợ c b á o c á o ở n h ũ n g d ò n g họ c ó n h iề u th à n h v iê n bị

u n g t h ư nộ i m ạ c t ử c u n g [3, 7, 15] N g o à i b a g e n kể trên, c ò n c ó hai g e n PMS1

( M I M / / 6 0 0 2 5 8 ) và PM S2 ( M I M # 6 0 0 2 5 9 ) t ư ơ n g ứ n g n ằ m trên n h i ễ m sắc th ể 2 q 3 1 - q 3 3

và 7p22, với kích thước tương ứng 16 Kb và 15 exon Theo dữ liệu đã công bố, chủng

t h ố n g s ử a c h ữ a , n h ữ n g đ ộ t b iế n ở g e n n à y lại h i ế m đ ư ợ c c ô n g bố t r o n g b ệ n h s in h hộ i

c h ứ n g L y n c h , h o ặ c ở h ộ i c h ứ n g T u r c o t ( m ộ t b iế n th ể c ủ a hộ i c h ứ n g L y n c h ) I í i ệ n n a y

v ầ n c ó n h ữ n g t r a n h cãi liên q u a n tớ i c ơ c h ế b ằ n g c á c h đó PM SỈvà PMS2 c ó th ể h o ạ t

đ ộ n g d ẫ n t ó i k h u y n h h ư ớ n g u n g t h ư [5],

3 M ột số kỹ thuật di truyền phân tử phân tích đột biến

P h â n tí c h đ ộ t b iế n là m ộ t h ư ớ n g đ ư ợ c s ử d ụ n g kh i ta biết g e n n à o đ ó c h ịu trá c h

n h i ệ m c h o m ộ t tìn h t r ạ n g đ ã xác đ ị n h và n h ữ n g đ ộ t biến đ ặ c th ù t r o n g g e n đ ã đ ư ợ c IT 1 Ô

tả Những kỹ thuật được sử dụng để phát hiện các đột biến này là rất khác nhau, bao

g ồ m p h â n tíc h lai o l i g o n u c l e o t i d e đ ặ c th ù a le n , p h â n tíc h sợi k é p h e t e r o d u p l e x , p h â n líc h S o u t h e r n b lot, m u l t i p l e x P C R v à giải trìn h t ự trự c tiếp N g ư ờ i ta s ử d ụ n g p h â n tíc h

đ ộ t b iế n t r ự c tiế p k hi x á c đ ị n h c á c d ộ t b iế n đ ặ c h iệ u v à k h ô n g c ầ n k i ể m tr a c á c t h à n h

v i ê n k h á c c ủ a g ia đ ì n h h o ặ c bố m ẹ c ủ a đố i tư ợ n g , ở đ â y , c h ú n g tôi n ê u r a m ộ t sô

phương pháp phân tích đột biến được sử dụng phổ biến ở nhiêu phòng thí nghiệm.

• Nhân bản gen bằng PCR (Polymerase chain rection)

ở những mức thích họp Ket quả là sau mỗi chu kỳ nhiệt như vậy, số bản sao phân tử

D N A c ầ n n h â n b ả n đ ư ợ c t ă n g g ấ p đ ô i D o v ậy , đ â y là m ộ t kỹ t h u ậ t c ó đ ộ n h ạ y c a o ,

11

hiệu q u ả c h o v iệc n h â n b ả n tạ o n ê n lư ợ n g lớn b ả n s a o D N A từ m ộ t l ư ợ n g rất n h ỏ D N A

c ủ a e n z y m e g ió i h ạ n c ó t h ể là m m ấ t h o ặ c x u ấ t h i ệ n vị trí n h ậ n b iế t c ủ a e n z y m e g iớ i hạn K h i đó, v iệc x ử lý n ó v ớ i c ù n g e n z y m e giới h ạ n s ẽ tạ o n ê n c á c p h â n đ o ạn D N A bị cát đ ộ dài là k h á c n h a u v à th ể h i ệ n s ự đ a h ìn h tr ê n b ả n đ iệ n di D o v ậ y , đ â y là c h ỉ thị

c h o b iế t s ự c ó m ặ t c ủ a đ ộ t b iế n ở c á thể, c ũ n g n h ư c á c đ a h ì n h do n h ữ n g đ ộ t b i ế n t ự nliiôn g â y ra tạ o ra đ ặ c đ i ể m r i ê n g biệt ở m ọ i g i ố n g , loài t h ậ m c h í m ỗ i cá thể Đ â y là một p h ư ơ n g p h á p h i ệ u q u a c h o v iệc p h á t h iệ n n h ữ n g sai k h á c d o độ t biến g e n , bở i

p h â n đ o ạ n D N A có k íc h t h ư ớ c g ầ n n h ư n h a u k h ô n g t h ể p h â n biệt đ ư ợ c trên đ iệ n di đ ồ ,

nhưng nếu chúng được cắt bàng các enzyme giới hạn thành các phân đoạn có nhỏ hơn

đoạn DNA sợi đơn có cùng kích thước nhưng trình lự khác nhau Chuyển động của

D N A t r o n g gel đ iệ n di p h ụ th u ộ c v ào k íc h t h ư ớ c v à c ấ u h ỉn h k h ô n g g ia n c ủ a c h ú n g

M ộ t s ự th a y đổi n u c l e o t i d e n h ỏ ( th ê m , m ất, th a y th ế n u c l e o t i d e ) c ủ a m ộ t tro n g hai sợi

dơn của DNA sơi kép rất khó có thể phân biệt trên gel điện di, bởi vì các tính chất vật

lý c ù a c á c sợi c ặ p đ ô i ià g ầ n n h ư g i ố n g n h a u nên c h u y ể n đ ộ n g c ủ a D N A sợi k é p tr o n g

gel điện di gần như không thay đổi Tuy nhiên các chuyển động của sợi đơn lại bị ảnh

h ư ở n g bở i n h ữ n g t h a y đ ổ i d ù là rấ t n h ỏ t r o n g trìn h t ự (c ó th ể là th a y đổi 1 n u c l e o t i d e

t r o n g số v à i tr ă m n u c le o tid e )

