Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme để sản xuất sản phẩm protein thuỷ phân từ cá tạp và phế liệu trong nhà máy chế biến cá

DANH MỤC CÁC HINH 1 Hình 1 Thống kê lượng và kim ngạch xuất khẩu một số nhóm hàng thủy sản trong 6 tháng đầu năm 2010 2 Hình 2 Hình thái tế bào của các chủng phân lập từ cá tạp và phế li

CÔNG TY CP DỊCH VỤ VÀ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN HẠ LONG

*********************

CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Chủ nhiệm đề tài: CN Phạm Thị Hải Âu

Thời gian thực hiện: 1/2009 đến 06/2011

9393

HÀ NỘI – 2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU _ 7 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU _ 10 1.1 Tình hình khai thác, sử dụng cá tạp và phế liệu cá trong nước và trên thế giới _10 1.1.1 Tính hình khai thác và sử dụng cá tạp trên thế giới và ở Việt Nam 10 1.1.2 Tình hình sử dụng phế liệu cá trên thế giới và ở Việt nam 13 1.2 Tình hình ứng dụng enzym protease thương phẩm để thuỷ phân protein cá trong nước và trên thế giới 16 1.2.1 Tình hình ứng dụng enzym protease thương phẩm để thủy phân protein

cá trong nước và trên thế giới 16 1.2.2 Nguồn enzym protease 19 1.2.3 Một số enzym protease vi sinh vật đã được thương mại hóa [24, 25, 31, 37; 41; 50] _19 1.2.4 Cơ chế xúc tác của protease trong quá trình thủy phân protein _20 1.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzym [3; 4; 16] _20 1.3 Hệ vi sinh vật trong cá và giải pháp ức chế 22 1.3.1 Hệ vi sinh vật trong cá và cơ chế hoạt động của vi khuẩn gây thối ở cá 22 1.3.2 Một số giải pháp ức chế vi sinh vật có hại cho quá trình thủy phân _24 1.4 Nghiên cứu giải pháp thu hồi chất béo _27 1.4.1 Đặc điểm của chất béo trong dịch cá thủy phân _27 1.4.2 Một số phương pháp tách chất béo _28 1.5 Nghiên cứu giải pháp làm sạch dịch thủy phân _29 1.5.1 Đặc điểm của dịch cá thủy phân _29 1.5.2 Một số phương pháp làm sạch dịch thủy phân 29 1.6 Một số phương pháp sấy để tạo chế phẩm dạng bột _30 1.6.1 Bản chất của quá trình sấy [5] 30 1.6.2 Đặc điểm của phương pháp sấy thăng hoa và sấy phun _32 1.7 Một số chất bảo quản được phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm _32

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP _ 35 2.1 Nguyên liệu 35 2.1.1 Nguyên liệu _35 2.1.2 Hóa chất _35 2.2 Phương pháp _36 2.2.1 Phương pháp thu thập thông tin điều tra khảo sát _36 2.2.2 Phương pháp lấy mẫu _36 2.2.3 Phương pháp phân tích 36 2.2.4 Phương pháp công nghệ _37

3.2 Phân tích thành phần sinh hóa của cá tạp và phế liệu cá trong các nhà máy chế biến thủy sản _48 3.3 Nghiên cứu giải pháp ức chế hệ vi sinh vật phân hủy protein gây thối trong quá trình thủy phân 50 3.3.1 Xác định hệ vi sinh vật có mặt trong khối cá tạp và phế liệu của nhà máy chế biến cá 50 3.3.2 Nghiên cứu giải pháp ức chế hệ vi sinh vật có hại cho quá trình thủy phân protein _54 3.4 Nghiên cứu xây dựng qui trình thủy phân protein của cá tạp và phế liệu cá bằng enzym protease thương phẩm _60 3.4.1 Xác định hoạt độ enzym thương phẩm sử dụng _61 3.4.2 Khảo sát và lựa chọn enzym 61 3.4.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính xúc tác của enzym alcalase _63 3.4.4 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ nước bổ sung/nguyên liêu 64 3.4.5 Lựa chọn các yếu tố ảnh hưởng _65 3.5 Nghiên cứu giải pháp thu hồi chất béo _78 3.5.1 Nghiên cứu lựa chọn giải pháp thu hồi chất béo 78 3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tách chất béo _78 3.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng chất béo trong dịch sau tách 79 3.6 Nghiên cứu tạo sản phẩm từ dịch thủy phân _79 3.6.1 Xác định điều kiện khử mùi cho dịch thủy phân dùng cho người _79 3.6.2 Xác định thời gian cô đặc tạo sản phẩm giàu axit amin dạng lỏng cho người và cho chăn nuôi _81 3.6.3 Lựa chọn chất bảo quản thích hợp cho sản phẩm dạng dịch _82 3.7 Nghiên cứu tạo sản phẩm giàu axit amin dạng bột 84 3.8 Nghiên cứu qui trình sản xuất sản phẩm phụ từ sản phẩm thừa sau thủy phân _86 3.9 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột và dịch thủy phân protein cá giầu axit amin 87 3.10 Sản xuất protein thủy phân từ cá tạp và phế liệu cá trên mô hình đã xây dựng tại xưởng thực nghiệm _95 3.11 Kết quả phân tích chất lượng sản phẩm dịch và bột đạm thủy phân cho người và cho chăn nuôi sản xuất trên mô hình thực nghiệm 97 3.12 Ứng dụng và giới thiệu sản phẩm 98 3.13 Công bố TCCS và thiết kế bao bì, nhãn mác 102 3.14 Tính giá thành sản phẩm 103

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO _ 107

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BOD Nhu cầu ô xy sinh học

CP Cổ phần

FAO Tổ chức lương thực và nông nghiệp của Liên Hiệp Quốc FishanimalP Bột dịch đạm thủy phân dùng cho chăn nuôi

