Và, với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, góp phần quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất, tro
Trang 1LỜI NÓI ĐẦU
Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học – công nghệ, con người ngày càng tiếp cận gần hơn, hiểu biết nhiều hơn đến thế giới sinh vật nói chung và hệ vi sinh vật nói riêng Và, với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, góp phần quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất, trong y học, trong xử lý môi trường, Và một trong những sản phẩm quan trọng đó là exopolysaccharides.
Trang 2A TỔNG QUAN EXOPOLYSACCHARIDES ( EPS ) & MÀNG SINH HỌC EXOPOLYSACCHARIDES
I ĐỊNH NGHĨA
Exopolysaccharides là polyme có trọng lượng phân tử cao bao gồm dư lượng
đường, được tiết ra bởi một loại vi sinh vật vào môi trường xung quanh Vi sinh vật tổng hợp nhiều loại các polysaccharides đa chức năng bao gồm polysaccharides trong tế bào, các polysaccharides cấu trúc và polysaccharides ngoại bào hoặc
exopolysaccharides (EPS) Exopolysaccharides thường bao gồm các monosacarit và một số nhóm thể không carbohydrate (như acetate, pyruvate, succinate, và
phosphate)
Do sự đa dạng, phong phú trong thành phần, exopolysaccharides đã được ứng dụng phong phú trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm EPS của
vi sinh vật cung cấp đặc tính gần giống như chất gôm hiện đang sử dụng Với
phương pháp tiếp cận sáng tạo, những nỗ lực đang được tiến hành để thay thế các thiết bị truyền thống và phần lớn gôm bởi hệ vi sinh vật của mình Hơn nữa, một tiến bộ đáng kể đã được thực hiện trong việc phát hiện và phát triển các EPS vi sinh vật mới có ý nghĩa trong công nghiệp.
II CHỨC NĂNG
Những lợi ích cảm quan của exopolysaccharides từ vi khuẩn axit lactic cũng được thành lập và có bằng chứng cho các thuộc tính về sức khỏe do exopolysaccharides
từ vi khuẩn axit lactic.
Exopolysaccharides Capsular có thể bảo vệ vi khuẩn gây bệnh và góp phần vào khả năng lây bệnh nhân tạo của chúng Phần đính kèm của vi khuẩn cố định nitơ ở rễ cây và các phần tử trong đất, có ý nghĩa quan trọng đối với vùng xung quanh trong đất của vùng rễ và lây nhiễm của thực vật, có thể được trung gian bởi
exopolysaccharides Một ví dụ cho việc sử dụng công nghiệp của exopolysaccharides
là ứng dụng dextran trong bánh mì panettone và các ngành công nghiệp bánh Exopolysaccharides cũng có một vai trò quan trọng trong các bệnh nhiễm trùng nội nha.
III DANH SÁCH CÁC EXOPOLYSACCHARIDES
• acetan (Acetobacter xylinum)
• alginate (Azotobacter vinelandii)
• cellulose (Acetobacter xylinum)
• chitosan (Mucorales spp.)
Trang 3• curdlan (Alcaligenes faecalis var myxogenes)
• cyclosophorans (Agrobacterium spp., Rhizobium spp and Xanthomonas spp.)
• dextran (Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc
dextranicum and Lactobacillus hilgardii)
• emulsan (Acinetobacter calcoaceticus)
• galactoglucopolysaccharides (Achromobacter spp., Agrobacterium
radiobacter, Pseudomonas marginalis, Rhizobium spp and Zooglea' spp.)
• gellan (Aureomonas elodea and Sphingomonas paucimobilis)
• glucuronan (Sinorhizobium meliloti)
• N-acetyl-glucosamine (Staphylococcus epidermidis)
• N-acetyl-heparosan (Escherichia coli)
• hyaluronic acid (Streptococcus equi)
• indican (Beijerinckia indica)
• kefiran (Lactobacillus hilgardii)
• lentinan (Lentinus elodes)
• levan (Alcaligenes viscosus, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis)
• pullulan (Aureobasidium pullulans)
• scleroglucan (Sclerotium rolfsii, Sclerotium delfinii and Sclerotium
glucanicum)
• schizophyllan (Schizophylum commune)
• stewartan (Pantoea stewartii subsp stewartii)
• succinoglycan (Alcaligenes faecalis var myxogenes, Sinorhizobium meliloti )
• xanthan (Xanthomonas campestris)
• welan (Alcaligenes spp.)
