Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy chủng vi sinh vật sản sinh Tetrodotoxin (TTX) trong cá nóc độc Việt Nam và tách chiết TTX

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP &PTNT ĐỀ TÀI CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THUỶ SẢN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY CHỦNG VI

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP &PTNT

ĐỀ TÀI CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THUỶ SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TETRODOTOXIN (TTX) TRONG CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM

VÀ TÁCH CHIẾT TTX”

Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài

(Ký tên) (Ký tên, đóng dấu)

ThS Bùi Thị Thu Hiền

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Nông nghiệp và PT nông thôn

(Ký tên) (Ký tên, đóng dấu khi gửi lưu trữ)

HẢI PHÒNG-2012

BỘ NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN NGHIÊN CỨU HẢI SẢN

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hải Phòng, ngày 22 tháng 6 năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên: Bùi Thị Thu Hiền

Ngày, tháng, năm sinh: 30 – 07 – 1980 Giới tính: Nữ

Học hàm, học vị: Thạc sỹ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên

Điện thoại: Mobile: 0989151180; Nhà riêng: 031.6284365 Fax: 031.3836812 E-mail: hien.rimf@gmail.com

Tên tổ chức đang công tác: Viện Nghiên cứu Hải sản

Địa chỉ tổ chức: 224 (170) Lê Lai, Ngô Quyền, Hải Phòng Địa chỉ nhà riêng: Hạ Đoạn 3, Đông Hải 2, Hải An, Hải Phòng

3 Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:

Tên cơ quan chủ trì đề tài: Viện nghiên cứu Hải sản

Điện thoại: 0313.836 135 Fax: 0313.836.812

E-mail: phson@rimf.org.vn

Website: http://www.rimf.org.vn

Địa chỉ: 224 – Lê Lai, Ngô Quyền, Hải Phòng

Họ và tên thủ trưởng: Phạm Huy Sơn

Số tài khoản: 8123

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước, Thành Phố Hải Phòng

Tên cơ quan chủ quản: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: 24 tháng, từ tháng 01 năm 2009 đến tháng

12 năm 2010

- Thực tế thực hiện: 30 tháng từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 06 năm

2011 (Theo công văn số 6961/BNN-KHCN ngày 22/12/2009)

2 Kinh phí và sử dụng kinh phí:

a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2.769,0 triệu đồng, trong đó:

+ Kinh phí hỗ trợ từ NSKH: 2.769,0 triệu đồng

+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0,0 triệu đồng

+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi với dự án (nếu có): 0,0 triệu đồng

Thời gian (tháng,

năm)

Kinh phí (Tr.đ)

1/ Chuyển kinh phí Đoàn vào 44,372.385 triệu năm 2009 sang năm

2010 do giao dự toán muộn (Theo công văn số 7157/BNN-KHCN ngày 24/12/2009)

2/ Dừng lại hai nội dung với tổng số kinh phí là 110,0 triệu đồng: xác định độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý do đề tài không đủ số lượng chế phẩm TTX theo yêu cầu của bên phân tích (Theo công văn số 3142/BNN-KHCN ngày 16/6/2011)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi

Lý do thay đổi (nếu có):

1/ Điều chỉnh 12,2 triệu từ chi phí khác sang thuê khoán chuyên môn, tăng số mẫu phân tích từ 150 mẫu sinh khối lên 185 mẫu sinh khối (Theo công văn số 6426/BNN-KHCN ngày 20/11/2009)

2/ Dừng lại hai nội dung với tổng số kinh phí là 110,0 triệu đồng: xác định độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý do đề tài không đủ số lượng chế phẩm TTX theo yêu cầu của bên phân tích (Theo công văn số 3142/BNN-KHCN ngày 16/6/2011)

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài:

TT Số, thời gian ban

2009 của đề tài “Tách chiết TTX từ vi sinh vật”

8 Công văn số: Công văn của Bộ trưởng Bộ Nông

đề tài “Tách chiết TTX từ vi sinh vật”

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú

1 Viện NCHS Viện NCHS Nội dung

1: Nghiên cứu tổng quan tài liệu

01 Báo cáo chuyên đề

Nội dung 2:

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn

- 01 Báo cáo

chuyên đề Phân lập và nuôi cấy các chủng vi sinh

các chủng

vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam

vật có trong 4 bộ phận của 3 loài cá nóc độc Việt Nam

- 01 Báo cáo chuyên đề về

Phân loại các chủng vi sinh đã

tuyển chọn

- 01 Báo cáo chuyên đề về

Nghiên cứu nâng cao hiệu suất tăng

sinh khối của các chủng vi sinh vật

Trường ĐH Kitasato - Nhật Bản

Nội dung 3:

Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết

và tinh sạch TTX từ chủng vi sinh vật đã tuyển chọn

01 Quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ

2/ Đại học Y

Hà Nội 3/ Trường đại học Tokyo - Nhật Bản

Nội dung 4:

Kiểm tra, phân tích xác định cấu trúc, chức năng

và độc tính của TTX sản xuất từ

vi sinh vật

01 Báo cáo phân tích kết quả kiểm tra, phân tích xác định cấu trúc, chức năng và độc tính TTX từ VSV

5 Viện Viện NCHS; Nội dung 5: Mô hình sản xuất

vi sinh vật (quy mô phòng thí nghiệm)

TTX từ vi sinh vật quy mô phòng thí nghiệm

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

1

Bùi Thị Thu

Hiền

Bùi Thị Thu Hiền

Nội dung 1:

Nghiên cứu tổng quan tài liệu

01 Báo cáo chuyên đề

Nguyễn Hữu Hoàng

Nguyễn Hoài Nam

Đào Thị Lương

Phạm Quốc Long

Đinh Thị Thu Thuỷ

Nội dung 2:

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng

vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam

- 01 Báo cáo chuyên đề

Phân lập và nuôi cấy các chủng vi sinh vật có

trong 4 bộ phận của 3 loài cá nóc độc Việt Nam

- 01 Báo cáo chuyên đề

về Phân loại các chủng

vi sinh đã tuyển chọn

- 01 Báo cáo chuyên đề

về Nghiên cứu nâng cao hiệu suất tăng sinh khối

Nguyễn Hữu Hoàng

Shigeru

Nội dung 3:

Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh

01 Quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ vi sinh vật

sạch TTX từ chủng vi sinh vật

Đinh Thị Thu Thuỷ

Nguyễn Trọng Thông

Nội dung 4:

Kiểm tra, phân tích xác định cấu trúc, chức năng

và độc tính của TTX sản xuất từ

vi sinh vật

01 Báo cáo phân tích kết quả kiểm tra, phân tích xác định cấu trúc, chức năng và độc tính TTX từ VSV

Nội dung 5: Đề xuất mô hình sản xuất TTX từ vi sinh vật (quy mô phòng thí nghiệm)

tập quy trình tách chiết và tinh

sạch TTX tại Trường Đại học

Kitasato Nhật Bản

- Kiểm tra, phân tích, xác định

cấu trúc của TTX do vi sinh

vật sản sinh ra

- Tinh sạch TTX sản xuất từ vi

sinh vật

- Đã học tập được quy trình tách chiết và tinh sạch TTX tại Trường Đại học Kitasato Nhật Bản

- Đã kiểm tra, phân tích, xác định cấu trúc và độ tinh sạch của TTX do vi sinh vật sản sinh ra tại Trường Đại học Tokyo Nhật Bản

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

1 Tổ chức 01 cuộc

Hội thảo

Đã tổ chức 01 cuộc Hội thảo, hội nghị

“Đánh giá kết quả nghiên cứu khoa học của đề tài đã đạt được năm 2009-2010 và định hướng nghiên cứu tiếp theo”

Đã nhận được các ý kiến đóng góp của các chuyên gia về kết quả đạt được và có

kế hoạch cho hướng nghiên cứu tiếp theo

8 Tóm tắt các nội dung công việc chủ yếu:

Thực tế đạt được

Người, cơ quan thực hiện chính

Bùi Thị Thu Hiền

2 Nội dung 2: Nghiên

4/2010

2/2009-Tổ chức:

Viện NC Hải sản Viện Vi sinh và CNSH

Cá nhân thực hiện:

Bùi Thị Thu Hiền, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Trọng Tâm, Phạm Huy Hưng, Vũ Xuân Sơn, Mai Văn Điện, Đào Trọng Hồng

Nguyễn Hoài Nam, Đào Thị Lương, Trịnh Thành Trung

3 Nội dung 3: Nghiên

cứu xây dựng quy

Cá nhân thực hiện:

Bùi Thị Thu Hiền, Nguyễn Hữu Hoàng, Shigeru SATO, Phạm Quốc Long, Đinh Thị Thu Thuỷ

4 Nội dung 4: Kiểm

Cá nhân thực hiện:

Phạm Quốc Long, Đinh Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Trọng Thông

Bùi Thị Thu Hiền

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

Theo kế hoạch

Thực tế đạt

-Thuần chủng -Có khả năng sản sinh TTX

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

01 Quy trình

được nghiệm thu ở cấp cơ

sở

Quy trình được nghiệm thu ở cấp cơ

Thực tế đạt được

Theo Thông

BKHCN

Theo Thông

BKHCN

1

Bài báo: Nghiên cứu phân loại hai chủng vi sinh

vật sản sinh Tetrodotoxin phân lập từ trứng cá nóc

độc Việt Nam Takifugu oblongus Tuyển tập

Nghiên cứu nghề cá biển, 2011 NXB Nông

nghiệp

01 01

2

Bài báo: Study on toxin-producing marine

organism: an overview on preliminaty results

obtained by the research institute of marine

fisheries Workshop international in Viet Nam,

2010

0 01

3

Bài báo: Tetrodotoxin nguồn gốc vi sinh vật và

triển vọng ứng dụng trong y dược ở Việt Nam

Tuyển tập Hội nghị khoa học Toàn quốc về sinh

học biển và phát triển bền vững, 2009 NXB Khoa

Thực tế đạt được

Ghi chú

(thời gian kết thúc)

2 Tiến sĩ 0 01 2013

f) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với

2 Đánh giá hiệu quả do đề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học công nghệ:

Hướng nghiên cứu thu nhận TTX bằng các chủng vi sinh vật là hướng

nghiên cứu mới đối với Việt Nam, hơn nữa trên thế giới chưa có chủng

thương mại, vì vậy phương án nhập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp TTX là không khả thi

b) Hiệu quả về kinh tế - xã hội:

Hiệu quả kinh tế – xã hội mà đề tài đem lại sẽ vô cùng cần thiết nếu quy

trình nghiên cứu được hoàn thiện Khi quá trình sản xuất TTX từ vi sinh vật

hoàn thiện sẽ làm giảm chi phí tách chiết, tinh sạch và không còn phụ thuộc

vào nguồn nguyên liệu tự nhiên Mặt khác, giá thành chế phẩm giảm, giúp cho

các ngành y, dược, nghiên cứu cơ bản có thể sử dụng rộng rãi TTX trong

các nghiên cứu, sản xuất dược phẩm

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:

TT Nội dung Thời gian

Bước đầu đề tài đã đạt được một số kết quả khả quan, đã phân lập được 130 chủng vi sinh vật từ các bộ phận của 03 loài cá nóc độc Việt Nam, đã nuôi cấy sinh khối và kiểm tra hoạt tính thì có 24 chủng có khả năng sinh sản Tetrodotoxin Điều đó cho thấy, các chủng vi sinh vật có nguồn gốc từ cá nóc Việt nam cũng có khả năng sinh độc tố TTX

đã bám sát đề cương và triển khai đúng tiến độ Kết quả đạt được có triển vọng

Do lĩnh vực này còn nhiều tính mới ở Việt Nam nên đề tài đã gặp rất nhiều khó khăn, đặc biệt là công nghệ thu hồi, tinh sạch TTX từ vi sinh vật