P C R - S S C P ( đ a h ì n h c ấ u h ìn h s ợ i đo'n d ự a P C R ) là m ộ t k ỹ t h u ậ t đ ơ n g iả n v à h i ệ u

q u ả c h o v iệc x á c đ ị n h n h ữ n g th a y đ ổi trìn h tự ỏ' đ o ạ n D N A đ ư ợ c k h u ế c h đại b a n g

PCR Đây là kỳ thuật ban đầu được Orita et al (1989) [14] đưa ra và được coi như là

m ộ t p h ư ơ n g p h á p n h a n h v à n h ạ y đ ể p h á t h iệ n cá c đ ộ t b iế n h o ặ c s ự đ a h ìn h c ủ a p h â n t ử

D N A S a u k h i b i ế n tín h D N A sợi k é p , d o tín h c h ấ t t ư ơ n g đố i k h ô n g ổ n định c ủ a D N A

s ợ i đ o n kh i v ắ n g m ặ t c ủ a m ộ t sợi b ổ s u n g , các tr ìn h t ự D N A trê n s ợ i đ ơ n có th ể g ặ p

12

c á c trìn h t ự b ố s u n g n ằ m n g a y trê n sợi D N A đó k ế t q u ả q u ả là c h ú n g b ắ t c ặ p với

n h a u , tạ o ra n h ữ n g v ò n g h o ặ c n ế p g ấp , tạ o ra n h ữ n g c ấ u c ấ u h ì n h k h ô n g g i a n k h á c

n h a u , s ự k h á c b iệ t v ề h ì n h d ạ n g g iữ a hai sợi đ ơ n với trìn h t ự k h á c n h a u s ẽ làm c h ú n g

di c h u y ế n k h á c n h a u t r ê n c ù n g m ộ t b ả n gel điện di, m ặ c dù s ố l ư ợ n g n u c l e o t i d e là n h ư nhau M ặ t k h á c gcl đ i ệ n di s ử d ụ n g tr o n g S S C P là gel p o l y a c r y l a m i d e p h é p p h â n tá c h

đ ư ợ c n h ữ n g b ă n g c ó sai k h á c n h ỏ chỉ 1 n u tc le o tit n ê n n h ữ n g đ ộ t b iế n th ê m , m â t

n u c le o tid e c ũ n g sẽ đ ư ợ c p h á t h iệ n th ô n g q u a k ỹ t h u ậ t này K ỹ t h u ậ t P C R - S S C P có ư u

đ i ể m là chi phí th ấp , tiệ n lợi v à đ ộ n h ạ y kh á c a o d ể x á c đ ịn h c á c đ ộ t b iế n g e n ơ đ iề u

k i ệ n tối ưu, k h o ả n g 8 0 % - 9 0 % cá c đ ộ t biến đ ư ợ c p h á t h iệ n n h ờ k ỹ t h u ậ t S S C P

N h ư ợ c đ iể m c ủ a p h ư ơ n g p h á p n à y là tốn k h á n h iề u thờ i gian.

p h á p giải trìn h tự D N A d ự a trên p h ả n ứ n g sao c h é p D N A s ử d ụ n g D N A p o l y m e r a s e

Nguyên tắc của phương pháp này là thực hiện phản ứng PCR với việc bô sung các 2’,

q u a th iế t bị p h á t h iệ n h u ỳ n h q u a n g v à la se r ở đ á y gel T h ô n g tin n à y đ ư ợ c t r u y ề n trự c

ti ế p v à o m á y tín h v à t ừ đ ó trìn h t ự n à y đ ư ợ c lưu lại t ự đ ộ n g N h ư vậy , vớ i k ỹ t h u ậ t giải

ư n g t h ư dại tr ự c t r à n g , t r o n g đ ó có H N P C C là d ạ n g u n g t h ư c ó tỷ lệ m ắ c p h ả i

vô g e n s ử a c h ữ a bắt c ặ p sai liê n k ế t u n g t h ư đại trự c t r à n g di t r u y ề n đ ã đ ư ợ c t h ự c h iệ n

ở k h á n h i ề u n ư ớ c t r ê n th ế giới D ữ liệ u về đ ộ t b iế n c á c g e n M M R g ó p p h ầ n đ ư a ra c á c quy t r ì n h c h ẩ n đ o á n v à s à n g lọc d ạ n g u n g t h ư này H i ệ n n a y , c ó tới h ơ n 2 5 0 đ ộ t biên

dòng mầm khác nhau đã dược xác định, trong đó phần lớn các đột biến này được phát

hiện ỏ' g e n MLH1 v à MSH2 và đ ư ợ c k h ẳ n g đ ịn h c ó liên k ế t vói H N P C C Đ á n g c h ú ý là chỉ có m ộ t ít h o ặ c k h ô n g c ó s ự k h á c b iệt về đ ộ biểu h iệ n đã đ ư ợ c p h á t h i ệ n g i ữ a c á c

c h ứ c n ă n g M M R

F e l i p e et al. đ ã đ á n h g iá 25 g ia đ ìn h n g ư ờ i B raz il c ó h ộ i c h ứ n g L y n c h N g ư ờ i ta

th ấ y r ằ n g 10 g ia đ ì n h ( 4 0 % ) t r o n g số đ ó có n h ữ n g đột b iế n ở c á c g e n MLH1 v à M SH2:

8 gia đ ì n h có đ ộ t b iế n ở MLH1 ( 8 0 % ) và hai g ia đ ì n h có đ ộ t b iế n ở MSH2 (2 0 % )

T r o n g đ ó c ó 5 đ ộ t b i ế n n h ầ m n g h ĩa , m ộ t đ ộ t b iế n vô n g h ĩa , b a đ ộ t b iế n d ị c h k h u n g và

m ộ t sai h ỏ n g ỏ' vi trí c ắ t n ố i [5] L y n c h et al [9] đ ã x á c đ ịn h c á c đ ộ t b iế n tại n h ữ n g g e n

n à y ỏ' 18 tr o n g số 5 6 c á c th ể ( 3 2 , 1 % ) G ầ n d â y , n g h i ê n c ứ u c ủ a H e n d r i k s et al. đ ã xác