Succinoglycan từ Sinorhizobium meliloti
Trang 4IV MÀNG SINH HỌC EXOPOLYSACCHARIDES
Nhiều nhận định về vi khuẩn được dựa trên những nghiên cứu trong phòng thí
nghiệm nơi vi khuẩn tồn tại, lơ lửng trong môi trường giàu dinh dưỡng Thế nhưng,
vi khuẩn trong thế giới tự nhiên thì “ứng xử” khác với vi khuẩn trong phòng thí
nghiệm Là vì, thiên nhiên, nơi kẻ thù thì nhiều mà thức ăn lại không bao nhiêu, là môi trường khắc nghiệt hơn nhiều so với phòng thí nghiệm Để tồn tại, vi khuẩn phải học cách bám lên bề mặt, liên kết chặt chẽ với các loài khác để cộng sinh và tự bảo vệ mình Cái thế giới thu nhỏ - gắn kết lại với nhau bằng một thứ "chất nhầy"
polysaccharides do vi khuẩn sản sinh ra , thành một thứ gọi là "Màng Sinh học"
Màng sinh học là cấu trúc thường gặp trong thế giới tự nhiên Người yêu thủy sinh vốn không lạ gì với cặn máy lọc hoặc váng trên mặt nước; đó (cặn hoặc váng trên mặt nước) là những ví dụ điển hình của màng sinh học Những trường hợp màng sinh học được nghiên cứu nhiều nhất, là:
1 cao răng;
2 bệnh nhân bị xơ nang vì viêm phổi mãn tính;
3 ống nước và thân tàu bị ăn mòn;
4 sự nhiễm bẩn ở các thứ như kính áp tròng, tim nhân tạo và các thiết bị cấy ghép y khoa
Lý do khiến vi khuẩn gắn vào và tạo nên màng sinh học lên bề mặt là vì bề mặt là nơi chất dinh dưỡng tích tụ lại Chính do mọi bề mặt đều có điện tích âm, điện tích
âm thì sẽ hút ion dương và cacbon hữu cơ hoà tan.
Rồi các hợp chất mang điện tích dương tích tụ lại bên nhau lại sẽ thu hút các hợp chất mang điện tích âm.
Vì thế, ngay cả trong môi trường nước nghèo chất dinh dưỡng, thường cũng có vừa đủ chất hữu cơ bám vào bề mặt để giúp vi khuẩn phát triển Khi các hợp chất hữu
cơ tụ lại trên mặt nước, chúng sẽ thu hút các vi khuẩn, tảo và động vật nguyên sinh thích ăn chúng đến, theo thời gian sẽ phát triển thành một màng sinh học, được gọi là neuston (sinh vật sống trong màng mặt nước/váng bề mặt).
Vi khuẩn bám vào bề mặt theo nhiều cách khác nhau Vài loài vi khuẩn tự bản thân
đã có tính kết dính: cơ bản chúng là “cục keo” bao phủ bởi các màng dính
lipopolysaccharide hoặc bởi các phần phụ gốc prôtêin Các vi khuẩn khác chỉ tổng hợp chất kết dính cần thiết khi xuất hiện bề mặt cho chúng bám vào Chẳng hạn như, trong vòng 15 phút khi vi khuẩn gây viêm đường hô hấp Psuedomonas
aeruginosa gặp một mặt kính, nó sẽ kích hoạt ngay một gen cần để tổng hợp
Trang 5polysaccharide Khi vi khuẩn đã gắn vào bề mặt, chúng chia ra và liên tục sản xuất thật nhiều polysaccharides để tạo nên màng sinh học hoàn chỉnh.
Một Màng Sinh học hòan chỉnh có thể dầy từ 600-900 µm, tức là dầy gấp mấy trăm lần một con vi khuẩn đơn lẻ.(một con vi khuẩn dài khoảng 1µm).
