Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lên sinh trưởng và quang hợp của 3 chủng vi tảo thuộc chi Chaetoceros phân lập được ở Việt Nam

BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN SINH TRƯỞNG VÀ QUANG HỢP CỦA 3 CHỦNG VI TẢO THUỘC CHI CHAETOCEROS PHÂN LẬP ĐƯỢC Ở VIỆT NAM Trần Dụ Chi, Nguyễn Hữ

BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG

CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ NHIỆT ĐỘ

LÊN SINH TRƯỞNG VÀ QUANG HỢP

CỦA 3 CHỦNG VI TẢO THUỘC CHI CHAETOCEROS

PHÂN LẬP ĐƯỢC Ở VIỆT NAM Trần Dụ Chi, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Thu Hường, Nguyễn Mạnh Cường

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Dương Đức Tiến, Nguyễn Hữu Hà

Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội

1 Mở đầu

Nuôi trồng thủy sản là một ngành kinh tế mũi nhọn, mang lại

nhiều lợi nhuận cho nền kinh tế quốc dân của Việt Nam Một trong

những khâu có ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng nuôi trồng chính là thức ăn Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn thức

ăn tự nhiên, đặc biệt là thức ăn tươi sống theo hướng giảm thiểu chi

phí, chủ động cho khối lượng lớn trong thời gian ngắn là một vấn để

được quan tâm đặc biệt

Vi tảo là nguồn thức ăn hết sức quan trọng đối với nuôi trồng

thủy sản Gần đây, phòng Công nghệ Tảo và Thuỷ sinh học thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được một sé chung Chaetoceros thuần khiết từ nước biển tự nhiên của Việt Nam Tuy nhiên, để có thể đưa những chủng tảo này vào sử dụng trong thực tiễn sản xuất, các nghiên cứu cơ bản cần được tiến hành 6

nhằm xác định khả năng sử dụng và tạo cơ sở cho việc xây dựng quy trình nuôi trồng tối ưu, phù hợp với điều kiện trong nước với chi phí thấp nhất có thể Nhằm đóng góp một phần nhỏ vào quá trình này, chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh

trưởng và quang hợp của 3 chủng vi tảo thuộc chỉ Chøơefoceros đã phân lập được

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là 3 chủng tảo Chøơefoceros

do GS Dương Đức Tiến và cộng sự phân lập được từ nước biển tự nhiên của Việt Nam Đó 1a Chaetoceros sp1, Chaetoceros sp2 va Chaetoceros sp3

ee

Hinh 1 Hinh dang va kich Hinh 2 Hinh dang va kich Hinh 3 Hinh dang va kich thudc cla Chaetoceros sp1 thước của Chaefoceros sp2 thước của Chaetoceros sp3

Tảo được nuôi có sục khí trong các bình thuỷ tỉnh 500 ml va 1000m] bằng chế độ nuôi theo mẻ Các bình nuôi được đặt trong tủ sinh trưởng Conviron (Canada) Cường độ ánh sáng là 50 hmol.m2.s 1 Quang chu kỳ là 10h/14h (sáng(tối) Các nhiệt độ sử dụng trong thí

nghiệm là 15°C, 20°C, 25°C và 30°C

Trước khi tiến hành thí nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ,

chúng tôi đã tiến hành nuôi tảo trong 3 môi trường khác nhau là môi trường F/2, môi trường Conway và môi trường MT3 Thí nghiệm lựa