địnlì ctược 7 đột biến ở gen PMS2, bao gồm bốn đột biến sắp xếp lại hệ gen và ba đột

biến đ iế m T r o n g số 7 cá th ể c ó đ ộ t b iế n này, s á u cá th ể th ể h i ệ n m ô h ìn h di tr u y ề n trội trên n h i ễ m s ắ c thề t h ư ờ n g [7], T h e o P is t o r i u s el củ [15], s ự s ắ p x ế p lại h ệ g e n c ó m ặ t ỏ'

m ộ t tỷ lệ đ á n g kế tr o n g to à n bộ n h ữ n g độ t h iế n có k h ả n ă n g g â y b ệ n h ở c á c g e n M M R

trong các bệnh nhân mắc hội chứng Lynch Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, sự sấp xếp lại hệ gen có mặt ỏ' 15 - 55% trong tất cả các đột biến ở các gen MMR

G o e c k e r et al đ ã p h â n tíc h m ố i liê n q u a n g i ữ a k iể u g e n đ ộ t b i ế n ở c á c g e n s ử a c h ữ a băt

th ể n g ư ờ i bị u n g t h ư này T ỷ lệ u n g t h ư đại trự c trà n g ở giai đ o ạ n c ò n trẻ c h o tới tr u n g

n iê n c h o t h ấ y v iệ c x á c đ ịn h c h iế n l ư ợ c c h ẩ n đ o á n và đ iề u trị c h o n h ữ n g n g ư ờ i bị u n g

t h ư k h ở i p h á t là c ầ n th iết [21], B ố n đ ộ t b iế n m ớ i đ ã đ ư ợ c p h á t h iệ n ờ g e n

MSH2/MLHỊ t ừ c á c d ò n g h ọ H N P C C n g ư ò i B ồ Đ à o N h a tr o n g m ộ t n g h i ê n c ứ u c ủ a G Isid o et ci/ [6], B ằ n g kỹ t h u ậ t P C R - S S C P , c á c tác giả đ ã th u đ ư ợ c c á c m ô h ìn h p h â n ly

n g h ĩa ở g e n AÍSH2. Đ ó ià đ ộ t b iế n t h a y th ế n u c le o tid e 2 0 8 9 T - > c ở c o d o n 6 9 7 và đột

là m m ấ t đ o ạ n n u c l e o t i d e từ n u c le o tid e 2 9 2 303 ỏ' trìn h tụ' c D N A Y o s h i h i t o e t al đ ã

thư Kết quả cho thấy có sự thay đổi theo trình tự thời gian về MSI và sự biểu hiện

M S I 12 ở nội m ô ỏ' b ệ n h n h â n n ày [23]

V ớ i v iệ c t ì m ra kỹ th u ậ t k h u ế c h đại đ a m ẫ u dò p h ụ t h u ộ c p h ả n ứ n g g ắ n n ố i

( m u l t i p l e x l i g a t i o n - d e p e n d e n t p r o b e a m p l i f i c a t i o n ( M L P A ) ) , c ó th ể n h ậ n th ấy , m ộ t tỷ

lệ lớn các đột biến dẫn tới sự tái sắp xếp hệ gen của một hoặc nhiều mất đoạn exon ảnh

hircmg tới c á c g e n MLH1 và MSH2. A i n s w o r t h et al [2] đã tìm th ấ y tỷ lệ tái s ắ p x ế p hệ

g e n ỏ' 10 t r o n g sô 6 7 n g ư ờ i A n h ( 1 5 % ) , với 5 d ạ n g tái s ắ p x ế p kh ác n h a u Z h a n g el al

[25] đ ã đ á n h g iá 16 c á th ể n g ư ờ i T h ụ y S ĩ có q u a n hệ họ h à n g c ó hộ i c h ứ n g L y n c h ,

n h ư n g k h ô n g m a n g c á c đ ộ t b iế n d ò n g m ầ m ỏ' hai g e n MLH1 và MSH2, tu y n h iê n lại có

5 n g ư ờ i t r o n g đ ó ( 3 1 % ) mang c á c m ấ t đ o ạ n hệ g e n k h á c n h au S o s á n h g iữ a c á c gia

t r ù n g t h â p ( 3 0 % c h o tớ i tu ổ i 7 1), n h ư n g lại c ó n g u y c ơ h ìn h t h à n h u n g t h ư n ộ i m ạ c tử

c u n g ( 7 1 % c h o tới t u ổ i 7 1 ) [15, 16] M ộ t số n g h i ê n c ứ u k h á c đ ã c h ứ n g m in h r ằ n g

n h ữ n g n g ư ờ i m a n g d ộ t b iế n ờ MSH2 c ó n g u y CO' c a o h ơ n h ìn h th à n h u n g t h ư ỏ’ ố n g tiết

niệu, dạ dày và buồng trứng, so với những người mang đột biến ở MLH1.

g e n M M R t r o n g c á c t r ư ờ n g h ợ p hội c h ứ n g L y n c h , n h ữ n g bất t h ư ờ n g di tr u y ề n ở

p r o m o t e r t r o n g c á c g e n này lại rất ít đ ư ợ c n g h iê n cứ u N h ữ n g n g h iê n c ứ u g ầ n đ â y đ a n g

xác định và mô tả những đột biến dòng mầm ở vùng trung tâm các promoter của

v.êin gan B trên bệnh nhân ung thư gan bằng kỹ thuật sinh học phân tử; môi liên quan

gììữa sự h iế n đô i g e n đ ặ c tr ư n g vó i m ộ t số đ ặ c đ iề m lâm s à n g và h u y ế t h ọ c ở b ệ n h

nhân lơ xê mi cấp dòng tuỷ cũng đã được nghiên cứu bởi nhóm các tác giả Phạm

Q a ia n g V i n h v à c ộ n g s ự (2 0 0 8 ) Đ ố i vớ i b ệ n h u n g t h ư đại tr ự c trà n g , g ầ n đ â y v à o n ă m