Màng sinh học không phải là một chất vô định hình, hay một khối đặc sệt các
polysaccharides và vi khuẩn; nó có tổ chức và cấu trúc Thậm chí là khu vực dầy nhất của màng sinh học cũng cho luồng nước chảy qua Nước chảy qua các cấu trúc hình nấm của những khối cầu vi khuẩn, qua đó, cung cấp dinh dưỡng cho chúng và đem chất thải đi
Rõ ràng, cấu trúc bên trong của màng sinh học không được cấu thành theo cách ngẫu nhiên Các nhà nghiên cứu cho biết có sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các vi khuẩn để đảm bảo màng sinh học được hình thành một cách chính xác (Các vi khuẩn đột biến không thể truyền thông với nhau để tạo nên các màng sinh học bất thường.) Các màng sinh học không luôn luôn giống y chang nhau, theo kiểu gồm nhiều lớp vi khuẩn hiếu khí bên trên và nhiều lớp vi khuẩn kỵ khí phía dưới Do các luồng nước chảy qua khuấy động nên các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí song song tồn tại trong các hốc nhỏ ở khắp trong màng sinh học Vì thế, các nhà nghiên cứu thiệt ngạc nhiên khi thấy quá trình khử nito xảy ra trong một bộ lọc xục khí vốn dùng để
xử lý nước thải Họ thấy lượng vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn tạo nitơ (nitrat hóa), vi khuẩn khử nitơ, và vi khuẩn kỵ khí, cả ở đáy và trên cùng, bằng y như nhau Và làm thêm những thí nghiệm khác, họ thấy có các hoạt động trao đổi chất qua lại giữa các vi khuẩn tạo nito (hiếu khí) và vi khuẩn khử nito (ky ̣khí) y như nhau ở cả tầng đáy cũng như tầng trên cùng.
Có thể vi khuẩn tạo nito và các vi khuẩn khác đã lập được một mối quan hệ tương hỗ hai bên cùng có lợi và chặt chẽ trong các màng sinh học của các bộ lọc sinh học Vì các vi sinh hiếu khí bình thường phóng thích NH3 trong quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ, các vi khuẩn tạo nito có thể dùng NH3 (cố định đạm) làm nguồn năng lượng cho mình Rồi đến lượt các vi khuẩn khử nito chuyên tiêu thụ acid, nên, có thể đã bảo vệ cho các vi khuẩn tạo nito - vốn đặc biệt nhạy cảm với tính acid.
Vi khuẩn trong màng sinh học có nhiều thuận lợi hơn là những vi khuẩn lơ lửng tự
do trong nước Trước hết, chúng chia sẻ thông tin di truyền và trao đổi chất cho nhau
Ví dụ như, trong màng sinh học ở cao răng, vi khuẩn Veillonella sử dụng lactate do vi khuẩn Streptococcus sinh ra Thứ nhì, vi khuẩn trong màng sinh học được bảo vệ khỏi
kẻ thù và các hoá chất độc hại.
Trang 6Trong thế giới dưới nước, màng sinh học bảo vệ vi khuẩn khỏi bị các động vật nguyên sinh, các loại tảo độc hại (dinoflagellates - tảo roi) và khuẩn độc
(Myxobacteria - niêm khuẩn) làm hại.
Về bệnh của người, màng sinh học giúp vi khuẩn không bị thuốc kháng sinh, hóa chất, kháng thể, tế bào miễn dịch, làm hại.
Vì thế, các tế bào lơ lửng của trực khuẩn mủ xanh - Pseudomonas aeruginosa sẽ bị tiêu diệt bởi 0,050 mg/ml tobramycin - kháng sinh dùng trong thuốc nhỏ mắt trong khi nhiều hơn thế 20 lần thuốc này (0.1 mg/ml) mà vẫn không diệt được trực khuẩn mủ xanh khi nó là hoá chất ức chế nito - nitrapyrin, sự tăng trưởng của vi khuẩn trong trường hợp cấy màng sinh học không bị ảnh hưởng gì cả, còn sự tăng trưởng của vi khuẩn sống trong môi trường cấy lơ lửng bị giảm 82 %
Các nhà nghiên cứu đã dùng kết quả thí nghiệm của họ để giải thích tại sao chất ức chế nito (nitrapyrin) không ngăn chặn được quá trình sinh ra nito ngoài thực tế cho nông dân, như đã tiên liệu theo nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Vì thế, tuy chất ức chế ni-tơ (nitrapyrin) là chất ức chế hiệu quả đối với N.europaea sống lơ lửng trong môi trường giàu dinh dưỡng trong phòng thí nghiệm, nhưng lại không có hiệu lực trong những điều kiện khi vi khuẩn có thể bám vào các hạt đất và trú ngụ bên trong màng bảo vệ sinh học.