FishanimalE Dịch đạm thủy phân dùng cho chăn nuôi

Fisamin P Bột đạm thủy phân dùng cho người

FisaminE Dịch đạm thủy phân dùng cho người

PCA Môi trường nuôi cấy để phát hiện vi khuẩn hiếu khí

TM Thương mại

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TSA Môi trường nuôi cấy đặc

TSB Môi trường nuôi cấy lỏng

DANH MỤC CÁC HINH

1 Hình 1 Thống kê lượng và kim ngạch xuất khẩu một số nhóm hàng thủy

sản trong 6 tháng đầu năm 2010

2 Hình 2 Hình thái tế bào của các chủng phân lập từ cá tạp và phế liệu cá

3 Hình 3 Hình thái khuẩn lạc một số chủng phân lập trên môi trường đặc hiệu

4 Hình 4 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng của các chủng

phân lập

5 Hình 5 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng phân lập

6 Hình 6 Ảnh hưởng của nisin đến sinh trưởng của các chủng phân lập

7 Hình 7 Ảnh hưởng của pH và nisin đến sinh trưởng của các chủng phân lập

8 Hình 8 Mặt đáp trị của hiệu suất thủy phân phụ thuộc vào thời gian và nhiệt

độ

9 Hình 9 Hiệu suất thủy phân phụ thuộc nhiệt độ và tỷ lệ enzym/ nguyên liệu

10 Hình 10 Mặt đáp trị của hiệu suất thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ và pH

11 Hình 11 Mặt đáp trị của hiệu suất thủy phân phụ thuộc vào thời gian và tỷ lệ

enzym/ nguyên liệu

12 Hình 12 Mặt đáp trị của hiệu suất thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ và pH

13 Hình 13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm ẩm và hiệu suất thu hồi

14 Hình 14 Ảnh hưởng của tốc độ nhập liệu đến hàm ẩm và hiệu suất thu hồi

15 Hình 15 Quy trình sản xuất sản phẩm giàu axit amin dạng bột (FISAMINP)

dùng cho người

16 Hình 16 Quy trình sản xuất sản phẩm giàu axit amin dạng dịch (FISAMINE)

dùng cho người

17 Hình 17 Quy trình sản xuất sản phẩm giàu axit amin dạng bột

(FISHANIMALP) dùng cho chăn nuôi

18 Hình 18 Quy trình sản xuất sản phẩm giàu axit amin dạng dịch

(FISHANIMALE) dùng cho chăn nuôi

19 Hình 19 Quy trình sản xuất bột cá từ các sản phẩm thừa của quá trình thủy

phân

20 Hình 20 Hình ảnh các thiết bị trong mô hình sản xuất quy mô pilot

21 Hình 21 Hình ảnh sản xuất thực nghiệm quy mô pilot

22 Hình 22 Biểu đồ sinh trưởng của lô thí nghiệm và lô đối chứng

23 Hình 23 Hình ảnh ứng dụng trong nuôi cá Giò tại Vân Đồn - Quảng Ninh

24 Hình 24 Hình ảnh nhãn mác và sản phẩm của đề tài

DANH MỤC CÁC BẢNG

TT Bảng Nội dung

1 Bảng 1 Tỷ lệ cá tạp khai thác hàng năm giai đoạn 2000-2003 ở một số

nước

2 Bảng 2 Tổng hợp sản lượng khai thác của các vùng

3 Bảng 3 Số liệu điều tra loại hình sử dụng cá tạp

4 Bảng 4 Thành phần hóa học của phế liệu cá

5 Bảng 5 Tỷ lệ chất thải trong quá trình chế biến thủy sản

6 Bảng 6 Một số vi sinh vật thường tìm thấy trên cá

7 Bảng 7 Một số đặc tính chủ yếu của thiết bị sấy thông dụng

8 Bảng 8 Mục tiêu và tầm quan trọng của các yếu tố

9 Bảng 9 Danh sách các doanh nghiệp chế biến thủy sản gửi phiếu điều tra

10 Bảng 10 Tổng hợp kết quả về tình hình sử dụng cá tạp và phế liệu cá trong

các nhà máy chế biến thủy sản

11 Bảng 11 Kết quả đánh giá cảm quan mẫu cá tạp và phế liệu cá

12 Bảng 12 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của cá tạp và phế liệu

cá

13 Bảng 13 Hình thái và đặc tính sinh hóa của các chủng phân lập

14 Bảng 14 Hình thái khuẩn lạc và kết quả thử sinh hóa của các nhóm vi sinh

vật phân lập từ cá tạp

15 Bảng 15 Hệ vi sinh vật trong khối cá tạp và phế liệu cá

16 Bảng 16 Ảnh hưởng của NaCl đến sự phát triển của các chủng vi sinh vật

phân lập từ cá tạp và phế liệu cá

17 Bảng 17 Ảnh hưởng của giải pháp ức chế bằng giảm pH đến sự sinh trưởng

của các chủng vi sinh vật trong cá

18 Bảng 18 Ảnh hưởng của nisin đến sự phát triển của các chủng phân lập từ

cá tạp và phế liệu cá

19 Bảng 19 Ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp giải pháp giảm pH môi

trường và nisin đến sự phát triển của các vi sinh vật có mặt trong

cá

20 Bảng 20 Kết quả khảo sát nguyên liệu cá tạp và phế liệu cá

21 Bảng 21 Hoạt độ protease của một số enzym thương phẩm

22 Bảng 22 Khả năng thủy phân cá của một số enzym thương phẩm

23 Bảng 23 Thành phần axit amin trong dịch sau thủy phân bằng enzym

24 Bảng 24 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến quá trình thủy phân phế liệu

cá

25 Bảng 25 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến quá trình thủy phân

26 Bảng 26 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym/ nguyên liệu đến quá trình thủy phân

protein cá

27 Bảng 27 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân protein cá

28 Bảng 28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein cá

30 Bảng 30 Mô hình thí nghiệm và kết quả thu được theo mô hình

31 Bảng 31 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân cá tạp

32 Bảng 32 Mô hình thí nghiệm và kết quả thu được theo mô hình

33 Bảng 33 Kết quả tối ưu hóa thủy phân phế liệu cá

34 Bảng 34 Kết quả thủy phân protein cá tạp và phế liệu cá theo các thông số

tối ưu

35 Bảng 35 Ảnh hưởng của phương pháp tách đến lượng chất béo thu được

36 Bảng 36 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng chất béo thu hồi

37 Bảng 37 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng chất béo trong dịch sau

tách

38 Bảng 38 Ảnh hưởng của thời gian xử lý than hoạt tính

39 Bảng 39 Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính đến chất lượng cảm quan

40 Bảng 40 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý than hoạt tính đến chất lượng dịch

41 Bảng 41 Ảnh hưởng của thời gian cô chân không đến hàm lượng chất khô

42 Bảng 42 Ảnh hưởng của một số chất bảo quản đến tổng số vi khuẩn hiếu

khí trong sản phẩm dạng dịch (CFU/ml)

43 Bảng 43 Ảnh hưởng của phương pháp sấy tới hàm ẩm của bột xương

44 Bảng 44 Danh mục các thiết bị trong mô hình sản xuất quy mô pilot

45 Bảng 45 Kết quả thủy phân ptotein cá tạp ở quy mô xưởng thực nghiệm

46 Bảng 46 Kết quả thủy phân protein phế liệu cá ở quy mô xưởng thực

nghiệm

47 Bảng 47 Chất lượng sản phẩm dịch và bột đạm thủy phân

48 Bảng 48 Thành phần axit amin trong dịch thủy phân

49 Bảng 49 Kết quả kiểm tra tăng trưởng

50 Bảng 50 Bảng cân đối lượng thức ăn sử dụng

51 Bảng 51 Chất lượng nước mắm sau bổ sung bột đạm thủy phân từ cá tạp

52 Bảng 52 Sơ lược tính giá thành cho 100kg sản phẩm

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có điều kiện thiên nhiên ưu đãi để phát triển nuôi trồng và chế biến thủy sản Ngành thuỷ sản Việt Nam đang từng bước khẳng định vị thế của mình trong lĩnh vực xuất khẩu thủy sản Hàng thủy sản của Việt Nam đã có mặt ở

164 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới với kim ngạch xuất khẩu đạt 4,3 tỷ USD năm 2009 Theo Tổng cục thủy sản, xuất khẩu thủy sản năm 2010 đạt 4,94 tỷ USD Tổng sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản ước đạt 5,2 triệu tấn (tăng 7,2% so với năm 2009 và 30% so với mục tiêu kế hoạch 5 năm 2006 – 2010) [2] Tổng sản lượng thủy sản khai thác năm 2008 là 2136,41 nghìn tấn Theo đó đến năm 2020, kinh tế thủy sản đóng góp 30 – 35% GDP trong khối nông – lâm – ngư nghiệp, tốc

độ tăng giá trị sản xuất 8 – 10%/năm, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 8 – 9 tỷ USD [2]

Việc đánh bắt, chế biến thủy sản xuất khẩu luôn luôn đi kèm theo một lượng phế phụ phẩm khá lớn Theo thống kê của tổ chức FAO lượng phế phụ phẩm bao gồm: Đầu, xương, da vây vẩy, thịt vụn và ruột cá thải ra trong quá trình chế biến đồ hộp chiếm từ 30 – 65%; trong sản xuất cá phi-lê, cá khô, cá muối, cá xông khói chiếm từ 50 – 75% [2]

Theo Hiệp hội thủy sản Việt Nam (VASEP), tại Đồng Bằng Sông Cửu Long hiện có trên 70 nhà máy chế biến mặt hàng fillet cá tra trong năm 2006, với 800.000 tấn cá nguyên liệu được đưa vào chế biến, chỉ thu được chưa đầy 300.00 tấn fillet và thải ra hơn 500.000 tấn phụ phẩm Năm 2007, nếu sản lượng cá nguyên liệu đạt 1.000.000 tấn thì các nhà máy chế biến phải thải ra thị trường hơn 600.000 tấn phụ phẩm cá tra [9]

Theo báo cáo "Đánh giá tác động môi trường trong lĩnh vực chế biến thủy sản năm 2002" của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn thì tác nhân gây hại cho môi trường xác định với tổng lượng chất thải rắn (đầu, xương, da, vây, vẩy ) ước khoảng 200.000 tấn/năm Cho đến nay, phế thải của nhà máy vẫn được sử dụng để sản xuất dầu diezel; phần lớn còn lại bán cho tư nhân dùng làm thức ăn chăn nuôi hoặc tiêu hủy Đặc điểm của loại chất thải này là dễ lên men thối rữa, nguyên nhân

do hoạt động của vi sinh vật có ở phế liệu và phân hủy rất nhanh dưới các điều kiện thời tiết nóng ẩm Việc phân hủy các chất thải này tuy không gây độc nhưng cũng tạo ra sự thay đổi lớn cho chất lượng môi trường sống của người lao động tại các cơ

sở chế biến thủy sản cũng như dân cư sống ở vùng phụ cận

Theo kết quả khảo sát của Dự án Cages (năm 2000) thì 25% cá tạp được dùng để sản xuất nước mắm; 30% cho chăn nuôi heo, gà; 30% cho nuôi trồng thủy sản; 15% cá tạp dùng cho các mục đích khác Đây là nguồn nguyên liệu được đánh giá vô cùng dồi dào cho sản xuất thức ăn cho người, cho nuôi trồng thủy sản và cho chăn nuôi [19]