5

Nghiệm thu cơ

Nhìn chung, Hội đồng nghiệm thu cấp

cơ sở đã đánh giá “Đạt” các kết quả của

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xvii

TTX: Tetrodotoxin xvii

LD50: Xác xvii

DANH MỤC CÁC BẢNG xviii

DANH MỤC CÁC HÌNH xx

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết 2

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ TETRODOTOXIN 4

1.1 1 Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX 4

1.1.2 Tính chất hóa lý của TTX 7

1.1.3 Đồng phân của TTX 8

1.1.4 Những sinh vật biển chứa độc tố Tetrodotoxin 9

1.1.4.1 TTX từ động vật biển 9

1.1.4.2 Các nghiên cứu sinh tổng hợp TTX từ vi sinh vật biển 12

1.1.5 Công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX 16

1.1.5.1 Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học 16

1.1.5.2 Tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc 16

1.2 VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TETRODOTOXIN 22

1.2.1 Đặc điểm của một số chủng vi khuẩn sinh TTX 22

1.2.1.1 Chi Vibrio 22

1.2.1.2 Chi Pseudomonas 22

1.2.1.3 Chi Pseudoalteromonas 23

1.2.1.4 Chi Micrococcus 23

1.2.1.5 Chi Psychrobacter 24

1.2.1.6 Chi Rhodotorula 24

1.2.2 Thu nhận và tinh sạch TTX từ vi sinh vật 25

1.3 ỨNG DỤNG CỦA TETRODOTOXIN 27

1.3.1 Cơ chế gây độc của Tetrodotoxin 27

1.3.2 Các ứng dụng trong y dược và triển vọng ở Việt Nam 31

1.3.2.1 Một số ứng dụng của TTX 31

1.3.2.2 Một số tác dụng có hại của TTX 32

1.3.2.3 Triển vọng ứng dụng TTX ở Việt Nam 33

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 35

2.1.1 Những đặc điểm cơ bản của bộ cá Nóc (Tetraodontiformes) 35

2.1.1.1 Phân loại: 35

2.1.1.2 Đặc điểm chung của bộ cá Nóc 35

2.1.1.3 Đặc điểm về hình dạng cá Nóc 35

2.1.2 Sự phân bố độc tố trong các bộ phận của cá Nóc 36

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Các phương pháp thực hiện nội dung Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam 39

2.2.1.1 Phương pháp phân loại và phân tích mẫu sinh học 3 loài cá nóc độc Việt Nam 39

2.2.1.2 Phương pháp phân tích hàm lượng độc tố của 3 loài cá nóc độc 39

2.2.1.3 Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật trên 4 bộ phận của 3 loài cá nóc đã lựa chọn 40

2.2.1.4 Phương pháp phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX 41

2.2.1.5 Phương pháp nghiên cứu nâng cao hiệu suất tăng sinh khối của một số chủng vi sinh đã lựa chọn 42

2.2.1.6 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng thu nhận TTX ở quy mô 1-5 lít/mẻ nuôi cấy phục vụ cho quá trình tách chiết, tinh sạch TTX .44

2.2.2 Các phương pháp thực hiện nội dung nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ chủng vi sinh vật đã tuyển chọn 44

2.2.2.1 Tham khảo tài liệu 44

2.2.2.2 Phương pháo thực nghiệm 45

2.2.3 Các phương pháp thực hiện nội dung kiểm tra, phân tích xác định cấu trúc, chức năng và độc tính của TTX tách chiết từ sinh khối vi sinh vật 46

2.2.3.1 Phương pháp phân tích, xác định cấu trúc của TTX từ cá nóc Việt Nam làm tiền đề kiểm chứng cấu trúc TTX chế phẩm từ vi sinh vật 46

2.2.3.2 Phương pháp kiểm tra, phân tích xác định cấu trúc của chế phẩm TTX tại Việt Nam 47

2.2.3.3 Phương pháp kiểm tra, phân tích xác định cấu trúc của chế phẩm TTX tại Nhật Bản 48

2.2.3.4 Phương pháp kiểm tra độc tính cấp của TTX 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CỦA 3 LOÀI CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 50

3.1.1 Kết quả phân loại của 3 loài cá nóc độc 50

3.1.1.1 Cá Nóc vằn Takifugu oblongus Bloch, 1786 50

3.1.1.2 Cá Nóc chấm cam Torquigener pallimaculatus Hardy, 1983 51

3.1.1.3 Cá Nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris Bloch & Schneider, 1801 52

3.1.2 Kết quả phân tích hàm lượng độc tố của 3 loài cá nóc độc 54

3.1.3 Kết quả tách chiết và xác định cấu trúc TTX từ mẫu cá nóc độc Việt Nam 58

3.1.3.1 Kết quả phân tích TTX từ mẫu cá nóc Việt Nam trên HPLC 58

3.1.3.2 Kết quả xác định cấu trúc TTX từ mẫu cá nóc Việt nam 58

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 64

3.2.1 Kết quả nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật từ 3 loài cá nóc độc 64

3.2.2 Kết quả phân tích kiểm tra định tính chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX 66

3.2.3 Kết quả phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX 70

3.2.3.1 Chủng M6 70

3.2.3.2 Chủng M8 71

3.2.3.3 Chủng M10 73

3.2.3.4 Chủng M 19 74

3.2.3.5 Chủng M28 và M3 76

3.2.3.6 Chủng M30 77

3.2.3.7 Chủng M37 80

3.2.3.8 Chủng M43 82

3.2.3.9 Chủng M55 83

3.2.3.10 Chủng M60 85

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX 87

3.3.1 Kết quả nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi cấy hai chủng vi sinh vật đã lựa chọn có khả năng sản sinh TTX 88

3.3.1.1 Kết quả nghiên cứu nâng cao hiệu suất tăng sinh khối của hai chủng vi sinh đã lựa chọn 88

3.3.1.2 Kết quả nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng thu nhận TTX ở quy mô 1-5 lít/mẻ nuôi cấy phục vụ cho quá trình tách chiết, tinh sạch TTX 98

* Giải thích quy trình công nghệ nuôi cấy chủng M30 và M37 107

3.3.2 Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ chủng vi sinh vật đã tuyển chọn 108

3.3.2.1 Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết TTX từ sinh khối vi sinh vật 108

3.3.2.2 Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tinh sạch TTX từ dịch chiết thô đã được tách chiết từ sinh khối vi sinh vật 118

3.2.6.3 Nghiên cứu kết tinh sản phẩm TTX từ sinh khối vi sinh vật 136

2.3.4.4 Tính toán hiệu quả kinh tế việc nuôi cấy sinh khối vi sinh vật cho sản sinh TTX 139 Tính toán hiệu quả kinh tế việc nuôi cấy sinh khối vi sinh vật cho sản sinh TTX 141

