Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và nghiên cứu vi khuẩn lậu

1. Tầm quan trọng của Y sinh học phân tử hiện nay Sinh học phân tử là một ngành của sinh học. Nó nghiên cứu các vấn đề về hình dạng, cấu trúc và chức năng của các đại phân tử có vai trò quan trọng với sự sống như các acid nucleic, protein đặc biệt là vai trò của chúng trong sự nhân lên của tế bào cũng như sự truyền lại các thông tin di truyền. Cơ sở của sinh học phân tử là sinh lý y học, di truyền và hóa sinh. - Đối với các bệnh nhiễm trùng: Chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, cơ chế gây bệnh, đột biến, kháng thuốc, các bệnh mới xuất hiện. Sinh học phân tử ngày càng đóng vai trò quan trọng và là một phương tiện hữu dụng trong chẩn đoán các vi sinh vật gây nhiễm trùng. Cho tới nay, việc xác định các căn nguyên gây nhiễm trùng thường dựa vào các phương pháp xác định trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua việc xác định hình thể, tính chất bắt màu, tính chất sinh vật hoá học, tính chất ly giải bởi phage, gây bệnh thực nghiệm, hoặc sự xuất hiện của các kháng thể đặc hiệu trong máu. Các kỹ thuật này nói chung là mất nhiều thời gian, trong nhiều trường hợp cũng khá tốn kém và đặc biệt là có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. Ngoài ra, một yêu cầu thiết yếu đối với các kỹ thụât này là cần một lượng vi sinh vật đủ lớn trong bệnh phẩm để có thể phát hiện được dưới kính hiển vi hoặc vi sinh vật mọc được trên những môi trường nhân tạo. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, do số lượng bệnh phẩm ít, hoặc bản thân vi khuẩn bị chết, hoặc mọc rất chậm… thì việc xác định bằng các kỹ thuật này gặp rất nhiều khó khăn, thậm chí là không thể xác định được vi sinh vật. Trong khi đó, nếu áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, kết quả xác định căn nguyên vi sinh vật sẽ nhanh hơn, nhiều trường hợp đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, các kỹ thuật này cho các kết quả có độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao, gần 100%. Song song với việc xác định nhanh căn nguyên vi sinh vật với độ chính xác cao, các kỹ thuật sinh học phân tử còn có thể cho biết một số cơ chế gây bệnh của vi sinh vật. Ví dụ, bằng việc sử dụng những cặp mồi đặc hiệu cho các gien qui định các yếu tố độc lực của các E. coli gây tiêu chảy, ngoài việc phát hiện sự có mặt của các loại E. coli này, người ta còn xác định sự có mặt của các gien qui định yếu tố độc lực trên và gián tiếp nói lên cơ chế gây bệnh của chúng [33]. Hay trong trường hợp xác định độc tố ruột của Staphylococcus aureus cũng vậy [10, 29]. Việc xác định S. aureus và sự có mặt của một hoặc một vài độc tố ruột có thể được phát hiện cùng một lúc bằng kỹ thuật Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR). PCR cũng cho phép xác định sự có mặt của một hoặc một gien liên quan đến sự kháng thuốc của vi sinh vậ. Ngoài ra, sử dụng một số cặp mồi đặc biệt có khả năng khuếch đại một vùng gien đặc trưng của một loại vi sinh vật nào đó như nấm, vi khuẩn, virus...người ta có thể xác định căn nguyên gây bệnh trong một loại bệnh phẩm nào đó. Trong một số trường hợp, bằng việc giải trình tự một đoạn nucleotide, sau đó so sánh trình tự này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gien, người ta có thể biết rằng đoàn nucleotide đó là của một vi sinh vật đã được nghiên cứu hoặc là một vi sinh vật mà chưa được biết. - Đối với bệnh ung thu: Chẩn đoán, cơ chế, can thiệp… Hiện nay, ung thư là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc khá cao. Vì sao ung thư khó chẩn đoán và điều trị? Nó là bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở các nước đang phát triển. Vấn đề là ở chỗ, ung thư là một bệnh có cơ chế, nguyên nhân tiến triển rất phức tạp. Dưới sự phát triển của khoa học công nghệ, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta đã tìm thấy nhiều yếu tố về mặt di truyền liên quan đến cơ chế phát sinh và tiến triển của ung thư. Cho tới nay, ứng dụng của sinh học phân tử trong lĩnh vực ung thư tập trung ở ba khía cạnh chính:

