Lên men đậu nành bằng chủng Lactobacillus acidophilus

Chúng được sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm từ sữa trong nhiều năm và làm cho các sản phẩm sữa lên men có vị chua, ví dụ như sữa chua.. Đây là những thí nghiệm bước

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC HÀNH

SVTH: NHÓM3, tổ 1 – DHTP4 GVHD: Ts ĐÀM SAO MAI

THS LƯU HUYỀN TRANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC HÀNH

DANH SÁCH NHÓM

MỤC LỤC

I Mở đầu – giới thiệu 1

II Vật liệu – phương pháp 1

2.1 T ng sinh gi ng:ă ố 1

2.2 Nguyên li u:ệ 2

2.3 Các ph ng pháp phân tíchươ 2

2.3.1 Xác đ nh s vi sinh v t s ng:ị ố ậ ố 2

2.3.2 nh l ng N t ng b ng ph ng pháp KJELDAHLĐị ượ ổ ằ ươ 6

2.3.2.1 Hóa ch t s d ng:ấ ử ụ 6

2.3.2.2 B c vô c hóa m u:ướ ơ ẫ 6

2.3.2.3 Ch ng c t:ư ấ 6

2.3.2.4 Chu n đẩ ộ 6

2.3.4 Xác đ nh hàm l ng acid h u c trong s n ph m s aị ượ ữ ơ ả ẩ ữ 7

2.4 Xử lý số liệu là phần nêu ra pp xử lý số liệu như thế nào? Có thể là công thức tính toán, có thể là xử lý số liệu thống kê Ghi kiểu này cũng được hoặc tích hợp luôn phần công thức tính toán trong từng phương pháp 7

2.4.1 S l ng t bào đ c trong 1g m u hay 1 ml m uố ượ ế ượ ẫ ẫ 7

2.4.2 L ng N t ng trong s n ph m đ u nành lên men:ượ ổ ả ẩ ậ 8

2.4.3 L ng lipitượ 9

2.4.4 L ng acid h u c trong đ u nành lên menượ ữ ơ ậ 9

III3 Kết quả - thảo luận 10

4.1 L ng N t ngượ ổ 10

11

4.2 Hàm l ng Lipitượ 11

IV Kết luận 14 .15

I Mở đầu – giới thiệu

Sản phẩm probiotics là chế phẩm được bổ sung những vi khuẩn và men có lợi Các loại vi khuẩn có lợi thông thường là vi khuẩn lên men, như là Bifidobacteria và Lacto-bacilli Chúng được sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm từ sữa trong nhiều năm và làm cho các sản phẩm sữa lên men

có vị chua, ví dụ như sữa chua Đây là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có tác dụng kích thích hệ miễn dịch, giảm nguy cơ mắc bệnh tiêu chảy, giảm táo bón Probiotics có trong 1 số sản phẩm từ sữa Probiotics không phải là chất thiết yếu, nhưng nó mang lại lợi ích cho sức khỏe trẻ nhỏ Ít nhất, ở mức tối thiểu, mỗi ngày trẻ em cần một lượng probitics trung bình 5x109 cfu (cfu = col-ony forming units) Để tốt cho sức khỏe người lớn và trẻ em, liều probiotics khuyên dùng mỗi ngày là 107 cfu

Sữa chua đậu nành là một sản phẩm lên men từ sữa đậu nành, cũng là một sản phẩm thuộc nhóm probiotics Đây là một loại thức ăn ngon miệng và tốt cho sức khỏe Ngoài ra nó còn mang tính tiện lợi,

dễ dàng pha chế, phối trộn để phát triển thành sản phẩm mới Và nếu được đầu tư nhiều hơn trong việc nghiên cứu thì đây có thể trở thành một loại thực phẩm chức năng rất tốt cho sức khỏe Sữa đậu nành có nhiều điểm tương tự với sữa bò Sữa đậu nành có lượng protein cao gần bằng sữa bò, nhưng ít Ca hơn sữa bò Sữa đậu nành có ưu điểm là không có lactose, có thể thay thế sữa bò cho những người không có khả năng tổng hợp enzyme tiêu hóa lactose trong các loại sữa khác Sữa đậu nành cũng chứa ít chất béo bão hòa hơn sữa bò, trong thành phần chủ yếu là các axit béo không no có giá trị dinh dưỡng cao đồng thời có thể có lợi cho tim mạch hơn Trong sữa đậu nành không có casein, là một loại protein của sữa bò