Một số nước trên thế giới đã sử dụng phế thải thủy sản để sản xuất một số sản phẩm có giá trị cao Ở Nhật Bản, người ta sử dụng phế phụ phẩm của cá ngừ như xương cá được dùng để làm bột xương, có giá trị cao trong điều trị bệnh thiếu canxi cho trẻ em, mỡ cá, mật cá ngừ để tách chiết axit béo không no DHA, EPA và các axit amin dùng cho y dược v.v Tại Malaysia, cá tạp là nhóm cá không được sử dụng trực tiếp cho nhu cầu của con người, mà chủ yếu làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản Khoảng 90% trang trại nuôi cá biển sử dụng nhóm cá này làm thức ăn [27]

Ở Philippin, cá tạp chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản, khoảng 144,638 tấn, chiếm 7% tổng sản lượng thủy sản năm 2003 [30]

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ, ngành công nghệ sinh học đã có những bước phát triển vượt bậc Những thành tựu công nghệ sinh học đã mang lại cho ngành công nghiệp thực phẩm là cải tiến quá trình chế biền từ nguyên liệu thô đến sản phẩm cuối cùng, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm, nâng cao giá trị dinh dưỡng và đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm Thêm vào đó, công nghệ sinh học cung cấp những phương pháp để cải tiến nâng cao chất lượng nguyên liệu thô, cải thiện hương liệu tự nhiên và các chất màu, phụ gia thực phẩm (như là các enzyme, các chất tạo nhũ tương) và cải tiến các quá trình sản xuất thân thiện hơn với môi trường, cũng như sản xuất ra các loại bao

bì thực phẩm dễ phân hủy và có khả năng kháng khuẩn

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trong chế biến tại các nhà máy chế biến cá tại một số địa bàn trọng điểm Với mong muốn nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn đạm protein thủy phân từ cá tạp và phế liệu cá Đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym để sản xuất sản phẩm protein thủy phân từ cá tạp và phế liệu trong nhà máy chế biến cá” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất dịch và bột protein cá thủy phân bằng enzym proteaza thương phẩm sử dụng cho chăn nuôi

- Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất dịch và bột protein thủy phân bằng enzym proteaza thương phẩm sử dụng cho người

- Xây dựng được qui trình sản xuất sản phẩm phụ từ sản phẩm thừa sau thủy phân

Nội dung nghiên cứu

1 Thu thập thông tin, điều tra khảo sát

2 Phân tích thành phần sinh hóa của cá tạp và phế liệu cá

3 Nghiên cứu giải pháp ức chế vi sinh vật phân hủy protein gây thối trong quá trình thủy phân

4 Nghiên cứu xây dựng quy trình thủy phân protein của cá tạp và phế liệu cá bằng enzym protease thương phẩm

5 Nghiên cứu giải pháp thu hồi chất béo

6 Nghiên cứu công nghệ tạo chế phẩm giầu axit amin dạng lỏng và dạng bột cho người và cho chăn nuôi

7 Nghiên cứu qui trình sản xuất sản phẩm phụ từ sản phẩm thừa sau thủy phân

8 Thiết kế bao bì, nhãn mác và công bố tiêu chuẩn cơ sở

9 Ứng dụng sản phẩm giầu axit amin làm thức ăn cho người và cho chăn nuôi

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình khai thác, sử dụng cá tạp và phế liệu cá trong nước và trên thế giới

1.1.1 Tính hình khai thác và sử dụng cá tạp trên thế giới và ở Việt Nam

Cá tạp “bycatch” là sản phẩm đánh bắt nhưng không sử dụng hoặc đánh bắt ngoài ý muốn [9] Khai thác cá tạp đang là mối quan tâm lớn liên quan đến công tác bảo vệ nguồn lợi thủy sản và chiến lược phát triển nghề cá nói chung Việc khai thác và sử dụng cá tạp được nhiều quốc gia đặc biệt là khu vực Châu Á Thái Bình Dương quan tâm Theo đánh giá của trung tâm phát triển nghề cá Đông Nam Á (SEAFDEC), nguồn số liệu và thông tin xác thực về tính hình khai thác và sử dụng

cá tạp là chưa đầy đủ Theo số liệu năm 2003, sản lượng khai thác hải sản của thế giới đạt 85,88 triệu tấn, tỷ lệ cá tạp chiếm 40,4%, vậy sản lượng cá tạp khai thác hàng năm là 34,69 triệu tấn [9] Số liệu khảo sát tình hình khai thác thủy hải sản ở một số quốc gia trong giai đoạn 2000 – 2004 và chỉ tập trung ở nghề kéo lưới cho thấy (bảng 1)

Bảng 1 Tỷ lệ cá tạp khai thác hàng năm giai đoạn 2000 -2003 ở một số nước [9]

TT Quốc gia Tổng sản lượng hải sản

khai thác (tấn)

Số lượng cá tạp (tấn)

Tỷ lệ cá tạp (%)

Tại Malaysia, cá tạp là nhóm cá không được sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho người, mà chủ yếu làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản Có khoảng 90% trang trại nuôi cá biển, sử dụng cá tạp làm thức ăn Năm 2003, nhóm cá tạp chiếm khoảng

32% tổng sản lượng khai thác hải sản của Malaysia (khoảng 1,28 triệu tấn) [28] Ở Philippin, cá tạp chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản [9]

Theo thống kê chính thức của Trung Quốc năm 2003 cho thấy sản lượng khai thác hải sản đạt 9.730.000 tấn, trong đó cá tạp chiếm 2,16 triệu tấn, chiếm khoảng 22% tổng sản lượng khai thác [28]

Ở Việt Nam, cá tạp được khai thác bằng hầu hết các loại hình như: Lưới kéo đáy, lưới vây, chụp mực, vó, mành, te, đáy v.v trong đó chủ yếu được khai thác bằng nghề lưới kéo đáy Do nhu cầu tiêu thụ cá gia tăng, đặc biệt trong nuôi trồng thủy sản nên cá tạp trở thành nhóm hàng hóa thu hút được sự quan tâm Theo ước tính của Viện Nghiên cứu Hải sản (2002), sản lượng cá tạp khoảng 0,93 triệu tấn trong tổng sản lượng khai thác hải sản khoảng 2,56 triệu tấn (chiếm 36,3% tổng sản lượng khai thác) [15]

Theo số liệu thống kê của Hải quan Việt Nam, trong giai đoạn 2006-2008, tốc độ tăng xuất khẩu hàng thuỷ sản đạt trung bình 19%/năm Sau mức giảm 5,5% của năm 2009, xuất khẩu thuỷ sản trong 6 tháng đầu năm 2010 đạt 2,02 tỷ USD, tăng 14,5% so với cùng kỳ năm 2009 Cơ cấu mặt hàng xuất khẩu thủy sản của nước ta trong giai đoạn 6 tháng đầu năm 2010 chủ yếu bao gồm cá (52%), tôm (35%), mực và bạch tuộc (9%), các loại thuỷ sản khác (4%), trong đó cá chiếm tỷ lệ cao nhất [12]

Hình 1 Thống kê lượng và kim ngạch xuất khẩu một số nhóm hàng thủy sản

trong 6 tháng đầu năm 2010 [12]

Trong khuôn khổ dự án hợp tác giữa Úc và Việt Nam “Khảo sát tình hình sử dụng cá tạp và phụ phẩm chế biến cá như là thành phần thức ăn nuôi trồng thủy sản

2004 cho rằng tỷ lệ cá tạp chiếm khoảng 36% tổng sản lượng khai thác và số liệu

sản lượng cụ thể theo các vùng như sau (bảng 2) [19]

Bảng 2 Bảng tổng hợp sản lượng khai thác của các vùng [9]

Vùng đánh bắt Tổng sản lượng

(tấn)

Cá tạp (tấn)

Giá trị cá tạp (triệu đồng)

Theo Nguyễn Văn Lung và cộng sự (2009), tổng sản lượng khai thác hải sản

của Việt Nam (tính cho 10 tháng trong năm) khoảng 1.689,784 tấn, trong đó cá tạp

chiếm tỷ lệ 41,48%, cá non chiếm tỷ lệ 54,24% trong tổng sản phẩm cá tạp Cá non

bị khai thác nhiều nhất trong thời gian từ tháng 5 -8 và tập trung khai thác ở vùng

biển ven bờ, độ sâu < 30m [9]

Cá tạp ở Việt Nam hiện đang được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau

trong đó chủ yếu tập trung vào 6 hình thức chính bao gồm: Làm thức ăn trực tiếp

phục vụ nuôi trồng thủy sản, chế biến bột cá, chế biến cá khô (phơi, hấp), chế biến

chượp, nước mắm, chế biến chả cá và làm thực phẩm cho con người [9]