chọn môi trường được tiến hành ở nhiệt độ phòng Từ kết quả thu

được, chúng tôi đã sử dụng môi trường F/2 cho thí nghiệm tìm hiểu

ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và quang hợp của tảo Cả ba

7

môi trường này đều được chuẩn bị trên nền nước biển tự nhiên có bổ

sung các thành phần dinh dưỡng nhất định như được trình bày trong

bảng 1 Nước biển dùng để pha môi trường được lấy từ Trạm nghiên

cứu Thực nghiệm Sinh vật biển thuộc Trung tâm giống Hải sản Cát

Bà với chất lượng không thay đổi qua các lần thí nghiệm

Bảng 1 Thành phần các môi trường nuôi tảo

Thành phần bổ sung vào môi Tên môi trường

trudng (g/l) F/2 Conway MT3

Na,SiO,.5H,O _ 0.018 0,01

NaH,PO,.2 H,O 0.05 0,04

CuSO,.5H,O 1.105 1,96.105

ZnSO,.5H,O 2,2.105 4,4.105

CoCI,.6H,O 1,1.105 2.104

MnCL 4H,O 1,8.10° 3,6.10%

NaMoO,.2H,O 0,6.105 0,126.104

(NH4)¿Mo;O,„.4H,O 0,126.105

Biotin 0,1.10° 0,01.105

Để xác định sinh trưởng của tảo chúng tôi sử dụng phương pháp

đếm tế bào bằng buồng đếm Thomas Để tìm hiểu ảnh hưởng của

nhiệt độ lên quang hợp của tảo chúng tôi sử dụng phương pháp đo

huỳnh quang chlorophy bằng máy đo huỳnh quang Hansatech (Anh)

Các thí nghiệm đều được lặp lại ba lần Các kết quả thu được được xử

ly thong ké bang phan mém SPSS

8

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Lựa chọn môi trường nuôi trồng

Trong 3 môi trường được sử dụng, môi trường F/2 và môi trường Conway là hai môi trường thường được sử dụng trong nuôi trồng vi tảo biển Tuy nhiên, trong thành phần hai môi trường này có chứa các chất vi lượng không dễ kiếm đối với các cơ sở nuôi tảo Môi trường

MT3 là môi trường được bổ sung ít chất dinh dưỡng nhất được đưa

vào thí nghiệm Các kết quả thu được được trình bày 6 bang 2

Bảng 2 Sinh trưởng của 3 chủng Chaefoceros được nuôi trong 3 môi trường khác nhau

Bảng 2.1 Mật độ tế bào của Chaefoceros sp.1 được nuôi trong các môi trường khác nhau

Thời Mật độ tảo (số tế bào/ml

gian Tảo nuôi ở MT Tảo nuôi ở MT F/2 Tảo nuôi ở MT

1 500000,0 + 79582,2 516666,7 + 30731,8 416666,7 + 38005,8

4 2058333,3 + 520323,1 | 2933333,3 + 1023121,6 1383333,3 + 234402,3

6 1925000,0 + 224258,0 | 3475000,0 + 650736,8 1941666,7 + 217338,7

8 1333333,3 + 174960,3 | 3666666,7 + 592686,9 1716666,7 + 303772,6

11 2966666,7 + 693261,2 | 5616666,7 + 1736350 1441666,7 + 285311,7

13 4225000,0 + 758919,2 | 5450000,0+ 1586400,5 1598333,3 + 252262,0

Bảng 2.2 Mật độ tế bào của Chaefoceros sp.2 nuôi ở các môi trường khác nhau

Thời Mật độ tảo (số tế bào/ml)

gian | Tảo nuôi ở MT MT3 Tảo nuôi ở MT F!2 Tảo nuôi ở MT

1 350000,00 + 34156,50 500000,00 + 64549,72 458333,33 + 35158,37

4 658333,33 + 88897 ,57 808333,33 + 93467,17 491666,67 + 37453,68

6 1166666 ,67 + 98,36,27 2658333,33 + 497060,81 1083333,33 + 198186,22

8 2100000,00 + 162275,49 4041666 ,67 + 392304,45 875000,00 + 80363,76

11 4133333,33 + 327787 ,19 4451666,67 + 1084083,07 | 866666,67 + 192209 38

13 3741666,67 + 32264,65 4388333,33 + 270375,25 316666,67 + 30731,81

Bảng 2.3 Mật độ tế bào tảo Chaefoceros sp.3 nuôi ở các môi trường khác nhau

Thời Mật độ tảo (số tế bào/ml)

