- Thuật ngữ CNSH gồm 2 vế công nghệ technology và sinh học bio: - Do UNESCO 1985 định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật v
Trang 1ĐỀ CƯƠNG BÀI GIẢNG
Trang 2CHƯƠNG 1 Tổng quan về công nghệ sinh học
Số tiết: 02 tiết (Lý thuyết: 02 tiết; bài tập, thảo luận: 0 tiết)
*) Mục tiêu
- Về kiến thức
+ Khái niệm, lịch sử phát triển của công nghệ sinh học
+ Phân loại của công nghệ sinh học, thành tựu của công nghệ sinh học
+ Triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học lâm nghiệp
- Về kĩ năng
+ Khái quát hóa, triển khai vấn đề.
+ Phân tích hình ảnh, bảng biểu, sơ đồ minh họa
+ Liên hệ, vận dụng thực tiễn trong đời sống
- Về thái độ
+ Sinh viên có thái độ nghiêm túc, tích cực chủ động, sáng tạo trong quá trình học tập và nghiên cứu,
tư duy khoa học biện chứng
+ Có hứng thú và say mê nghiên cứu khoa học
1.1 Khái niệm công nghệ sinh học
- Công nghệ sinh học có thể hiểu theo hai nghĩa rộng và hẹp
+ Theo nghĩa rộng thì Công nghệ sinh học bao gồm cả những thành tựu, những ứng dụngsinh học trong thực tiễn đời sống con người xuất hiện từ hàng trăm thế kỷ nay
+ Công nghệ sinh học hiểu theo nghĩa hẹp liên quan đến các kĩ thuật hiện đại mang tínhcông nghệ như Công nghệ di truyền và các kĩ thuật hiện đại
- Khái niệm biotechnology - công nghệ sinh học (CNSH) đã được đề xuất năm 1917 bởi một
kĩ sư người Hungari tên là Karl Ereky
- Trước năm 1970, Công nghệ sinh học cũng được hiểu là công nghệ lên men
- Đầu những năm 1970, Công nghệ sinh học đã chuyển sang giai đoạn mới cao hơn hẳn nhờ
kĩ thuật di truyền ra đời
- Thuật ngữ CNSH gồm 2 vế công nghệ (technology) và sinh học (bio):
- Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận
hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng.
=> Như vậy có thể khái quát chung khái niệm về công nghệ sinh học như sau: "Công
nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia của các tác nhân sinh học (ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa trên các thành tựu tổng hợp
Trang 3của nhiều bộ môn khoa học, phục vụ cho việc tăng của cải vật chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người".
1.2 Phân loại công nghệ sinh học
* CNSH phân loại theo các đối tượng:
- Công nghệ sinh học phân tử (Molecular biotechnology): gồm công nghệ gen và các ứngdụng kĩ thuật di truyền
- Công nghệ sinh học Protein và enzym
- Cảm biến sinh học (biosensor)
- Công nghệ sinh học vi sinh vật (Microbial Biotechnology)
- Công nghệ sinh học thực vật (Plant Biotechnology)
- Công nghệ sinh học động vật (Animal Biotechnology)
* CNSH phân loại theo các lĩnh vực kinh tế - xã hội:
- Công nghệ sinh học nông nghiệp (biotechnology in agriculture)
- Công nghệ sinh học y dược (medicine - pharmaceutics)
- Công nghệ sinh học môi trường (environmental biotechnology)
- Công nghệ sinh học năng lượng (biotechnology in energy production)
- Công nghệ sinh học vật liệu (material biotechnology)
- Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm (biotechnology in food processing)
- Công nghệ sinh học hoá học (biotechnology in chemical production)…
Ngoài những lĩnh vực này, nhiều hướng nghiên cứu chuyên sâu về nhiều vấn đề đã hìnhthành như CNSH hương liệu, CNSH khoáng chất,
1.3 Lịch sử phát triển của công nghệ sinh học
Sự phát triển của công nghệ sinh học có thể chia làm 3 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Giai đoạn trước năm 1900
Con người đã sử dụng các tác nhân sinh học đặc biệt là các vi sinh vật vào việc bảo quản
và chế biến thực phẩm Các sản phẩm nhờ áp dụng sinh học chỉ được áp dụng qua thực nghiệm,kinh nghiệm, sản xuất thủ công với quy mô nhỏ
* Giai đoạn 2: Giai đoạn từ 1900 đến 1970
- Sử dụng vi sinh vật trong sản xuất sinh khối, các hoạt chất thứ cấp
- Vào đầu những năm 1900, người ta đã sử dụng các qui trình lên men vào công nghiệphoá học ở qui mô lớn để sản xuất axeton, butanol, ethanol
- Trong Đại chiến thế giới lần thứ II: sản xuất được một khối lượng lớn penicillin,steptomycin và các chất kháng sinh khác
- Sau chiến tranh, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ vi sinh vật
Trang 4* Giai đoạn 3: Giai đoạn từ những năm 1970 trở lại đây (Giai đoạn phát triển công nghệ
sinh học hiện đại)
- Đặc điểm của giai đoạn này là sự phát triển mạnh của CNSH (các kĩ thuật, phương phápnhư: sinh học phân tử, kĩ thuật gene, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, động vật, công nghệenzym, công nghệ lên men ) và khả năng ứng dụng rộng rãi trên nhiều ngành của CNSH ở quy
mô lớn
- Vào những năm đầu thập kỷ 1980 kĩ thuật ADN tái tổ hợp ra đời
- Khác với các CNSH kinh điển, CNSH hiện đại được tiến hành chủ yếu nhờ kĩ thuật di truyền
1.4 Thành tựu và xu thế phát triển của công nghệ sinh học
+ Hoàn thành giải mã bộ gen người và nhiều sinh vật khác (lúa, chuột, Arabidopsis ) + Sự phát triển mạnh mẽ của cây trồng chuyển gen
+ Động vật nhân bản : Năm 1997, J Wilmus và cộng sự Viện Roslin đã tạo ra chú cừu
Dolly, động vật nhân bản đầu tiên từ nhân tế bào tuyến vú của một con cừu trưởng thành
+ Nuôi cấy tế bào gốc (stem cell-tế bào mầm): Tế bào gốc là các tế bào có khả năng phân
chia liên tục trong nuôi cấy và phát triển thành các tế bào chuyên hóa Hiện nay hướng sử dụng
tế bào gốc trong nghiên cứu và ứng dụng để chữa bệnh bằng liệu pháp thay thế tế bào đang mở
ra triển vọng vô cùng to lớn cho nghành y tế
+ Protein tái tổ hợp : Trong thập kỷ qua, tốc độ phát triển protein tái tổ hợp đã phát triển
vượt bậc với nhiều thành tựu đáng kể Hiện có khoảng 50 loại sản phẩm khác nhau đã được sửdụng ở Mĩ và châu Âu Hiện nay, hàng trăm loại protein mới đang được thử nghiệm lâm sàng.Những protein tái tổ hợp này được sản xuất và sử dụng chủ yếu trong điều trị bệnh nan y
+ Công nghệ nano sinh học (Bio-nanotechnology) : Đây là lĩnh vực mới được đề cập và