Bảng 3 Số liệu điều tra loại hình sử dụng cá tạp [9]

TT Hình thức sử dụng Lượt điều tra Tỷ lệ (%)

6 Bán buôn lại cho các cơ sở nuôi trồng thủy

sản, chăn nuôi gia súc

Theo báo cáo tổng kết nhiệm vụ khoa học kỹ thuật cấp Bộ Nông nghiệp và

phát triển nông thôn, năm 2008 có khoảng 115 nghìn tấn nguyên liệu cá tạp được sử

dụng để sản xuất cá khô (ứng với 28767, 83 tấn cá khô); khoảng 160 nghìn tấn cá

tạp dùng cho sản xuất bột cá (ứng với 39 792,5 tấn bột cá) Lượng cá tạp sử dụng

trong sản xuất nước mắm khoảng 190 – 195 nghìn tấn Các loài cá được dùng chủ

yếu là cá cơm Stolephorus sp, cá trích Sardinella sp, cá lẹp Thryssa [15]

Theo Nguyễn Văn Lung và cộng sự, cá tạp sử dụng trực tiếp làm thức ăn nuôi trồng thủy sản chiếm khoảng 37% tổng sản lượng cá tạp (chế biến bột cá 36%, 27% còn lại dùng để chế biến cá khô, làm chượp, nước mắm, cá hấp, chả cá v.v) Qua tính toán cho thấy nhu cầu cá tạp làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản năm

2009 là 2,9 – 3,0 triệu tấn (để đạt sản lượng nuôi 2,6 triệu tấn) [9] Trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là nuôi cá bè, cá tạp được sử dụng làm thức ăn cho cá Lượng cá tạp dùng làm thức ăn nuôi thủy sản ước tính trong khoảng 176 420 – 323.400 tấn Trong đó sử dụng trong nuôi trồng thủy sản nội địa khoảng 64.800-180.000 tấn và nuôi thủy sản ven biển khoảng 71.820-143.640 tấn cá tạp [15]

Để nâng cao giá trị sử dụng của cá tạp, Nguyễn Văn Lệ và cộng sự năm 1999

đã nghiên cứu chế biến một số loại cá tạp thành các sản phẩm có giá trị như Surimi,

cá khô tẩm gia vị và chả cá [20]

1.1.2 Tình hình sử dụng phế liệu cá trên thế giới và ở Việt nam

Theo đánh giá của tổ chức FAO, hàng năm có khoảng 25-30 triệu tấn trong tổng sản lượng cá thế giới bị loại bỏ do việc xử lý không tốt và nhiều lí do khác [30] Bên cạnh đó, một số lượng tương đương cũng bị loại bỏ trong quá trình chế biến Các phế phụ phẩm của quá trình chế biến cá được sinh ra trong các bước sau:

Phân loại cá: cá bỏ đi

Moi ruột, cắt và phi lê: Đầu, phần bỏ đi và đuôi

Lột da và cắt: Da, vụn thịt và xương

Các phế liệu cá sinh ra trong quá trình chế biến bao gồm: Phần bỏ đi, phế liệu, đầu, da, đuôi và xương Tỷ lệ phần trăm phụ phẩm và các chất thải rắn sinh ra dao động từ 30 -65% (đối với chế biến đồ hộp); 50 -70% (đối với phi lê, làm khô, ướp muối, xông khói) [30] Phế phụ phẩm thủy sản là loại chóng bị hư hỏng do chúng chứa nhiều vi sinh vật và nhiều enzym trong nội tạng Thành phần hóa học của phế liệu cá được tổng hợp trong bảng 4

Bảng 4 Thành phần hóa học của phế liệu cá [21]

Phế liệu Thịt

(%) Xương (%) Nước (%) Mỡ (%) Protein (%) Tro (%) Đầu 12-21 ~ 56 52 -77 0,3 – 2,3 10 – 21 4 – 5

Xương + mang 8-12 ~ 34 53 -83 0,5 – 2,5 10 -21 2 – 12

Cho đến nay, phần lớn phế liệu và phế phụ phẩm sinh ra trong quá trình chế biến đều được đưa đến nhà máy để sản xuất bột cá và dầu cá Bột cá được sử dụng làm thức ăn nuôi động vật và phân bón và dầu cá có thể sử dụng làm dầu diezel sinh học Phần phế liệu da và xương còn được dùng để sản xuất gelatin và colagen [11]

Một số nước đã sử dụng phế thải thủy sản để sản xuất một số sản phẩm có giá trị cao Nhật Bản đã sử dụng phế phụ phẩm từ cá ngừ như: xương cá để sản xuất bột xương có giá trị cao trong điều trị bệnh thiếu canxi cho trẻ em, mỡ cá, mật cá ngừ để tách chiết axit béo không no DHA, EPA và các axit amin dùng cho y dược Ngoài ra, người ta còn dùng sụn cá nhám để tách chiết Natri chondroitin sulphat để tăng độ đàn hồi cho gân cốt và lưu thông máu [8; 11]

Ở một số nước phế liệu cá được ủ chua nhờ sử dụng chính hệ enzym trong ruột cá để thủy phân làm thức ăn gia súc giàu dinh dưỡng Để sản xuất cá ủ chua, người ta nghiền nhỏ cá và thủy phân trong môi trường axit, làm protein bị thủy phân thành các axit amin và peptit mạch ngắn Cá ủ chua được thêm vào hỗn hợp thức ăn theo lượng khác nhau (5 – 20% trọng lượng) tùy thuộc vào loài và tuổi của động vật nuôi Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp ủ chua là mức độ thủy phân dao động từ 20-70% tùy thuộc vào thời gian và nhiệt độ ủ [15]

Thay cho việc ủ chua trong môi trường axit, phương pháp sử dụng enzym để thu hồi protein từ nội tạng của cá và tạo ra sản phẩm hòa tan là dịch thủy phân protein Việc sản xuất dịch thủy phân protein cá bằng công nghệ enzym cũng là giải pháp để nâng cao giâ trị của phế liệu cá Bằng cách sử dụng enzym để thủy phân, protein nhận được sẽ có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với phương pháp thủy phân bằng axit hay kiềm [15]

Các công đoạn chính của quá trình thủy phân bằng enzym bao gồm:

Cá phế phẩm → Đồng nhất khối cá bằng xay nhỏ → Bổ sung enzym thủy phân → Bất hoạt enzym → Ly tâm → Cô đặc → Dịch thủy phân [6]

Sau khi loại nước, thu được dạng bột có hàm lượng protein cao và ổn định Việc sản xuất sản phẩm protein cá cô đặc (FPC) sử dụng cho người cũng được nhiều nước quan tâm Sản phẩm protein cá cô đặc có thể chia thành 2 nhóm:

FPC -A: Là dạng bột, không mùi, không vị với tối đa 0,75% chất béo và tối thiểu 67% protein (có thể lên tới 80%) Việc sản xuất FPC –A dựa trên nguyên lý chiết bằng dung môi isopropanol hoặc ethanol Người ta sử dụng nó dưới dạng thực phẩm như: bánh mì, ngũ cốc, thực phẩm ăn kiêng và bánh qui [15]

FPC- B: Là dạng bột, có mùi vị như cá với hàm lượng chất béo tối đa là 3%

và protein từ 20-80% Được sản xuất bằng chiết cơ học, loại dầu, sau đó loại nước

và làm khô bằng bay hơi như phương pháp sản xuất bột cá thông thường Dạng FPC-B này được sử dụng để nấu món súp và các món hầm [15]

Theo Nguyễn Xuân Thi và cộng sự (2008), lượng sản phẩm cá đông lạnh năm 2006 là 418.614 tấn (ứng với 163.259,46 tấn phế liệu cá), đồ hộp cá là 15.200,98 tấn (ứng với 2.941,32 tấn phế liệu) và các sản phẩm cá khô khoảng 28.767,83 tấn (ứng với 2.165,32 tấn) [15] Như vậy, ước tính có khoảng 195.366,1 tấn phế liệu cá thải ra từ các cơ sở chế biến cá Theo báo cáo đánh giá hiện trạng môi trường trong chế biến thủy sản của Viện Nghiên cứu hải sản (2008) và tính toán của Trung tâm tư vấn và quy hoạch phát triển thủy sản, một số chỉ tiêu về chất thải trong chế biến thủy sản được thể hiện ở bảng 5

Bảng 5 Tỷ lệ chất thải trong quá trình chế biến thủy sản [2]

TT Kiểu chế

biến Chất thải rắn

(tấn/tấn TP)

Nước thải (m3/tấn TP)

