KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA VI KHUẦN L. ACIDOPHILUS TRÊN HỖN HỢP 3 LOẠI NGUYÊN LIỆU SỮA BÒ, SỮA DỪA VÀ SỮA ĐẬU NÀNH

acidophillus bằng cách chuẩn độ mẫu bằng NaOH, từ đây ta sẽ xác định được hàm lượng g/L acid lactic bởi sự lên men của vi khuẩn L.. Đồng thời ta xác định hàm lượng lipit thô trong ng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÌ MINH

oOo VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MƠN : CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA VI KHUẦN L ACIDOPHILUS TRÊN HỖN HỢP 3 LOẠI NGUYÊN LIỆU: SỮA BỊ, SỮA DỪA VÀ SỮA ĐẬU NÀNH

Lớp học phần: 210503901 Viện: Cơng Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm GVHD: TS ĐÀM SAO MAI

TP.Hờ Chí Minh , tháng 02 năm 2011

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

oOo

BỘ MƠN : CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA VI KHUẦN L ACIDOPHILUS TRÊN HỖN HỢP 3 LOẠI NGUYÊN LIỆU: SỮA BỊ, SỮA DỪA VÀ SỮA ĐẬU NÀNH

Lớp học phần: 210503901 Viện: Cơng Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm GVHD: TS ĐÀM SAO MAI

TP.Hờ Chí Minh , tháng 02 năm 2011

2

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

DANH SÁCH NHÓM 23

Đề nghị nhóm lên trực tiếp gặp cô Mai để nhờ chỉnh sửa và hướng dẫn!

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA VI KHUẦN L ACIDOPHILUS TRÊN HỖN HỢP 3 LOẠI NGUYÊN LIỆU: SỮA BÒ, SỮA DỪA VÀ SỮA ĐẬU

NÀNH

1 TỔNG QUAN

Sữa chua là loại thực phẩm được sản xuất từ vi khuẩn lên men từ sữa Mỗi loại

vi khuẩn có khả năng lên men tạo ra hàm lương acid lactic khác nhau trên những loại nguyên liệu khác nhau Bài báo cáo này khảo sát khả năng lên men của vi khuẩn L acidophillus trên hỗn hợp 3 chủng nguyên liêu khác nhau: sữa bò tươi, sữa dừa và sữa đậu nành Nguyên liệu sau khi được cấy vi khuẩn L acidophillus sẽ đem ủ và được trữ lạnh để thực hiện kiểm tra các chỉ tiêu hoá sinh, vi sinh và cảm quan Đầu tiên ta sẽ kiểm tra số lượng khuẩn lạc bằng cách trải đĩa sẽ xác định được số lượng vi khuẩn sống sót và các vi khuẩn lạ có trong mẫu Tiếp theo ta xác định khối lượng acid lactic của sự len men vi khuẩn L acidophillus bằng cách chuẩn độ mẫu bằng NaOH, từ đây

ta sẽ xác định được hàm lượng g/L acid lactic bởi sự lên men của vi khuẩn L acidophillus Đồng thời ta xác định hàm lượng lipit thô trong nguyên liệu bằng bình chiết, sau khi xử lý tạp chất trong mẫu, ta đi sấy loại nước thu được khối lượng gần đúng lipit có trong mẫu Xác định hàm lượng đạm bằng phương pháp KJELDAHL ta

lượng Nitơ có trong mẫu

2 GIỚI THIỆU

Nhu cầu các sản phẩm từ sữa tăng đáng kể so với cách đây vài chục năm Tại thị trường sữa tại Việt Nam đạt doanh thu hơn 18.500 tỷ đồng năm 2009, riêng các sản phẩm sữa chua đạt khoảng 2.000 tỷ đồng, tăng 11% so với năm 2008, tiêu thụ chủ yếu