có thể tạo ra histamin và tăng sản xuất chất nhầy trong cơ thể

Lactobacillus acidophilus là một probiotic được sử dụng để lên men sữa đậu nành Khi uống vào ống tiêu hoá, Lactobacillus acidophilus gắn vào thành ruột, phát triển và chống lại vi khuẩn gây bệnh theo cơ chế: Cạnh tranh chỗ trú đóng với vi khuẩn gây hại, thay đổi pH đường ruột, tiết các chất có tính kháng khuẩn

và có tính kháng sinh, tác động kháng enterotoxine, kích thích hệ miễn nhiễm Lactobacillus acidophilus

có thể tồn tại trong ống tiêu hóa khoảng 15 ngày

Hai nguyên liệu trên đặc biệt là đậu nành có rất nhiều và phổ biến ở nước ta Hiện sản phẩm vẫn chưa có mặt trên thị trường nên sản phẩm hứa hẹn nhiều triển vọng trong tương lai Đây là những thí nghiệm bước đầu để có thể tham khảo nếu nhà sản xuất muốn thử nghiệm sản phẩm ra thị trường, do đó thí nghiệm cũng sẽ đưa ra những số liệu mang tính so sánh với những sản phẩm khác chủng vi sinh vật hoặc khác về nguyên liệu sử dụng nhằm đưa ra những kết quả có tính tham khảo cho những nghiên cứu tiếp theo

II Vật liệu – phương pháp

2.1 Tăng sinh giống :

Sử dụng môi trường MRS, đây là một môi trường tổng hợp và có hướng dấn cách pha chế trên nhãn lọ Sau khi pha môi trường xong (50ml môi trường/bình erlen), đem đi hấp khử trùng bằng phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao(1,5 atm / 20 –30 phút) Để môi trường nguội rồi cấy giống L.acidophilus gốc để tăng sinh trong 24h

Sau khi ủ 24h, đem di cấy vào nguyên liệu

2.2 Nguyên liệu :

Sản phẩm sữa chua lên men L.acidophilus sử dụng nguyên liệu nghiên cứu là sữa đậu nành Hiện nay sữa đậu nành được bày bán rất nhiều từ nhiều nguồn khác nhau, để thí nghiệm có mức độ lặp lại cao, thông tin đưa ra tin cậy chúng tôi lựa chọn sữa đậu nành được sản xuất theo dây chuyền công nghiệp Sữa đậu nành là sản phẩm sữa đậu nành không đường Vfresh của công ti ty Vinamilk Một số thông tin dinh dưỡng của nguyên liệu:???

Sữa được đem đi thanh trùng để loại bỏ những vi sinh vật có thể tạp nhiễm Vì sữa đậu nành dùng trong thí nghiệm sử dụng là sản phẩm tiệt trùng, vậy nên bước thanh trùng không đòi hỏi quá khắt khe như những nguyên liệu khác

Cách thực hiện:

+ Dụng cụ: một nồi nhỏ dung tích 2l, một nhiệt kế, bếp ga

+ Thực hiện:

Cho sữa đậu nành vào nồi, bật bếp nấu sữa Vì sữa đậu nành có tính chất rất dễ trào khi sôi ở nhiệt độ cao,

do đó khi thấy sữa sôi ta tắt bếp hạ nhiệt sau đó đun tiếp, sao cho nhiệt độ sữa được giữ ở 80oC Làm nguội sữa đến 40oC rồi cấy giống vào Đo nhiệt độ sữa bằng nhiệt kế.-> viết ngắn lại phần này

2.3 Các phương pháp phân tích

2.3.1 Xác định số vi sinh vật sống:

Xác định số lượng khuẩn lạc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp cho phép ta xác định số lượng vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để dễ dàng khi đếm và tính toán

2.3.1.1 Dụng cụ

- Ống nghiệm, giá để ống nghiệm

- Đĩa petri

- Bình tam giác 250 ml

- Cốc thủy tinh 250 ml

- Pipet các loại

- Bông không thấm nước, bông y tế

- Que trang, ống hút chia độ 1ml

- Đèn cồn, diêm quẹt

2

2.3.1.2 Cách tiến hành

● Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

Hóa chất

MRS BROTH (?g/L)  hấp KT  để nguội

Pha chế

Đây là 1 hóa chất tổng hợp và thực hiện pha chế theo hướng dẫn trên nhãn lọ

Điều chỉnh độ pH của môi trường

- Dùng HCl 10% hoặc NaOH 10% để điều chỉnh pH

- Muốn kiểm tra độ pH, ta sử dụng máy đo pH vì nó nhạy và cho độ chính xác cao Nếu không có thể sử dụng giấy quỳ để đo pH nhưng không có độ chính xác cao

Khử trùng môi trường

Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau Phương pháp được sử dụng với môi rường MRS BROTH là phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao(1,5 atm / 20 –30 phút)

Phân phối môi trường vào dụng cụ

Phân phối môi trường vào đĩa petri Trình tự phân phối như sau:

- Thực hiện trong điều kiện khử trùng

- Môi trường đang ở dạng lỏng

- Nhanh tay đổ môi trường vào petri và đậy nắp đĩa lại

- Để bề mặt môi trường khô ráo rồi lật úp đĩa lại

● Pha loãng mẫu

Tiến hành pha loãng mẫu theo phương pháp thập phân, dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từ ốngnghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng thì ta được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết

ko cần hình vẽ này!

Đổ đĩa

-Hút 0.1ml dịch đã đồng nhất tại mỗi nồng độ pha loãng ( từ 10-4 đến 10-11 ) vào các đĩa petri

-Dùng que trang trải đều, để khoảng 10-15 phút đề bề mặt đĩa khô

-Bao gói, ủ ở nhiệt độ thường trong 2 ngày

● Đếm khuẩn lạc

Đếm tất cả những khuẩn lạc trên bề mặt thạch, dùng bút để đếm, loại bỏ những đĩa bị nhiễm vi sinh vật khác

Tóm tắt phần này lại trong mấy dòng rồi ghi công thức tính thôi, tránh ghi dài dòng

2.3.1.3 Kết quả (ko đưa phần kết quả vào phần vật liệu phương pháp! Kết quả phải để riêng ở 1 mục)

Số khuẩn lạc trên mỗi đĩa tương ứng với các nồng độ

10-4

>250

- Trải đĩa không đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Mật độ dày đặc

>250

- Trải đĩa đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Mật độ dày nhưng không dày như lần 1

4

>250

- Trải đĩa đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Mật độ dày đặc

>250 - Trải đĩa đều, khuẩn

lạc mọc đẹp

- Không bị nhiễm vsv khác

- Mật độ dày

10-6

293 - Trải đĩa đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Khuẩn lạc mọc nhiều

139

- Trải đĩa đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Mật độ dày

10-7

123

- Trải đĩa không đều

- Bị nhiễm vsv khác

>250 - Trải đĩa đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Mật độ vừa, khuẩn lạc mọc rõ

10-8

88 - Trải đĩa đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Khuẩn lạc mọc nhiều

109 - Không bị nhiễm

vsv khác

- Mật độ thưa, có chỗ khuẩn lạc mọc thành chùm

10-9

35

- Trải đĩa không đều

- Không bị nhiễm vsv khác

- Khuẩn lạc mọc ít dần

14

- Khuẩn lạc mọc đẹp, rõ

- Không bị nhiễm vsv khác

- Mật độ thưa

vsv khác

- Khuẩn lạc ít và thưa

vsv khác

- Mật độ ít

10-11

4

- Không bị nhiễm vsv khác

- Khuẩn lạc mọc ít

và thưa

5

- Không bị nhiễm vsv khác

- Khuẩn lạc mọc ít

và thưa Phần này đưa hết xuống phụ lục, chỉ nêu ra kết quả thôi

2.3.2 Định lượng N tổng bằng phương pháp KJELDAHL

2.3.2.1 Hóa chất sử dụng:

H2SO4 0.1N, Methyl red 1%, NaOH 0.1N, Hỗn hợp xúc tác CuSO4:K2SO4 (1:10)

Mẫu sau khi được lấy ra từ tủ trữ ở 40C vẫn còn cứng, cấu trúc chưa đồng nhất, ta cần đưa mẫu về dạng lỏng và lắc đều để đồng nhất mẫu trước khi sử dụng