BOD5 (mg/l) (mg/l) COD (mg/l) SS (mg/l) TN (mg/l) Tp

Ghi chú: (*) là tỷ lệ chất thải rắn của chế biến nhuyễn thể 2 mảnh vỏ

Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá tra vùng Đồng bằng sông Cửu Long, nuôi tôm trên cả nước phát triển mạnh nên đòi hỏi nguồn cung bột cá tăng theo Bên cạnh nguồn cá tạp, phế liệu cùa các nhà máy chế biến cá cũng là nguồn cung cấp nguyên liệu chính để sản xuất bột cá Các nhà máy chế biến cá tra đông lạnh hàng năm đã cung cấp từ 700 - 800 nghìn tấn phế liệu cho chế biến bột cá Năm 2008 sản lượng bột cá đạt 144 ngàn tấn (năm 2001 đạt 54,7 nghìn tấn), tốc độ tăng bình quân 14,8% năm Theo ước tính, nhu cầu bột cá sử dụng làm thức ăn cho nuôi thủy sản giao động khoảng 150.000 – 200.000 tấn/năm, vì vậy, hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một lượng bột cá từ nước ngoài Việc tận thu các phế phụ phẩm trong nhà máy chế biến thủy sản nói chung và nhà máy chế biến cá nói riêng không những góp phần giải quyết nhu cầu thức ăn cho nuôi thủy sản mà còn có ý nghĩa lớn

1.2 Tình hình ứng dụng enzym protease thương phẩm để thuỷ phân protein cá trong nước và trên thế giới

1.2.1 Tình hình ứng dụng enzym protease thương phẩm để thủy phân protein

cá trong nước và trên thế giới

Việc sử dụng enzym protease trong chăn nuôi chủ yếu để tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn thô đã được ứng dụng rộng rãi ở Mỹ Enzym protease được dùng

để sản xuất dịch thủy phân giàu axit amin từ protein cá Theo patent số 0204612 USPTO (Mỹ) năm 2006, phế thải cá được thủy phân bằng enzym protease trung tính và kiềm tính, sau đó protease được bất hoạt bằng gia nhiệt Sản phẩm của quá trình thủy phân protein cá được dùng để thay thế bột cá và các nguồn protein khác Dịch thủy phân protein cá có hàm lượng peptit và amin axit tự do cao hơn, dễ dàng tiêu hóa hơn, đặc biệt là các động vật còn non hệ thống tiêu hóa chưa phát triển đầy

đủ Ngoài ra, dịch thủy phân protein cá còn có một lợi ích khác đó là có thể sản xuất

từ phế thải của công nghiệp đánh bắt và chế biến [43]

Ở Pháp, enzym protease được sử dụng trong chăn nuôi chủ yếu để sản xuất sữa cho bê con và chế biến các phế liệu của kỹ nghệ thịt cá [16] Guerard F (2002)

đã ứng dụng công nghệ enzym trong sản xuất dịch đạm thủy phân từ phế thải của nhà máy sản xuất cá hộp Theo tác giả, dịch thủy phân protein cá (FPH) đang ngày càng thu hút sự quan tâm vì khả năng ứng dụng của chúng như một nguồn peptit có hoạt tính sinh học hoặc như nguồn cơ chất nitơ để chuẩn bị môi trường lên men vi sinh vật Các phế thải của nhà máy chế biến cá hộp được thủy phân với enzym protease thương phẩm “Umamizyme” Quá trình thủy phân enzym được tiến hành trong bình lên men 1 lít, ở pH 7 nhiệt độ 45°C Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân được nghiên cứu (tỷ lệ enzym/cơ chất protein thay đổi trong khoảng từ 0.1 đến 1.5% (w/w), mức độ thủy phân protein, hàm lượng nitơ giải phóng ra, trọng lượng phân tử của peptit Mức độ thủy phân trên 22.5% nhận được khi tỷ lệ enzym/cơ chất là 1.5%, sau 4 giờ thủy phân Đã xác định được đường thẳng tuyến tính giữa mức độ thủy phân và hàm lượng nitơ thu hồi Nhân tố giới hạn quá trình thủy phân được rút ra từ kết quả thí nghiệm là nhiệt độ 45°C và pH 7 Các kết quả thí nghiệm cũng cho thấy khi thủy phân phế thải của quá trình chế biến cá hồi, enzym “Umamizyme” có hiệu quả thủy phân tương đương với enzym Alcalase® 2, 4L Tuy nhiên, tính ổn định của enzym Umamizyme thấp hơn enzym Alcalase® 2, 4L [33]

Nước Nga, đã sử dụng chế phẩm enzym trong chăn nuôi từ những năm 1972 Hiện nay, nước Nga có khoảng trên 20 chế phẩm enzym thường dùng trong chăn nuôi Trong số đó có chế phẩm protease (còn gọi protomezenterin) nhận được từ

môi trường dịch thể nuôi cấy B mesentericus, có chứa các enzym có khả năng làm

đông sữa, được dùng trong các kỹ nghệ chế biến để nuôi các động vật còn non [19]

Ở Rumani và Bungari, người ta đã tiến hành nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm protease để chuẩn bị thức ăn cho gia súc, nhằm làm tăng hệ số sử dụng thức

ăn Các nhà nghiên cứu cũng kết luận rằng xử lý thức ăn chăn nuôi bằng enzym có thể làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn lên khoảng 10% Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng khi chuẩn bị thức ăn cho động vật còn non [17; 18; 34]

Ngoài việc sử dụng enzym protease để thủy phân protein dùng trong chăn nuôi, chúng còn được sử dụng trong chế biến thực phẩm nhằm cải tiến công nghệ sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm Nước mắm là một loại nước chấm được sản xuất từ cá Tùy theo công nghệ sản xuất và các phụ gia bổ sung mà mỗi Quốc gia trong khu vực Đông Nam Á có sản phẩm đặc trưng của riêng mình với các tên gọi khác nhau như: Nước mắm (Việt Nam), Shottsuru Uwo – shoyu (Nhật Bản), Jeot - kal (Hàn Quốc), Nam - pla (Thái Lan), Budu (Malaysia), Patis (Philippines), Ngapi (Brunei) [15]

Theo công nghệ cổ truyền, cá được trộn với muối theo một tỷ lệ nhất định (khoảng 25%) đem gài nén (gọi là chượp nén) và đem phơi nắng để quá trình lên men tự nhiên, nhờ hệ enzym protease có trong ruột cá, protein cá được thủy phân thành peptit, axit amin và các hợp chất bay hơi khác Tuy nhiên, quá trình này thường diễn ra rất chậm và yếu Thời gian để sản xuất các sản phẩm thủy phân từ cá thường kéo dài từ 6 tháng đến 1 năm [14]

Việc đưa thêm protease từ ngoài vào sẽ làm tăng rõ rệt quá trình thủy phân, rút ngắn thời gian chế biến Trong sản xuất nước mắm, nhờ bổ sung enzym protease, protein của cá bị thủy phân mạnh, nên quá trình loại mỡ, loại xương khỏi phần thịt

cá đã bị thủy phân được dễ dàng hơn, lượng nước mắm cốt thu được cũng nhiều hơn hẳn so với mẫu đối chứng Đối với sản phẩm cá xông khói, việc bổ sung protease làm biến đổi nhanh chóng cấu tạo của mô cá, do đó muối và các chất gia vị

dễ dàng thấm vào, nhờ đó thời gian muối cá, thời gian xông khói cũng như thời gian

xử lý nhiệt khi chế biến cá được rút ngắn [14]

Thái Lan là nước đi đầu trong việc ứng dụng công nghệ enzym trong thủy

phẩm được bổ sung theo trình tự như sau: 0,25% Alcalase 2.4L thủy phân ở 65oC trong 2 giờ, tiếp đến bổ sung 0,5% Flavozyme 500L thủy phân ở 50oC trong 4 giờ Sau đó, 10% NaCl được bổ sung vào và mẫu được giữ ở 50oC trong 3 ngày và hàm lượng muối được điều chỉnh đến 25% NaCl Tiếp tục ủ ở 50oC trong khoảng thời gian hơn 2 ngày trước khi được để ở nhiệt độ 35oC trong 7 tháng Kết quả là sau 7 tháng nước mắm có hàm lượng α-amino cao Điểm cảm quan của nước mắm thủy phân nhờ enzym protease không khác với mẫu sản xuất theo công nghệ truyền thống lên men 12 tháng [34]