2009, Lê Trần Ngoan đã công bố kết quả nghiên cứu tứ vong do ung thư đại - trực

t r à n g ỏ' 8 v ù n g s in h t h á i n ư ớ c ta t r o n g 2 n ă m 2 0 0 5 - 2 0 0 6 C h o tới nay , h ầ u n h ư c h ư a có

n g h i ê n c ứ u n à o đi s â u tìm h iể u c á c đ ộ t biến ỏ' n h ữ n g g e n s ử a c h ữ a bắt c ặ p sai liên q u a n

tòi ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ỏ' người Việt Nam Trên thực tế, mới

c h ỉ có s ố liệ u h ạ n c h ế liên q u a n đ ế n v iệ c p h ò n g n g ừ a d i t r u y ề n t r o n g H N P C C T h ự c tế

c h o th ấ y , c h ẩ n đ o á n v à đ iề u trị u n g th ư đ ạ i tr ự c t r à n g ở đ ộ tu ổ i c à n g s ớ m thì sẽ có

nlhiôu cơ hội thành công.

5- M ục tiêu và nội d u n g n g hiên cứu

5.1 Mục tiêu nghiên cứu

X â y d ự n g đ ư ợ c q u y trìn h p h â n tích g e n n h ằ m p h á t h iệ n d ộ t biến g e n s ử a c h ữ a bắt

K v à B ệ n h v iệ n Đ ạ i h ọ c Y H à N ộ i 10 m ẫ u đối c h ứ n g là m á u c ủ a n g ư ờ i có độ tuổi

trên 60, không mắc bệnh ung thư.

- Tách chiết DNA tống sô từ các mẫu máu và mô bệnh phẩm đã thu thập được

- Thiếl kế các cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân bản một số phân đoạn gen MSH2.

b ằ n g P C R

- P h á t h i ệ n c á c đ ộ t b iế n ở g e n n g h i ê n c ứ u b ằ n g c á c k ỳ t h u ậ t P C R - S S C P , P C R - R F L P

và giải trì nil tự DNA.

16

C H Ư Ơ N G 2 Đ Ó I T Ư Ợ N G VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N G H I Ê N c ử u

1 V ật liệu n g h iê n cứu

Đ ô i t ư ợ n g n g h iê n c ử u và đ ịa d iê m t h í n g h iệ m

Đ ô i t ư ợ n g th í n g h i ệ m b a o g ồ m m ẫ u m á u và m ô củ a 50 n g ư ờ i m a c b ệ n h u n g th ư đại trực t r à n g v à u n g t h ư d ạ d à y đ ư ợ c th u th ậ p từ K h o a U n g b ư ớ u v à c h ă m s ó c g i ả m n h ẹ

T h iế t bị d ù n g c h o n g h i ê n c ứ u b ao g ồ m : C á c h ệ t h ố n g đ iệ n di đ ứ n g v à n g a n g c ủ a

B i o R a d ( M ỹ ) , b ể ổ n n h iệ t, m á y ly tâ m lạnh K y r a t e c v à m á y ly tâ m n h iệ t đ ộ t h ư ờ n g

(Eppendorf), máy PCR (Perkin Helmer), tủ lạnh -80°c, tủ lạnh thường, cân phân tích

2 Phương p h áp nghiên cứu

2.1 Thu thập và bảo quản mâu

M a u m á u đ ư ợ c t h u t h ậ p t r o n g c á c ố n g c h u y ê n d ụ n g , đ ư ợ c c h ố n g đ ô n g b ằ n g E D T A ,

đ ả m b ả o k h ô n g bị n h i ễ m c á c c h ấ t k h á c , k h ô n g bị lẫn c á c m ẫ u với n hau.

Cả mẫu máu và mô được bảo quản trong điều kiện -20°c cho đến khi được sử dụng

2.3 Kiếm tra độ tinh sạch và chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR

K i ể m t r a D N A th u d ư ợ c t r o n g q u á trìn h tá c h ch iết b ằ n g p h ư ơ n g p h á p đ iện di trên gel a g a r o s e n ồ n g đ ộ 0 , 8 % p h a tr o n g đ ệ m T B E , s ử d ụ n g t h a n g c h u ẩ n D N A }JHind\\\

v ớ i đ iệ n t h ế 8 0 V , đ ồ n g thời tiế n h à n h p h ư ơ n g p h á p đo q u a n g p h ổ t h ô n g q u a chỉ số O D

Thê tích (nO

N hiệt độ

° c

Thời gian

30 40

Chu kỳ

10% + 2.5|.il TEMED cho lml PAGE 12% S au khi đông đ ặ c , gel được lấ y ra và chạy

19

diện di t r o n g đ i ề u k i ệ n 2 0 0 V , thờ i g i a n 45 p h ú t ở n h iệ t đ ộ k h ô n g đổi với d u n g d ịc h

Biên tính mâu và điện di

tro n g 10 p h ú t, s a u đ ó g â y sốc n h iệ t n h a n h b ằ n g c á c h đ ư a v à o đ á lạ n h tr o n g 10 phút

Đ iệ n di S S C P c á c m ẫ u đ ã biến tín h vớ i P A G E 12% đ ư ợ c tiế n h à n h t r o n g d u n g d ịch

đ ệ m T B E 0 ,5 X v ớ i h i ệ u đ iệ n th ế 9 0 V tro n g 5-7 giờ B ả n gel s a u kh i đ i ệ n di đ ư ợ c

n h u ộ m bạc.