3.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA, PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG VÀ ĐỘC

TÍNH CỦA TTX TÁCH CHIẾT TỪ SINH KHỐI VI SINH VẬT 143

3.4.1 Kết quả kiểm tra, phân tích, xác định cấu trúc TTX từ vi sinh vật tại Việt Nam 143

3.4.2 Kết quả kiểm tra, phân tích, xác định cấu trúc TTX từ vi sinh vật tại Nhật Bản 144

3.4.3 Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm TTX 144

3.5 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT TTX TỪ VI SINH VẬT QUY MÔ THÍ NGHIỆM 147

Giải thích quy trình công nghệ nuôi cấy chủng M30 và M37 147

CH ƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 156

4.1 Kết luận 156

4.2 Đề xuất 156

TÀI LIỆU THAM KHẢO 157

PHỤ LỤC 1 167

PHỤ LỤC 2 165

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TTX: Tetrodotoxin

LD50: Liều gây chết cho 50% vật nuôi

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS: Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ

OD: Mật độ quang

µM: Micro mol/lít

ADN: Acid Deoxyribo Nucleic

EPI: Dẫn xuất epi-TTX

ANH: Dẫn xuất anh-TTX

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1.Vi khuẩn sinh TTX phân lập từ một số loài sinh vật biển 13

Bảng 3.1 Hàm lượng độc tố TTXs Cá Nóc vằn Takifugu oblongus Bloch, 1786 54 Bảng 3.2 Hàm lượng độc tố TTXs Cá Nóc chấm cam Torquigener pallimaculatus Hardy,

1983 56 Bảng 3.3 Hàm lượng độc tố TTXs Cá Nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris Bloch & Schneider, 1801 57

Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H và 13C NMR cùng các tương tác xa H-C của TTX 62 Bảng 3.5 Số lượng vi sinh vật phân lập từ 4 mô của 3 loài cá nóc độc 64 Bảng 3.6 Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 loại môi trường từ 3 loài cá nóc độc 65 Bảng 3.7 Số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX phân lập từ 4 mô của

3 loài cá nóc độc 67 Bảng 3.8 Số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh TTX trên 4 môi trường 68 Bảng 3.9 Kết quả phân tích định lượng hàm lượng TTXs có trong 500ml sinh khối của 24 chủng 69 Bảng 3.10 Kết quả phân loại một số chủng vi sinh vật sản sinh TTX hàm lượng cao 87 Bảng 3.11 Lựa chọn môi trường thích hợp 88 Bảng 3.12 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp 89 Bảng 3.13 Hàm lượng độc tố của chủng M30 và M37 trong điều kiện chỉnh pH ban đầu và chỉnh pH trong quá trình nuôi 90 Bảng 3.14 Hàm lượng độc tố của chủng M30 và M37 nuôi trong các đệm khác nhau 91 Bảng 3.15 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 92 Bảng 3.16 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 93 Bảng 3.17 Lựa chọn chế độ cung cấp khí thích hợp 95 Bảng 3.18 Lựa chọn loại tiền chất thích hợp 96 Bảng 3.19 Lựa chọn tỷ lệ tiền chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy 97 Bảng 3.20 Thời gian lắc giống khởi động 99 Bảng 3.21 Sinh trưởng của chủng vi khuẩn M30 và M37 trong quá trình lên men ở các lượng giống khởi động khác nhau .100 Bảng 3.22 Sinh trưởng và sinh tổng hợp TTX của các chủng vi khuẩn M30 và M37 trong quá trình lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau 102 Bảng 3.23 Sinh trưởng và sinh tổng hợp TTX của các chủng vi khuẩn M30 và M37 trong quá trình lên men ở các tốc độ thông khí khác nhau 104 Bảng 3.24 Lên men ở quy mô 5 lít cho 2 chủng vi khuẩn trong các điều kiện nuôi tối ưu 105 Bảng 3.25 Kết quả phân t ích TTX từ hai m ẫu sinh khối M30 v à M37 trên HPLC 109

Bảng 3.25 Kết quả phân tích trên HPLC các mẫu tách bằng lọc và ly tâm 110 Bảng 3.26 Kết quả phân tích TTX trên HPLC của các mẫu chiết xuất trong các nồng độ axit axetic khác nhau 112 Bảng 3.27 Kết quả phân tích TTX trên HPLC các mẫu theo các thông số ly tâm khác nhau 114 Bảng 3.28 Ảnh hưởng của các thành phần dịch giải hấp đến việc thu hồi độc tố TTX 121 Bảng 3.29 Kết quả phân tích định tính và định lượng các phân đoạn giải hấp theo tỷ lệ than hoạt tính/mẫu độc tố thô 122 Bảng 3.30 Kết quả định tính phần dịch rửa than từ các thí nghiệm 124 Bảng 3.31 Kết quả định tính và định lượng các phân đoạn với các thí nghiệm thay đổi tốc

độ dòng chảy qua cột sắc ký 126 Bảng 3.32 Kết quả phân tích hàm lượng TTX và dẫn xuất trên HPLC của dịch giải hấp từ sắc ký cột than hoạt tính 127 Bảng 3.33 Kết quả định lượng độc tố của dịch giải hấp với các mẫu độc tố ở pH khác nhau 129 Bảng 3.34 Định lượng TTX và các dẫn xuất của các dịch giải hấp ở nồng độ axit axetic khác nhau 131 Bảng 3.35 Kết quả định lượng các phân đoạn dịch giải hấp khi tiến hành tinh sạch trên cột sắc ký theo tỷ lệ gel Bio-Gel/mẫu khác nhau 132 Bảng 3.36 Hàm lượng TTX trong các phân đoạn chứa độc từ tinh sạch bằng cột Bio-Rex

70 (H+) 134 Bảng 3.37 So sánh hiệu suất thu hồi sản phẩm TTX qua các bước tinh sạch 140