Ing-Lung Shih (Đài Loan) năm 2003 đã nghiên cứu bổ sung enzym protease dưới dạng koji đậu tương và ang-khak vào phế thải chế biến cá ngừ (bao gồm: ruột

và phủ tạng cá) để sản xuất nước mắm nhằm nâng cao giá trị của cá ngừ và giảm ô nhiễm môi trường Nước mắm làm từ cá ngừ nguyên con được dùng như mẫu đối chứng Kết quả cho thấy nước mắm sản xuất từ phế thải chế biến cá ngừ có chất lượng tương đương với nước mắm làm từ cá ngừ nguyên con Nước mắm bổ sung ang-khak cho hương cảm quan tốt hơn Các hợp chất bay hơi của các mẫu nước mắm được tách và nhận biết nhờ máy sắc ký khí và sắc khí khối phổ (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy) Tổng số 23 hợp chất bay hơi tạo hương thơm cho nước mắm đã được nhận biết Những hợp chất thơm này được hình thành chủ yếu từ các chất béo, các phức hợp amino và các loại đường có trong nguyên liệu bổ sung, trong đó chất béo đóng vai trò chủ yếu [35; 36]

Taniguchi (Nhật Bản) năm 2003, đã bổ sung các enzym thủy phân protein là: protease A, aroase, và papain W40 vào thịt cá và các nội tạng cá để sản xuất nước mắm chất lượng cao Những thay đổi về thành phần trong quá trình chín của nước mắm được kiểm tra Kết quả cho thấy các mẫu nước mắm bổ sung protease A và papain, những thay đổi về pH và hàm lượng axit là tương tự nhau Sau 120 ngày, giá trị pH giảm xấp xỉ pH 5.6 và chuẩn độ axit không nhỏ hơn 3 Hàm lượng nitơ tổng và nitơ formol ở mẫu nước mắm bổ sung protease A là cao nhất, tiếp đến là mẫu nước mắm bổ sung papain và thấp nhất là enzym aroase Sự khác nhau về tốc

độ thủy phân protein cá và sản phẩm thủy phân phụ thuộc và loại enzym protease

bổ sung vào cá Có thể kết luận rằng, hàm lượng nitơ tổng, hàm lượng nitơ amin và tốc độ amin hóa ở mẫu nước mắm bổ sung enzym là cao hơn mẫu không bổ sung Đặc biệt, mẫu nước mắm bổ sung enzym protease A, một enzym chịu mặn, tốc độ amin hóa cao nhất và sấp xỉ 62% [23]

Theo báo cáo của Ferderal Laboratories Corporation (Thái Lan), bột đạm thủy phân được sản xuất từ nguồn phế phẩm của nhà máy chế biến cá và cá tạp sau khi sử lý khử mầu và được sấy chân không ở nhiệt độ không lớn hơn 1400F sau đó được nghiền và được sử dụng cho người dưới dạng bột súp cá [32]

1.2.2 Nguồn enzym protease

Enzym protease là enzym thủy phân protein có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: động vật, thực vật và vi sinh vật Ở động vật, enzym protease được tìm thấy trong các cơ quan và mô cơ của động vật: Các enzym được tạo ra từ tuyến tuỵ của người (tripsin, chymotripsin), trong dịch dạ dày lợn và gia cầm (pepsin), trong dịch dạ dày bê con (rennin) v.v và là những enzym được phát hiện sớm nhất Protease thực vật được phát hiện muộn hơn (bắt đầu từ cuối thế kỷ thứ 18) Đó là các protease có trong đu đủ (papain), trong dứa (bromelin), trong các cây sung, si vả thuộc họ Ficus (fisin) và trong các loại hạt nảy mầm [16]

Protease của vi sinh vật được phát hiện từ năm 1918, nhưng đến những năm

50 mới được chú ý nghiên cứu Các vi sinh vật được sử dụng để sản xuất enzym

protease chủ yếu từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc thuộc các chi như: Bacillus (B subtilis, B licheniformis, B amyloliquefacien, B mensentericus, B firmus, B magaterium, B pumilis ), Streptomyces (S fradiae, S griseus, S redius ) và Aspergillus (A niger, A sojae, A oryzae, A awamori ) [1; 3; 4; 18] Ở vi sinh vật,

enzym protease có thể ở bên trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Ngày nay, hầu hết các protease sản xuất trên qui mô công nghiệp là protease ngoại bào

Các enzym protease thu được từ động vật và thực vật chủ yếu được sử dụng trong y tế, dược phẩm và mỹ phẩm, chỉ một lượng rất ít được dùng trong chế biến thực phẩm như: rennin (làm đông casein trong sản xuất phomat), papain (làm mềm thịt) v.v [18] Khác với protease thực vật và protease động vật, protease vi sinh vật

có tính đặc hiệu cao và có khả năng sản xuất trên qui mô công nghiệp

1.2.3 Một số enzym protease vi sinh vật đã được thương mại hóa [24, 25, 31, 37; 41; 50]

Alcalase: Được sản xuất từ chủng B licheniformis, Subtilisin A là thành phần

enzym chính, đó là một endopeptidase Nhiệt độ thích hợp cho enzym hoạt động từ 50-600C, tùy thuộc vào cơ chất thủy phân pH thích hợp cho quá trình thủy phân là 6,0-8,5 [24; 25]

Flavourzyme: Được sản xuất từ chủng A.oryzae, chế phẩm này bao gồm cả hoạt

tính endopeptidase và exopeptidase pH thích hợp cho quá trình thủy phân là 5,0-7,0 Nhiệt độ thích hợp 45-550C [31]

Kojizyme: Được sản xuất từ chủng A oryzae, đây là enzym có cả hoạt tính

exopeptidase và endopeptidase Nhiệt độ thích hợp cho enzym họat động từ

45-550C, pH thích hợp là 4,8 – 6,5 [37; 38]

Neutrase: Được sản xuất từ B subtilis Là enzym thủy phân liên kết peptit nội

mạch (Endopeptidase) Neutrase là một endopeptidase kim loại, được ổn định bằng

Ca++, hoạt động tối ưu ở pH 5,5-7,5 & nhiệt độ 45-550C Sản phẩm thủy phân là các polipeptide [41]

Protamex: Là một enzym protease của Bacillus thủy phân protein Khác với các

Endopeptidase khác protamex tạo ra dịch thủy phân protein không có vị đắng ngay

cả khi mức độ thủy phân rất thấp Protamex hoạt động tối ưu ở pH 5,5-7,5, nhiệt độ 40-600C [50]

1.2.4 Cơ chế xúc tác của protease trong quá trình thủy phân protein

Quá trình thủy phân protein thường xảy ra theo một trình tự nhất định Lúc đầu, enzym proteinase (endopeptidase) phân cắt các liên kết peptit của phân tử protein từ giữa chuỗi polypeptit và cho các sản phẩm thủy phân có phân tử lượng trung bình (albumoza, peptit và polypeptit) Tiếp đó các enzym peptidase (exopeptidase) phân cắt các axit amin từ hai đầu của chuỗi polypeptit cho sản phẩm thủy phân là các peptit mạch ngắn và các axit amin [40] Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein thành các amino axit hòa tan

Quá trình thủy phân protein đến axit amin là một quá trình rất phức tạp Enzym protease phân cắt phân tử protein thành những phân tử nhỏ hơn Cơ chế hoạt động thủy phân protein của enzym protease được Boyce (1986) mô tả theo sơ đồ sau [18]:

Endopeptidase (Proteinase)

Protein  Albumoza  Pepton  Polypeptit  Peptit

Exopeptidase (Peptidase)

Peptit  Peptit và axit amin

1.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzym [3; 4; 16]

Quá trình thủy phân protein chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, trong đó điển hình là những yếu tố sau:

Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym/ cơ chất

Tốc độ phản ứng của protease tỉ lệ thuận với nồng độ phức chất trung gian Nồng độ enzym/cơ chất càng cao, tốc độ phản ứng càng lớn Khi toàn bộ lượng enzym trong phản ứng đều tham gia vào phức enzym – cơ chất, tốc độ sẽ đạt cực đại Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzym, khi nồng độ enzym tăng, tốc độ phản ứng cũng tăng Tuy nhiên, khi nồng độ enzym bão hòa với nồng độ cơ chất thì dù có tăng nồng độ enzym lên thì tốc độ phản ứng vẫn không thay đổi

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, tốc độ phản ứng enzym càng tăng khi tăng nhiệt độ Do enzym có bản chất là protein nên khi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì tốc độ phản ứng enzym sẽ giảm do sự biến tính của protein Tại giá trị mà nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Nhiệt độ mà tại đó enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt

độ tới hạn Nhiệt độ quá thấp cũng làm giảm hoạt tính của enzym, nhưng không làm biến tính enzym, vì vậy khi đưa nhiệt độ trở lại điều kiện thích hợp thì hoạt tính của enzym lại được phục hồi Các enzym mang hoạt tính proteolytic có nguồn gốc khác nhau thì khác nhau về nhiệt độ tối thích

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa

Hoạt động của một số enzym mang hoạt tính proteolytic phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác Trong số đó, một số chất có tác dụng làm tăng tính hoạt động, số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt động của các enzym