Bộ giáo dục vμ đμo tạo Bộ y tế

Trường đại học y hμ nội

tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007"

Chuyên ngành Vi sinh vật Mã số: 62.72.68.01

Bộ giáo dục vμ đμo tạo Bộ y tế

Trường đại học y hμ nội

tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007"

Chuyên ngành Vi sinh vật Mã số: Mã số: 62.72.68.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Văn Phủng

3.2.4 Chuyển vetor tái tổ hợp vào tế bào chủ 21

4 ứng dụng sinh học phân tử trong xác định

4.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử khác đ∙ 42

và đang đ−ợc sử dụng rộng r∙i trong xác

định và nghiên cứu N.gonorrhoeae

5 Kết luận 43

Chữ viết tắt

AAGAP Ala-Ala-Glu-Ala-Pro

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

BAC Bacterium artificial chromosomes

BSA Bovine Serum Abumin

cat chloramphenicol acetyltransferase

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CMRNG Chromosomally mediated resistant N gonorrhoeae: N

gonorhoeae kháng thuốc qua trung gian nhiễm sắc thể

CSWs Commercial sex workers: gái mại dâm

DGI Disseminated gonococcal infection: nhiễm vi khuẩn lậu lan tỏa DMSO Dimethyl sulfoxide

Fbp Ferric binding protein: protein gắn sắt

FDA Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thực phẩm và

dược phẩm FrpB Fe-regulated protein B: protein điều hòa sắt

Frps Ferric-repressible proteins: Các protein ức chế sắt

GASP Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme: chương

trình giám sát toàn cầu về độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu với kháng sinh

HAM Homosexually active male: đồng tính luyến ái nam

Hb Hemoglobin

KDO Ketodeoxy deoxy octanoic acid

LCR Ligase chain reaction: phản ứng chuỗi ligase

LF Lactoferrin

LOS lipo-oligosaccharide

LPS Lipopolysacharide

LTQĐTD Lây truyền qua đường tình dục

Met Methionin

MIC Minimum inhibitory concentration: nồng độ ức chế tối thiểu

NAG Nonagglutination: Không ngưng kết

PBPs Penicillin-binding proteins: protein gắn Penicillin

PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase

PFGE Pulsed field gel electrophoresis: điện di trường xung

PPNG Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu

sản sinh men Penicillinase

QRNG Quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu kháng

Quinolone RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: kỹ thuật đa hình

chiều dài đoạn cắt giới hạn Rmp Reduction modifiable protein: protein có thể biến đổi khử

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: điện

di trên gel polyacrylamid STD Sexually Transmitted Disease: bệnh lây truyền qua đường tình

dụcTEM Transfer Electronic Microscopy: Kính hiển vi điện tử dẫn truyền

TF Transferin

Tm Melting temperature: nhiệt độ biến tính

TMA Transcription-mediated amplification: khuếch đại qua trung gian

bản sao TRNG Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu

kháng tetracycline WHO World Health Organization: tổ chức Y tế thế giới

ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn

đoán vμ nghiên cứu vi khuẩn lậu

1 Tầm quan trọng của Y sinh học phân tử hiện nay

Sinh học phân tử là một ngành của sinh học Nó nghiên cứu các vấn đề về hình dạng, cấu trúc và chức năng của các đại phân tử có vai trò quan trọng với sự sống như các acid nucleic, protein đặc biệt là vai trò của chúng trong

sự nhân lên của tế bào cũng như sự truyền lại các thông tin di truyền

Cơ sở của sinh học phân tử là sinh lý y học, di truyền và hóa sinh

- Đối với các bệnh nhiễm trùng: Chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, cơ chế gây bệnh, đột biến, kháng thuốc, các bệnh mới xuất hiện

Sinh học phân tử ngày càng đóng vai trò quan trọng và là một phương tiện hữu dụng trong chẩn đoán các vi sinh vật gây nhiễm trùng Cho tới nay, việc xác định các căn nguyên gây nhiễm trùng thường dựa vào các phương pháp xác định trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua việc xác định hình thể, tính chất bắt màu, tính chất sinh vật hoá học, tính chất ly giải bởi phage, gây bệnh thực nghiệm, hoặc sự xuất hiện của các kháng thể đặc hiệu trong máu Các

kỹ thuật này nói chung là mất nhiều thời gian, trong nhiều trường hợp cũng khá tốn kém và đặc biệt là có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao Ngoài ra, một yêu cầu thiết yếu đối với các kỹ thụât này là cần một lượng vi sinh vật