nghiên cứu nhưng đã mở ra các triển vọng rất to lớn Quy mô nghiên cứu và tác động của côngnghệ này ở kích thước rất nhỏ (nm) Kết hợp công nghệ nano với công nghệ sinh học phân tửcho phép khai thác tối đa các thuộc tính của phân tử sinh học và các quá trình tế bào Các ứngdụng bao gồm :
- Tăng tốc độ chẩn đoán bệnh ;
- Tạo ra các cấu trúc sinh học có kích thước nano nhằm chuyển các phân tử chứcnăng vào trong tế bào ;
- Cải thiện độ chính xác và đặc thù của dược liệu ;
- Giảm thiểu tối đa các cảm biến sinh học (biosensor) bằng cách kết hợp các thànhphần sinh học và điện tử thành một cấu trúc duy nhất ;
- Kích thích sự phát triển của các công nghệ sản xuất xanh (green manufacturingpractices)
Trang 51.5 Triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông - lâm nghiệp
* Công nghệ sinh học trong nông nghiệp
Giống cây trồng và vật nuôi nhân vô tính và chuyển gen mang những đặc điểm nông sinh quý giá
Các chế phẩm sinh học dùng trong bảo vệ cây trồng vật nuôi, như : vaccine, thuốc trừsâu bệnh và phân bón vi sinh
- Công nghệ bảo quản và chế biến nông sản bằng các chế phẩm vi sinh và enzym Giá trịnông sản được nâng lên nhiều lần
- Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm : Các enzym (amylaza, rennin, galactosidaza, gluco-isomeraza, pectinaza), các chất phụ gia thực phẩm
ß Các loại thức ăn bổ sung cho chăn nuôi (kháng sinh mới )
- Các loại thuốc trừ sâu, diệt cỏ với tính đặc hiệu tăng lên (các sản phẩm Bt, cácBaculovirut, tuyến trùng ký sinh )
- Các hoocmon sinh trưởng thực vật (các cytokinin, auxin, )
- Các hóa chất chẩn đoán bệnh cho động- thực vật
* Công nghệ sinh học trong lâm nghiệp:
- Công nghệ gen: Trong lâm nghiệp đã nghiên cứu sử dụng isozyme và chỉ thị phân tửtrong chọn giống keo, bạch đàn và lát hoa
- Nuôi cấy mô – tế bào: Hiện tại chúng ta đã làm chủ và tạo công nghệ nhân in vitro cho
nhiều loại cây lâm nghiệp
- Công nghệ vi sinh , sử dụng vi sinh vật để làm phân bón
- Chế phẩm diệt sâu hại trên một số loài cây
- Trong lĩnh vực xử lý môi trường: bioga
- Công nghệ enzym
*) Tài liệu học tập
1 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, NXB Nông
nghiệp
2 Nguyễn Như Hiền (2006), Công nghệ sinh học, tập 1, NXB Giáo dục Hà Nội.
3 Nguyễn Mộng Hùng (2004), Công nghệ phôi và tế bào động vật , NXB Đại học Quốc gia
4 Nguyễn Mộng Hùng (2002), Tế bào gốc, Tạp chí những vấn đề sinh học ngày nay.
5 Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế.
6 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải thiện giống, NXB Nông
nghiệp
Trang 67 Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng (1996), Những kiến thức cơ bản về Công nghệ sinh học, NXB
Giáo dục
8 http://www Congnghesinhhocvietnam
9 http://www Nhasinh họctre
*) Câu hỏi ôn tập chương 1:
1 CNSH khác gì so với các môn khoa học cụ thể khác (Toán học, Vật lí, Hóa học ), quan niệm chính xác về CNSH hiện đại ?
2 Khái niệm Công nghệ sinh học? Phân loại của Công nghệ sinh học?
3 Lịch sử phát triển của công nghệ sinh học?
4 Thành tựu và xu thế phát triển của Công nghệ sinh học ?
5 Triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông - lâm nghiệp?
6 Tại sao nói thế kỉ 21 là thế kỉ của công nghệ sinh học?
Trang 7CHƯƠNG 2 Các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại
Số tiết: 07 tiết (Lý thuyết: 07 tiết; bài tập, thảo luận: 0 tiết)
*) Mục tiêu
- Về kiến thức:
+ Các kĩ thuật chính sử dụng trong tạo ADN tái tổ hợp
+ Các kĩ thuật chính trong phân tích ADN
- Về kĩ năng
+ Khái quát hóa, triển khai vấn đề
+ Phân tích hình ảnh, bảng biểu, sơ đồ minh họa
+ Thiết lập được các bước của một quy trình công nghệ
+ Liên hệ, vận dụng thực tiễn trong đời sống
- Về thái độ
+ Sinh viên có thái độ nghiêm túc, tích cực chủ động, sáng tạo trong quá trình học tập và nghiên cứu,hình thành tư duy khoa học duy vật biện chứng
+ Có hứng thú và say mê nghiên cứu khoa học
2.1 Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo ADN tái tổ hợp
+ Các enzym sửa đổi
2.1.2.1 Các enzym giới hạn (Restriction enzym - RE)
- Khái niệm enzym giới hạn
- Enzym giới hạn không mang tính đặc hiệu loài
- Có 3 loại enzym giới hạn, trong đó enzym giới hạn loại II là được sử dụng chủ yếu
- Các kiểu cắt của RE: + Cắt tạo đầu bằng
+ Cắt tạo đầu sole: tạo đầu sole 5’, tạo đầu sole 3’
Trang 8- Exonuclease (Enzym cắt ngoài): Cắt ADN từ các đầu của phân tử
- Endonuclease (Enzym cắt trong): Cắt ADN ở các vị trí bên trong
2.1.2.5 Các enzym sửa đổi ADN.
2.1.3 Các vectơ nhân dòng sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp
2.1.3.1 Các vectơ plasmid
Do đặc tính tự nhiên là có thể tự nhân bản các nhân tố di truyền, các plasmid được sửdụng như một vectơ nhân dòng trong tế bào vi khuẩn (thường là tế bào vi khuẩn E Coli)
Thế hệ đầu tiên: Là các plasmid tự nhiên đến nay hầu như không còn sử dụng nữa.
Thế hệ thứ hai : Là các plasmid được cấu tạo phức tạp hơn Một trong những plasmid
thường được sử dụng là pBR 322
Thế hệ thứ ba : Để tiện cho việc sử dụng nhiều loại RE khác nhau, nhiều trình tự nhận
biết của chúng được xếp nối tiếp nhau thành multiple cloning sites – MCS (các vị trí tạo dòng)
Có 3 nhóm plasmid thông dụng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường như:
Trang 92.1.3.3 Vectơ cosmid.
Loại vectơ này kết hợp thuộc tính của phage và plasmid: chúng chứa vị trí cos (đầu dính)của phage đồng thời chúng lại có gốc tái bản của plasmid Vì vậy vectơ cosmid sẽ không tự nhânlên được như phage nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và tự tái bảntrong vi khuẩn
Vectơ cosmid cho phép nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng 40 - 45 kb)
2.1.3.4 Các Vectơ khác: YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men), BAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn), MAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú).