Protease của A awamori 78-2 bị kìm hãm bởi các ion Co2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+,

Ca2+, Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+ và EDTA Protease I, II, III của A oryzae không bị kìm

hãm bởi các ion Ba2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ nhưng bị kìm hãm bởi các ion kim loại khác Cu2+, Co2+,Cd2+, Fe3+ Protease của B subtilis bị mất hoạt tính bởi hợp

Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào hỗn hợp enzym/cơ chất

Nước không những là môi trường để khuyếch tán hỗn hợp enzym – cơ chất

mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng Nước không những có ảnh hưởng đến vận tốc mà còn ảnh hưởng đến chiều hướng của phản ứng thủy phân từ enzym

Nước làm nồng độ muối của chính nguyên liệu giảm xuống, tạo điều kiện thích hợp cho enzym hoạt động và vi sinh vật tốt phát triển nhanh chóng Nhờ có nước bổ sung thêm vào hỗn hợp enzym-cơ chất, enzym protease chuyển protein thành các thể trung gian như pepton, polypeptid đến các dạng axit amin

Thông thường, các enzym protease hoạt động mạnh trong điều kiện muối nhạt Ngoài ra, nước còn làm cho nhiệt độ phân phối đều nguyên liệu làm chúng mau nát [4] Bổ sung thêm nước tạo môi trường lỏng giúp cho enzym và vi sinh vật tốt hỗ trợ quá trình thủy phân hoạt động được dễ dàng, làm cho tế bào thịt cá được thủy phân nhanh chóng và dễ dàng

Lượng nước cho vào nếu ít quá thì tác dụng thủy phân của enzym kém nhưng nếu nhiều quá thì không khống chế được quá trình thối rữa gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Lượng nước bổ sung vào tùy thuộc vào đặc điểm của nguyên liệu, thông thường từ 20 – 30% có khi tới 40% – 200% so với nguyên liệu

là cá [3]

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Lý thuyết cũng như thực tế nghiên cứu cho thấy mức độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng (pha logarit), sau đó tốc độ phản ứng chậm dần lại Thời gian dài hơn và sử dụng lượng enzym lớn hơn thì mức độ thủy phân cao hơn

Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Khi thủy phân bằng enzym, yếu tố quan trọng để thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc Để tạo diều kiện tốt hơn cho sự thủy phân của enzym làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzym và cơ chất, muốn vậy phải làm nhỏ kích thước

cơ chất là phế liệu cá trước khi thủy phân

1.3 Hệ vi sinh vật trong cá và giải pháp ức chế

1.3.1 Hệ vi sinh vật trong cá và cơ chế hoạt động của vi khuẩn gây thối ở cá

Cá dùng trong xuất khẩu thủy sản và chế biến là những loại sống trong môi trường nước mặn Trước khi chết, cơ thể cá vô trùng Khi cá chết các hệ thống miễn dịch tự nhiên của chúng ngừng hoạt động, cho phép các vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể Tùy theo điều kiện bảo quản, cá bị phân huỷ với các tốc độ khác nhau và hệ vi sinh vật xuất hiện trên cơ thể cá cũng khác nhau Các vi sinh vật thường gặp trên cá

là các vi sinh vật hoại sinh, bào tử của nấm mốc, cũng có thể gặp một số vi khuẩn gây bệnh cho người và thuỷ sản thường gặp trong môi trường biển, ao hồ, sông rạch

như: Aeromonas hydrophyla, Aeromonas sobria, Pseudomonas caviae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas anguilliseptica, pseudomonas chlororaphis, Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus mycoides, Bacillus megatherium, Clostridium sporogenes, các loại cầu khuẩn khác nhau, các loại trực khuẩn đường ruột như: Escherichia coli, Salmonella, Strephylococcus, Shigella sp, Vibrio cholera Các vi sinh vật thường

sinh sản trên da, mang và ruột cá sống Tổng số lượng vi sinh vật giao động từ 102 –

107 CFU/ 1cm2 trên bề mặt da, tới 103-109 CFU/ 1cm2 mang và ruột Các sinh vật gây thối rữa cá thường là những vi sinh vật hoại sinh, chúng xâm nhập vào chượp, dần dần các vi sinh vật bên ngoài tuỳ thuộc điều kiện độ ẩm, nhiệt độ sẽ xâm nhập vào bên trong khối cá, một số ít trong số chúng tham gia vào quá trình thuỷ phân protein (nhưng rất yếu vì bị ức chế bởi nồng độ muối cao) và một số gây thối hỏng sản phẩm và trong quá trình sinh trưởng, phát triển chúng để lại độc tố cho người sử dụng

Bảng 6 Một số vi sinh vật thường tìm thấy trên cá [13]

Vi khuẩn Gram Mức độ

phổ biến

Nấm men Mức độ

phổ biến

Nấm mốc Mức độ

phổ biến

Acinetobacter - × Candida ×× Aspergillus ×

Aeromonas - ×× Cryptococcus ×× Aureobasidium ××

Alcaligenes - × Debaryomyces × Penicillium ×

Bacillus + × Hansenula × Scopulariopsis ×

Vi khuẩn gây thối rữa phát triển và hoạt động mạnh trên bề mặt thịt cá Những vi khuẩn này có hoạt tính proteaza cao, chính chúng tiết ra proteaza để phân giải protein thành popeptit và axit amin, sau đó sẽ khử amin, các hợp chất thành các axit béo và ammoniac tự do, các axit amin thơm cho những sản phẩm điển hình là hydro sunfua, indol, skatol, axit butyric và các sản phẩm khác tạo thành mùi khó chịu Sự thối rữa của thịt cá xảy ra trong môi trường kỵ khí và hiếu khí:

Các vi khuẩn hiếu khí: Proteus vulgaris; Bacillus subtillis; Bacillus mesentericus; Bacillus megatherium

Các vi khuẩn kỵ khí: Clostridium perfringeus; Clostridium putrificum

Quá trình thối rữa hiếu khí

Quá trình này bắt đầu từ bề ngoài của thịt cá sau đó sẽ ăn sâu vào trong theo các lớp tiếp giáp giữa cơ thể thịt với xương Quá trình này xảy ra theo 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Trên bề mặt cá mọc khuẩn lạc của các vi khuẩn hiếu khí và thay đổi cảm quan về cá chưa rõ ràng

- Giai đoạn 2: Bắt đầu thấy rõ khuẩn lạc và bề mặt cá bị mềm, cá bị thay đổi màu sắc và mùi, phản ứng thịt cá ngả sang kiềm

- Giai đoạn 3: Vi khuẩn phát triển mạnh trong cá làm cho các mô liên kết bị đứt và protein bị phân huỷ

Quá trình gây thối rữa kị khí

Là do các vi sinh vật hô hấp kị khí gây ra, chúng nhiễm vào cá bằng đường ruột hoặc từ môi trường bên ngoài Quá trình này xảy ra tương tự quá trình hiếu khí theo trình tự sản phẩm phân huỷ, sự thối rữa thịt cá, cũng như các sản phẩm giàu protein khác, còn gọi là sự lên men thối, sản phâm của sự lên men này là ammoniac

và axit béo, các chất có mùi thối khó chịu làm ô nhiễm môi trường sống và làm giảm chất lượng sản phẩm sau thuỷ phân

Trong quá trình thủy phân cá trừ nhóm vi khuẩn Bacillus sp có khả năng sinh

tổng hợp proteaza là nhóm có ích còn các vi khuẩn hiếu khí khác và nhóm vi khuẩn

kị khí Clostridium sp cần phải hạn chế sự sinh trưởng đến mức thấp nhất nhằm tạo

ra sản phẩm thủy phân có hương thơm và chất lượng cao, không chứa độc tố vi khuẩn