gian Tảo nuôi ở MT Tảo nuôi ở MT F/2 Tảo nuôi ở MT

1 300000,0 + 40824,8 300000,0 + 31622,8 333333,3 + 71492,0

4 633333,3 + 157938,1 316666,7 + 47726,1 400000,0 + 48304,6

6 1108333,3 + 430777,7 | 125000,0 + 28136,6 541666,7 + 191231,4

8 766666,7 + 458742,2 86666,7 + 12018,5 111666,7 + 22422,7

Kết quả cho thấy môi trường F/2 là môi trường tốt nhất cho sinh

trưởng của cả ba chủng vi tảo thí nghiệm Tuy nhiên, đối với

Chaetoceros sp.1 va Chaetoceros sp.2, sinh trudng cua tao trong méi

trường MT3 tỏ ra tốt hơn sinh trưởng của tảo trong môi trường

Conway Ngược lại, Chaetoceros sp.3 sinh trưởng trong môi trường

Conway tốt hơn trong môi trường MT3 Kết hợp với sự so sánh các

thành phần bổ sung giữa các môi trường chúng tôi nhận thấy: ở môi

trường F/2, mặc dù không có thành phần bổ sung KOH, KNO; và

(NH,);¿MoO,„ như môi trường Conway, hơn nữa các thành phần vi

lượng của nó đều được bổ sung với lượng nhỏ hơn, nhưng F/2 vẫn thể

hiện là môi trường nuôi trồng cho sinh khối tốt nhất đối với vi tảo

Chaetoceros Mat khac, so sánh giữa thành phần bổ sung của môi

trường MT3 với môi trường Conway, chúng tôi thấy môi trường MT3

không được bổ sung các vitamin, chỉ bổ sung nguyên tố vì lượng là Fe

dưới dạng FeSO,, nhưng môi trường MT3 vẫn cho sinh khối tốt hơn

môi trường Conway đối với hai chủng tảo Chaefoceros sp.l và

Chaetoceros sp.2 Từ những điều này có thể thấy được thành phần

các nguyên tố vi lượng và các vitamin được bổ sung vào trong môi

trường nuôi cấy không có ảnh hưởng đáng kể đến sinh trưởng của vi

tảo biển Chaefoceros sp.1 uà Chaefoceros sp.2 và do đó nên giảm thiểu

việc bổ sung các nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cấy Trong

khi đó, các muối phosphate, silicat, muối sắt và nitrat natri là các

thành phần cần phải bổ sung với lượng hợp lý, đặc biệt đối với tao silic

thì yếu tố silic là rất cần thiết cho việc tạo vỏ tế bào Tuy nhiên, để

khẳng định được những suy đoán này cần phải có những nghiên cứu

bổ sung kết hợp với việc phân tích thành phần của nước biển sử dụng

10

trong nuôi trồng Những kết quả nghiên cứu này đã gợi ra những môi

trường bổ sung các tổ hợp thành phần dinh dưỡng có chọn lọc khác nhau có thể được dùng trong các nghiên cứu tiếp sau nhằm mục đích

tìm ra môi trường tối ưu, đơn giản với giá rẻ cho đối tượng vi tảo biển

Chaetoceros sp.1 va Chaetoceros sp.2 Trong khi d6, sinh trưởng của Chaetoceros sp.3 tuy cũng tỏ ra tốt nhất trong môi trường F/2 như hai chung vi tao còn lại, nhưng khi so sánh sinh trưởng của chúng trong môi trường MT3 và môi trường Conway thì sự khác biệt đã xuất hiện Không giống như đối với Chaetoceros sp.1 va Chaetoceros sp.2, Chaetoceros sp.3 sinh trưởng trong môi trường Conway tốt hơn trong

môi trường MT3 Như vậy, kết quả sinh trưởng của Chøefoceros sp.3 cho thấy có mối tương quan tỷ lệ giữa khả năng sinh trưởng của tảo

với hàm lượng dinh dưỡng được bổ sung cho môi trường Điều này

chứng tỏ đối với Chøœefoceros sp.1 và Chøœefoceros sp.2, nhu cầu đinh dưỡng vi lượng và nhu cầu về vitamin không cao bằng còn nhu cầu về

các muối phosphate, silicate lại cao hơn so với nhu cầu của

Chaefoceros sp.3 Về chỉ phí, giá tiền mua các muối vi lượng và

vitamin cao hơn các muối phosphate hay silicate Như vậy, nuôi trồng

Chaetoceros sp.1 va Chaetoceros sp.2 td ra it tốn kém hơn nuôi trồng Chaetoceros sp.3