đủ lớn trong bệnh phẩm để có thể phát hiện được dưới kính hiển vi hoặc vi sinh vật mọc được trên những môi trường nhân tạo Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, do số lượng bệnh phẩm ít, hoặc bản thân vi khuẩn bị chết, hoặc mọc rất chậm… thì việc xác định bằng các kỹ thuật này gặp rất nhiều khó khăn, thậm chí là không thể xác định được vi sinh vật Trong khi đó, nếu áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, kết quả xác định căn nguyên vi sinh vật

sẽ nhanh hơn, nhiều trường hợp đỡ tốn kém hơn Đặc biệt, các kỹ thuật này

cho các kết quả có độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao, gần 100% Song song với việc xác định nhanh căn nguyên vi sinh vật với độ chính xác cao, các kỹ thuật sinh học phân tử còn có thể cho biết một số cơ chế gây bệnh của vi sinh vật Ví dụ, bằng việc sử dụng những cặp mồi đặc hiệu cho các gien qui định

các yếu tố độc lực của các E coli gây tiêu chảy, ngoài việc phát hiện sự có mặt của các loại E coli này, người ta còn xác định sự có mặt của các gien

qui định yếu tố độc lực trên và gián tiếp nói lên cơ chế gây bệnh của chúng

[33] Hay trong trường hợp xác định độc tố ruột của Staphylococcus aureus cũng vậy [10, 29] Việc xác định S aureus và sự có mặt của một hoặc một

vài độc tố ruột có thể được phát hiện cùng một lúc bằng kỹ thuật Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) PCR cũng cho phép xác định sự có mặt của một hoặc một gien liên quan đến sự kháng thuốc của vi sinh vậ Ngoài ra, sử dụng một

số cặp mồi đặc biệt có khả năng khuếch đại một vùng gien đặc trưng của một loại vi sinh vật nào đó như nấm, vi khuẩn, virus người ta có thể xác định căn nguyên gây bệnh trong một loại bệnh phẩm nào đó Trong một số trường hợp, bằng việc giải trình tự một đoạn nucleotide, sau đó so sánh trình tự này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gien, người ta có thể biết rằng đoàn nucleotide đó là của một vi sinh vật đã được nghiên cứu hoặc là một vi sinh vật mà chưa được biết

- Đối với bệnh ung thu: Chẩn đoán, cơ chế, can thiệp…

Hiện nay, ung thư là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc khá cao Vì sao ung thư khó chẩn đoán và điều trị? Nó là bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở các nước đang phát triển Vấn đề là ở chỗ, ung thư là một bệnh có cơ chế, nguyên nhân tiến triển rất phức tạp Dưới sự phát triển của khoa học công nghệ, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta đã tìm thấy nhiều yếu tố về mặt di truyền liên quan đến cơ chế phát sinh và tiến triển của ung thư Cho tới nay, ứng dụng của sinh học phân tử trong lĩnh vực ung thư tập trung ở ba khía cạnh chính:

+ Xác định các bệnh nhân có những yếu tố thuận lợi về mặt di truyền

để phát sinh ung thư (ví dụ như phát hiện các đột biến của các tế bào sinh dục ở bệnh nhân trong gia đình có tần xuất ung thư cao) và phát hiện các thay đổi về mặt di truyền ở các tế bào sinh dưỡng có nguy cơ bị tổn thương

và dẫn đến ung thư

+ Phát hiện sớm: Biện pháp tốt nhất để chống lại ung thư là phát hiện sớm Việc xác định sớm ung thư sẽ mang lại hiệu quả điều trị cao Nếu phát hiện muộn, việc điều trị thường khó khăn và tiên lượng xấu