Một vài ứng dụng của màng sinh học là dùng để Lọc sinh học và làm màng trị bỏng
Lọc sinh học sử dụng vi sinh vật để phân hủy những hợp chất hữu cơ ( hoặc biến đổi những hợp chất vô cơ) thành cacbonic, nước và muối Khi hệ thống lọc sinh học được lắp đặt, vi sinh vật đã có sẵn trong nguyên liệu mà ở đó nó được sử dụng như một lớp lọc Trong các phòng thí nghiệm, với mục đích tăng cường tốc độ phân hủy,
vi sinh vật được cân nhắc đến đầu tiên là hiệu quả của chúng trong việc phân hủy của nguyên liệu được nghiên cứu.
Nguyên liệu lọc thường là than bùn, đất, phân compốt hay cây thạch nam, tuy nhiên bột cacbon đã được hoạt hóa và polysterene cũng có thể được sử dụng Sự lựa chọn nguyên liệu lọc là vô cùng quan trọng bởi vì nó phải cung cấp cho vi sinh
Trang 7vật dinh dưỡng, sự phát triển về mặt sinh học, và có dung tích hấp thụ tốt.
Quá trình sinh học là một sự ô xi hóa nhờ vi sinh vật, và có thể được viết như sau: Hợp chất gây ô nhiễm + Oxi -> CO2+ H2O + nhiệt + sinh khối
Vi sinh vật sống trong lớp màng sinh học ẩm , mỏng, nơi được bao bọc xung quanh các phần tử của nguyên liệu lọc Khí bẩn được khuyếch tán trong hệ thống lọc và được hấp thụ bên trên màng sinh học Thực tế đây là vị trí mà quá trình ô xi hóa được thực hiện Các chất bẩn không được luân chuyển cố định đến nguyên liệu lọc
Màng trị bỏng:
Người ta dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương Qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu
Chế phẩm này của nhóm nghiên cứu có khả năng thấm nước cao, khả năng kết dính chặt chẽ và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời.
Màng có khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ra các nhiễm trùng vết thương
hở da như vết bỏng, hay các vết thương mất Chỉ cần áp sát màng vào vết thương
và không cần sử dụng bất cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời, làm vết thương mau lành do thúc đẩy quá trình tái tạo mô hạt.
B TỐI ƯU HÓA SẢN XUẤT EXOPOLYSACCHARIDE BẰNG Lactobacillus
delbrueckii subsp bulgaricus RR TRONG MÔI TRƯỜNG BÁN TỔNG HỢP -
Stacy A Kimmel, Robert F Roberts, Gregory R Ziegler.
(Bộ phận Khoa học – Thực Phẩm, Đại Học Tiểu Bang Pennsylvania, University Park, Pennsylvania 16802.)
Nhiệt độ lên men tối ưu, pH, và nồng độ nito cho quá trình sản xuất exopolysaccharide bởi Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus RR trong một môi trường bán tổng hợp đã được xác định bằng cách sử dụng phương pháp phản ứng trên bề mặt Việc thiết kế bao gồm 20 thí nghiệm, 15 kết hợp độc đáo, và 5 ứng dụng Tất cả các quá trình lên men đã được thực hiện trong nồi lên men 2,5l thể tích làm việc và kết thúc khi 90% glucose trong môi trường đã được sử dụng Quần thể L delbrueckii subsp bulgaricus RR và hàm lượng exopolysaccharide được xác định vào cuối mỗi quá trình lên men Nhiệt độ tối ưu, pH, và nồng độ nito trong sản xuất exopolysaccharide là 38 ° C, pH = 5, và 30 g / lít, với sản lượng dự đoán là 295
mg exopolysaccharide/lit Năng suất thực tế theo những điều kiện này là 354 mg exopolysaccharide / lít, trong khoảng tin cậy 95% (217-374 mg của exopolysaccharide / lít) Một thí nghiệm bổ sung thực hiện theo điều kiện tối ưu cho thấy sản xuất exopolysaccharide thu được sự tăng trưởng kết hợp, với sản xuất tại
Trang 8điểm cuối thích hợp thu 101.4 mg / g tế bào khô Cuối cùng, để có được vật liệu cho các đặc tính hơn nữa, một quá trình lên men 100 lít đã được tiến hành trong điều kiện tối ưu 29g exopolysaccharide được phân lập từ ly tâm, lọc nước lên men và kết tủa bởi ethanol.