Bảng 3.38 So sánh hiệu suất thu hồi sản phẩm TTX qua các bước tinh sạch 141

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo của TTX 4 Hình 1.2 Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX 5 Hình 1.3 Cấu trúc dạng lactone của họ TTX 6 Hình 1.4 Hai dạng tautome của Tetrodotoxin 6 Hình 1.5 Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX 7 Hình 1.9 Sự khác biệt về cấu trúc của nhóm độc tố TTX 9 Hình 1.10 Một số loài cá nóc biển chứa độc tố Tetrodotoxin 10 Hình 1.11 Một số động vật biển khác chứa Tetrodotoxin 11 Hình 1.12 Một số động vật trên cạn chứa Tetrodotoxin 11 Hình 1.13 Tiểu đơn vi lặp lại 28 Hình 1.14 Kênh ion (từ bên ngoài tế bào) 28 Hình 1.15 Màng với những kênh ion và ion natri đã bị hydrat hóa và TTX 28

Hình 2.1 Buồng trứng của cá Nóc Torquigener pallimaculatus trong mùa sinh sản 39

Hình 2.2 Phân tích TTX trên hệ thống HPLC 45

Hình 3.1 Cá Nóc vằn Takifugu oblongus Bloch, 1786 51 Hình 3.2 Cá Nóc chấm cam Torquigener pallimaculatus Hardy, 1983 52 Hình 3.3 Cá Nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris Bloch & Schneider, 1801 54

Hình 3.4 Sắc kí đồ của mẫu cá nóc 58 Hình 3.5 Phổ khối lượng của TTX 59 Hình 3.6 Phổ 13 C-NMR của TTX 60 Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của TTX 60 Hình 3.8 Phổ COSY của TTX 61 Hình 3.9 Phổ HMBC của TTX 61 Hình 3.10 Cấu trúc TTX ở dạng Hemilactal 63 Hình 3.11 Tỷ lệ % các chủng vi sinh vật phân lập được từ 3 loài cá nóc độc đã lựa chọn 64 Hình 3.12 Tỷ lệ % các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 mô cá nóc độc 65 Hình 3.13 Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 loại môi trường 66 Hình 3.14 Tỷ lệ % các chủng sinh TTX so với tổng số các chủng phân lập được trên 4 mô

cá nóc 67 Hình 3.15 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M6 70 Hình 3.16 Cây phát sinh chủng loại của chủng M6 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trật rADN 16S 71 Hình 3.17 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M8 72 Hình 3.18 Cây phát sinh chủng loại của chủng M8 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trật rADN 16S 72 Hình 3.19 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M10 73 Hình 3.20 Cây phát sinh chủng loại của chủng M10 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trật rADN 16S 74

Hình 3.21 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M19 75 Hình 3.22 Cây phát sinh chủng loại của chủng M19 với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự rADN 16S 75 Hình 3.23 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M28 76 Hình 3.24 Cây phát sinh chủng loại của chủng M28 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình rADN 16S 77 Hình 3.25 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M30 78 Hình 3.26 Cây phát sinh chủng loại của chủng M10, M19, M28, M30 và M43 với các loài

có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự rADN 16S 79 Hình 3.27 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M37 80 Hình 3.28 Cây phát sinh chủng loại của chủng M37 với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự rADN 16S 81 Hình 3.29 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M43 82 Hình 3.30 Cây phát sinh chủng loại của chủng M43 với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự rADN 16S 83 Hình 3.31 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M55 84 Hình 3.32 Cây phát sinh chủng loại của chủng M55 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trật tự rADN 26S 84 Hình 3.33 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M60 85 Hình 3.34 Cây phát sinh chủng loại của chủng M60 và các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình rADN 26S 86 Hình 3.35 Động học của quá trình lên men và khả năng sinh độc tố TTX của chủng M30 94 Hình 3.36 Động học của quá trình lên men và khả năng sinh độc tố TTX của chủng M37 94 Hình 3.37 Biều đồ so sánh kết quả phân tích bằng HPLC của các mẫu dịch từ 2 kỹ thuật lọc và ly tâm 111 Hình 3.38: Đồ thị biểu diễn hàm lượng TTX tinh sạch qua Bio-Gel ở các chế độ pH dịch mẫu khác nhau 129 Hình 3.40 Phương trình tương quan tỷ lệ chuột chết với liều uống TTX 146 Hình 3.41 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M30 148 Hình 3.42 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M37 148 Hình 3.43 Sinh khối vi sinh vật 150 Hình 3.44 Ly tâm mẫu sinh khối vi sinh 150 Hình 3.45 Cô quay giảm thể tích mẫu chiết 151 Hình 3.46 Đưa mẫu độc tố thô lên cột Bio Gel P2 153 Hình 3.47 Tinh sạch độc tố thô trên cột Bio Gel P2 154 Hình 3.48 Đưa mẫu độc tố thô lên cột Bio Rex 70 154 Hình 3.49 Kết tinh TTX 155

MỞ ĐẦU

Tetrodotoxin là một độc tố cực mạnh được chiết xuất chủ yếu từ cá Nóc Việc ứng dụng TTX đã được nghiên cứu để sử dụng làm thuốc gây tê, gây mê,… nhưng những năm gần đây, nhiều nhà khoa học Canada, Mỹ đã nghiên cứu sử dụng TTX là thuốc cai nghiện Ở nước ta, Dư Đình Động và cộng sự cũng đã nghiên cứu thành công sử dụng TTX kết hợp với bài thuốc cổ truyền

để làm thuốc cai nghiện và đang được tiến hành thử nghiệm trên các bệnh nhân cho kết quả khả quan

Ước tính cần khoảng 1200g TTX cho khoảng 2 triệu bệnh nhân chữa ung thư trong một tháng; 400 g TTX cho 2 triệu người cai nghiện trong 10 ngày (Peter Hoi-fu Yu và Chun Fai Yu, 2008) Những năm trước đây, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc hoặc động vật biển Nhưng vì hàm lượng TTX từ cá nóc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới tách chiết được 1 g TTX) nên giá thành của TTX rất cao (Peter Hoi-fu Yu và Chun Fai Yu, 2008) Hơn nữa, trữ lượng của cá nóc cũng ngày càng giảm trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng Để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học, nhưng giá thành của sản phẩm kiểu này không kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc (Peter Hoi-fu Yu và Chun Fai Yu, 2008)