Tiến hành cân 1ml mẫu đã được đồng nhất bằng cân phân tích (hút bằng pipet), ghi lại lượng thu được Mẫu sau cân được cho vào bình phân tích Kieldahl cùng với 10ml H2SO4đđ, 4 gam hỗn hợp xúc tác đã chuẩn bị từ trước Lắp vào hệ thống vô cơ hóa mẫu tự động Ban đầu ta thiếp lập nhiệt độ ở 280-300oC, sau khi có khói trắng tăng nhiệt độ lên 370oC, đun được 20 phút tăng tiếp lên 400oC, giữ ở nhiệt độ này cho tới khi dịch đun trong suốt, tiếp tục đun trong khoảng 60-90 phút rồi lấy ra để nguội, pha loãng bằng nước cất (định mức đến 100 mL)

2.3.2.3 Chưng cất:

Chuẩn bị dụng cụ chưng cất Cho vào bình cầu 10ml mẫu đã vô cơ hóa cùng 3 giọt PP, 30ml NaOH 30% (màu của hỗn hợp chuyển sang xanh tím) Chuẩn bị bình hứng có 25ml H2SO4 và 3 giọt MR 1%, lắp vào bình chưng cất Sau đó tiến hành chưng cất mẫu Dùng quỳ tím để kiểm tra xem đã chưng cất hết mẫu chưa

2.3.2.4 Chuẩn độ

Chuẩn lượng mẫu đã hấp phụ trong bình hứng với NaOH 0.1N Chuẩn song song cùng một mẫu trắng chứa 25ml H2SO4 0.1N phần này tóm gọn lại, ko ghi theo kiểu này, ghi thành 1 đoạn văn ngắn bao gồm các ý cần thiết là được tránh chép y chang qui trình trong tài liệu

2.3.3 Định lượng lipit:

6

Sử dụng phương pháp ADAM-ROSE-GOTTLIEB

Cho vào bình lắng gạn:

Mẫu: 5-10ml (đã cân sẵn  ghi nhận lượng cân)

Dd cồn amoniac (cồn 90 150ml: ammoniac 50mL): 10ml

Ete: 20 ml

Chỉ thị phenolphthalein: 2 giọt

Lúc đầu lắc khẽ, sau lắc mạnh dần và cuối cùng lắc thật mạnh Để yên trong 30 phút, trong bình sẽ chia làm 2 lớp:

Lớp dưới là lớp ammoniac hòa tan protein và các thành phần khác

Lớp trên là ete hòa tan chất béo và lẫn một số chất khác

Tách lấy lớp ete Cho thêm vào bình lắng 15 ml ete dầu hỏa, lắc thật mạnh rồi để yên 15 phút, các chất ko phải là chất béo sẽ tách ra và lắng xuống dưới đáy bình lắng gạn, được dồn vào lớp dd ammoniac

Chuyển hết phần ete vào chén thủy tinh đã sấy khô và cân sẵn Rửa bình lắng gạn 2 lần, mỗi lần với 5ml ete và dồn hết cả vào chén thủy tinh Để bay hơi hết ete ở nhiệt độ thường, sau đó cho cả vào tủ sấy 1050C trong 30 phút Lấy ra để vào bình hút ẩm cho đến nguội rồi đem cân Pp này nếu giống với pp cũ chỉ cần nêu nguồn, người đọc sẽ tự tìm kiếm còn nếu khác với pp gốc thì chỉ ghi ra những phần khác

2.3.4 Xác định hàm lượng acid hữu cơ trong sản phẩm sữa

Phương pháp : chuẩn độ theo phương pháp acid bazơ

10 mL mẫu + 50mL nước cất + 5 giọt phenolphthalein cho vào erlen 250mL

Trộn đều mẫu, dùng pipet chuyển 10ml sữa vào cốc thủy tinh Thêm vào 3-5 giọt dung dịch phenolphtalein, lắc đều Định phân với dung dịch NaOH 0.1N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây Đọc thể tích dung dịch NaOH 0.1N tiêu tốn, ml

2.4 Xử lý số liệu là phần nêu ra pp xử lý số liệu như thế nào? Có thể là công thức tính toán, có thể là xử

lý số liệu thống kê Ghi kiểu này cũng được hoặc tích hợp luôn phần công thức tính toán trong từng phương pháp.