Từ các kết quả nêu trên, chúng tôi đã sử dụng môi trường F/2 (là

môi trường tốt nhất cho cả ba loại tảo) cho thí nghiệm tiếp theo về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và quang hợp của chúng

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của 3 chung vi

tảo Chaetoceros

Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng lên sinh trưởng của tảo Ảnh

hưởng của nhiệt có thể trực tiếp hoặc gián tiếp và thường có tác động

đồng thời với chế độ chiếu sáng nhất là khi nuôi tảo ngoài trời, nhiệt

độ trở thành yếu tố khống chế, có thể cho phép một vài loài phát triển chiếm ưu thế Ngưỡng chịu nhiệt cho sinh trưởng của đa số loài tảo là

20 đến 24°C và khả năng chịu đựng nằm trong khoảng 16 - 27°C (Lê

Viễn Chí, 1996) Tuy nhiên, đối với mỗi loài tảo khác nhau có thể có

ngưỡng chịu nhiệt cũng như nhiệt độ cho sự phát triển tối ưu khác nhau tuỳ thuộc vào các đặc điểm sinh thái cũng như sinh lý của loài Các đường cong sinh trưởng của 3 chủng vi tảo Chaefoceros nuôi trong

11

4 nhiệt độ khác nhau được trình

bày trong hình 4, 5 và 6 Các kết

quả thu được cho thấy mô hình

tác động của nhiệt độ lên ba

chủng vi tảo này là tương tự

nhau Tảo sinh trưởng tốt nhất ở

20°C Sinh trưởng của chúng ở

15°C kém hơn ở 20°C nhưng cao

hơn hẳn sinh trưởng của tảo ở hai

nhiệt độ còn lại So sánh sinh

trưởng của tảo ở 25°C và 30°C

chúng tôi nhận thấy sinh trưởng

của tảo ở 25°C té ra tốt hơn Ở

30°C, Chaetoceros sp.3 chi tén tai

đến ngày thứ 10 Trong khi đó,

Chaetoceros sp.2, tế bào vẫn tôn tại

được tới ngày cuối cùng của đợt

nuôi (ngày thứ 18) Như vậy, so với

hai chủng khác trong cùng một chi

là Chaetoceros sp.1 va Chaetoceros

sp.2, tao Chaetoceros sp.3 có khả

nang chiu nhiét kém hon

v6i Chaetoceros

3.3 Ảnh hưởng của sự biến

thiên nhiệt độ lên hoạt

động quang hợp của 3

chung vi tao Chaetoceros

amo Tin 4-

8 8 5

Joon,

04

I 23 3 4 5 6 7 ® 9 WH 12:12 14 1S 16 17 WK

“Thi gian (ngày)

| nh4 'nh trưng của Cleekzxerus spŸ' nuội öcác nhiệt độ khác nhau

HUY) Jou

„I0

sD

TY

123 4 5 6 7 8 9 WH 12 13 14 1S 16 17 18

Thời ren (ngày) Hình S Sinh trưởng của Cloefoceros sp2 nưới ở cúc nhiệt đó khúc

nhau

xu

iu —e—I%€ -—- tan |:

š mam

Š 12000000

coun 0D xua 0

Pas 6 Teo wee

‘Thi glan (ngay) Hình 6 Sinh trường của Chaetoceros sp3 nud các nhiệt độ khác nhau

nuôi ở các nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ là một trong các yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến cấu

trúc bộ máy quang hợp và chức năng của nó Người ta biết rằng màng

thylacoit rất nhạy cảm với nhiệt độ (Santarius và Muller, 1979;