Mặt khác, việc phát hiện ra nguồn gốc sinh học của TTX từ vi sinh vật

đã mở ra một hướng nghiên cứu mới đó là sinh tổng hợp TTX từ vi sinh vật

Nó vừa có thể chủ động sản xuất TTX trong điều kiện phòng thí nghiệm hoặc trong công nghiệp với số lượng lớn, vừa giảm được giá thành, độ tinh sạch lại cao

1 Tính cấp thiết

Trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tìm hiểu, khai thác và sử dụng các chất có hoạt tính sinh học cao từ sinh vật biển như: prolactin, oxytoxin, progesteron, estrion, các axit amin, aldosteron, và đặc biệt là các chất độc sinh học (biotoxin) phục vụ nền kinh tế quốc dân

Tetrodotoxin là một trong số các chất độc sinh học có hoạt tính sinh học cao, là chất độc thần kinh rất mạnh Chất này không chỉ được sử dụng trong khoa học để nghiên cứu sự vận chuyển ion Na+ qua màng tế bào, mà còn được sử dụng để điều chế thuốc gây tê, gây mê và thuốc kích thích sự hoạt động của hệ tuần hoàn, điều trị một số bệnh hiểm nghèo như các bệnh về tim mạch, ung thư, HIV-AIDS, làm thuốc cai nghiện, Vì vậy, nghiên cứu

“Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh sản Tetrodotxin trong

cá nóc độc Việt Nam và tách chiết TTX” là hết sức cần thiết

2 Mục tiêu đề tài

Tách chiết được TTX từ các chủng vi sinh vật phân lập trong cá nóc độc Việt Nam

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu chính là các chủng vi sinh vật sản sinh Tetrodotoxin phân lập từ cá nóc độc Việt Nam

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Lần đầu tiên tại Việt Nam xây dựng được quy trình công nghệ nuôi cấy và tách chiết được Tetrodotoxin từ vi sinh vật phân lập trên cá nóc độc Việt Nam Sản phẩm Tetrodotoxin tách chiết từ sinh khối vi sinh vật có chất lượng đạt tiêu chuẩn theo sản phẩm thương mại

- Tạo ra các dẫn liệu khoa học để làm tài liệu ứng dụng, tham khảo cho những người làm công tác giảng dạy, nghiên cứu, thiết kế chế tạo, sản xuất,

học viên, sinh viên và những người có quan tâm đến công nghệ nuôi cấy, tách chiết và phân lập Tetrodotoxin từ vi sinh vật

- Đối với tổ chức chủ trì đề tài và các đơn vị phối hợp: Nâng cao vị thế năng lực nghiên cứu của đơn vị và các cán bộ nghiên cứu Tăng cường gắn kết giữa tổ chức nghiên cứu với cơ sở sản xuất

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Sản phẩm Tetrodotoxin tách chiết từ sinh khối vi sinh vật có chất lượng đạt tiêu chuẩn sản phẩm thương mại tách chiết từ cá nóc (tương đương sản phẩm cùng loại của nước ngoài) sẽ góp phần giúp cho các ngành kinh tế (Y, Dược, thực phẩm ) chủ động trong sản xuất, hạn chế nhập khẩu

- Đối với cơ sở ứng dụng kết quả nghiên cứu: Giúp cho cơ sở tiếp cận được công nghệ mới Kết quả ứng dụng sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cho cơ

sở Giúp cơ sở gắn kết với đơn vị nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.1 TỔNG QUAN VỀ TETRODOTOXIN

Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc sinh học, có hoạt tính sinh học cao,

có bản chất phi protein nên khó bị phá hủy bởi nhiệt; là một hợp chất hữu cơ

dị vòng, có cấu trúc lưỡng cực, có liên kết nội phân tử với hemilactal và được phân loại như là một hợp chất aminohydroquinazoline (Goto T et al., 1965)

1.1 1 Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX

Tên tiếng Anh: Tetrodotoxin

Công thức phân tử : C11H17N3O8

Khối lượng phân tử: 319 g.mol−1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của TTX

Các dẫn xuất tạo ra từ TTX: anhydrotetrodotoxin, 4-epitetrodotoxin, epitetrodotoxin, nor-tetrodotoxin, quinazolin, acid tetrodoic,

6-TTX được phân lập đầu tiên từ loài cá nóc Nhật bản và sau đó được tìm thấy ở nhiều loài cá nóc khác cũng như ở một số loài sinh vật khác (Kazuo Shiomi et al., 1985) Cấu trúc của TTX được xác định lần đầu tiên năm 1964

bởi Goto và cs (Goto T và cs, 1965), Tsuda và cộng sự (Tsuda K và cs, 1964), Woodward (Woodward R.B,1964)

Sau đó các nhà khoa học đã tiến hành tổng hợp TTX nhưng chưa thực

sự thu được sản phẩm chất lượng ổn định Cùng với sự phát triển của khoa học, các thiết bị phân tích hiện đại ra đời, các dẫn xuất của TTX đã lần lượt được xác định cấu trúc và mối tương quan giữa cấu trúc và độc tính của chúng (Yotsu-Yamashita M và cs, 1999)

Năm 1988, khi nghiên cứu cấu trúc của TTX phân lập được từ thiên nhiên, Yasumoto và cộng sự (Yasumoto T và cs, 1998) đã thấy trên phổ NMR sự tồn tại ở 2 dạng tautome là hemilactal và lactone của TTX Giữa 2 dạng tautome này có sự chuyển hóa lẫn nhau như hình 1.4 tạo nên tỷ lệ nhất định giữa 2 tautome này và tỷ lệ đó tùy thuộc vào cấu trúc của từng dẫn xuất TTX

Hình 1.2 Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX

Hình 1.3 Cấu trúc dạng lactone của họ TTX

Hình 1.4 Hai dạng tautome của Tetrodotoxin

Hình 1.5 Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX

Theo tổng hợp của Yotsu-Yamashita (Yotsu-Yamashita, M, 2001), phương pháp đặc hiệu để phân tích TTX hiện nay là sử dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) nối ghép detector huỳnh quang (FLD) hoặc detector phổ khối (MSD), công cụ đắc lực nhất trong xác định cấu trúc TTX là phổ cộng

hiều (1H, 13C) và 2 chiều (COSY, NOESY… )

hất vẫn tồn tại Đun sôi

hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 c

1.1.2 Tính chất hóa lý của TTX

Dạng tồn tại: dạng tinh thể hoặc dạng bột màu trắng Ở trạng thái tự do

TTX tồn tại ở dạng hydrat C11H17O8N3.1/2 H2O (M = 328,28) (Đái Duy Ban, 2009)