+ Các kỹ thuật sinh học phân tử mới cũng đang được phát triển nhằm vào các tế bào ung thư hoặc môi trường của khối u Người ta đã áp dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán, điều trị cũng như nghiên cứu nhiều dạng ung thư như ung thư tuyến giáp, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày ruột, ung thư phổi, ung thư vú….Ví dụ, sự có mặt của một số yếu tố

di truyền như sự thiếu hụt gien gây bệnh thiếu máu Fanconi BRCA2 và sự nhạy cảm với mitomycin C liên quan đến ung thư [5, 27, 32] Những gien có khả năng gây ung thư (H-ras, erbB-2, EGFR, MDM2, C-MYC, CCND1), hoặc những gien có vai trò trong sự ức chế các khối u (p53, Rb, p21, p27/KIP1, p16, PTEN, STK15, FHIT, FEZ1/LZTS1, bc10), đã được nghiên cứu rất nhiều trong ung thư bàng quang và một số dạng ung thu khác [3, 19, 45] Trong ung thư tuyến giáp, người ta thấy có sự thay đổi kiểu RET/PTC

và các đột biến điểm của các gien BRAF và RAS [24, 46] Việc nghiên cứu, phát hiện các gien này đều được thực hiện nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử Các kỹ thuật này ngày càng cung cấp các thông tin và những hiểu biết mới

về cơ sở di truyền, cơ chế phát sinh, gâybệnh, chẩn đoán, tiên lượng và cả

điều trị ung thư

- Đối với bệnh di truyền: Chẩn đoán (đặc biệt là chẩn đoán trước sinh), co chế, đột biến, can thiệp, tư vấn di truyền…

Hiện nay, các bệnh lý di truyền đang là một vấn đề được các nhà sản khoa, nhi khoa rất quan tâm Gien là đơn vị cấu trúc cơ bản của vật liệu di truyền Protein là sản phẩm của các gien Mỗi protein có một vai trò nhất định trong

tế bào, từ đó, tạo ra các chức năng của mô và cơ quan Sự khiếm khuyết của gien và chức năng không toàn vẹn của protein có thể dẫn đến những rối loạn cấu trúc, chức năng của cơ thể Trong nhiều trường hợp, sẽ có biểu hiện bệnh

lý Những biểu hiện bệnh lý trên lâm sàng hoặc cận lâm sàng xuất hiện khi

đứa trẻ sinh ra gọi là các bênh lý di truyền Ví dụ như bệnh McArdle hay là bệnh rối loạn chuyển hoá Glycogen týp V Đây là một bệnh rối loạn chuyển hoá di truyền theo tính trạng lặn Bệnh do thiếu hụt glycogen phosphorylase dạng iso ở cơ Đây là một enzyme ở cơ xương có vai trò trong việc phân huỷ glycogen Lần đầu tiên, Brian McArdle đã mô tả các triệu chứng lâm sàng của bệnh này voà năm 1951 Gần đây, người ta đã nghiên cứu các cơ chế di truyền phân tử của bệnh này Kết quả cho thấy, bệnh xuất hiện là do có các

đột biến trên gien PYGM (tới 65 đột biến) [2] Vì các rối loạn liên quan đến vật liệu di truyền có thể xuất hiện trong tế bào ngay từ khi đưa trẻ chưa ra

đời Do vậy, nếu có thể phát hiện sớm các rối loạn di truyền này, người ta có thể có hướng xử lý thích hợp tuỳ từng trường hợp Ngoài ra, nếu những rối loạn di truyền có liên quan đến cả người bố và mẹ, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta có thể xác định các thay đổi di truyền này và các thông tin như vậy có thể dùng để tư vấn trước sinh

- Đối với sản xuất thuốc và các chế phẩm sinh học, protein tái tổ hợp (insulin, yếu tố VIII…), vacxin (viêm gan B, HPV, các vacxin ADN…), chế phẩm điều trị…

Trong giai đoạn hiện nay, do sự bùng nổ của khoa học công nghệ, các kỹ thuật sinh học phân tử không chỉ được áp dụng trong lĩnhvực chẩn đoán, điều trị, mà nó còn được áp dụng rộng rãi trong công nghệ dược nhằm sản xuất ra các loại dược phẩm mới, hay trong việc sản xQất `a c°c ciế phẩm 3inh học