Sự quan tâm về vi khuẩn axit lactic sản xuất exopolysaccharide (EPS) đã tăng lên gần đây bởi vì đây là những loại sinh vật thực phẩm sản xuất polymer quan trọng trong việc xác định các đặc tính lưu biến của các sản phẩm từ bơ sữa và có thể ứng dụng vào thực phẩm không chứa bơ sữa Khi thêm vào sản phẩm thực phẩm, polysaccharides mang chức năng như chất làm đặc, ổn định, chất chuyển thể sữa, tác nhân làm đông , và tác nhân giữ nước Để đánh giá các thuộc tính chức năng
mà EPSs mang đến lợi ích trong thực phẩm yêu cầu có sẵn nguồn nguyên liệu với đầy đủ số lượng Điều này thường đòi hỏi việc thử nghiệm từ lên men quy mô thí điểm đến quy mô công nghiệp một khi điều kiện tối ưu đã được xác định.
Sự tối ưu hóa môi trường tăng trưởng là điều quan trọng để thu được EPS tối đa sản xuất bởi các sinh vật như Xanthomonas, Pseudomonas, và Rhizobium spp.Những kết quả đã được công bố để tối ưu hóa sản xuất EPS bởi vi khuẩn axit lactic bao gồm các nghiên cứu đánh giá tác động của điều kiện môi trường như nhiệt độ và độ pH Một số các nghiên cứu kiểm tra tác động của nhiệt độ bằng cách
sử dụng các chủng Lactobacillus delbrueckii subsp sản xuất EPS Garcia-Garibay và Marshall nhận thấy rằng sự sản xuất polymer tương ứng (tương đương 1 1 mg dextran / 1 đơn vị khuẩn lạc ) của chủng NCFB 2772 phát triển ở sữa gầy ở nhiệt
độ (48 o C) cao hơn so với ở nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng (37-42 ° C) Sự sản xuất polymer tương ứng cao hơn (1 mg/1 gram các tế bào [trọng lượng khô]) ở nhiệt độ cao hơn (45 ° C) cũng được tìm thấy bởi Grobben et al, ngưởi đã kiểm tra
sự sản xuất EPS bởi cùng một chủng trong môi trường xác định Mozzi et al đã nhận thấy một mối tương quan giữa nhiệt độ tăng trưởng tối ưu (37 đến 42 ° C) và sản xuất polymer từ chủng CRL 870 Ngược lại, Schellhaass báo cáo sản lượng polymer cao hơn bởi chủng RR ở nhiệt độ dưới mức nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng.
Van den Berg et al đã tiến hành một nghiên cứu đánh giá tác động của nhiệt độ và
độ pH trong sản xuất EPS từ chụng L shake 0-1 Họ nhận thấy, bằng cách sử dụng phép theo dõi một biến tại một thời gian (OVAT), sản xuất EPS tối đa xảy ra ở 20 °
C và pH 5,8 Một nghiên cứu khác của Mozzi et al nhận thấy rằng sự tổng hợp polymer tối đa (488 mg / lít) từ chủng L casei CRL 87 xảy ra ở 30 ° pH 6,0 Tuy nhiên, điều kiện sản xuất tối ưu nhất (EPS được sản xuất mỗi gram theo trọng lượng khô của tế bào) và năng suất EPS (gam EPS x 100/grams của đường tiêu thụ) đã được tìm thấy ở pH 4.0.
Trang 9Đối với một số vi khuẩn sản xuất EPS , chẳng hạn như Xanthomonas, Pseudomonas, và Rhizobium spp, trong những điều kiện nguồn nitơ hạn chế kết quả sản xuất EPS sẽ tăng lên Tác động của nồng độ nitơ ảnh hưởng đến sản xuất EPS bởi các chủng lactobacilli không được kiểm tra.
L delbrueckii subsp.bulgaricus RR là một chủng sản xuất EPS phổ biến Hiệu quả của việc sử dụng L delbrueckii subsp Bulgaricus RR trong quá trình khởi đầu nuôi cấy trên các đặc tính lưu biến của thạch sữa (sữa chua) được kiểm tra dưới nhiều điều kiện khác nhau Ngoài ra, thành phần monosaccharide và sự lặp đi lặp lại cấu trúc của EPS được sản xuất bởi L Delbrueckii subsp bulgaricus RR đã được xác định Tuy nhiên, đặc tính tương tác giữa các protein sữa và EPS được sản xuất bởi
L delbrueckii subsp bulgaricus RR, cũng như đánh giá ảnh hưởng chức năng của EPS đến hệ thống thực phẩm không lên men, đã bị cản trở bởi vì không có đủ số lượng các polymer có chức năng.
Mục tiêu của công việc hiện tại là xác định điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, và nồng
độ nito cho sản xuất EPS bởi chủng subsp L delbrueckii bulgaricus RR trong môi trường bán xác định bằng cách sử dụng thiết kế bề mặt phản ứng thử nghiệm và
sử dụng các điều kiện này để sản xuất EPS mang nhiều đặc tính hơn nữa.
I VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
1 Chủng vi khuẩn và quá trình nuôi cấy
L delbrueckii subsp bulgaricus RR ban đầu thu được từ phòng thí nghiệm của H.A Morris (Đại học Minnesota, St Paul) và duy trì trong môi trường MRS (Difco) Nguyên liệu của quá trình nuôi cấy được chuẩn bị bằng cách trộn với môi trường nuôi cấy thuần khiết từ 12 đến 16h ở 42 ° C trong canh trường MRS, kết hợp với 10% glycerol và được bảo quản ở -75 o C Môi trường nuôi cấy chính thức đã được chuẩn bị bằng cách chuyển 0,5 ml môi trường nuôi cấy được đông lạnh ở trên với
10 ml canh trường MRS và ủ nó từ 12 đến 18 h ở 40 ° C Môi trường làm việc của chủng RR đã được chuyển giao (1% [vol / vol) lên 20 ml canh trường MRS và ủ từ
12 đến 18 h 40 ° C Dung dịch tiền nuôi cấy này đã được ly tâm ở 8000 × g và 4 ° C trong 10 phút và rửa sạch hai lần với 20 ml nước cất vô trùng Dịch treo tế bào (trong nước cất vô trùng) được sử dụng để cấy khối lượng lớn (2,0 lít) của môi trường bán tổng hợp (semidefined medium - SDM).
2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường bán tổng hợp ( SDM ) sử dụng như môi trường cơ sở cho các thí nghiệm EPS có các thành phần sau đây (g/l): dextrose, 20, 80 Tween, 1, ammonium citrate, 2, sodium acetate, 5; MgSO4 • 7H2O, 0.1, MnSO4, 0.05; K2HPO4, 2, nấm men
Trang 10nitơ cơ sở mà không amoni và axit amino (Difco), 5; Bacto.-casitone (Difco), 10 Độ
pH của tất cả môi trường đã được điều chỉnh đến 6,5 ± 0,2 trước khi khử trùng bằng cách làm nóng trong 15 phút ở 121 ° C Glucose được khử trùng một cách riêng biệt và thêm vào môi trường Quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm của chúng tôi chỉ ra rằng thời gian thế hệ mới cho dòng RR MRS và SDM không khác biệt đáng kể ở 42 ° C và các phương tiện can thiệp tối thiểu với các xét nghiệm được sử dụng để định lượng EPS
3.Thiết kế thử nghiệm
Để xác định các điều kiện tối ưu cho EPS sản xuất từ chủng RR, một phản ứng bề mặt được thiết kế thử nghiệm bằng cách sử dụng một mô hình bậc hai được tạo ra bằng cách sử dụng Echip (eChip, Inc, Hockessin, Del) Ba yếu tố khả biến được đưa vào mô hình: nhiệt độ (35-45 ° C), pH (4-6), và Bacto.-Casitone (nitơ) tập trung (10
- 30 g / lít) của môi trường tăng trưởng Các thiết kế có 20 thí nghiệm, 15 sự kết hợp, và năm lần lập lại (xem Bảng 1).
4 Sự lên men
Tất cả các quá trình lên men tối ưu hóa được thực hiện trong một khối lượng làm việc 2,5 lít Bio-flow III (New Brunswick, Edison, NJ) lên men chìm Sau khi cấy, độ
pH giảm từ 6,5 đến điểm thiết lập để sản xuất axit lactic pH sau đó đã được duy trì
ở điểm thiết lập bằng cách thêm 5 N NaOH Sự khuấy trộn được duy trì 200 rpm suốt quá trình lên men Ngay trước khi cấy, môi trường được rửa với nitơ trong 20 phút với tốc độ 1 lít / phút Mẫu (khoảng 30 ml) đã được loại bỏ theo chu kì đều đặn và phân tích cho sự tăng trưởng, glucose, và EPS như mô tả dưới đây Quá trình lên men được chấm dứt khi 90% glucose ban đầu được sử dụng.
5 Phép đo tăng trưởng.
Mức tăng trưởng này được theo dõi bằng kĩ thuật đo quang (650 nm) và nuôi cấy trên đĩa với độ pha loãng thích hợp trên môi trường thạch MRS, tiếp theo là ủ kỵ khí trong 48 giờ ở 42 ° C Với thử nghiệm sơ bộ, xác định trọng lượng khô tế bào được thực hiện trên bản sao mẫu 10 ml canh trường lên men Mỗi mẫu được ly tâm (8000 × g trong 10 phút) và rửa sạch hai lần với nước cất Các hạt nhỏ được tách huyền phù trong 5 ml nước cất, sấy khô ở nhiệt độ 97 ° C trong 5 h, và sau đó được cân lại.
6 Phân tích glucose
Glucose của môi trường trong quá trình lên men đã được theo dõi bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao Các column và đầu dò được duy trì ở mức 35 ° C Dung môi 0,005 M sulfuric acid, đã được chuyển tại một tốc độ dòng chảy 0,6 ml / phút Dữ liệu được
Trang 11thu thập bằng cách sử dụng hệ thống thu thập dữ liệu SSI Vision IV (khoa học Systems Inc, State College, Pa) Glucose được định lượng bằng cách liên hệ các khu vực cao điểm để có một đường cong tiêu chuẩn.
và sau đó ly tâm (8000 × g trong 20 phút) để loại bỏ các tế bào và protein Các chất nổi trên mặt được chiết ra bình vào ống thẩm tách (trọng lượng phân tử cắt, 6.000 đến 8.000) và thẩm tích 48 giờ so với bốn thay đổi của nước cất Tất cả các xét nghiệm được thực hiện nhiều lần, và các thủ tục tương tự đã được thực hiện với môi trường chưa cấy giống Nồng độ carbohydrate của retentate được xác định bằng cách sử dụng phương pháp phenol-sulfuric acid Khảo nghiệm carbohydrate
đã được điều chỉnh bằng cách sử dụng một hỗn hợp OFD-galactose, D-glucose, andL-rhamnose (05:01:01), và kết quả được báo cáo bằng số mg carbohydrate mỗi lít Các giá trị hiển thị cho EPS được tính toán bằng cách loại bỏ số lượng tạp nhiễm trong môi trường chưa cấy giống (khoảng 44 mg carbohydrate / lít) từ số lượng trong canh trường lên men.
8 Sản xuất với quy mô lớn và thu hồi EPS
Sản xuất EPS quy mô lớn được thực hiện trong một mạch lên men 100 lít (khối lượng) (Bio-service, Allentown, Pa) Sự khuấy trộn đã được duy trì ở mức 100 rpm,
và hệ thống lên men kín đã được rửa bằng nitơ trong quá trình tiệt trùng để có được một môi trường kỵ khí Nhiệt độ, sự khuấy trộn, và độ pH đã được theo dõi và kiểm soát với một máy tính Macintosh (Apple Computer Inc., Cupertino, California)
và một chương trình phát triển trong nhà bằng cách sử dụng hệ thống phòng thí nghiệm phát triển (National Instruments, Austin, Texas) Một mô hình 2700 Select Biochemistry Analyzer (YSI Biochemical Products, Yellow Springs, Ohio) đã được sử dụng để giám sát việc sử dụng glucose trong suốt quá trình lên men và phục hồi Các thiết bị đầu cuối (90% glucose được sử dụng), sự khuấy trộn đã được tăng lên đến 350 rpm và nhiệt độ của bể chứa đã được nâng lên đến 100 ° C Sau 15 phút ở
100 ° C, bể chứa được làm lạnh đến 37 ° C và 100 ml 1 5% (wt / vol) pronase E (EC 3.4.24.31; Sigma Chemical Co) được bổ sung Sau 60 phút ở 37 ° C, 250 ml 80%