Nhuộm bản gel và quan sát kết quả

G ỡ b ả n gel r a v à đ ư a v ào k h a y c h ứ a 50 ml d u n g d ịc h H N 0 3 1% tr o n g thời g ia n 5 phút đ ế cố đ ịn h b ả n g e l, n g ừ n g h o à n to à n cá c p h ả n ứ n g S a u đ ó lấy b ả n gel k hỏi d u n g

dịch và rửa sạch bàng nước khử ion từ 3 đến 5 lần Bổ sung 30 ml dung dịch A gN 0 3 0,2% và ngâm bản gel từ 20 đến 30 phút Sau đó loại bỏ dung dịch AgNO.ì và rửa sạch bản gel bằng nước khử ion từ 3 đến 5 lần Bố sung 50ml dung dịch NajCOi 3% có

th êm 100ịil f o r m a l d e h y d e G e l đ ư ợ c g i ữ n g ậ p t r o n g d u n g d ịc h c h o đ ế n khi b ă n g x u ấ t hiện rõ nét S a u đ ó loại b ó d u n g d ịc h v à rử a sạc h gel b ằ n g n ư ớ c ld iử io n t ừ 3 đ ế n 5 lân

• Phân tích P C R -R FL P

Đ e p h á t h i ệ n đ ộ t b i ế n đ iể m ở c á c e x o n g e n MSH2, c h ú n g tôi lự a c h ọ n p h ư ơ n g p h á p

P C R - R F L P D ự a v à o c á c c ô n g bố c ủ a n h iề u tác g iả v à d ự a v ào tr ìn h tự c á c e x o n q u a n

chọn enzyme H o e l II đế phát hiện đột biến trên exon 3, 8 13 và 14.

• P h â n tíc h tr ìn h tự DNA (D NA seq u en cin g )

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

] K ết quả tách chiết DNA tổ ng số

Toàn bộ các mẫu máu và mô bệnh được tách DNA tổng số để đạt lượng đủ lớn với

độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm phân tích gen Ket quả điện di cho thấy DNA

đã được tách chiết thành công Các mẫu DNA thu được đều hiển thị trên điện di đồ với một băng duy nhất Chất lượng DNA từ các mẫu khác nhau tương đối đồng đều và ổn đinh thê hiện qua các băng điện di có độ sáng cao, băng gọn, không bị đứt gãy và không chứa ARN.

H ìn h 6 K ế t q u ả t á c h D N A t ô n g s ô t ừ m á u (A ) v à m ô b ệ n h p h ẩ m (B )

M : m a r k e r h i H i n d l U , T 1 - T 8 : D N A t ố n g s ố t á c h t ừ m ô b ệ n h p h ẩ m n g ư ờ i s ố 1 - 8 ;

B 1 - B 8 : D N A t ố n g s ố t á c h t ừ m á u b ệ n h p h ẩ m n g ư ờ i s ố 1 - 8

Dộ tinh sạch và hàm lượng DNA thu được ở mỗi mẫu được xác đinh bằng phương

-2 được pha loãng tới nồng độ 100(il/ml và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.

2 N hân bản các p h â n đoạn gen M SH2 bằng P C R

PCR được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế như trên, sử dụng khuôn là DNA tống số tách chiết từ các mẫu máu và mẫu mô của bệnh nhân Dựa trên nguyên lý hoạt động của phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa thành phần phản ứng, xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho mỗi exon Qua nhiều thử nghiệm chúng tôi đã xác định được điều kiện tối ưu cho PCR mỗi exon và đã nhân bản thành công các exon quan tâm Ket quả nhân bản 09 exon được kiểm tra nhờ phương pháp điện di trên gel agarose 1,2% pha và chạy trong môi trường đệm TAE IX ở điện thế 90V trong 30 phút Căn cứ thang chuẩn 100 bp, chúng tôi đã xác định sản phẩm nhân bản thu được từ các phản ứng có kích thước phù hợp với từng exon tương ứng Chi tiết kêt quả nhân bản các exon được thể hiện trong các hình từ Hình 7 - 9

i !

M a p 5 1® 7, ’ •J P

21

Exon 2 được chúng tôi tiến hành tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 50°

xấp xỉ 345bp Nhưng ở điểm nhiệt 51°c băng DNA thể hiện độ sáng cao nhất Vì vậy,

nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho quá trình nhân bản exon 2 là 51°c Sau khi nhân bản đồng

loạt các mẫu, kết quả điện di được thể hiện ỏ' Hình 7.

• Kết quả nlíân bản exoiĩ 3

Dựa vào nlìiệt độ gắn mồi được khuyến cáo bởi hãng cung cấp dối với mồi xuôi

và mồi ngược, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 56° đến

58°c, với mỗi bước nhảy là 0,5°c Ở nhiệt độ 56°c ngoài băng chính với kích thước

khoảng 281 bp còn xuất hiện 1 băng phụ phía trên với kích thước >900 bp ở 3 điểm

nhiệt còn lại là 56,5°c, 57°c và 57,5°c chỉ có duy nhất 1 băng DNA với kích thước

có độ sáng là cao nhất Vì vậy, chủng tôi quyết định chọn 57°c là nhiệt độ gắn mồi cho

việc PCR exon 3 Kết quả nhân bản các mẫu nghiên cứu được thể hiện trên Hình 8.

Tương tự như exon 2 và 3, chúng tôi đã tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho các exon

K ết q u ả điện di ở trên cho thấy ch ú n g tôi đã nhân bản đượ c các p h ân đoạn ADN

p h ù hợp với kích th ư ớ c lý th u y ết như đã tính toán dựa trên Irình tự củ a gen tương ứng

v ớ i vị trí cặp m ồi đ ư ợ c th iết kế cho m ỗi exon C ác sản p h ẩm P C R trên được sử dụng tro n g các p h ân tích tiếp theo nhằm sàng lọc, phát hiện các đột biến ở gen MSH2.