Thebud và Santarius, 1982) Định vị trên màng thylakoit có những

phân tử sắc tố có khả năng phát huỳnh quang Huỳnh quang diệp lục

12

đã được sử dụng để đánh giá thực

trạng cấu trúc và chức năng của

mang thylacoit

Ở dải nhiệt độ sinh lý, huỳnh

quang chủ yếu được phát ra từ

chlorophyll a cua PSII

(Papageorgiuos, 1975) Nó phan

ánh hoạt động của các quá trình

khởi nguyên của quang hợp như sự

hấp thụ ánh sáng, sự phân bố và

vận chuyển năng lượng cũng như

các phản ứng quang hoá của PSII

(Krause và Weis, 1984; Rinderle va

Lichtetheler, 1988) Cac phan tng

quang hoá này phụ thuộc vào trạng

thái oxy hoá khử của chất nhận

điện tử đầu tiên của PSII và của

các phức hệ vận chuyển điện tử

khác của màng

Để nghiên cứu ảnh hưởng của

nhiệt độ lên hoạt động của bộ máy

Chœefoceros nuôi ở các mức nhiệt

độ khác nhau, chúng tôi sử dụng

phương pháp đo huỳnh quang diệp

0 Sữa

0490

0400

0180

0 100

0350

0300

1S 17 9 212 4 26 272 9 0132 46 1517 19 aE 45

Nhiệt độ C)

Hình 7 Đường cong huỳnh quang - nhiệt do của Chaetaceros

spl nudia 15°C va 20°C

0.700 0.600 0.500 0.400

0.300

£ , ~ Ằ

BS cua ee =

0200 |

0100

0000 ' ~.S

0450 0.400 |

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49

Nhiet da (°C)

Hình 8 Đường cong huynh quang - nhiét do cua

Chaetoceros sp2 nudi o 15°C va 20°C

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 3% 37 3

Nhiệt độ ( C) Hình S5 Đường cong huỳnh quang - nhiệt độ của

Chaetfoceros sp3 nuôi ở L5*C va 20°C

lục để theo dõi sự biến thiên tỷ số Fv/Fm Fv/Fm là một thông số đã được chứng minh là tỉ lệ với hiệu suất sử dụng năng lượng ánh sáng

của PSII và thường được sử dụng để phát hiện và đánh giá mức độ stress của bộ máy quang hợp (Smillic and Hetherington, 1983; Schrieber et al., 1988) Mức độ stress cũng như khả năng phục hồi của

bộ máy quang hợp rất khác nhau, nó phụ thuộc vào loài, trạng thái

sinh lý, cũng như điều kiện môi trường

Vào ngày nuôi trồng thứ 12, chúng tôi đã tiến hành theo dõi sự biến thiên của tỷ số Fv/Fm của tảo nuôi ở 15°C va 20°C theo su gia tăng nhiệt độ tuyến tính từ 15°C đến khi không thể đo được huỳnh quang của tảo nữa Tốc độ gia tăng nhiệt độ là 2°C/6 phút Các

13

đường cong huỳnh quang - nhiệt độ thu được được trình bày ở các hình 7, 8 và 9

Các kết quả cho thấy đối với cả ba chủng Chøefoceros đều có sự suy giảm tỷ số Fv/Fm khi nhiệt độ tăng lên và đến một ngưỡng nào đó không thể đo được huỳnh quang của chúng nữa Ngưỡng nhiệt độ mà

ở đó không thể đo huỳnh quang của mẫu được nữa, hay nói cách khác

ngưỡng nhiệt độ mà ở đó các phân tử sắc tố không phát huỳnh quang nữa rất khác nhau ở các đối tượng khác nhau Thông số này được sử

dụng để xác định khả năng chịu nhiệt của bộ máy quang hợp (Katia

Georgieva và Ivan Yordanov, 1993) Điều đầu tiên chúng tôi nhận

thấy là mặc đù sinh trưởng của tảo nuôi ở 20°C tốt hơn hẳn sinh

trưởng của tảo nuôi ở 15°C, nhưng tỷ sé Fv/Fm cua ca ba chung thí nghiệm nuôi ở 15°C luôn luôn cao hơn tỷ số này của tảo nuôi ở 209 Điều này cho thấy không có mối tương quan tỷ lên thuận giữa hiệu

suất quang hóa của PSII với sinh trưởng của tảo Mặt khác, mô hình suy giảm EFv/Fm là tương tự nhau giữa tảo nuôi ở 15°C và tảo nuôi ở