2.4.1 Số lượng tế bào được trong 1g mẫu hay 1 ml mẫu

N(CFU/g hay CFU/ml)

)

( n1v d1 niv di

C

+ +

∑

= Trong đó:

ni: số hộp peptri cấy tại nồng độ pha loãng thứ i

di: hệ số pha loãng tương ứng

v: thể tích dịch mẫu (0.1ml) cấy vào trong mỗi đĩa

10 1 , 0 1 10 1 , 0 2 10 1 , 0 1 10 1 , 0

.

1

35 88 109 123 139

−

−

−

+ + + +

= 4,41.109 (CFU/ml)

2.4.2 Lượng N tổng trong sản phẩm đậu nành lên men:

Hàm lượng Nito toàn phần được tính theo công thức:

V1: thể tích H2SO4 (mL) 0.1N dùng trong bình hứng

N1: nồng độ đương lượng của dd H2SO4 dùng trong bình hứng

V2: thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn độ H2SO4 dư

N2: nồng độ đương lượng của dd NaOH dùng chuẩn độ

m: khối lượng mẫu thử (g) (hoặc V.d nếu ko biết khối lượng mà biết thể tích mẫu thử và khối lượng riêng tương ứng)

Lượng protein thô (%) = N toàn phần x k

k: hệ số qui đổi từ %N sang protein, với mẫu sữa k thường = 6.38

Ngoài ra, có thể tính bằng công thức mẫu trắng như sau:

T: thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn mẫu trắng (mẫu ko có đạm  lượng H2SO4 còn nguyên vẹn: 50mL)

B: thể tích NaOH (mL) dùng để chuẩn mẫu thực (mẫu có đạm  lượng H2SO4 còn lại sau khi đã hấp phụ NH3)

N: nồng độ đương lượng dd NaOH dùng chuẩn độ (0.1N)

mmẫu trắng = 25.7ml

8

mmẫu thực = 23.9ml

mmẫu = 1.2g

%N có trong 10ml mẫu đã vô cơ hóa: %N = 0.21%

Vì lượng mẫu vộ cơ sử dụng để chưng cất là 10ml/100ml Vậy %N có trong 1ml mẫu ban đầu là:

%N = 0.21 10 = 2.1%

%protein thô = 13.4%

2.4.3 Lượng lipit

% chất béo = [(P-P’).100]/G

Trong đó:

P: trọng lượng chén + lipid (g)

P’: trọng lượng chén (g)

G: trọng lượng mẫu thử (g)

Sau khi tiến hành phân tích mẫu, thu được các kết quả :

 Cân mẫu, hút 10ml mẫu đem cân: mmẫu= 10.15g

 Thay chén bằng becker 100ml, mbecker= 89.38g

 Khối lượng của becker chứa lipid, mbecker+lipid= 89.52g

 % chất béo= [(mbecker+lipid-mbecker)/mmẫu

= [(89.52- 89.38)]/10.15

= 1.379%

2.4.4 Lượng acid hữu cơ trong đậu nành lên men

Tính kết quả:

Hàm lượng acid tính bằng acid lactic được tính bằng công thức:

Trong đó:

V1 (mL): thể tích dd NaOH dùng chuẩn mẫu thử

V2 (mL): thể tích dd NaOH dùng chuẩn mẫu trắng

0.089: khối lượng của 1 mdlg acid lactic

N: nồng độ NaOH dùng chuẩn mẫu

1000: hệ số chuyển đổi về g/L

V (mL): thể tích mẫu dùng ban đầu

Sau 2 lần tiến hành thí nghiệm, lượng NaOH thu được khi chuẩn mẫu thực: 8.9ml và 8.7ml Lấy số liệu trung bình: 8.8 ml Lượng NaOH dùng chuẩn mẫu trắng: 0.1ml

Acid lactic (g/l) = 7.743 (g/l)

III3 Kết quả - thảo luận

Các chỉ tiêu trên các mẫu sản phẩm sữa chua có cùng loại vi khuẩn L.acidophilus nhưng nguyên liệu khác nhau được thống kê như sau:

Protein thô

Chỉ tiêu vi sinh (CFU/ml)

4.1 Lượng N tổng

10