N hằm sàng lọc, p h át hiện đột biến gen MSH2 , chúng tôi tiến h àn h ph ân tích các

ph ân đoạn gen sau khi đã được nhân b ả n bằng PC R , sử dụn g kỹ th u ậ t PC R -R FL P và

P C R -S S C P C ác m ẫu nghiên c ứ a m ang phân đoạn gen thể h iện m ô hình phân ly sai khác trên đ iện di đồ so với đối chứ ng đ ư ự c giải trìn h tự để x ác định đ ộ t b iến gen V iệc tiến hành n g hiên cứ u n ày được thự c hiện trên cơ sở nghiên cứu tài liệu đã công bố về phân tích đột biến các gen M M R ở nh iều quốc gia khác nhau C ác ngh iên cứu gần đây cho thấy có k h o ản g h ơ n 250 đột biến d ò n g m ầm khác nhau đ ã được x ác định và MSH2

vân được x e m là gen quan trọng trong chấn đoán hội chứng IIN P C C T im m G oecker

et al đã ph ân tích m ối liên quan giữa k iểu gen đột biển ở các gen sửa chữ a bắt cặp sai

MSH2 và k iểu hìn h H N P C C v à đã xác định được 294 đột biến tro n g số 259 cá thể

các dòng họ H N P C C người B ồ Đ ào N h a trong m ột nghiên cứu của G Isid o et al [6]

V ới việc sử dụ n g kỹ th u ậ t P C R -SS C P, các tác giả đã thu đượ c các m ô hình SSCP bất

gen MSH2. Đ ó là đ ộ t biến thay th ế nucleotide 2089T > C ở cocỉon 697 v à đột biến dị hoán ở n u cleo tid e 2074G > C N goài ra, m ột đột biến thay thế n u cleo tid e khác là 2152C > T ở gen MSH2 làm thay thế bộ ba m ã hóa axit am in glutam in thành bộ ba kết thúc C ác đột b iến này có thể đượ c xác định bằng giải trình tự A D N , phân tích M SI và nhiều kỹ th u ậ t khác.

3 1 K ế t q u ả p h â n t í c h đ ộ t b i ế n b ằ n g P C R - R F L P

Đây là p h ư ơ n g pháp thườ ng đ ư ợ c sử dụn g trong các nghiên cứu xác định đột

b iến điểm N ếu x u ất h iện đột biến làm thay đổi trình tự vị trí nhận b iết của enzym giới hạn, sản p h ẩm củ a p h ả n ứng cắt bằng enzym e giới hạn đó sẽ có kích thướ c khác so với đối chứng k h ô n g m an g đột biến D ựa trên các trình tự gen MSH2 đã công bố, trong Iighièn cứu này, c h ú n g tôi xác định n g h iên cứu phát hiện đột biến đ iểm trên các exon exon 3, 8, 13 và 14, sử dụng enzym giới hạn Hae III E nzym Hae III có trìn h tự nhận

b iết như sau: 5 \ G G / C C 3 ’

3 ’ C C /G G 5 ’ Hình 10 dưới đây m inh họa kết quả dự đoán khi phản ứng cắt các phân đoạn exon

tương ứng nếu diễn ra hoàn toàn.

2 4

H ìn h 1 0 D ự đ o á n k ế t q u ả p h ả n ứ n g c ắ t h o à n t o à n e x o n 3 , 8 , 1 3 v à 1 4 b ở i e n z y m e H a é L l l

S au đây là kết q u ả ph ân tích R FL P bốn exon nêu trên.

*1* Exon 3

Đ e kiểm tra xem đột biến m ất vị trí nhận biết của Hae III trên exon 3 có xảy ra ở

n h ữ n g bệnh nhân u n g th ư đại trực trong nghiên cứu này hay không, chúng tôi đã dùng

e n zy m e này để cắt các sản phấm P C R exon 3 của tấ t cả các m ẫu m ô bệnh phẩm hiện có.

sàng lọc bang P C R -R F L P cho thấy, tất cả các m ẫu (cả m ẫu đối chứ ng và m ẫu bệnh)

n h ư tín h toán theo lý thuyết, không có trư ờng hợp cắt không đặc hiệu N hư vậy,

c h ú n g tôi chưa p hát h iện được đột biến ở vị trí 471 O A tro n g các m ẫu nghiên cứu.

T ro n g m ột nghiên cứ u gần đây, khi sàng lọc các bệnh nhân H N PC C người H àn Q uốc,

hiện được đột biến tại vị trí nucleotide 471 O A làm m ất đi vị trí cất của enzym e này trê n exon 3 [20] Đ ể khẳng định có đột biến này ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại V iệt N am hay k hông, cần m ở rộng nghiên cứu trên số lượng m ẫu lớn hơn.

♦> Exon 8

ng ư ờ i bị ung thư đại trự c tràng, dạ dày nên chúng tôi đã tiến hành cắt tất cả các m ẫu

m ô bệnh phấm và đối chứng N eu D N A người bệnh không chứa vị trí cắt của enzym e giới hạn này thì ta có thể khẳng định đó là đột biến điểm mới thông qua giải trình tự

K ết quả P C R -R F L P tấ t cả các m ẫu cho thấy enzym e Hae III đều cắt các sản phẩm PC R

v à th u được 2 băng có kích thước tươ ng ứng theo lý th u yết là 284 và 81bp N hư vậy,

th ư ớ c tương ứng là 166, 59 và 19 bp K hi điện di trên gel polyacrylam ide 12%, băng

19 bp có kích thước nhỏ nên khô n g thể quan sát được băng này ở m ật độ gel điện di

D o vậy chỉ cần dựa vào hai băng 166bp và 59bp, ta có thể xác định được kết quả phản

m ẫ u nghiên cứu của ch úng tôi cho thấy, chúng tôi đều thu được các phân đoạn 166bp

v à 59bp ở hầu hết các m ẫu (H ình 13).