ở khu vực nông thôn

Mỗi người có nhu cầu khác nhau với từng loại sữa chua, mùi vị và cấu trúc sản phẩm phụ thuộc vào khả năng lên men của vi khuẩn L acidophillus và thời gian ủ thích hợp, len men tạo acid lactic bằng sự phân giải đường chuyển hoá thành acid lactic tạo

vị chua đặc trưng cho sản phẩm, ngoài ra quá trình len men giúp cho các chất dinh

dưỡng chuyển thành dạng dễ tiêu hoá hơn Kết quả là tạo ra sản phẩm có vị đặc trưng của sữa tươi, dừa và đậu nành có vị béo ngậy, hơi nồng và chua, có cấu trúc mịn và màu trắng đục

Đối tượng nghiên cứu của bài viết là các thành phần dinh dưỡng, các chỉ tiêu của nguyên liệu và ảnh hưởng của L acidophillus tới nguyên liệu trong quá trình lên men

Ưu điểm của phương pháp lên men này là chỉ sử dụng một loại vi khuẩn, điều này giúp ta dễ dàng đánh giá được năng lực lên men của nó và các chỉ tiêu vi sinh, hoá sinh so với một, hai hay ba loại nguyên liệu Nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm nhưng khó xác định được hàm lượng chính xác, riêng rẽ các chất của từng loại nguyên liệu có trong hỗn hợp nguyên liệu so với việc chỉ dùng một loại nguyên liệu để lên men

Phương pháp xử lý số liệu của bài khảo sát này sử dụng phương pháp thống kê, phần mềm excel và so sánh và tập hợp

Khảo sát này nhằm mục đích kiểm tra khả năng lên men tạo acid lactic của vi khuẩn L acidophillus và các quá trình chuyển hoá các chất dinh dưỡng cần thiết của cơ thể, xác định được pH, hàm lượng đạm, lipit, chất béo có trong sản phẩm và so sánh với các sản phẩm từ nguyên liệu khác để chọn lựa được loại nguyên liệu phù hợp cho quá trình lên men Tạo ra một loại sản phẩm mới có hương vị đặc biệt mang hương vị đặc trưng của nguyên liệu, sự ảnh hưởng của nguyên liệu đến quá trình lên men và cách tối ưu hoá sản phẩm để sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất

3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

Nguyên liệu lên men gồm có 200ml sữa đậu nành Vfresh, 200ml sữa bò tươi vinamilk và 200ml nước cốt từ dừa sau khi thanh trùng tại nhiệt độ 75-90 diệt vi khuẩn

thành các hũ nhỏ, đem ủ lên men Sau khi thực hiện quá trình ủ đem trữ lạnh để tiến hành các chỉ tiêu vi sinh, hoá sinh và cảm quan

Nguyên liệu giống là vi khuẩn L acidophillus có nguồn gốc từ trường DH BK

TP HCM

4 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp cho phép ta xác định số lượng vi sinh vật còn sống có trong mẫu Những tế bào sống sẽ phát triển hoàn thiện thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng liên tiếp sao cho độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng

lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế khi đếm và tính toán

Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống trong mẫu Những tế bào sống mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường thích hợp

Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy thuộc môi

trường nuôi cấy

Phương pháp này thực hiện như sau: pha loãng mẫu sao cho số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên mỗi đĩa Petri khoảng 25- 250 Dưới mức 25 sẽ khó chính xác trên mức

250 rất khó phân biệt các khuẩn lạc khi đếm Đưa mẫu vào mặt thạch dùng que trang xoa đều lên toàn bộ diện tích của đĩa thạch trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để tránh lẫn tạp

Với mỗi loại vi khuẩn đòi hỏi phải có thời gian nuôi cấy tối ưu Sao cho các tế bào sống đủ thời gian phát triển thành khuẩn lạc

Kết quả thu được là số trung bình của 2- 3 đĩa Petri với cùng điều kiện nuôi cấy Kết quả cũng thường được trình bày dưới dạng CFU (colony torming unit) thay vì số tế bào/ml, vì rằng có nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc

Mặc dù có một số nhược điểm song đây vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định số lượng vi sinh vật Phương pháp này có độ nhạy cao, nên thường được dùng trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm

Quy trình chi tiết của phương pháp đếm khuẩn lạc: mẫu được pha loãng theo dãy nồng độ như sau: 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 ,10-11…

Nguyên tắc chung là 1 phần mẫu 9 phần dung dich pha loãng cho nên nếu là 0.1ml mẫu cần bổ sung 0.9ml dung dịch pha loãng

Chuẩn bị môi trường thích hợp trên đĩa petri

Cách thực hiện:

 Chuẩn bị:

Pha môi trường MRS: 52g môi trường dạng rắn định mức thành một lít, đem nấu, cho vào erlen, hấp khử trùng, đổ đĩa

Pha nước muối sinh lý (0.9%): 18g NaCl, định mức thành 2 lít

Đĩa peptri, pipet 1ml, pipet 10ml, que trang hình tam giác bao gói và đem sấy

Cho 9ml nước muối sinh lý vào ống nghiệm, vặn hờ nắp, đem hấp khử trùng ở

Môi trường MRS cho vào ba bình tam giác, làm nút bông rồi đem hấp khử

 Tiến hành

Cách cấy mẫu:

Pha loãng mẫu cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý(đã hấp khử trùng), ta được 10-4, tiếp tục pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10

-11,

Ghi vào nắp hộp peptri có môi trường thạch các thông tin: nồng độ pha loãng

Đổ đĩa cho vào mỗi đĩa peptri ( đã vô trùng) 15-20ml môi trường MRS, để đong lại

mỗi đĩa peptri Dùng que trang trải đều lên mặt đĩa

Sau đó lật ngược mặt đĩa lại, bao gói và đem ủ 48 giờ ở nhiệt độ phòng

Mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.

Sau đó kiểm tra kết quả ta đếm được số khuẩn lạc quan sát được:

Nồng độ

pha loãng

Kết quả

đĩa petri 1

Kết quả

đĩa petri 2

5 Xác định hàm lượng lipit bằng phương pháp Adam-Rose

Mẫu được xử lý bằng cồn và amoniac để kết tủa protein và làm bay hơi dung dịch thu được sau đó sấy khô sẽ thu được lượng lipit trong mẫu Trong môi trường amoniac và cồn, lipid được chiết xuất dưới tác dụng của Petrolium eter và Dietyl eter, protein sẻ được hoà tan bởi amoniac, cồn hút nước làm lipit dễ hoà tan hơn trong ete để tách protein ra khỏi chất béo

Tiến hành

Hút 10 ml mẫu cho vào becher 100ml, chuyển toàn bộ mẫu vào bình chiết bằng

50mL), thêm 20ml ether vào, lắc mạnh khoảng 5 phút, để lắng 30 phút

Lúc đầu lắc khẽ, sau đó lắc mạnh dần và cuối cùng lắc thật mạnh Để yên trong

15 phút, trong bình sẽ chia ra hai lớp:

+ Lớp dưới là lớp ammoniac hòa tan protein và các thành phần khác

+ Lớp trên là ete hòa tan chất béo và lẫn một số chất khác

Cho thêm vào phần diethyl ether 15mL ete dầu hỏa, lắc thật mạnh rồi để yên 15 phút, các chất không phải là chất béo sẽ tách ra và lắng xuống dưới bình lắng gạn, được dồn vào lớp dung dịch ammoniac

Chuyển hết phần ete vào erlen đã sấy khô và biết trước khối lượng Rửa bình

lắng gạn 2 lần, mỗi lần 5 mL diethyl ether và dồn hết cả vào erlen.

bình hút ẩm cho đến nguội rồi đem cân

Khối lượng được tính khi chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp sau khi sấy thêm

30 phút không được lệnh quá 0.5mg

Công thức tính:

Trong đó:

P: khối lượng mẫu thử (g) Kết quả trung bình của hai lần thử song song được làm tròn tới số lẽ thứ nhất, sai lệch giửa lai lần thử không được quá 0.2%

Kết quả và tính toán.

Bảng kết quả phân tích lipit:

Vậy hàm lượng béo trong yaourt chiếm 5.62%

Hàm lượng béo của một vài nhóm trong lớp:

Soymilk 50% &

Coconut milk 50%

& L.Acidophilus

Cow milk 50% &

Coconut milk 50%

& L.Acidophilus

100%

Cowmilk &

L.Acidophilus

Soymilk & Cow milk & Coconut

L.Acidophilus

ilk 5

0% &

Coc

onut

milk

50%

& L.

Acid

ophi s

Cow

milk

50%

& C

ocon

ut m ilk 5 0% &

L.Ac

idop

hi s

100%

Cow

milk & L.

Acid

ophi s

Soym ilk &

Cow

milk

Coc

onut

milk & L.

Acid

ophi s

0 2 4 6 8

L Acidophilus

% Lipit

Từ kết quả trên ta thấy, hàm lượng béo trong sữa chua được làm từ 100% Cow

milk là cao nhất, từ cow milk 50% và Coconut milk 50% là thấp nhất Theo thực tế ta

biết trong các loại sữa dùng làm nguyên liệu làm sữa chua thì hàm lượng béo coconut

milk (17-25%)> cow milk (2.5-6%) > soy milk (1.17-1.8%).

So với các nhóm khác thì hàm lượng béo của nhóm cũng tương đối cao Hàm

lượng béo tương đối cao là vì trong thành phần sản phẩm của nhóm có chứa coconut milk: là một loại nguyên liệu có hàm lượng béo cao kết hợp với cow milk: cũng có chứa hàm lượng béo và có cả Coconut milk Do đó thành phần lipit cao là hợp lý

Phân loại yaourt dựa vào hàm lượng chất béo trong sản phẩm Lượng chất béo trong yaourt có thể dao động từ 0 – 10%, thông thường là từ 0.5 – 3.5 % Theo tổ chức

y tế thế giới WHO và tổ chức nông lương FAO, sản phẩm yaourt có thể chia thành 3 nhóm sau:

Yaourt béo(Fat yaourt): Hàm lượng chất béo sản phẩm không thấp hơn 3% Yaourt “ Bán gầy”(partially skimmed yaourt): Hàm lượng chất béo nằm trong

khoảng 0.5 – 3%

Yaourt gầy (Skimmed yaourt): Hàm lượng chất béo không lớn hơn 0.5%

Theo cách phân loại như trên thì sản phẩm của nhóm được xếp vào loại yaourt béo nhưng hàm lượng béo so ra thì quá cao Điều này xảy ra là do có sữa dừa trong thành phần sản phẩm và hầu như trên thị trường không có sản phẩm sữa chua nào sản xuất từ sữa dừa

Với hàm lượng béo cao như vậy thì tạo cho sản phẩm có mùi thơm, màu đục thích hợp cho sản phẩm sữa chua nhưng đồng thời hàm béo cao như vậy sẽ làm cho sản phẩm có sự phân lớp, mất giá trị cảm quan của sản phẩm, đồng thời cũng giảm thời gian bảo quản dễ có hiện tượng ôi hóa và những sản phẩm sữa chua có hàm béo quá cao sẽ không thích hợp cho thị trường tiêu thụ hiện nay với đòi hỏi thực phẩm ít béo

6 Phương pháp xác định acid lactic

Chuẩn độ theo phương pháp acid bazo Mẫu được chuẩn bị và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 30s, sau đó tính toán kết quả

Xác định hàm lượng acid hữu cơ trong sản phẩm sữa chua

Phương pháp chuẩn độ acid – bazơ (phương pháp trung hòa).

Mục đích: xác định hàm lượng acid có trong sữa chua thành phẩm.

Nguyên lý : Dùng dung dich NaOH 0.1N để trung hòa lượng acid còn lại trong mẫu với chất

chỉ thị P.P 1%

Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất:

3 cái erlen 250ml

1 burret 25 ml

1 ống đong 100ml

1pipet 10ml

Dung dịch NaOH0.1N

Dung dịch P.P 1%

Cách tiến hành

10ml mẫu+50ml nước cất+ 5 giọt phenolphthalein cho vào erlen 250ml

Chuẩn độ với NaOH 0.1N cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30s

Chú ý: nếu mẫu khá lỏng thì có thể chuẩn độ trực tiếp bằng NaOH 0.1N nếu mẫu khá đặc thì sau khi pha với 50ml nước cất , tiến hành lắc thật kỹ, để lắng một thời gian hút phần dịch ở trên đem đi chuẩn độ

Công thức tính:

Hàm lượng acid

Acid lactic

V V1 2 0,089 N 1000

g

 

 

Trong đó

V1(mL): thể tích dung dịch NaOH dùng chuẩn mẫu thử

Lần 1: 9,3mL Lần 2: 9,1mL

V2(mL): thể tích dung dịch NaOH dùng chuẩn mẫu trắng (8.6mL)

0,089: khối lượng của 1 mdlg acid lactic

N: nồng độ NaOH dùng chuẩn mẫu (0.1N)

1000 hệ số chuyển đổi về g/L

V(mL) : thể tích dùng ban đầu

n hệ số pha loãng (5 lần)

Kết quả và tính toán:

L.acidophilu s

50% soya+50%

50%cow+ 50%

soya+cow+coconut 2.67

50%

soya

+50%

coco

nut

50%c

ow+ 5 0% co

conu t

100%

cow

soya +cow +coc

onut

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

L.acidophilus

L.acidophilus

nguyen lieu

Biểu đồ so sánh giá trị g/L acidlactic trên các loại ngyên liệu

Nhận xét:

7 Định lượng N tổng số bằng phương pháp KJELDAHL.

Vô cơ hóa mẫu:

Đồng nhất mẫu (lắc kỹ) lấy 1ml mẫu cho vào bình Kjeldahl + 15mL H2SO4đđ + 4g hỗn hợp xúc tác

trong suốt, tiếp tục đun trong khoảng 60-90 phút rồi lấy ra để nguội, pha loãng bằng nước cất (định mức đến 100 mL) để tránh hiện tượng kết tinh của muối

Chưng cất:

Lắp erlen có chứa 25mL H2SO4 0.1 N + 3 giọt methyl red 1% vào dưới ống sinh hàn Tiến hành chưng cất với 10ml mẫu, 3 giọt pp,40ml NAOH O,1N Cho nước cất vào bình đun (gần ngập ống), khoảng 1/2-2/3 bình Mở nước ống sinh hàn cho chảy liên tục, chưng cất liên tục trong 20-30 phút từ lúc nước sôi Thử xem đã chưng cất hoàn toàn chưa bằng cách hạ bình hứng, rửa đầu ống sinh hàn bằng nước cất (rửa ngay trong bình hứng) rồi đặt giấy pH vào miệng ống sinh hàn, nếu giấy pH ko đổi màu tức

là chưng cất đã hoàn tất Nếu dịch H2SO4 dùng hấp phụ bị đổi màu trong quá trình chưng cất thì phải làm lại, tăng lượng dịch hấp phụ lên

Chuẩn độ: định lượng H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi

dd có màu vàng nhạt hoặc xanh lá mạ non

Thực hiện mẫu trắng với lượng thuốc thử và trình tự như trên, ghi nhận thể tích NaOH 0,1N của mẫu trắng

Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra theo thứ tự sau:

N (%)= (40,5 – 23,6) x0,1x 14,007 x 100

2NH3 + H2O  2NH4OH

có trong mẫu

Kết quả phân tích hàm lượng đạm tổng:

Kết quả

Vì thí nghiệm có tiến hành song song với mẫu trắng nên ta sẽ sử dụng công thức dưới đây để tính toán :

% N = (T −B )∗N∗14.007∗100

m(mg)

+ T : số ml NaOH trung bình dùng để chuẩn độ mẫu thực (ml) ( 23,6ml)

+ B : số ml NaOH trung bình dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) (40,5 ml)

+ N : nồng độ đương lượng của dung dịch NaOH dùng để chuẩn độ (N = 0.1N)

Thế các số liệu nghiên cứu được vào công thức ta có hàm lượng đạm tổng là:

% N =(47.5−45.3)∗0.1∗14.007∗100

1000 (mg) =0.308

Hàm lượng đạm của một vài nhóm trong lớp:

100% Cow milk

&

L.Acidophilus

100%

Coconutmilk &

L.Acidophilus

Soymilk 50% &

Coconut milk 50%

& L.Acidophilus

Soymilk & Cow milk & Coconut milk &

L.Acidophilus