Là các vectơ được thiết kế để nhân dòng các đoạn ADN lớn (đến 1000kb)
2.1.4 Nhân dòng gen (gene cloning)
Mục đích của việc nhân dòng gen là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình
tự ADN xác định Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng gen:
2.1.4.2 Xử lí ADN cần nhân dòng
- Trước hết cần chọn lọc sơ khởi các đoạn ADN có kích thước gần nhau và tương ứng vớiloại vectơ đã chọn
- Sau đó, hai đầu của các ADN này cần được xử lí cho phù hợp với hai đầu chỗ mối cắtcủa vectơ
2.1.4.3 Tạo vectơ tái tổ hợp
Vectơ và ADN cần tạo dòng đã được xử lí sẽ được trộn chung theo một tỷ lệ nhất địnhvới sự hiện diện của ligase để tạo thành vectơ ADN tái tổ hợp Vectơ tái tổ hợp sau đó sẽ đượctinh sạch qua tách chiết và tủa
2.1.4.4 Chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ
- Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổhợp thành một số lượng lớn của bản sao
- Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng một kĩ thuật chuyển thích hợp
2.1.4.5 Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân dòng Từ đây có thể chọn lọc các trình tự cần quan tâm
2.2 Các kĩ thuật chính sử dụng trong phân tích ADN
Trang 102.2.1 Phương pháp tách chiết ADN
2.2.1.1 Tách chiết ADN genom
Nguyên lí
Trong tế bào sinh vật có những loại acid nucleic sau đây: ADN genom, ARN tổng số,ADN plasmid Do vậy muốn tách được một trong các loại nucleotide đó, bước đầu tiên ta cầnphải có tế bào sinh vật, tiếp theo tiến hành phá vỡ tế bào nhưng không được làm hư hại mẫu acidnucleic cần tách chiết Sau đó, tiến hành loại bỏ các thành phần không mong muốn ra khỏi dịch
tế bào để thu được ADN genom, tiếp theo là tinh sạch và đánh giá kết quả
Các bước tiến hành.
- Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân:
Lấy mẫu sinh học, phá vỡ cấu trúc tế bào bằng cách nghiền mô, tế bào trong nitơ lỏng
-196 0C hoặc xử lí mẫu với các chất tẩy mạnh như SDS (sodium dodecyl sulfat), sarcosyl vàproteinase K; hoặc dùng enzym lysozyme Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân,giải phóng ADN ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với ADN
- Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein:Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform:isoamine theo tỷ lệ 25:24:1.Hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein
Sau li tâm cao tốc, hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước chứa ADN,ARN; pha giữa chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa; pha dưới là dung dịch (phenol, chloroform,isoamine) Thu pha nước chứa axit nucleic
- Bước 3: Tủa axit nucleic:
Lợi ích của việc tủa axit nucleic: Thu nhận axit nucleic dưới dạng cô đặc và bảo vệ khỏi sự pháhủy của các enzym nuclease
+ Tủa trong ethanol, việc tủa này được thực hiện trong môi trường có nồng độ muối cao vànồng độ ion cao (2,5 V ethanol:1 V mẫu) và nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa Hầu như toàn bộ axitnucleic đều tủa trong các điều kiện trên
+ Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiệndiện của muối, 1V isopropanol:1 V mẫu Các ADN có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa
Trong cả hai phương pháp, axit nucleic sẽ được thu nhận lại bằng li tâm
- Bước 4: Loại bỏ ARN thu ADN genom:
+ Hòa tan cặn tủa chứa acid nucleic và xử lí loại bỏ ARN bằng enzym RNase Sau đó kếttủa trở lại thu ADN genom
2.2.1.2 Tách chiết ADN plasmid
Trang 11Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc thể Plasmidđược tìm thấy hầu hết ở các vi khuẩn và một số ít các vi sinh vật nhân thực bậc thấp như nấmmen.
Nguyên lí.
Tế bào vi khuẩn có chứa ADN genom, ADN plasmid và các thành phần khác Do vậy, muốnthu được ADN plamid trước hết cần thu một lượng lớn tế bào vi khuẩn sau đó tiến hành phá vỡ tếbào vi khuẩn và loại bỏ các thành phần không mong muốn Kết quả thu được phân tử ADN palsmid.Kiểm tra độ tinh sạch
Các bước tiến hành.
- Bước 1: Thu sinh khối tế bào vi khuẩn
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn thích hợp Li tâm thu sinh khối
- Bước 2: Phá vỡ tế bào vi khuẩn
Tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng hóa chất hoặc siêu âm
Sử dụng enzym Lysozyme để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn
- Bước 3: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là protein và ADN genom
Xử lí natri acetat và li tâm Sau li tâm, ADN bộ gen và protein kết tủa ở đáy ống, lớp dịch nổi phíatrên chứa ADN plasmid Thu lớp dịch nổi chứa plasmid chuyển sang ống khác
- Bước 4: Tủa ADN plasmid
+ Lớp dịch chứa plasmid được bổ sung thêm ethanol 100% (hoặc isopropanol) lạnh đểkết tủa ADN plasmid
+ Li tâm thu tủa ADN plasmid
+ Hòa tủa trong nước khử ion hoặc dung dịch TE Sau đó kiểm tra độ tinh sạch bằng điện
di hoặc quang phổ kế
2.2.2 Các kĩ thuật lai axit nucleic
Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, tạm thời có thể chia chúng làm 3 nhóm lớn: Laitrên pha lỏng, lai trên pha rắn, lai tại chỗ
2.2.2.1 Lai trên pha lỏng
Nguyên tắc
Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm
Phân tích định lượng các phân tử lai:
Ba phương pháp thường được sử dụng là:
- Phương pháp dùng quang phổ kế
- Phương pháp sử dụng nuclease S1
- Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
Trang 12Các ứng dụng của phương pháp lai trên pha lỏng
- Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài gần nhau
- Phân tích các trình tự lặp lại
- Ứng dụng trong việc so sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại
2.2.2.2 Lai trên pha rắn
Nguyên tắc
Điểm đặc biệt ở đây là một trong hai trình tự bổ sung thường là trình tự đích (trình tự cầntìm) được cố định trên một giá thể rắn
Các yếu tố kĩ thuật quan trọng trong các phương pháp lai trên pha rắn
Giá thể rắn dùng cố định nucleic acid là các màng lai Có hai loại màng lai: màng laibằng nitrocellulose và màng lai bằng nilon Trong đó màng lai bằng nilon được sử dụng phổ biếnhơn do có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau
Ứng dụng của phương pháp lai trên pha rắn
Trong rất nhiều ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn, nổi bật lên các phươngpháp lai Southern blot, Northern blot, Western blot và dot (slot) blot
a Southern blot
Cơ sở của phương pháp là kĩ thuật chuyển ADN từ gel lên màng lai do Southern mô tả năm1975
* Phương pháp Southern blot gồm các bước sau:
+ ADN bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bởi một hay nhiềuenzym giới hạn, các đoạn này được phân tách dựa vào kich thước khi điện di trên gel agarose
+ ADN được làm biến tính ngay trên gel rồi được chuyển lên một màng lai
+ ADN cố định trên màng được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Sau quá trìnhlai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt
+ Cuối cùng, người ta dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai
* Các ứng dụng quan trọng của Southern blot
+ Lập bản đồ giới hạn của một gen
+ Phát hiện các đa dạng trình tự của cùng một gen
+ Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen
b Northern blot
Là phương pháp lai ARN của tế bào với mẫu dò ADN
Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mARNđặc trưng trong một hỗn hợp ARN
Phương pháp này bao gồm một số bước sau:
Trang 13+ ARN đã được làm biến tính sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di trên gelagarose có chứa chất làm biến tính
+ Sau đó ARN được chuyển lên màng lai
+ ARN cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ
+ Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi
c Western blot:
Lai Western blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứngmiễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể
d Dot và slot blot
+ Phương pháp này cho phép định lượng tương đối một ARN đặc trưng trong một hỗn hợpARN mà không cần phải phân tách chúng ra Phương pháp này có thể sử dụng cho ADN
+ Trong phương pháp này người ta đặt trực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai Quá trìnhlai và phát hiện phân tử lai giống như đề cập ở phần trên Bản phóng xạ tự ghi sau đó được phân tíchbằng kĩ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu
2.2.2.3 Lai tại chỗ (in situ hybridization):
- Lai trên nhiễm sắc thể
- Lai trên tế bào và mô
2.2.3 Các phương pháp giải trình tự gen
2.2.3.1 Phương pháp Maxam và Gilbert
Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằngphương pháp hóa học
- Trước hết các phân tử ADN được đánh dấu bằng 32P ở một đầu
- Sau đó, chúng được chia làm năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa họcchuyên biệt làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và cắt phân tử ADN ngay nucleotide ấy.Năm nhóm nucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C
Kết quả là sự hình thành nên năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một tập hợpđều chấm dứt tại cùng một loại nucleotide
- Cuối cùng năm phân đoạn trên được đem phân tách trên gel polyacrylamide Kết quảđược đọc trên bản phóng xạ tự ghi
2.2.3.2 Phương pháp enzym học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger
- Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzym ADN polymerase mạch bổ sung chotrình tự ADN mạch đơn cần xác định Đặc trưng của phương pháp này là ngoài bốn loạinucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide
Trang 14- Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng Người ta lần lượt cho vàomỗi phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng rất nhỏ Do hàm lượng thấpnên thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp mộtoligonucleotide khi đó lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngừng lại
Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được phân tách trên gel polyacrylamide và kết quảđược đọc trên bản phóng xạ tự ghi
2.2.3.3 Các phương pháp cải biên từ phương pháp của Sanger
Xác định trình tự bằng máy tự động
Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóachất – các fluochrome Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một flouchrome có màukhác nhau Như vậy, tất cả các oligonucleotie cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ
có cùng một màu Sau khi điện di trên gel polyacrylamide, kết quả sẽ được đọc qua một hệ thống
vi tính
Phương pháp PCR dùng trong xác định trình tự axit nucleotide
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp PCR vàphương pháp sử dụng các dideoxynucleotide
Phương pháp chỉ sử dụng được khi vùng cần xác định trình tự đã biết trước, và ứng dụngchủ yếu là nhằm phát hiện nhanh một đột biến điểm
2.2.4 Kĩ thuật PCR
2.2.4.1 Khái niệm về phản ứng PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp)
Vào năm 1985, K Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch đại nhanhnhiều bản sao (amplification) của các đoạn ADN mà không cần sự có mặt của tế bào Kĩ thuậtnày được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR
Thực chất của kĩ thuật PCR là phương pháp tạo dòng (nhân bản) ADN trong phòng thínghiệm
- ADN mẫu (ADN cần khuếch đại): không cần độ tinh sạch cao
- Các mồi (primer): Gồm mồi xuôi và mồi ngược
- Enzym Taq ADN Polymerase chịu nhiệt
- dNTP: các loại nucleotit triphosphate như: dATP, dTTP, dCTP, dGTP
Trang 15- Dung dịch đệm (buffer) thích hợp và MgCl2.
- Nước cất hai lần
2.2.4.4 Chu kỳ của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kì gồm ba bước:
Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturing)
-950C trong vòng 30 giây đến 1 phút
Bước 2: Giai đoạn lai hay gắn mồi (Annealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn.Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C - 700C, tùy thuộc vào Tm của cácmồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 720C Thời gian phụ thuộc độ dài trình tự ADN cần khuếchđại, kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút
Một chu kì bao gồm nhiều bước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làmtăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Thường số lượng chu kì <40
2.2.4.5 Một số kĩ thuật phát triển trên nền kĩ thuật PCR
PCR đảo ngược (inverse PCR)
Được dùng để khuếch đại các đoạn phân tử kế cận với đoạn có trình tự DNA đã biếttrước, phân tử DNA này được cắt hạn chế và nối lại nhờ enzyme DNA ligase để tạo thành mộtvòng tròn có tính chất monomer, sau đó đoạn ADN được khuếch đại nhờ hai primer tương đồngvới đầu của trình tự đã biết trước
Kĩ thuật RT-PCR
Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu ARN theo nguyên lýcủa PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất (phiên mã ngược khuôn mẫu ARN thành sợiADN thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi ADN thứ hai) và giai đoạnthứ hai (dùng ADN sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR)
2.2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR
ADN mẫu
Trang 16- Phản ứng PCR tối ưu khi ADN thật tinh sạch Tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩn đoán bằngPCR vẫn đạt kết quả đối với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu ADNkhông được bảo quản tốt
- Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu
Enzym
- Enzym được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I
- Enzym Taq - polymerase chịu nhiệt được phát hiện và sử dụng
- Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chứcnăng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn
Mồi (primer) và nhiệt độ lai
- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao.+ Không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi (sense) và mồi ngược (antisense) vàcũng không có những cấu trúc “kẹp tóc”
+ Tm của mồi xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau
+ Thành phần nucleotide của các mồi phải cân bằng, tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC + Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng vớicác trình tự lặp lại trên gene
+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn
- Nhiệt độ của phản ứng PCR thay đổi ít nhiều phụ thuộc vào điều kiện cụ thể Nhiệt độ
Tm đã được tính toán cho các loại mẫu ADN khác nhau
Dung dịch đệm (buffer)
- Nồng độ ion Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR
+ Nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5mM) làm giảm phản ứng kéo dài mạch
+ Nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn
- Độ pH của dung dịch đệm.
pH của dung dịch đệm ảnh hưởng rất nhiều đến sản phẩm PCR: pH dung dịch đệm daođộng khoảng 8,3 - 9,0 ở 200C
Hàm lượng các dNTP (Deoxynucleotide triphosphate)
Bốn loại nucleotid (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) thường được sử dụng ở nồng độ là 20 200µM/mỗi nucleotide cho kết quả ổn định trung thực và chuyên tính
-Số chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40
Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
Trang 17Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm “khuếch đại ” riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiêncứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị.
Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùngmột kiểu
2.2.4.7 Ưu điểm - nhược điểm của phản ứng PCR
Ưu điểm của phản ứng PCR
- Tính đặc hiệu của phản ứng PCR cao: Việc nhân bản ADN bằng PCR có tính đặc hiệurất cao, vì việc nhân ADN chỉ được tiến hành sau khi hai mồi bắt cặp với ADN khuôn
- Thời gian thực hiện cực nhanh, chỉ cần mất vài phút
- Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thànhphần tối thiểu và được sử dụng đồng thời
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao:
PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô, ngay cả khi mẫu này đã bị phân hủy mộtphần
Nhược điểm
- Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên: Trừ vàitrường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn ADN lớn hơn 3kb
Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5kb cho kết quả tốt
- Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đạibản sao của phương pháp này Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đạicủa những lần thao tác trước
Có thể khắc phục một vấn đề này bằng một số biện pháp sau:
+ Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tách các sảnphẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau
+ Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác
+ Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước
+ Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toánsao cho đủ với 1, 2 lần thao tác
- Các sai sót gây ra do Taq polymerase: Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai sótkhá cao 10-4
2.2.4.8 Ứng dụng của phản ứng PCR
- Sử dụng PCR trong tách dòng gen, xây dựng các ngân hàng gen, lập các loại bản đồ gen
và giải trình tự gen, bộ gen
- PCR được ứng dụng trong các nghiên cứu chẩn đoán sớm các bệnh
Trang 18- PCR được sử dụng trong tạo đột biến in vitro và trong một số kĩ thuật chuyển gen nhằm
tạo ra các giống vật nuôi cây trồng và vi sinh vật mới
- PCR được sử dụng trong các kĩ thuật xác định tính đa hình
Tính linh động của phân tử trong bản gel dưới tác dụng của một điện trường được tínhtheo công thức:
Log u = Log u 0 - K r C
Trong đó, Log u0: Tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng
Kr: Hằng số làm chậm do cấu trúc gel, khối lượng phân tử axit nucleic
2.2.5.2 Các kĩ thuật điện di chủ yếu
Các kĩ thuật điện di được sử dụng chủ yếu gồm:
-
Điện di trên gel agarrose : Là kĩ thuật điện đi để kiểm tra ADN sử dụng agarose từ 0,3
% - 2,0 % làm bản gel Thường dùng để phân tách những đoạn ADN có kích thước trong khoảng0,5 - 20,0 kb Nếu kích thước đoạn ADN nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng khoảng 1 - 2
%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng hàm lượng agarose khoảng 0,7 - 0,8%
-
Điện di trên gel polyacrylamid : Là kĩ thuật điện đi để kiểm tra ADN hoặc protein, sửdụng bản polyacrylamid với nồng độ khoảng 3,5% - 20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạnADN hoặc trọng lượng phân tử protein Đối với ADN, thường áp dụng cho các đoạn có kíchthước nhỏ tức là dưới 1000 cặp base Đoạn gel có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượngphân tử càng nhỏ thì hàm lượng polyacrylamid sử dụng càng lớn, và ngược lại
Trang 19Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose Do đó, gel này chỉ được
sử dụng cho những mục đích đặc hiệu:
+ Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
+ Xác định trình tự ADN
+ Phân tách các đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 cặp bazơ
- Điện di trên giấy : Là kĩ thuật điện di sử dụng giấy thấm Whatman 3 MM làm cầu nốigiữa hai điện cực của buồng điện di, các đại phân tử tích điện dịch chuyển trên giấy với tốc độkhác nhau tùy theo kích thước và trọng lượng phân tử Trước đây, phương pháp điện di trên giấythường được sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền protein, izoenzyme
- Điện di trên gel tinh bột:
Tinh bột biến tính được sử dụng làm bản gel dùng trong điện di trong các nghiên cứuprotein, enzyme, izoenzyme
Ngoài ra, tùy thuộc thiết kế vị trí các cực của buồng điện di, có thể chia làm hai nhómphương pháp là diện di nằm ngang và điện di đứng Phương pháp điện di nằm ngang có buồngđiện di với các cực trên cùng một mặt phẳng, còn phương pháp điện di đứng với buồng điện di
có cực âm (-) thường ở phía trên, cực dương (+) thường ở phía dưới
2.2.5.3 Các bước thực hiện kĩ thuật điện di
- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
+ Dung dịch đệm thường sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE (Tris Boric acid - EDTA) và TAE (Tris - Acetic acid - EDTA)
-+ Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 1x TBE (1x TAE) hòa tan với hàm lượngagarose (polyacrylamid) với hàm lượng cần thiết, đặt trong lò vi sóng hoặc đun nóng đến khi hòatan hoàn toàn, đổ vào khuôn có các lược cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết
+ Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào buồng điện di và đổ dung dịch đệm ngậpbản gel khoảng 1 - 2 mm
- Bước 2: Nạp mẫu
Mẫu ADN đã tách chiết và xử lí enzyme giới hạn cắt thành các đoạn có kích thước nhỏ,được trộn đều vào đệm nạp mẫu có thêm chất màu tạo thành hỗn hợp có màu xanh, giúp dễ quansát vịt trí di chuyển của các vệt mẫu trong quá trình điện di Để kiểm tra kích thước các đoạnADN, thường chạy đồng thời cùng với mẫu ADN chuẩn (thang ADN)
[Thang ADN: Đó là một tập hợp nhiều trình tự ADN có kích thước đã biết (thang ADN - ADN ladder), thông thường người ta sử dụng thang ADN là thực khuẩn thể lamda được thủy giải bởi enzyme giới hạn Hind III].
- Bước 3: Chạy điện di
Trang 20Nguồn điện trong điện di thường sử dụng điện thế khoảng 100V, cường độ 100mA Thờigian chạy điện di trong khoảng 40 phút đến 1 - 2 giờ tùy theo chiều dài bản gel và mức độ yêucầu tách các phân tử (có thể đựa vào vị trí các vạch màu, khi các vạch màu chạy được khoảng ¾chiều dài bản gel có thể kết thúc điện di).
- Bước 4: Nhuộm bản gel và soi gel
+ Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm ethyldium bromid (EtBr), hoặc các phươngpháp nhuộm khác (nhuộm bạc, nhuộm SYBR green )
+ Bản gel sau khi nhuộm EtBr được đặt vào thiết bị hiện hình có tia UV, để quan sát kếtquả điện di Vị trí các đoạn điện di theo kích thước khác nhau quan sát được những vệt xám màu
da cam trên bản gel, hoặc đặt bản gel vào các thiết bị chụp ảnh chuyên dụng để chụp ảnh ,trường hợp nhuộm bạc hoặc nhuộm SYBR green có thể xác định kết quả bằng mắt thường
Phổ điện di là băng gọn, rõ, chứng tỏ ADN không bị đứt gãy và không lẫn tạp
2.2.6 Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN dựa trên PCR
2.2.6.1 Phương pháp phân tích RAPD (Randomly amplified Polymorphism ADN - đa hình các
đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên)
Phương pháp RAPD được William phát minh vào năm 1990, Welsh và cộng sự hoànthiện 1991
Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD (còn gọi là RAPD - PCR) sử dụng cùng một số cặp mồi ngẫu nhiên nhấtđịnh (thường sử dụng 10 - 40 cặp mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADNđặc trưng của mẫu nghiên cứu
Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau, sản phẩm PCR ở điều kiện như nhau lànhư nhau
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD gồm các bước cơ bản như phản ứng PCR bao gồmcác bước chính sau
- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch ADN hệ gen
- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên
Có thể sử dụng các loại mồi ngẫu nhiên khác nhau để nghiên cứu một loại mẫu, hoặcdùng 1 loại mồi nhưng với các loại mẫu khác nhau để so sánh
- Bước 3: Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tiến hành điện di trên agarose, hoặc gel polyacrylamid, sau đó đượcnhuộm bằng ethidium bromid Soi gel dưới ánh sáng tử ngoại, phát hiện băng ADN Chụp ảnhbăng ADN
Trang 21- Bước 4: Phân tích và đánh giá kết quả.