— 166 bp

59 bp

H ìn h 1 3 Ả n h đ i ệ n d i k i ể m t r a s ả n p h ẩ m c ắ t e x o n 1 3 g e n M S H 2

M: m a r k e r 1 0 0 bp C á c g iế n g c ò n lại: s ả n p h ẩ m c ắ t b ằ n g e n z y m e giớ i h ạn c ủ a c á c m ẫ u b ệ n h p h ẩ m

T uy nhiên, qu an sát sản phẩm cắt exon 13 ở m ẫu 13T1, chúng tôi nhận thấy có

sự khác biệt giữ a m ẫu m ô bệnh phẩm của người số 1 so với người bình th ư ờ n g và với

E80 13t1 13t3~Ĩ3t6~

H ìn h 1 4 Ả n h đ i ệ n d i k i ể m t r a s ả n p h ẩ m c ắ t e x o n 1 3 g e n M S H 2 b ằ n g H a đ l l

E 80 : m ẫ u c ủ a n g ư ờ i bình t h ư ờ n g , 1 3 T 1 -1 3 T 6 : m ẫ u c ủ a n g ư ờ i b ệ n h

C húng tôi đ ã giải trình tự exon 13 của người bệnh số 1 để khẳng định bản chất

sự sai khác của m ẫu 13T1 so với các m ẫu khác K ết quả giải trình tự v à so sánh với trình tự m ẫu đối ch ứ n g cho thấy xuất hiện đột biến m at nucleotide A nằm trong vùng

m ã hó a ở exon 13 củ a m ẫu bệnh phẩm (vị trí số 43 trong kết quả giải trình tự) tương ứng với vị trí n u cleo tid e số 156 trên m ạch 5 ’-3 ’ của exon 13 và là vị trí nucleotide số

xuất hiện băng bên dướ i băng 166bp ở m ẫu 13T1 (H ình 14).

4 5

tc H c t t t c a a

- 1 - ị

5 5 TTGACTGTCA

- 1 -1

6 5 CCAGCCCCTA

- 1 -1

7 5 CTCGGGCTAA

-1 -1

8 5 GATGCAGTCC

— 1 — 1

9 5 ACAATGGACA

- 1 - 1

1 0 5 CTTCTGCTGA

- 1 -1

1 1 5 CTCACATGGC

-1 -1

1 2 5 ACAAAACACC

- 1 -ị

1 3 5 CAATTTGGGC

- 1 -1

1 4 5 CATGAGTACT

- 1 -I

1 5 5 ATCACCCCAG

- 1 - 1

1 6 5 TTTGTCGAAT

-1 -1

1 7 5 ATATGTTGAT

- Ị -i

1 8 5 TTACCTCCCA

- I -1

1 9 5 TATTGGGGCC

Sản phẩm P C R exon 14 sau khi bị xử lý bàng enzym e giới hạn Hae III thu được

2 băng có kích thướ c 176 và 139 bp như lý thuyết K ết quả điện di kiểm tra sản phấm cát cho thấy tất cả các m ẫu P C R exon 14 của m ầu m ô bệnh phấm v à m ẫu của người bìn h th ư ờ n g đều bị cắt hoàn toàn th àn h 2 băng C húng tôi không phát hiện sự sai khác giữ a m ẫu đối chứ ng v à m ẫu bệnh.

H ìn h 1 6 À n h đ i ệ n d i k i ể m t r a s ả n p h ẩ m c ắ t c ủ a e x o n 1 4 g e n M S H 2

M: m a rk er lO O bp 1 4 E 8 0 : s ả n p h ẩ m c ắ t c ủ a m ẫ u đ ổ i c h ứ n g d ư ơ n g (n g ư ờ i bình th ư ờ n g )

C á c g iế n g c ò n lại: s à n p h ẩ m c ắ t e x o n 1 4 c ủ a c á c m ẫ u b ệ n h p h ấ m

N h ư vậy, sau khi sàng lọc trên 50 m ẫu m ô bệnh phẩm bằng phươ ng pháp PCR-

R FL P , ch ú n g tôi đã phát hiện m ột sai khác trong m ô hình phân tách băng điện di ở exon 13 trên m ẫu bệnh T I (13T 1).

3 2 K ế t q u ả p h â n t í c h đ ộ t b i ế n b ằ n g S S C P v à g i ả i t r ì n h t ự

cứu được sử dụ n g cho phân tích SSCP nhàm phát hiện đột biến C ác sản phẩm PC R đượ c sử dụn g để chạy điện di sợi đơn bằng PA G E 12% không biến tính theo phương

ph áp đã trìn h bày ở trên Sau khi điện di và nhuộm gel, chúng tôi thu được m ột số kết

q uả n hư sau.

K ết quả phân tích SS C P cho thấy hầu hết các m ẫu đều hiển thị trên điện di đồ với hai v ù n g gồ m vùng băn g sợi đơn và băng sợi đôi Phần lớn các m ẫu bệnh đều thể

h iện m ô hình p h â n tách băng tư ơ n g tự m ẫu đối chứng ở các exon Tuy nhiên, chúng tôi

cũ n g đã p h át h iện m ộ t sổ m ẫu, ở m ột số exon xuất hiện sự sai khác tro ng kết quả điện

h ăn g sợi đơn p h ía dưới Sự ph ân tách băng này cho thấy có thể có sự khác biệt về trình

tự D N A tại exon 2 ở m ẫu m ô un g th ư này Đ ể khẳng định điều đó, chủng tôi tiến hành giải trình tự ph ân đoạn exon 2 của m ẫu T35.

H ì n h 1 8 M ô h ì n h P C R - S S C P e x o n 2 g e n M S H 2 c ủ a m ộ t s ô ' m ẫ u b ệ n h p h ẩ m v à

đ ố i c h ứ n g M ũ i t ê n c h ỉ b ă n g c h ỉ s ự k h á c b i ệ t s o v ớ i đ ố i c h ứ n g

K ết quả giải trìn h tự (H ình 19) v à so sánh với trình tự tương ứng ở m ẫu đối chứng ch o thấy m ẫu T35 m ang đột biến mất m ột nucleotide A tại vị trí 265 trên phân đoạn ex o n 2 đượ c nh ân trong m ẫu bệnh này, tương ứng với vị trí nucleotide 5193,

ranh giới intron v à exon 2) Sự thay đổi trong vùng ranh giới này có thể dẫn đến sự thay đổi tro n g cắt nối m A R N , ảnh hưở ng đến quá trình biến đổi sau phiên m ã, từ đó có thể làm thay đổi sản phẩm chuỗi polypeptide được dịch mã Q uan sát sắc đồ giải trình

tự cho thấy, đột biến m ất nu cleo tid e A nằm cuối trình tự 13 nucleotide A denine lặp liên tiếp Đ ây là m ột v ù n g vi vệ tinh thuộc dạng lặp đơn nucleotide D o vậy, đột biến

m ất n u cleo tid e này liên quan đến trạng thái bất ổn vi vệ tinh, được coi là chỉ thị trong chẩn đoán ung th ư đại trự c trà n g dạng H N PC C

H ì n h 1 9 K ế t q u ả g i ả i t r ì n h t ự e x o n 2 g e n M S H 2 c ủ a n g ư ờ i b ệ n h s ố 3 5 ( M ẩ u T 3 5 )

T uy nhiên, kết q uả giải trình tự này cho thấy, đây là đột biến m ất nucleotide ở trạn g thái dị hợp tử, do tồn tại đồng thời các tín hiệu tươ ng ứng của trình tự kiếu dại (b ìn h thường).