Nhiệt độ nóng chảy: Tetrodotoxin có bản chất là phi protein, không bị

nhiệt phá huỷ, nấu chín hay phơi khô, sấy, độc c

(100oC) thì sau 6 giờ mới giảm được một nửa độc tính; muốn phá hủy hoàn

ong 10 phút (Đái Duy Ban, 2009), không

1.1.3 Đồng phân của TTX

™ 4 – epitetrodotoxin (4 – epiTTX)

ược tìm thấy qua phân tích HPLC, có khối lượng phân tử là 319,268 g/mol

ưng điểm khác biệt là

- C4 có hướng quay khác với cấu trúc của TTX (www.nextbio.com

toàn độc tính phải đun sôi ở 200oC tr

g chảy ở nhiệt độ 2000C, khi tăng nhiệt độ nó chuyển sang màu sẫm (khoảng 2200C trở lên) nhưng vẫn không bị nóng chảy (Yamashita M.Y., 2001)

Độ hòa tan: không tan trong dung môi hữu cơ, tan trong acid loãng, tan

nhẹ trong nước Không bền trong môi trường kiềm và môi trường acid mạnh: trong môi trường axit TTX chuyển thành hợp chất axit hydroclotetrodoic

C11H17O8N3HCl; trong môi trường kiềm TTX chuyển

epi TTX là một dạng dẫn xuất của TTX thuộc nhóm độc tố

đ

và công thức phân tử là C11H17N3O8 giống với TTX, nh

liên kết của nhóm OH tại vị trí

phân tử là C H N O , khác hoàn toàn so với TTX, đó là tại vị trí C và C cùng liên kết với nguyên tử O còn trong cấu trúc của TTX thì 2 vị trí đó mỗi

vị trí gắn với một nhóm OH (

N H

N H O

H OH

O

NH2OH

O

N H

N H O

H

OH

O

NH2OH

H OH

OH +

-4

O O

N H

N H O

H

OH

O

NH2O

H

OH

H OH+

10 7

3

1 4a

tố tarichatoxin từ sa giông và một số loài sinh vật khác, sau đó tarichatoxin được

ấp sử dụng như TTX (Mosher H.S.et al, 1964)

khác nhau ở các loài động vật khác nhau Vì vậy, trong một thời gian dài,

đã có r(PFP), mặc dù vậy hiểu biết về độc tố của tự nhiên còn hạn chế, cho đến

c coi là có ngunhất từ cá nóc Đến năm 1964, khi Mosher và cộng sự đã tách được độc

cung c

ừ cuối những năm 1960 trở đi, TTX được tách chiết từ nhiều ngu

75, TTX còn được

năm sau Sheumack et al., 1978 các nhà khoa h y TTX ở loài bạch

tuộc xanh (Hapalochlaena maculosa) (Sheum

Tetraodon sp Fugu sp

Fugu sp Fugu sp Fugu sp

gốc TTX vẫn là chủ đề còn nhiều bàn cãi Năm 1966 Trishananda và cộng sự đã công bố 4 trường hợp bị ngộ độc thực phẩm do ăn phải trứng sam

ở Thái Lan, điều này sau đó được khẳng định do trứng sam có chứa TTX (Trishananda et al, 1966) Ngoài ra, TTX cũng được tách ra từ cá bống dưới dạng tinh thể (Noguchi, T., Hashimoto, Y., 1973) Năm 19

ấy ở da ếch (Atelopus c Costa Rican (Kim Y.H et al, 1975) Ba

ọc đã tìm thấack et al., 1978)

Arothron meleagris

Hình 1.10 Một số loài cá nóc bi ển chứa độc t ố Tetrodotoxin

Một số động vật biển khác cũng chứa Tetrodotoxin gồm bạch tuộc tua

sp)

xanh Australia (Hapaloclaena maculosa), sao biển (Astropecten scoparius), cua xanthid mắt đỏ (Eriphia.sp.), cua hình móng ngựa (Carcinoscorpius rotundicauda), 2 loài cua Philippine (Zosimus aeneus và Atergatis floridus), một số ốc sên biển, động vật thân mềm (Nassarius

h tuộc tua xanh Australia

(Hap

Nhuyễn thể Tảo độc Vi khuẩn

Cua xanthid mắt đỏ (Eriphia.spp) Bạc

aloclaena maculosa)

Ốc tù và Cá bống Sao biển Sam

Hình 1.11 Một số động vật biển khác chứa Tetrodotoxin

.) Sa giông Taricha granulosa

Ngoài sinh vật biển, các sinh vật trên cạn bao gồm ếch Harlequin

(Atelopus sp.), ếch Costa Rican (Atelopus chiriquiensis), các loài sa giông thuộc chi Taricha (Taricha torosas,Taricha rirularis, T.granulosa) và chi

Diemictylus, các loài thuộc họ Salamandridae (Kì giông), loài chân bụng

Gastropod charonia saulinae cũng có chứa TTX

Hai loài ếch Harlequin (Atelopus sp

Hình 1.12 Một số động vật trên cạn chứa Tetrodotoxin

TTX tập trung nhiều ở trong gan, trứng, cơ quan sinh sản, ví dụ ở loài

Spheroides niphobles TTX có trong gan (1000µg/g), trong trứng (400µg/g),

trong da (40µg/g) Tuy nhiên, hàm lượng TTX không chỉ phụ thuộc vào loài, vào từng cơ quan, từng loại mô mà hàm lượng TTX còn phụ thuộc theo mùa, thông thường vào mùa sinh sản và đẻ trứng thì hàm lượng TTX là rất lớn (Diaz

Oshima Y and Konta T., 1981)

4.2 Các nghiên cứu sinh tổng hợp TTX từ vi sinh vật biển

ớng sử dụng T ược đang ngày hổ biến (chủ yếu

ch ản xuất thuố trước đây, TTX được tách chiết chủ yếu từ

cá óc hoặc động v ng vì hàm lượng TTX từ cá nóc rất thấp (1 kg trứng cá nóc độ h chiết được 1 g nên giá thành của