Dựa vào kết quả băng ADN trên gel để xác định tính đồng dạng di truyền bằng các phầnmềm thông dụng hoặc tính theo các biểu thức khác nhau để lập sơ đồ hình cây biểu hiện mốiquan hệ tương đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu
Có thể tính hệ số tương đồng di truyền được tính theo công thức của Nei M và Li.W.H (1979)
Trong đó: S là hệ số tương đồng di truyền
NAB là số băng ADN có cả ở mẫu A và B
NA là số băng ADN có ở mẫu A
NB là số băng ADN có ở mẫu B
Ưu điểm của kỹ thuật RAPD
Phương pháp này có ưu điểm:
- Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ genecủa đối tượng cần nghiên cứu
- Phát hiện tính đa dạng đáng tin
- Bộ mồi có thể sử dụng cho các loài khác nhau
- Chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao
- Phương pháp tiến hành đơn giản hơn so với RFLP
- Phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen
- Chi phí thực hiện thấp, ít tốn kém
Nhược điểm của kỹ thuật
- Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, kết quả phân tích không ổn định
- Phương pháp rất nhạy cảm với các yếu tố tham gia phản ứng
- Không chắc chắn các đoạn có cùng kích thước từ hai mẫu khác nhau thực sự tạo ra từcùng một vị trí trên hệ gen
Ứng dụng kỹ thuật RAPD
- Đánh giá đa dạng di truyền:
- Nhận diện chỉ thị phân tử
- Xây dựng bản đồ gene
2.2.6.2 Kỹ thuật AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism) - Sự đa hình chiều dài của
các phân đoạn ADN được nhân bản chọn lọc
Trang 22AFLP thực chất là sự khuếch đại các đoạn ADN được cắt bằng enzym hạn chế Bởi vậy
có thể coi AFLP là sự cải tiến phương pháp RFLP nhờ phản ứng PCR hay phương pháp RAPD cảitiến với sự tham gia của các enzym hạn chế và cặp mồi đặc hiệu
Nguyên tắc của AFLP
Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc là sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu đểnhân bản các đoạn ADN đã bị cắt bởi enzym giới hạn
Mồi đặc hiệu gồm có hai phần: Phần bổ sung với adaptor và phần bổ sung với nhữngnucleotide tùy ý (thường 1 - 3 nucleotide)
Quy trình của AFLP
- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch ADN
- Bước 2: Cắt các phân tử ADN bằng các enzym giới hạn
- Bước 3: Nối các đoạn ADN đã cắt với các adaptor
- Bước 4: Sử dụng kỹ thuật PCR nhân các đoạn ADN với các cặp mồi đặc hiệu Các hỗnhợp ADN (đã được gắn adapter ) và primer được đưa vào phản ứng PCR
- Bước 5: Phân tích kết quả sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý kết quả bằng phần mềmthông dụng để đánh giá sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu
Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật AFLP
- Ưu điểm:
Kỹ thuật AFLP có tiềm năng to lớn trong kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền:
+ Kỹ thuật AFLP có thể phân tích với bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến phức tạp
+ Phân tích sự đa dạng di truyền, đánh dấu các gen và ứng dụng để lập bản đồ gen
+ Có thể nhân bản chọn lọc nhiều đoạn giới hạn trong một phản ứng AFLP
- Phát hiện tính đa hình (phân lập giống)
- Xây dựng bản đồ các bản đồ ADN marker có hiệu quả so với các ADN marker khác
- Phát hiện những vùng ADN nhân dòng của genom
- Xác định các đoạn ADN được chuyển trong các vectơ chuyển gen
2.2.6.3 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats): Đa hình trình tự lặp lại đơn giản
Trang 23Hệ gen sinh vật Eucaryote có mặt các trình tự nucleotide lặp lại, có kích thước khác nhauđặc trưng cho loài SSR gồm 2 – 5 nucleotide lặp lại nhiều lần: (TG)n hoặc (AAT) Các đoạnADN lặp lại này được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR
Kỹ thuật SSR đơn giản, không tốn kém, là chỉ thị đồng trội nên được sử dụng để pháthiện cá thể dị hợp tử
Các bước tiến hành:
+ Tách chiết, tinh sạch ADN nghiên cứu
+ Thực hiện PCR với mồi đặc trưng cho các đoạn lặp
+ Điện di sản phẩm PCR, tính toán số liệu, so sánh sự sai khác, giống nhau của băng
+ Xử lí số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng
2.2.6.4 Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site): Điểm trình tự được đánh dấu
Kỹ thuật này do Olson và cộng sự đề xuất năm 1989 STS là một đoạn ADN ngắn gồmkhoảng 60 – 1000 cặp bazo có thể phát hiện bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật STS cho phép xác địnhnhững vị trí cần biết bằng các trình tự ADN biết trước
2.2.7 cADN- ngân hàng cADN (Thư viện cADN)
cADN là các phân tử ADN được tổng hợp từ khuôn mARN qua quá trình sao chép ngược.
cADN được lưu giữ trong các ngân hàng cADN
Thư viện cADN là tập hợp các bản sao cADN từ tất cả các mARN của một tế bào Thưviện cADN mang tính đặc trưng tế bào rất cao
Thư viện cADN được thiết lập chủ yếu nhằm mục đích nghiên cứu sự biểu hiện của mộtgen xác định cùng với những vấn đề liên quan như sự điều hòa biểu hiện gen, mối tương tác giữacác gen trong một quá tình sống,…
Thư viện cADN được hình thành theo những bước sau:
- Việc chọn vectơ tương đối dễ dàng do kích thước của các cADN ít khi lớn hơn 9 kb
- Bên cạnh đó, mARN được tách chiết từ tế bào và được chuyển thành cADN nhờ enzymphiên mã ngược Vectơ tái tổ hợp được hình thành do sự kết hợp giữa plasmid và cADN
- Sau đó, vectơ tái tổ hợp được đưa vào trong tế bào vi khuẩn bằng phương pháp biến nạp Saukhi tế bào vi khuẩn đã nhận các vectơ tái tổ hợp, nuôi chúng trong môi trường lỏng một thời gian ngắntrước khi đem trải chúng trên môi trường đặc Các dòng vi khuẩn sẽ hình thành nên các khuẩn lạc trênmặt thạch