Mộp tr.ng hữne ch” ph@m s)nh học đang được sử dụng rộng rãi hiện nay là insulin Ban đầu, insulin được sản xuất từ tuỵ của bò, lợn, ngựa, cả cá Nhưng sau này nhờ công nghệ tái tổ hợp, người ta có thể tạo ra insulin nhân tạo hoàn toàn trong phòng thí nghiệm Insulin được sản xuất bằng công nghệ di truyền đã được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng Để làm được việc này, người

ta đã đưa đoạn gien chịu trách nhiệm sản xuất insulin của người vào bộ gien

của một loài vi khuẩn, virut nào đó, E coli chẳng hạn Khi vi khuẩn nhân

lên, đoạn gien chèn vào cũng được nhân lên, sao mã, dịch mã và tổng hợp ra protein tương ứng [1, 7, 48] Ngoài insulin, nhiều chế phẩm khác như vaccine cũng được sản xuất bằng công nghệ di truyền Một số vaccine đã và

đang được nghiên cứu bằng công nghệ tái tổ hợp như vaxcin phòng virus viêm gan B, vaxcin phòng viêm não Nhật Bản, vaxcin phòng Tả…[21, 22,

42, 49] Việc áp dụng các kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử đã và đang tạo

ra một xu hướng mới trong y sinh học

2 Tình hình ứng dụng sinh học phân tử trong lĩnh vực y học

- Trên thế giới

Các kỹ thuật sinh học phân tử đã được áp dụng rộng rãi trên thếgiới từ nhiều năm nay Đặc biệt, kể từ sau khi kỹ thụât PCR ra đời (nửa đầu những năm 1980), sinh học phân tử đã có những bước tiến vượt bậc Người ta đã có thể thao tác với các vật liệu di truyền như ADN, ARN, protein…trong phòng thí nghiệm [15, 28, 35] Thêm nữa, việc tổng hợp ra các vật liệu di truyền trên với số lượng lớn đã không còn là một vấn đề khó khăn Nhiều dự án giải trình tự bộ gien của nhiều động vật, thực vật, và vi sinh vật đã và đang được tiến hành [18, 30, 47] Những thành tựu của khoa học công nghệ, đặc biệt là sinh học phân tử đã góp phần quan trọng vào sự hiểu biết của con người với thế giới xung quanh

ở Việt Nam, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong các lĩnh vực

khoa học nói chung và y sinh học nói riêng cũng mới được triển khai trong

vòng hơn 20 năm Mặc dù vậy, hiện nay nhiều phòng thí nghiệm cũng đã

được trang bị các thiết bị như máy PCR, Realtime PCR, máy giải trình tự

nucleotide, protein Nhiều đề tài và dự án nghiên cứu đã và đang được triển

khai nhằm áp dụng các tiến bộ của khoa học vào nghiên cứu, sản xuất, chẩn

đoán và điều trị [11, 16, 26, 31, 38, 43] Nhiều kết quả của các công trình

nghiên cứu đã được áp dụng vào trong thực tế nhằm xác định các căn nguyên

vi sinh vật (vi khuẩn, virut, ký sinh trùng) gây bệnh Nhiều nghiên cứu sản

xuất thuốc, chế phẩm sinh học, vaxine đã và đang được triển khai Tuy

nhiên, việc nghiên cứu và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử ở Việt Nam

còn nhiều hạn chế do thiếu kinh phí để mua trang thiết bị hoặc đầu tư cho

các công trình nghiên cứu có khả năng áp dụng cao

3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường dùng

3.1 PCR

Nguyên lý chung

Năm 1985, nhà khoa học người Mỹ, Kary B Mullis đã phát triển “phản ứng

chuỗi trùng hợp’’ gọi là Polymerase Chain Reaction Kỹ thuật này cho phép

nhân bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào (ADN hoặc ARN) lên hàng tỉ

lần trong một thời gian ngắn [12, 13, 16, 20, 23, 34, 37] Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo sự sao chép của ADN

trong tế bào, trong đó, ADN được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Từ một

phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng được tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi

chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN mới Kỹ thuật

PCR được thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu (mồi này có khả năng bắt cặp,

bổ sung vào hai đầu của hai sợi ADN khuôn theo chiều 5’ đến 3’ dưới tác

dụng của enzym Taq ADN polymerase Đoạn mồi sẽ được kéo dài về phía

đầu 3’ của mồi để hình thành mạch ADN mới với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi ADN khuôn Qua các chu kỳ nhiệt, số lượng đoạn ADN cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính

ở nhiệt độ 940-950C, đoạn ADN duỗi xoắn và tách hoàn toàn thành hai sợi

đơn

- Giai đoạn gắn mồi

Nhiệt độ được hạ xuống 540-550C các nucleotide trên mỗi đoạn mồi xuôi

và mồi ngược sẽ gắn bổ sung với các nucleotide ở hai đầu (trên hai sợi) của

đoạn gien cần tổng hợp

- Giai đoạn kéo dài mồi

Nhờ hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase, các dNTPs được gắn vào đầu 3’ của đoạn mồi theo trình tự bổ sung với các nucleotide trên sợi ADN khuôn mẫu Giai đoạn này được thực hiện ở 720C

Các loại PCR

Có rất nhiều cách phân loại PCR Trong đó, phân loại theo đoạn vật liệu di truyền làm đích và số lượng primer rất hay được dùng

+ Theo vật liệu di truyền

Thông thường, đoạn ADN được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu là một đoạn ADN khác Tuy nhiên, trong một số trường hợp, người ta có thể dùng PCR

để tổng hợp một đoạn ADN cần quan tâm từ đoạn ARN làm khuôn mẫu Kỹ thuật này gọi là RT-PCR

+ Theo số lượng primer dùng trong phản ứng

PCR đơn mồi chỉ sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn vật liệu di truyền cần quan tâm PCR đa mồi sử dùng trên 2 cặp mồi gắn đặc hiệu vào hai vị trí trên sợi ADN làm khuôn mẫu

Các thành phần tham gia phản ứng PCR

- Mồi (primer)

Việc thiết kế một mồi để PCR là một khâu quan trọng Mồi phải đạt được các yêu cầu sau:

Chiều dài từ 18 đến 24 nucleotide

Tỷ lệ G+C/A+T rất quan trọng

Tránh sự lặp lại trật tự các nucleotide trong chuỗi

Tránh sự lặp lại hai hoặc 3 nucleotide theo nguyên tắc bổ sung tại đầu 3’ Tránh đầu 3’ bắt đầu với A hoặc T

Nhiệt độ dùng để gắn mồi khác nhau ở mỗi loại mồi và được tính theo công thức:

ở suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt cao làm cho phản ứng PCR đơn giản hơn rất nhiều

- Vật liệu di truyền làm khuôn cho PCR

Có rất nhiều loại khuôn như ADN hoặc ARN bao gồm: genomic ADN, mRNA, cADN, plasmid, phage, cosmid

Lượng khuôn cho mỗi phản ứng PCR cũng khác nhau:

1 μg genomic ADN người

10 ng genomic ADN nấm

1 ng genomic ADN E coli hoặc vi khuẩn nói chung

1-2 pg plasmid

20 pg Bacteriophage ADN

- 4 loại dNTP

- Dung dịch đệm chứa các loại muối khác nhau đặc biệt là MgCl2

Máy PCR hoạt động dựa trên nguyên lý thay dổi nhiệt độ nóng và lạnh một cách nhanh chóng

ứng dụng của PCR trong sinh học phân tử

Trong sinh học phân tử: tách dòng gien, phân tích đột biến gien, biểu hiện gien, phân tích bộ gien

Đối với Y học: PCR được dùng trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, phát hiện gien độc lực, chẩn đoán và theo dõi quá trình điều trị nhiễm virut, chẩn

đoán trước sinh như xác định giới tính thai nhi, bệnh di truyền , ứng dụng trong pháp y

Trong vi sinh vật, PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng rất sớm

và ngày càng rộng rói để chẩn đoỏn cǎn nguyờn của cỏc bệnh nhiễm trựng,

để tỡm hiểu sõu hơn về cơ chế gõy bệnh của chỳng và để phõn loại chỳng một cỏch chi tiết và chớnh xỏc hơn Cú thể kể túm tắt một số ứng dụng chớnh của PCR trong Vi sinh vật học như sau:

a Xỏc định cǎn nguyờn của cỏc bệnh nhiễm trựng

Cǎn cứ vào các đặc điểm (tính trạng) thường gặp nhất của các vi sinh vật được quan tâm, người ta tìm đến các gen quyết định các tính trạng đó, thiết

kế một bộ gen mồi (primer) phù hợp nhằm để khuyếch đại một vùng ổn định nào đó trên bộ gen nói trên Sản phẩm của quá trình khuyếch đại sau này, vì vậy, đã được xác định (cả về độ dài và trình tự các nucleotide) ngay từ giai đoạn này

Khi đưa bộ gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách chiết từ vi sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn gen có trình tự các nucleotide bổ sung với trình tự của gen mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau và, sau đó, gen mồi được kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ ADN polymerase Đoạn ADN

đó, nhờ vậy, sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất nhiều lần; sau quá trình nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn ADN này, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide Như vậy, sau khi điện di, nếu có bǎng ADN chạy giống như bǎng chuẩn thì điều đó có nghĩa là có vi sinh vật cần tìm trong bệnh phẩm; ngược lại, nếu không thấy bǎng nào xuất hiện hoặc có những bǎng không giống với bǎng chuẩn thì có nghĩa là không

có tác nhân gây bệnh cần tìm trong bệnh phẩm

Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ PCR Sau đây là một số ứng dụng điển hình:

• Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn:

Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy

Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa nuôi cấy nhân tạo được Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1) Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm

Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài (2) hoặc một đoạn 419-bp (3) của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi) Bằng cách đó, bệnh Lyme có thể được chẩn đoán sớm và chính xác

Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy

Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước tiểu (5) Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh

105 vi khuẩn/ml đờm mới cho kết quả dương tính)

PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này Nó có thể cho kết quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp

cổ điển Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn đoán rất khó khǎn

Ngày nay, người ta còn dùng PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin

(dấu hiệu rất có giá trị để coi một M tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách

kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài

Helicobacter pylori (HP): HP hiện đang là một trong những vấn đề thời sự

của Y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét

và ung thư dạ dày

Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ

mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc

tính của nó Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định

Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp

mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi;

Pseudomonas pseudomallei (nay là Burkholderia pseudomallei) với mảnh

517-bp của 16S ARNr cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR Amíp:

Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan

tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp

gây bệnh và amíp không gây bệnh (6)

Vi rút: Vi rút viêm gan B (7,8), HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành công bằng PCR

Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này, có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang

• Xác định độc tố của vi sinh vật:

Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần

đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic

Escherichia coli, ETEC); vt1 và vt2 của E coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E côli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã

được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại

Escherichia coli gây tiêu chảy

PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn

Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen

mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio

cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm

huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG)

Clostridium difficile đã được định loại thông qua xác định các loại độc tố

riêng biệt của chúng bằng PCR

• Xác định vi khuẩn ngoài môi trường:

Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể

được tìm trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Salmonella, Shigella

Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống

Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình

độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác

mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sụi cỏch thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phỳt rồi thu lấy dịch nổi sau ly tõm loại bỏ tế bào là đủ

c Phõn loại vi khuẩn

Nhờ khuyếch đại những đoạn gen phụ trỏch ARNr 16S, người ta cú thể so sỏnh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa cỏc vi khuẩn, gúp phần phõn loại

vi khuẩn chi tiết hơn và chớnh xỏc hơn

3.2 Tách, tạo dòng gien

Mục đích của việc tạo dòng là là nhằm thu đ−ợc một l−ợng lớn bản sao của một trình tự ADN xác định Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong một th− việnk gien dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm-tức tập hợp vi khuẩn cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần tìm

b Xử lý ADN cần tạo dòng

Trước hết, cần chọc lọc sơ bộ các đoạn ADN có kích thước gần nhau và tương ứng với loại vector đã chọn Sau đó, hai đầu của các ADN này cần

được xử lý cho phù hợp với hai đầu chô mối cắt của vector (bằng cách cắt bằng cùng một enzyme giới hạn để tạo các đầu so le tương hợp chẳng hạn…)

c Tạo vector tái tổ hợp

Vector và ADN cần tạo dòng đã được xử lý sẽ được trộn chung theo một tỷ

lệ nhất định với sự hiện diện của ligase Ligase xúc tác phản ứng nối vetor với insert tạo thành vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp sau đó sẽ được tinh sạch qua tách chiết và tủa

Vộctơ tỏch dũng (vector cloning) là một phõn tử cú kớch thước nhỏ cho phộp

cài gắn một đoạn DNA ngoại lai vào nhằm mục đớch nhõn đoạn DNA ngoại lai lờn với số lượng lớn

Cỏc đặc điểm cần cú của một vộctơ tỏch dũng:

Cú khả cài gắn cỏc đoạn DNA ngoại lai

Cỏc loại vectơ tỏch dũng thường dựng: Plasmid, Cosmid, Phage, BAC

(Bacterium artificial chromosomes)

d Chuyển vetor tái tổ hợp vào tế bào chủ

Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao Tùy thuộc loại tế bào chủ

thông dụng một kỹ thuật chuyển thích hợp Hai loại tế bào chủ thông dụng

nhất là (i) tế bào vi khuẩn, thường là E coli, rất thông dụng vì thao tác dễ

dàng và không tốn kém lại sinh sản nhanh; (ii) tế bào eucaryote (tế bào động thực vật nuôi cấy hay tế bào nấm men), loại tế bào chủ này chỉ được sử dụng vào những mục đích cụ thể, ví dụ như khi người ta cần nghiên cứu in vivo sự

điều hòa biểu hiện các gien eucaryote hay khi protein cần sản xuất phải được tổng hợp và biến đổi nhờ các phản ứng đặc trưng cho tế bào eucaryote…

e Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gien

Để phát hiện dòng cần tìm, người ta sử dụng một mẫu dò, mẫu dò có thể là một kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gien cần tìm hoặc một trình

tự ADN bổ xung cho gien cần tìm…

Do bản chất của ADN cần tạo dòn, người ta phân biệt hai loại thư viện gien: thư viện bộ gien và thư viện cDNA

Các thực khuẩn thể-phage xâm nhiễm tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn Khi số lượng phage tăng lên đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn Nhưng trong một số trường hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phae cũng không sinh sôi Hiện tượng này

có thể do một trong hai nguyên nhân (i) ADN của phage gắn xen vào bộ gien của vi khuẩn dưới dạng không hoạt động trong một thời gian dài hay ngắn; (ii) ADN của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này gọi là các Enzyme giới hạn Đây chính

là hiện tượng giới hạn Khi nghiên cứu ADN của phage bằng phương pháp Southern, người ta thấy rằng, ADN của phage tách từ vi khuẩn bị phá vỡ có kích thước nguyên vẹn trong khi ADN phage trích từ vi khuẩn không bị phá

vỡ lại bị cắt thành những đoạn nhỏ có kích thước xác định

Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có mộ số vi khuẩn bị phá hủy Các phage do số ít vi khuẩn nàyphóng thích có khả năng phân hủy chủng vi khuẩn trước kia cọn gọi là kháng phage

Tên gọi của các enzyme hạn chế

Tên gọi của các enzyme hạn chế được qui định như sau:

+ Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tiên của giống vi khuẩn mà từ đó, enzyme này

+ Đôi khi trong tên của enzyme hạn chế còn có một chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn đã được dùng để sản xuất ra enzyme

Ví dụ:

Escherichia coli Ry13

Giống loài Chủng

EcoRI: enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E coli

EcoRV: enzyme thứ năm được tìm thấy ở E coli

Các loại enzyme giới hạn:

Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng phân giải ADN mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí có trình tự nhất định

Do đặc tính cơ bản của các enzyme hạn chế là khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử ADN nên dựa vào khả năng này, người ta chia làm ba loại:

- Loại 1: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử ADN đến cách đó khoảng 1000-5000 nuleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide

- Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó

- Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự và cắt ADN ở vị trí cách đó khoảng

20 nucleotide

b Gắn

Gắn có nghĩa là nối hai đoạn với nhau Trong sinh học phân tử, khái niệm gắn đoạn ADN có nghĩa nối hai đoạn ADN sợi kép với nhau Gắn là một quá trình tự nhiên xảy ra trong cơ chế sửa chữa và nhân lên của ADN trong

tế bào Tuy nhiên, trong phòng thí nghiệm, nhờ công nghệ sinh học, người ta

có thể tạo ra các điều kiện để gắn hai đoạn ADN với nhau trong ống nghiệm

Kỹ thụât này có ứng dụng rất to lớn trong các thực nghiệm tái tổ hợp ADN

và các ứng dụng khác Ví dụ, bằng cách sử dụng kỹ thuật gắn các đoạn ADN với nhau, người ta có thể sử dụng một hỗn hợp các plasmids bị cắt và các

đoạn gien – ADN tự do có các đầu có khả năng gắn bổ xung vào các đầu của các đoạn plasmid Người ta cho thêm vào hỗn hợp một enzyme gắn Nhờ