TT rất cao (Peter Hoi-f hun Fai Yu, 2008) Hơ ữa, trữ lượng của

cá c cũng ngày càng g khi nhu cầu tiêu thụ

của thị trường, m

TX lại ngày càng

tổ hợp TTX theo phươ oá học, nhưng gi ủa sản phẩm kiểu

nà hông kinh tế bằng phươ áp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc (Peter

Ho fu Yu và Chun

nguồn gốc sinh học củMặt khác, việc phát hiện

đã ở ra một hướ ới đó là sinh tổng hợp

TX trong điều kiện phòng

X từ vi sinh vật

hiệm htron công nghiệp v

Dưới đây l

n, vừa giảm được giá th nh, độ tinh sạch lại

vật iển khác nhau (bảng 1.1)

B ài

khuẩn

ảng 1.1.Vi khuẩn sinh TTX phân lập từ một số lo sinh vật biển

STT Loài vi Sinh vật mang Tài liệu tham khảo

vernicularis radiatus)

, 2000)

vermicularis)

Ruột sao biển (Narita H et al., 1987)

7 Shewanella putrefaciens Ruột cá nóc (Takifugu

tuộc vòng xanh (Octopus maculotus)

(Simon K.D et al., 200

14 Lysinibacillus fusiformis Fugu obscurus (Jun Wang et al, 2010)

15 Aeromonas sp Takifugu obscurus (Guimei Yang et al

2010)

16 Bacillus sp., Kytococcus

sedentarius and

Arothron hisp (Muller, 1841) ellulomonas fimi

Kết quả cho thấy rõ ràng là TTX được sản sinh từ vi khuẩn là không giới hạn trong những nhóm phân loại Những nhóm vi khuẩn khác nhau, cả Gram

vi sinh v

hoặc dẫn xuất TTX Đây cũng là một trong

lập được hai chủng

Shewa

âm và Gram dương đều có khả năng sản sinh ra độc tố Vậy thì tại sao lại có khá nhiều các nghiên cứu phân lập các vi sinh vật đó từ cá nóc Điều này được giải thích là do hàm lượng TTX trong cá nóc là khá cao; sản lượng

cá nóc trên thế giới cũng tương đối lớn nên quá trình đánh bắt, thu mua cá nóc cũng dễ dàng hơn các loài sinh vật khác Và đó là lý do vì sao có nhiều nghiên cứu đã chọn cá nóc làm vật chủ để thực hiện quá trình phân lập, nuôi cấy vi sinh vật sản sinh TTX Sau đây là một số nghiên cứu điển hình về vi sinh sản sinh TTX từ cá nóc :

Năm 1987, để xác minh lại khả năng sản sinh TTX của một số chủng

ật, USIO SIMIDU và cộng sự đã tiến hành nuôi cấy thử nghiệm 15

chủng thuộc họ Vibrionaceae, 5 chủng thuộc giống Alteromonas và một chủng E.coli trên môi trường ORI, ở nhiệt độ 20 oC trong 24-30 giờ Sau khi phân tích bằng HPLC, nhóm tác giả này đã xác minh được 15 chủng thuộc họ Vibrionaceae có khả năng sinh TTX

những nghiên cứu thử nghiệm, kiểm tra tính xác thực của các nghiên cứu trước đã công bố (USIO SIMIDU et al., 1987)

Năm 1995, Kendo Matsumura đã nghiên cứu tìm kiếm môi trường

thích hợp để vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá nóc Fugu niphobles

có khả năng sản sinh TTX với hàm lượng cao Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng TTX là khá cao: 27,2 MU/ml (Kendo Matsumura, 1995)

Năm 2007, Venmathi Maran và cộng sự đã phân

nella woodyi và Roseobacter sp từ một loài chân khớp sống ký sinh trên da cá nóc Takifugu pardalis Tác giả cho rằng, các chủng vi khuẩn sản

sinh TTX với một hàm lượng rất nhỏ Do vậy, đòi hỏi các nhà khoa học cần phải nghiên cứu, sàng lọc chủng vi khuẩn nào có khả năng sản sinh TTX với

hàm lượng cao Đồng thời, cần phải tìm ra được các điều kiện tối ưu như nhiệt

iao-Jie Wang và cộng sự (2008) đã nuôi cấy thử nghiệm một số chủng

vụ cho y dược (Peter Hoi-fu Yu và Chun Fai Yu, 2008)

trên các môi trường khác nhau từ các

độ, pH, chế độ dinh dưỡng, thời gian nuôi ủ để vi khuẩn đó tạo sinh khối theo ý muốn Đây chính là một trong những vấn đề mà nhiều nhà khoa học đã và đang cần phải nghiên cứu trong thời gian tới (Đ Trường, 2009)

X

vật sinh TTX phân lập từ động vật biển chân bụng Kết quả là có một

số vi sinh vật phân lập trên môi trường ORI, TCBS sinh độc tố TTX với hàm lượng khác nhau Chủng sinh hàm lượng thấp nhất là 5ng/g, chủng cao nhất là 184ng/g (Xiao-Jie Wang et al., 2008)

Trong cùng năm 2008, Pete

một số chủng Vibrios sinh TTX đã được các n

các điều kiện thích hợp để thu sinh khối có hàm lượng TTX cao Kết quả thật bất ngờ khi nhóm nghiên cứu cho rằng có thể thu được từ 0,5g đến 1,5 g TTX/1 lít sinh khối vi si

triển vọng cho một hướng đi mới cho ngành công ng

Theo kết quả nghiên cứu của Simon và cộng sự (2009) cho rằng độc tố

phân tích từ dịch nuôi sinh khối của loài Shewanella sp., phân lập từ cá nóc

sau khi nuôi ở nhiệt độ 250C, thời gian 10 ngày trên môi trường MB (Marine Broth), có thể giết được chuột 20 gam trong vòng từ 5 đến 7 phút (Simon K.D

et al, 2009)

Năm 2010, Bragadeeswaran S và cộng sự đã phân lập và định tên được

ba chủng vi sinh có khả năng sinh TTX là Bacillus sp., Kytococcus

sedentarius and Cellulomonas fimi từ cá nóc Arothron hispidus (Muller,

1841)

Như vậy, các nghiên cứu định tính và định lượng để thu nhận TTX ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau,