Nghiên cứu xây dựng Panel Lympho và bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyên hòa hợp mô phục vụ phẩu thuật ghép cơ quan, ghép mô ( kết quả bàn luận )

Dựa trên kết quả có được và trên nguyên tắc chọn mẫu đưa vào danh sách Panel chúng tôi dựa trên độ lập lại của các kiểu hình của phần tử HLA ở các mẫu phân tích.. Với những mục tiêu để

Chương 4

KẾT QUÁ - BÀN LUẬN

KET QuA VÀ BÀN LUẬN

1 Panel HLA

Hình 4.2 Lấy mẫu chuẩn HLA

- Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 150 người ảnh nguyện trong số 300 người đã

được lấy máu Bằng phương pháp PCR tại labo miễn địch Đại học Louvain, Vương

Quốc Bỉ cho kết quả như sau: |

Bảng 4.9 Kết quả tht HLA lớp I bing phương pháp PCR

Lo

43, | HLA-A*11&24; HLA-B*15&51, 15&78

44, | HLA-A*02&11; HLA-B*46&51

45, | HLA-A*24&33; HLA-B*40&58

46 | HLA-A*02&11; HLA-B*15&46 47,_| HLA-A*02&11; HLA-B*58

68, | HLA-A*02&11; HLA-B*40&56

69 | HLA-A*02&33; HLA-B*15&58 T0 | HLA-A*02&24; HLA-B*15&40

79 | HLA-A*24&29; HLA-B*07&27

81

HLA lớp I:

HLA - A:

A30 A33 A36 AGS A74

Nếu tính theo kiểu gien thì tần suất của các yếu tố HLA ~ A lớp I:

Al A2 A3 All A24 A2

AW A33 A36 AGS A74

Tổng cộng 275/21 (homo), 2 HLA ~ A không xác định được

Theo kiéu gien:

B7 BII BI3 BIS B1S H27 B35

B37 B3S B32 B40 B44 B46 B5Ụ

BãI B52 B54 B5S B56 B57 BSS

B78

Téng cong 273/23 (homo), 2 HLA - B xác định không được

Nhận xét các kết quả trên: chúng tôi có 2 trường hợp không xác định HUA-A và

HLA-B, trong đó một trường hợp không xác định được cả A lẫn B, điểu này có 2 giả

thuyết được đặt ra là do sai lệch kỹ thuật trong quá trình vận hành qui trình PCR hoặc

do kiểu gen quá đặc biệt chưa thể đặt tên được Còn lại chúng tôi xác định được 2

trường hợp có kiểu gien A không xác định được B và ngược lại xác định được B không

84

tại

xác định được A, điều này chỉ có một khẩ năng kiểu gien la chưa định danh được bằng phương pháp PCR hiện tại

Dựa trên kết quả có được và trên nguyên tắc chọn mẫu đưa vào danh sách

Panel (chúng tôi dựa trên độ lập lại của các kiểu hình của phần tử HLA ở các mẫu phân tích) Từ đó xây dựng được panel lympho chuẩn cho người Việt Nam

ion

Hình 4 4 Chuẩn bị vận hành máy Dynal để thử HLA bằng kỹ thuật PCR

86

49 | HUA - A*01&11; HLA — B*15&57

63 | HLA~A*01&33; HUA - B*40&57

31 | HLA~A*01&29; HLA — B*15&37

29 | HLA ~ A*02&11; HLA - B*40&46

61 | HLA- A*24&26; HLA — B*07&35

87

93 HLA ~ A*26&33; HLA — B*27&58

86 HLA — A*11&26; HLA — B¥15&46

74 HLA — A*11&68; HLA — B*13&46

36 HLA - A*02&68; HLA - B*46&52

48 HLA ~ A*24&68; HLA — B*08& 15

91 HLA — A*02&74; HLA - B*15&55

38 HLA — A*24&30; HLA ~ B*07&35

40 HLA — A*24&29; HLA ~ B*07&18

3 HLA-A*24 =; HLA-~ B*15&18

13 HLA - A*02 ; HLA - B*37&46

5 HLA ~ A*02&24; HLA - B*35&39

92 HLA — A*24&26; HLA — B*35&54

27 HLA — A*11&33; HLA — B*50&58

58 HLA ~ A*02&33; HLA — B*50&58

78 HLA - A*11&33; HLA - B*11&44

97 HLA - A*11&33; HLA ~ B*15&44

95 HLA — A*11&31; HLA - B*38&51

89 HLA ~ A*02&03; HLA - B*39&51

20 HLA — A*24&33; HLA - B*40&51

8 HLA — A*02&24; HLA - B*46&52

36 HLA — A*02&68; HLA - B*46&52

1 HLA - A*11&29; HLA — B*07&54

53 HLA — A*02&11; HLA ~ B*46&54

16 HLA — A*02&11; HLA — B*55&57

64 HLA ~ A*11&33; HLA — B*51&55

88

đặt ra Với phần mềm này, chúng tôi sẽ sử dụng trong các thử nghiệm HLA về sau che người có nhu cầu

Bảng 4.11 Huyết thanh có kháng thể HLA

Là

Sau khi chúng tôi chiết tách huyết thanh từ máu sản phụ sau sanh, chúng tôi kiểm chứng lại bằng cách lấy máu 6 người tình nguyện đã biết trước HLA lớp I thử nghiệm bằng phương pháp PCR tại labo miễn địch Đại học Louvain, lấy ngẫu nhiên và chưa biết trước loại HLA, sử dụng thuốc thử vừa tìm để thử, cho kết quả HLA lớp 1 bằng phương pháp vi độc tế bào với tiêu chuẩn theo qui ước

93

máu của sẵn phụ, nhằm xây dựng bộ sinh phẩm chẩn đoán yếu tố HLA, một trong

những xé: nghiệm cần thiết cho việc ghốp ev quan

Ngoài ra, có thể sử đụng dân Panel DLA cho mục tiêu theo đối phần ứng thải

ghép, do sự bất đồng nhóm HLA giữa người cho và người nhận, thông qua sự hiện điện

của kháng thể kháng mô người nhận, được hình thành sau khi ghép cơ quan

Do đó, nguyên tắc đòi hỏi tính đặc thù của một dàn Panel là phải thể hiện tính

đa dạng về kiểu hình của các thành phần cấu thành nên dàn panel.

Với những mục tiêu để ra và dựa trên cơ sở thành lập một panel cũng như dự, trên các kiểu hình của phân tử HLA lớp Ï có được, khi phân tích kiểu hình của phân tí HLA bằng kỹ thuật PCR ~ SSO, chúng tôi đã thiết lập ra dàn Panel

Trong đàn Panci HUA mà chúng tôi thiết lập được, đều có các kiểu hình của

phân tử HLA mà chúng tôi đã phân tích Tuy nhiên, có những yếu tố HLA mà tần suất

xuất hiện của chúng thấp như yếu tố: A30 và A36 Về nguyên tắc, điểu đó sẽ khó khăn cho vấn để phân tích kết quả khí thiếu độ lập lại Tuy nhiên, để khắc phục chúng

tôi dựa vào độ lập lại của những phân tử HLA khác Cho nên, có thể không gặp khó

khăn nhiều khi trong mẫu huyết thanh có kháng yếu tố HLA mà tần suất thấp như đã

nêu trên

Như vậy, so với số lượng kiểu hình có được từ phân tử HLA — A là 19 kiểu hình

va HLA -B 18 34 kiểu hình, thì trong dần Panel của chúng tôi có: HLA — Á là 12 kiểu

hình và HLA - B là 22 kiểu hình, như vậy kiểu hình mà chúng tôi thiếu trong dàn

Panel: HLA - A: 7 kiểu hình và HLA — B: 12 kiểu hình bao gồm:

HLA - A23, A25, A34, A66, A31, A32, A60;

HLA - B8, B45, B14, B18, B41, B42, B47, B48, B49, B53, B57, B72

Tuy nhiên để đảm bảo một dần Pane! với đầy đủ kiểu hình như trên thì là một điểu lý tưởng nhưng rất khó thực hiện, vì kiểu hình của phân tử HLA nói chung và HLA lớp I nói riêng, rất đa dạng và tùy thuộc vào chủng tộc của các dân tộc, cần thiết

phải ghỉ nhận tiếp tục trong thời gian dài mới có thể đây đủ được

Bảng 4.12 So sánh kiểu hình và tần xuất HLA-A ở một số chủng tộc

"

Qua bảng tổng kết trên, chúng tôi nhận thấy, một số kiểu hình mà chúng tôi không có được trong mẫu nghiên cứu cũng phù hợp vì:

Tân suất HLA kể trên, xuất hiện ở người da vàng, đại diện là nhóm người Nhật

và người Hoa quá thấp Cho nên, khả năng chúng tôi phát hiện chúng cũng rất khó

Số lượng mẫu chúng tôi thực hiện thấp nhưng để thực hiện trên số lượng lớn thì

có lẽ kinh phí không cho phép chúng tôi tiến hành (giá thành của mỗi mẫu nếu làm ở

Bỉ là 200 USD, còn ở Việt Nam là 500 USD)

Trong khi đó đàn panel của chúng tôi, những kiểu hình thể hiện qua phân tử

HLA có được, với tần suất cao so sánh với tần suất của các nhóm dân tộc khác như:

Bảng 4.14 So sánh kiểu hình và tần xuất HLA-A ở một số chủng tộc

Qua bang so sánh trên, chúng tôi nhận thấy:

Tân suất xuất hiện của những kiểu hình phân tử HLA lớp I của chúng tôi rất phù hợp với tần suất xuất hiện của nhóm người da vàng mà đại diện là người Nhật và người Hoa Điều này cho thấy quần thể người đa vàng thường có những kiểu hình của

phân tử HLA lớp Ï mà chúng tôi thực hiện được Như thế, dàn panel của chúng tôi xây

dựng, nó có thể đại diện tốt cho một dàn panel tương đối chuẩn và có thể sử dụng tốt

cho những mục tiêu chúng tôi để ra và nếu so sánh với dàn panei của cộng sự chúng

tôi ở Bi, thì không thua kém gì về tính đa dạng

Hy vọng rằng khi có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục cố gắng phát hiện những

kiểu hình của phân tử HLA mà chúng tôi còn thiếu (những kiểu hình hiếm ở người

Chau A), dé bổ sung vào danh sách panel, hầu từng bước có được dàn panel thật lý

tưởng như mọi người từng làm công tác này mơ ước

TỶ LỆ HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG HLA LỚP I:

Kết quả chúng tôi thu được: Tỷ lệ kháng thể kháng HLA lớp Ï trong máu sản

tour

- Theo kết quả công trình nghiên cứu được thực hiện ở phòng huyết học Blutforschung, Đức 1988 nghiên cứu về tần suất kháng thể kháng HLA lớp I tén 161

sản phụ thì tỷ lệ xuất hiện kháng thể kháng HLA lớp ï là 23%

Đứng về mặt thống kê để so sánh tỷ lệ huyết thanh dương tính của chúng tôi với

công trình nghiên cứu của phòng huyết học Blutforchung, Đức, chúng tôi sử dụng phép

kiểm:

X? = 1,524; độ tự do = 1; p >0.05 Như vậy, với p> 0.05 cho thấy kết quả tỷ lệ huyết thanh dương tính với kháng

nguyên HLA lớp I của chúng tôi với phòng huyết học Blutforchung, Đức khác nhau

không có ý nghĩa thống kê

Nhìn chung, tỉ lệ kháng thể kháng HLA lớp I của chúng tôi thu được so với công trình nghiên cứu của tác giả Bạch Khánh Hòa, cũng như công trình nghiên cứu của

viện huyết học Bludforchung ở Đức tương tự nhau Như vậy, dựa vào kết quả trên, chúng ta có thể sử dụng huyết thanh sau sổ nhau của sẵn phụ tiến hành chiết tách kháng thể kháng HLA nhằm xây dựng bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyén HLA trên tế bào lympho mà không cần phân biệt số lần sinh của sản phụ

Biéu dé 4.2 SO SANH TY LE CAC TYPE HLA-A CUA 91 NGUOI KINH VIET NAM VA CAC ANTI HLA-A TIM BUGC TRONG 297 MẪU HUYẾT THANH Tuy nhiên cũng có một số HLA-A đã xác dinh (HLA-A33, A32,A28,,) mà kết quả

anti của các HLA này chúng tôi không có Điêu này có thể là do số lượng mẫu dương tính của chúng tôi không nhiều (54/297) và chúng tôi chỉ lựa chọn những mẫu có độ đặc hiệu cao nhằm nâng cao tính đặc hiệu của bộ sinh phẩm của chúng tôi sau này

Tuy nhiên các HLA-A khác biệt này chiếm tỉ lệ không cao Do đó nhìn chung tỷ lệ

anti HLA-A chúng tôi âm được khá phù hợp và tương đối đặc trưng đối với người Việt

Nam

102

Biểu đồ 4.3 SO SÁNH TỶ LỆ ANTI HLA-A VOI KIỂU HÌNH CÁC HLA-A CỦA NGƯỜI VIỆT NAM THEO CÁC TÁC GIẢ BẠCH KHÁNH HÒA (BKH), BẠCH QUỐC TUYÊN

(BQT) VA KINH VIET NAM 1998

Về and HLA-B: xét về mặt kiểu hình, chúng tôi phát hiện được 15 loại kháng thể

khang HLA-B (HLA-B7, B15, B27, B35, B37, B39, B40, B44, B46, B51, B52,B54, B55, B56, B57) Những kháng thể phát hiện được đa dạng tuy nhiên tỷ lệ của những kháng

thể này phân tán và không cao Điễu này cũng khá tương ứng với tỉ lệ của các HLA-B tìm được ở Việt Nam theo các tác giả khác Nhìn chung hầu hết các anti HLA-B ching

tôi phát hiện đều tương ứng với các kiểu hình HLA-B mà các tác giả khác tìm được ở người Việt Nam Ngoài ra chúng tôi còn tìm được một số các anti HLA-B khác (B39, B52) Sở đĩ có sự khác biệt nhau như vậy một phần là do bộ panel của chúng tôi có

những HLA-B khác so với các HLA-B tìm được của các tác giả khác

Tuy nhiên do kinh phí của chúng tôi có hạn nên chúng tôi chỉ phân tích một số

mẫu tương đối không phức tạp và có tính đặc hiệu cao Trong tương lai nếu chúng ta

có bộ panel với nhiều HLA các nhóm hơn nữa thì sự xác định các anti HLA sé phong

phú hơn

103

mB5 ME7 LIBI3 LIHI5S MH?7 EE355S D37 BIH39 NH40 FB4L H44

El B46 MB47 ME5I WB5S2 MEHší MH55 L1B5G LIBš7 EIE3S B17

Biểu đồ 4.4 SO SÁNH TỶ LỆ ANTI HLA- B CỦA 91 NGƯỜI KINH

VIỆT NAM VA HLA-B CUA 297 SAN PHU

104

Biểu đồ 4.5 SO SÁNH TỶ LỆ ANTI HLA-B VOI HLA-B CUA CÁC TÁC GIA BACH

KHÁNH HÒA (BKH), BẠCH QUỐC TUYÊN (BỢT) VÀ 91 NGƯỜI KINH VIỆT NAM

(KVN)

VỀ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM:

Kỹ thuật vi độc tế bào Terasaki để chẩn đoán kháng nguyên HLA là kỹ thuật miễn địch tương đối đơn giản, có thể thực hiện khi có bộ huyết thanh chẩn đoán kháng

nguyên HLA Ngược lại, kỹ thuật đò tìm kháng thể cũng dựa trên nguyên lý vi độc tế

bào để phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh khi chúng ta có bộ dần

lympho

Kỹ thuật chúng tôi sử dụng là theo Terasaki nhưng có cải tiến cho phù hợp với

một số yêu câu của hoàn cảnh Trang thiết bị của kỹ thuật này không phức tạp lắm,

một số phòng xét nghiệm của chúng ta có thể trang bị được Bộ dần lympho được sử dụng trong để tài này là bộ dan tế bao lympho HLA lớp 1 của 38 người Việt Nam được

thực hiện ở labo khoa học trường đại học Louvain cung cấp

105

a

Tuy nhién, vé mit han ché : Panel HLA cia chúng tôi thể hiện một cách tương đối về tính đa dạng các kiểu hình của phân tử HUA lớp 1, rất đặc trưng cho người châu Á, bao gồm:

HLA-A1, A2, A3, A11, A24, A26, A29, A30, A31, A33, A34, A68, A74

HLA-B7, B§, B13, B15, B18, B27, B35, B37, B38, B39, B40, B44, B46, B50, B51, B52, B54, B55, B56, B57, B58

Tuy nhiên, chúng tôi vẫn còn thiếu một số kiểu hình HLA lớp I ma tin suất của chúng tất thấp ở người châu Á:

HLA-A23, A25, A32, A66, A69

HLA-B14, B41, B42, B45, B47, B48, B49, B53, B72

Ngoài ra để kit thử phổ biến ứng dụng chúng tôi sẽ tính toán độ chuyên biệt và

độ nhạy của kit thử sau Trước mắt qua 5 trường hợp kiểm chứng chưa thấy có sai lệch

106

KẾT LUẬN

how

KET LUAN

Qua các kết quả đã thực hiện chúng tôi có thể rút ra một số kết luận như sau:

1 Chúng tôi đã xác định được HLA một số người nh nguyện bằng phương pháp

hiện đại (PCR) có thể dùng làm tiêu chuẩn đã và đang được sử dụng rộng rãi tại các

nước tiên tiến trên thế giới ở thời điểm hiện tại Từ đó xây dựng được đần panel

lympho chuẩn HLA lớp I cho người Việt Nam tại Thành phố Hỗ Chí Minh, có thể kiểm tra đối chứng khi cần:

80 HLA ~ A*03&33; HLA — B*52&58

66 HLA — A*02&03; HLA — B*13&55

28 HLA — A*03&29; HLA - B*07&35

49, HLA — A*01&11; HLA - B*15&57

63 HLA ~ A*01&33; HLA - B*40&57

48 HLA - A*24&68; HLA — B*08&15

91 HLA — A*02&74; HLA — B*15&55

38 HLA — A*24&30; HLA — B*07&35

40 HLA — A*24&29; HLA ~ B*07&18

3 HLA-—A*24— ; HLA- B*15&18

107