2.2.8 Chọn lọc các gen có ý nghĩa
2.2.8.1 Phương pháp lai ADN (lai Southern): đã học trong lai trên pha rắn.
2.2.8.2 Phương pháp nhận biết qua protein
Trang 24Theo lí thuyết, một gen trong đoạn ADN cần tìm mã hóa cho một protein đặc hiệu, hoạtđộng của gen trong tế bào đó sẽ sản sinh ra một protein đặc trưng
Người ta sử dụng mẫu dò là các protein kháng thể đã đánh dấu phóng xạ để phát hiện raprotein cần tìm Từ đó suy ra dòng nào đã sản sinh ra protein có phản ứng với mẫu dò
+ Gắn gen trên đĩa microarray, có lớp phủ polylysine để gắn chặt gen
+ Tách ARN thông tin ở các mẫu nghiên cứu khác nhau Đánh dấu chất phát màu riêngcho ARN thông tin ở từng loại mẫu (cùng mẫu cùng một loại màu)
+ Trộn chung mARN của hai loại mẫu và cho tiến hành lai trên đĩa
Phát hiện phản ứng phát quang màu trong tối được ghi lại qua hình ảnh Sử dụng chương trìnhmáy tính chuyên dụng để xác định tình trạng biểu hiện gen ở các máy phân tích
- Khả năng ứng dụng: Microarray là một công cụ cực kì hữu hiệu phục vụ lĩnh vực genomhọc, nghiên cứu và xác định chức năng của các gen trong hệ gen, biết tính trạng quan tâm do nhữnggen nào kiểm soát, chức năng của các gen đó
2.2.10 Các phương pháp chuyển nạp gen ở động vật
* Khái niệm kĩ thuật chuyển gen:
Kĩ thuật chuyển gen là kĩ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng ADNtái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và các sinh vật nói chung (vsv, đv,,,,) làm chogen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mớicủa cơ thể chuyển gen
* Các phương pháp chuyển nạp gen ở động vật:
- Phương pháp chuyển nhiễm
Trang 25*) Tài liệu học tập
1 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, NXB Nông
nghiệp
2 Nguyễn Như Hiền (2006), Công nghệ sinh học, tập 1, NXB Giáo dục Hà Nội.
3 Nguyễn Mộng Hùng (2004), Công nghệ phôi và tế bào động vật , NXB Đại học Quốc gia
4 Nguyễn Mộng Hùng (2002), Tế bào gốc, Tạp chí những vấn đề sinh học ngày nay.
5 Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế.
6 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải thiện giống, NXB Nông
*) Câu hỏi ôn tập chương 2
1 Khái niệm ADN tái tổ hợp?
2 Các enzym chủ yếu sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp?
3 Các vectơ nhân dòng sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp?
4 Nhân dòng gen? Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng?
5 Phương pháp chiết tách ADN genome và ADN plasmid?
6 Các kỹ thuật lai axit nucleic? Nguyên tắc? Ứng dụng?
7 Các phương pháp giải trình tự gen?
8 Kỹ thuật PCR: Khái niệm, nguyên tắc, thành phần, chu kì, các yếu tố ảnh hưởng, ưu - nhược điểm?
9 Cho biết nguyên lí và các bước thực hiện kỹ thuật điện di?
10 Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN dựa trên PCR: Phương pháp phân tích RAPD ? Phương pháp phântích AFLP? Kỹ thuật SSR?
11 cADN- ngân hàng cADN ?
12 Chọn lọc các gen có ý nghĩa?
13 Kỹ thuật Microarray? Phương pháp tiến hành? Khả năng ứng dụng?
14 Trình bày các phương pháp chuyển gen ở động vật?
Trang 26CHƯƠNG 3 Công nghệ sinh học trong chăn nuôi và thú y
Số tiết: 10 (Lý thuyết: 08 tiết; thảo luận: 02 tiết )
* ) Mục tiêu:
- Kiến thức:
+ Trình bày được kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
+ Nêu được khái niệm tế bào gốc
+ Trình bày được kỹ thuật cấy chuyển phôi, kỹ thuật nhân bản (cloning) động vật
+ Trình bày được kỹ thuật chuyển gen vào động vật
+ Giải thích được sự khác biệt giữa vacxin tái tổ hợp và vacxin thông thường
- Kỹ năng:
Thiết lập được các bước của kỹ thuật cấy chuyển phôi, kỹ thuật nhân bản động vật
- Thái độ:
Thái độ học tập, nghiên cứu khoa học nghiêm túc, tư duy duy vật biện chứng
3.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
- Năm 1907, nuôi cấy tế bào động vật in vitro lần đầu tiên được chứng minh có khả năngthực hiện Đến năm 1949, J.F Enders nuôi mô động vật thành công
- Đầu thập niên 1950, tế bào động vật có vú được nuôi với số lượng lớn để nuôi nhiềuvirus bại liệt dùng chế vaccine chống bệnh bại liệt
Việc phát triển ở quy mô lớn công nghệ nuôi cấy tế bào động vật nhằm các mục đích sau:
+ Sản xuất các virus động vật dùng làm vacxin+ Sản xuất các protein, hormone trị liệu,+ Sản xuất các kháng thể đơn dòng+ Sản xuất tế bào gốc
Các bước cơ bản của nuôi cấy tế bào động vật gồm:
+ Đưa các tế bào vào nuôi cấy+ Các dòng tế bào liên tục+ Môi trường dinh dưỡng và cách pha chế3.1.1 Đưa các tế bào vào nuôi cấy
Khởi đầu từ một mảnh mô được tách ra trong các điều kiện vô trùng rồi đem xử lí vớienzyme protease, thường là trypsin, để cắt mô tách các tế bào rời nhau ra
Trang 27Sau khi loại bỏ Trypsin, huyền phù tế bào được chuyển vào bình nuôi cấy chuyên dụngđáy phẳng bằng thủy tinh hay plastic có chứa môi trường dinh dưỡng lỏng thích hợp cho sự pháttriển của tế bào.