20°C Tuy nhiên, ngưỡng nhiệt độ tối đa vẫn đo được huỳnh quang của

ba chủng tảo rất khác nhau Ngưỡng nhiệt độ này cla Chaetoceros sp1, Chaetoceros sp2 va Chaetoceros sp3 lan luot la 45°C, 49°C va

39°C Tu két qua này chúng tôi sơ bộ kết luận rằng trong 3 chủng vi

tao thi nghiệm, Chøefoceros sp1 có khả năng chịu nhiệt tốt, nhất và

khả năng này kém nhất ở Chaetocerose sp3 Điều này cũng phù hợp

với kết quả thu được về tác động của nhiệt độ lên sinh trưởng của 3

chủng tảo này

4 Kết luận

- Trong ba môi trường thử nghiệm F/2 Conway và MT3, môi

trường F/2 tốt nhất cho sinh trưởng của Choefoceros sp1, Chœetoceros

sp2 và Choetoceros sp3 Bên cạnh đó, so với môi trường Conway môi trường MT3 tốt hơn cho sinh trưởng của Chaetoceros spl va

Chaetoceros sp2 Ngugc lai, d6i véi sinh truéng cia Chaetoceros sp3, môi trường Conway tỏ ra tốt hơn môi trường MT34

- Mô hình tác động của nhiệt độ lên sinh trưởng của 3 chủng tảo

Chaetoceros là tương tự nhau Trong 4 nhiệt độ thí nghiệm, 15°C và

20°C là nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của tảo, trong đó 20°C là 14

nhiệt độ thích hợp nhất Tảo sinh trưởng rất kém ở 30°C, thậm chí Chaetoceros sp3 chỉ tồn tại đến ngày thứ 10 ở nhiệt độ này

- Tỷ số Fv/Fm của cả ba chủng Chøefoceros đều cao hơn ở lô tảo

nuôi ở 15°C so với lô tảo nuôi ở 20°C Fv/Fm giam đi khi nhiệt độ tăng

dần từ 15°C lên cao hơn Ngưỡng nhiệt độ tối đa vẫn đo được huỳnh

quang cua Chaetoceros sp1, Chaetoceros sp2 va Chaetoceros sp3 lan

lượt là 45°C, 49°C và 39°C Từ đó có thể sơ bộ kết luận rằng

Choefoceros sp1 có khả năng chịu nhiệt tốt nhat va Chaetoceros sp3 cé kha năng chịu nhiệt kém nhất

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1;

Katia Georgieva and Ivan Yordanov, 1993 Temperaturedependence

of chlorophyll fluorescence parameters of Pea Seedlings Plant Physiol (142) 151 - 155

Krause and Weis, 1984 Chlorophyll fluorescence as a tool in plant physiology Interpretation of fluorescence signals Photosynth.Res

(5) 139 - 157

Lê Viễn Chí, 1996 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, công nghệ nuôi trồng tảo silic Sleletonema costatum (Greville) Cleve làm thức ăn

cho ấu trùng tôm biển Luận án PTS khoa học Sinh học

Papageorgiuos, 1975 Chlorophyll fluorescence: an intrinsic probe of photosynthesis Bioenergetics of photosynthesis 320 - 366

Rinderle va Lichtetheler, 1988 The chlorophyll fluorescence ratio F690/F730 as a possible stress indicator Application of Chlorophyll fluorescence 189 - 196

Santarius va Muller, 1979 Investigation on heat resistence of spinach leaves Planta (146) 529 - 538

Schrieber et al., 1988 Application of the PAM fluorometer in stress detection Application of Chlorophyll fluorescence 151 - 156

Smillie and Hetherington, 1983 Stress tolerance and stress induced injury in crop plant measured by Chlorophyll fluorescence in vivo Chilling, freezing, ice cover, heat and high light Plant Physiol (72)

1043 - 1050.