H ìn h 2 0 K ế t q u ả S S C P e x o n 3 g e n M S H 2

( + ) : đ ố i c h ứ n g d ư ơ n g , c á c g iế n g c ò n lại: m ẫ u m ô b ệ n h p h ẩ m n g ư ờ i t ư ơ n g ứ n g , m ũi tê n ch ỉ s ự sa i

k h á c tr o n g q u á trình p h â n tá c h c á c b ă n g m ô hình sỢi đ ơ n s o vớ i n g ư ờ i bình th ư ờ n g

K ết quả điện di SS C P sản phẩm PC R exon 3 cho thấy có sự khác biệt về mô

h ình dịch chuyến của các sợi đơn D N A ở m ẫu bệnh số 14 so với người bình thườ ng và

v ớ i các m ẫu bệnh khác Phân tích kết quả giải trình tự exon 3 từ m ẫu bệnh phẩm này,

ch ú n g tôi đã phát hiện được m ột đột biến thay thế dị họp tử nằm tro n g vùng m ã hóa,

(H ìn h 21) Sự thay thế G bởi T (đột biến dị hoán) ở vị trí này dẫn đến thay thế axit

am in (p ro lin ) khô n g phân cực thành axit am in glutam in phân cực có tính axit.

A C C T G T C T C T G G C C A T C A A C T

H ì n h 2 1 K ế t q u ả g i ả i t r ì n h t ự e x o n 3 g e n M S H 2 c ủ a n g ư ờ i b ệ n h s ố 1 4

T rong các nghiên cứu về gen M SH 2 ở nhiều quần thế người trên thế giới, có

m ộ t vài nghiên cứu phát hiện thấy đột biến ở exon 3 T rong số đó là kết quả nghiên

c ứ u của Y un-Q ing và cộng sự (1999) nghiên cứu trên 37 bệnh nhân H N PC C người

N h ậ t Bản đã phát hiện được đột b iến dịch khung do m ất 4 nucleotide tại vị trí codon

169 -1 7 0 [24J Tuy nhiên, nghicn cứu tương tự trên các bệnh nhân 1INPCC người châu

A khác như T rung Q uốc hay H àn Q uốc cũng chư a phát hiện thấy đột biến ở exon này.

H ìn h 2 2 K ế t q u ả S S C P e x o n 8 g e n M S H 2

( + ) : đ ố i c h ứ n g d ư ơ n g , c á c g iế n g c ò n lại: m ẫ u m ô b ệ n h p h ẩ m n g ư ờ i t ư ơ n g ứ n g , m ũi t ê n c h ỉ s ự sa i

k h á c tr o n g q u á trình p h â n tá c h c á c b ă n g m ô hình sỢi đ ơ n s o vớ i n g ư ờ i binh th ư ờ n g

Đ iện di đồ các sản phẩm P C R để phân tích SSC P exon 8 (H ình 22) cho thấy có

m ô hình phân tách băng sai khác so với đối chứng ở các m ẫu bệnh phẩm của người số

3 1, 34 và 36 T uy nhiên, kết quả giải trình tự D N A các m ẫu này cho thấy chưa phát

h iện được đột biến ở các m ẫu này.

H ình 23 (A -E ) T ro n g các m ẫu nghiên cứu, bằng PC R -SS C P, chúng tôi chưa phát hiện

th ấy m ô hình phân ly khác biệt so với đối chứng.

Kết quả phân tích exon 15

K ết quả điện di exon 15 cho thấy có sự sai khác về m ô hình sợi đơn của m ẫu số

4 so với m ẫu đối c h ứ n g (H ình 2 4 A) v à m ẫu số 19 (H ình 24B ) M ầu số 4 là của m ột bệnh nh ân nữ 51 tuổi được chẩn đoán m ắc ung thư đại tràng, m ẫu số 19 là của bện h nhân nam 62 tuổi đ ư ợ c chẩn đoán m ắc ung thư đại tràng.

P hân tích v à đối chiếu trình tự D N A của m ẫu người bệnh số 4 với m ẫu đối

c h ử n g cho thấy khô n g có sự khác biệt trong trình tự của exon 15 gen MSH2 này Tuy

n hiên, kết quả giải trìn h tự m ẫu số 19 lại phát hiện m ột đột biến dạng thay th ế O A ở

co d on 848 (c.8 4 8 C > A ) (H ình 25) Đ ây là m ột đột biến đồng ng h ĩa (đột biến câm ), sự

th ay th e nucleotide c bởi A khô n g làm thay đồi axit am in tro n g chuỗi p o ly p ep tid e được m ã hóa bởi gen MSH2 , m à chỉ thay đổi bộ b a G C C —» G C A , đều là các bộ ba m ã

m an g th ô n g tin m ã h ó a đoạn trình tự axit am in có vai trò quan trọn g do tạo m iền tư ơ n g tác với protein M utL tro n g cơ chế sửa chữa n hữ ng lỗi sai hỏng tro n g quá trình tái bản

D N A [23], Tuy vậy, p h át hiện đột biên đông nghĩa cho thây sản phâm protein do exon

15 tạo ra có thể khô n g bị thay đổi, do vậy không ảnh hưở ng đến chức năng m iền tư ơ n g tác M utL cũng k h ô n g bị biến đổi.