Các tế bào sau khi trải qua pha lag (giai đoạn tiềm sinh), sẽ bám vào đáy bình chứa và bắtđầu nguyên phân
Dòng tế bào nuôi bắt nguồn trực tiếp từ mô đã biệt hóa được gọi là dòng nuôi sơ cấp(primary culture)
Các tế bào phân chia đã nhanh chóng tạo thành một lớp tế bào lấp kín khít đáy bình nênđược gọi là lớp đơn (monolayer)
Các tế bào dòng nuôi cấy sơ cấp có thể tách khỏi bình bằng xử lí với Trysin hay EDTA(tác nhân kiềm) Chúng có thể được dùng để tạo dòng nuôi thứ cấp (secondary cultures) bằngcách đưa chúng vào môi trường dinh dưỡng mới với nồng độ cao Các tế bào của dòng sơ cấp cóthể chuyển qua hàng loạt cấy chuyền
Các tế bào sinh sản với tốc độ ổn định qua nhiều lần chuyền kết quả thu được từng nhóm
tế bào và chúng đưực coi là một chủng tế bào (cell strain) Các dòng tế bào không phải tồn tại
vô hạn mà chúng phân chia chỉ một số lần nhất định trước khi tốc độ tăng trưởng của chúng giảm
và chết Ví dụ, các tế bào người nói chung chỉ chia 50-100 lần trước khi chết
3.1.2 Các dòng tế bào liên tục
Không phải tất cả các tế bào nuôi cấy sơ cấp và thế hệ kế tiếp đều chết Phần lớn các tếbào chuột sẽ chết sau khi phân chia 30-50 lần, nhưng một số ít tế bào đã biến đổi dẫn đến có hìnhthái khác, tăng trưởng nhanh hơn và có khả năng bắt đầu dòng nuôi từ một số lượng ít tế bào.Thế hệ bắt nguồn từ những tế bào ngoại lệ đó có sự tồn tại vô hạn, khác với chủng tế bào mà từ
đó chúng bắt nguồn, chúng được gọi là các dòng tế bào (cell lines)
Trong quá trình cấy chuyển liên tục, các dòng tế bào có thể trải qua những biến đổi sâusắc về đặc tính của chúng Ví dụ: Sau mỗi đợt phân chia có thể có sự tăng các cụm tế bào thaycho dạng lớp đơn và các cụm tế bào này sắp xếp không theo quy luật Các dòng tế bào này đượcgọi là các tế bào biến dạng hoặc gọi chung là các tế bào ung thư (neoplastic) Chúng sẽ gây raung thư nếu được chuyển vào các động vật có liên quan Các tế bào ung thư thường ở dạng đabội lệch (aneuploid) và còn có các biến đổi kiểu gen khác
Các dòng tế bào biến dạng cũng có thể thu được bằng cách nhiễm các virus gây ung thưhoặc xử lí các chất hóa học gây ung thư cho các tế bào nuôi cấy sơ cấp hoặc cho các chủng tếbào
Trang 28Chính vì vậy, để ngăn cản sự biến đổi của các dòng tế bào khi nuôi cấy liên tục, người taphải bảo quản nguồn tế bào khởi nguyên ở trạng thái đông lạnh Các tế bào được trộn với chấtphụ gia như glyxerol, dimetylsulphoxit để ngăn cản sự gây hại của các tinh thể băng Sau đóchúng được đưa vào các ống tiêm và bảo quản trong nitơ lỏng.
3.1.3 Môi trường dinh dưỡng và cách pha chế
Một trong những yếu tố quyết định sự thành công của nuôi cấy tế bào động vật in vitro làthành phần thích hợp của môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy phải chọn môi trường dinhdưỡng tốt nhất cho sự tăng trưởng và sinh sản của tế bào khi tách mô khỏi cơ thể
a Môi trường tự nhiên: Do sự phức tạp của môi trường dinh dưỡng khi nuôi câý tê bào
động vật nên có thể dùng ngay các môi trường tự nhiên như cục máu đông, dịch huyết tương,nước ối bào thai, dịch chiết phôi…
b Môi trường nuôi tổng hợp:
Một thành phần không thể thiếu được cho tất cả các loại môi trường tổng hợp là huyếttương của máu, chiếm khoảng 5-10%., Tất cả các môi trường tổng hợp đều phải có thêm thànhphần căn bản là dung dịch sinh lí hay dung dịch muối cân bằng gồm hỗn hợp các muối vô cơ, màchức năng của nó là duy trì pH, áp suất thẩm thấu và cung cấp chất vô cơ
c Các thành phần căn bản của môi trường:
Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật rất phức tạp nên môi trường chứa nhiều thànhphần khác nhau Ví dụ, muối gồm: NaCl, CaCl2, MgS04, NaHC03, đường, phenol đỏ Ngoài cácchất trong huyết tương, cần bổ sung các loại amino acid (khoảng 20 loại) và 7 loại vitamin Môitrường dinh dưỡng phải thỏa mãn các điều kiện:
+ Có đủ những ion vô cơ căn bản (Na, Ca,K…)
+ Áp suất thẩm thấu phải chính xác+ pH phải chính xác (thường được giữ ở 7-7,3)+ Nguồn năng lượng lấy từ glucose
+ Có phenol để dễ theo dõi pH
Giữ pH ổn định rất khó nên cần dùng dung dịch đệm, ngoài ra còn thêm soda Việc duytrì lượng CO2 (5%) ở một áp suất hợp lí là yếu tố không thể thiếu được Nếu môi trường cànggiàu dinh dưỡng thì càng dễ nhiễm VSV khác nên trong môi trường nuôi phải thêm các chấtkháng vi khuẩn và nấm (penicillin diệt khuẩn, nystatin diệt nấm…)
3.1.4 Các cách nuôi cấy:
Nuôi cấy quy mô nhỏ
Nuôi cấy quy mô lớn
3.1.5 Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào động vật:
Trang 29- Để đánh giá độ độc in vitro (in vitro toxicity testing)
- Sản xuất các vacxin virus
- Sản xuất các protein như interferon, kháng thể và các hormone dùng trị liệu Chúng làsản phẩm vốn có của tế bào sống, nên nuôi nhiều tế bào và tạo điều kiện thích hợp để chúngđược tiết ra với số lượng lớn rồi chiết tách thu nhận sản phẩm Các protein trị liệu này tuy giáthành cao, nhưng hiệu quả trị liệu rất tốt vì chúng được tạo ra gần điều kiện tự nhiên của tế bào
Do vậy loại sản xuất này hiện vẫn được duy trì
- Nuôi tế bào gốc dùng trong liệu pháp tế bào nhằm đưa tế bào bình thường thay thế tếbào bệnh
- Các hocmone như hormone tăng trưởng của người
3.2 Sản xuất tế bào gốc (stem cells)
3.2.1 Tính toàn năng của tế bào động vật
Trước đây, người ta mới chỉ chứng minh được tính toàn năng của tế bào hợp tử và các tếbào phôi ở giai đoạn sớm của động vật Đến năm 1997, với công trình tạo được cừu Dolly từnhân của tế bào tuyến vú một cừu cái trưởng thành, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào đãchuyên hóa của động vật đã được khẳng định
3.2.2 Định nghĩa tế bào gốc (stem cells)
Tế bào gốc là các tế bào có khả năng phân chia liên tục trong nuôi cấy và phát triển thành các tếbào chuyên hóa
3.2.3 Khả năng ứng dụng của tế bào gốc
a Trong nghiên cứu cơ bản
Các tế bào đa tiềm năng được sử dụng trong các nghiên cứu nhằm tìm hiểu các tác nhântham gia vào quá trình xác định hướng biệt hóa tế bào
b Đối tượng để thử nghiệm về an toàn được phẩm
Các tế bào đa tiềm năng còn là đối tượng quan trọng để thử nghiệm về an toàn dượcphẩm in vitro và in vivo
c Tế bào trị liệu:
- Chữa trị các bệnh thuộc hệ thần kinh do sự thoái biến các tế bào thần kinh Ví dụ bệnhParkinson, trong đó các tế bào tiết dopamine bị chết; bệnh Alzheimer, trong đó các tế bào sảnxuất các chất dẫn truyền thần kinh bị chết; bệnh teo cơ do các tế bào thần kinh vận động bịchết…
- Tái tạo da sau chữa trị bỏng
- Tái tạo mô cơ- xương qua thủ thuật ghép các tế bào gốc phôi trung bì hay các bệnhxương, sụn Trong chấn thương chỉnh hình