1.3.2 Một số giải pháp ức chế vi sinh vật có hại cho quá trình thủy phân

Để ức chế vi sinh vật tạp nhiễm, có một số giải pháp chính là giảm pH môi trường, bổ sung muối và bổ sung các chất kháng sinh

a) Giải pháp giảm pH môi trường

pH môi trường có tác động rất lớn tới sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy pH là yếu tố rất quan trọng, mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng pH tối thích pH của môi trường làm thay đổi trạng thái tích điện của tế bào Tác dụng của

pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của tế bào pH cần cho hoạt động của nhiều enzym Nồng độ ion H+ còn ảnh hưởng trực tiếp đến độ hoà tan của một số khoáng K, Na, Mg pH môi trường còn ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ các nguồn hydrat cacbon, nitơ của sinh vật [3] Môi trường nuôi cấy được chỉnh về các độ pH khác nhau ảnh hưởng trực tiếp tới sự xuất hiện nhiều hay ít của các chủng vi sinh vật mà ta nghiên cứu Hầu hết nấm mốc và nấm men phát triển tốt trong môi trường hơi axit, giá trị pH từ 3 đến 6, nhưng vi khuẩn lại sinh trưởng tốt ở

pH hơi kiềm (pH 7) Giá trị pH dưới 2, có tác dụng rất tốt để ức chế sự phát triển của vi khuẩn

b) Giải pháp dùng muối ăn

Sự có mặt của muối trong dịch nuôi cấy cũng như trong dịch lên men sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, gây ra hiện tượng co nguyên sinh chất đối với tế bào vi sinh vật Khả năng chịu được nồng độ muối ở mỗi chủng vi sinh vật khác nhau là khác nhau, nó thay đổi khá rộng, tùy thuộc vào chủng giống và môi trường phân lập chúng Ở một nồng độ muối nhất định, với một chủng nấm men xác định, sự có mặt của muối trong môi trường có thể làm tăng khả năng chống chịu của

tế bào khi gập các điều kiện bất lợi khác, nhờ sự tích lũy trehaloza nội bào

Muối ăn kìm hãm sự tự phân của enzym và vi khuẩn Nồng độ muối lớn gây nên tác dụng thẩm thấu lớn có thể làm vỡ màng tế bào vi khuẩn, làm thoát nước ra ngoài vì thế vi khuẩn khó phát triển Muối ăn có độ độc với vi khuẩn: sự thối rữa của cá chủ yếu là do tác dụng thủy phân của các enzym và vi khuẩn Các loại enzym trong thịt cá có hoạt tính mạnh nhất trong nước muối loãng hoặc môi trường không muối nhưng ở nồng độ cao chúng sẽ bị kìm hãm [16]

c) Giải pháp sử dụng nisin

Nisin là một Bacterioxin được tạo ra bởi một số chủng vi khuẩn của loài

Lactococcus lactis Công thức tổng quát của Nisin là C143H23ON42O37S7 Cho đến nay, nisin được nghiên cứu nhiều nhất về các tính chất và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Xuất phát từ những ưu điểm: Không độc, không kích thích tăng trưởng, có

hoạt tính chống Clostridium, nisin có thể trở thành chất bảo quản thực phẩm có hiệu

nisin vào thực phẩm Hirsch đã chứng minh rằng việc sử dụng chủng vi khuẩn lactic sinh nisin làm giống lên men ban đầu (starter culture) có thể ngăn chặn sự hư hỏng

phomat gây ra bởi Clostridium botulium [53] Dạng chế phẩm của nisin sẵn có nhất

hiện nay trên thị trường đó là Nisaplin TM với thành phần 2,5% nisin [4]

Tổ chức nông lương và thực phẩm quốc tế, tổ chức y tế thế giới (FAO/WHO) đồng ý cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm

1969 [4, 6, 8] Hiện nay nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng với ký hiệu quốc tế E234 Tổ chức FAO/WHO cũng khuyến cáo mức hấp phụ tối đa hàng ngày nisin vào cơ thể cho 1 người nặng 70kg là 60mg nisin tinh khiết, tương đương với 33.000 đơn vị hoạt tính quốc tế [4, 6, 8]

Hiện nay nisin được sử dụng như là chất phụ gia thực phẩm an toàn ở hơn 50 quốc gia trên thế giới [8] Tuy nhiên, những nghiên cứu về nisin vẫn đang tập trung theo một số hướng chính:

Nghiên cứu mở rộng tác động của nisin với các chủng vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm mốc vốn có tính kháng nisin ở điều kiện thông thường

Nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm, thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm Do nisin có bản chất là protein nên pH có thể là một yếu tố tác động tới khả năng liên kết của nisin với bề mặt tế bào Một số nghiên cứu đã công bố, ở pH 6,5 nisin có khả năng hấp phụ lên bề mặt của tế bào chủng sinh nisin, nó bị giải phóng khi pH<3 Tuy vậy với mỗi chủng vi sinh vật khác nhau thì giá trị pH tối ưu cho sự tiếp xúc với thành tế bào sẽ khác

d) Giải pháp sử dụng Oxytetracyclin

Oxytetracyclin (hay còn gọi là teramixin, oxymicoin…) là chất kết tinh màu vàng, tan trong nước 0,5mg/ml ở 250C Thường dùng ở dạng clohydrat oxytetracyclin Dạng này có công thức tổng quát là C22H24O9N2.HCl Muối của oxytetracyclin thường tạo với kim loại kiềm thô thành những muối kép không tan trong nước (Ca-Ba, Ba-Mg) Do đó người ta thường lợi dụng tính chất này để chiết chất kháng sinh ra khỏi dung dịch nuôi cấy

Oxytetracyclin có thể dễ dàng phân biệt với các chất khác thuộc nhóm tetrcyclin: khi tác dụng với H2SO4 cho màu tím đậm, còn khi tác dụng với FeCl3 lại cho màu vàng nâu, các sản phẩm phân huỷ của oxytetracyclin thì cho màu xanh lá cây Oxytetracyclin bền vững ở pH axit Trong môi trường kiềm bị phân huỷ nhanh

chóng trong dung môi hữu cơ (axeton), khi có mặt của axit mạnh, oxytetracyclin bị phân huỷ và biến thành dẫn xuất khử nước là anhydrooxytetracyclin [1]

Oxytetracyclin có tác dụng chống vi khuẩn gây bệnh Người ta thường dung

oxytetracyclin để điều trị các bệnh Tulare, sốt phát ban, bệnh do Brucella và các

bệnh mà vi sinh vật gây bệnh đã kháng lại penicillin và streptomycin

Khi sử dụng oxytetracyclin người ta thấy có những biến chứng nghiêm trọng hoặc các phản ứng phụ có liên quan đến tính độc, do đó thường phải dùng phối hợp

với nixtalin có thể tránh được bệnh do Cadida albicans gây nên Dùng phối hợp với streptomixin có thể giảm khả năng kháng thuốc của vi khuẩn lao (Mycobacterium tubereulosis) đối với streptomixin Oxytetracyclin được sử dụng nhiều trong chăn

nuôi, thú y và công nghiệp thực phẩm

Dựa trên những thông tin trên, giải pháp sử dụng chất kháng sinh oxytetracyclin không được lựa chọn, do việc lạm dụng chất kháng sinh trong chế biến thực phẩm sẽ dẫn đến hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật, sẽ gây khó khăn trong việc điều trị các bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật gây ra cho con người sau này Vì vậy, ba giải pháp là hạ pH, tăng nồng độ muối ăn và sử dụng Nisin sẽ được lựa chọn trong nghiên cứu này

1.4 Nghiên cứu giải pháp thu hồi chất béo

1.4.1 Đặc điểm của chất béo trong dịch cá thủy phân

Dịch thủy phân cá chứa rất nhiều chất khác nhau Muốn có được sản phẩm axit amin tinh khiết thì việc loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình thủy phân là rất cần thiết Với đối tượng đặc thù của đề tài là cá tạp và phế phụ phẩm cá việc tách chiết và làm sạch mỡ cá sẽ tương đối phức tạp do quá trình bán phân hủy mỡ cá tạo

ra các axit béo gây khó khăn trong tách pha Ngay cả khi chất béo được tách pha, các thành phần hòa tan trong lipit từ lục phủ ngũ tạng của cá sẽ làm giảm chất lượng của mỡ thu nhận được Do đó việc tách lipit ra khỏi sản phẩm cuối cùng đóng một vai trò rất quan trọng đối với chất lượng của sản phẩm cuối cùng

Một trong những công nghệ chế biến mỡ cá được áp dụng rộng rãi trên thế giới hiện nay là không nấu trực tiếp mà chỉ gia nhiệt sau khi đã ép để loại trừ các phụ phẩm rắn Ưu điểm của quy trình này là không sử dụng trực tiếp nhiệt độ nên

mỡ cá có màu sáng hơn, quá trình ly tâm và lọc cho mỡ có hàm lượng nước, axit béo tự do và cặn thấp hơn Phương pháp này có hiệu suất thu hồi mỡ cao, thời gian sản xuất ngắn, nên giá thành của mỡ thấp, nhưng chi phí đầu tư thiết bị lại khá lớn

Ở Việt Nam, cho đến nay việc loại bỏ lipit trong sản xuất và chế biến cá vẫn dựa trên phương pháp tách cơ học (vớt bằng rổ, rá, lọc qua vải v.v) mà chưa có một công trình nghiên cứu nào được công bố

đó bước tiếp theo là thu lipit bằng li tâm, lọc hoặc gạn chắt [27]

- Phương pháp thẩm thấu qua gel: Trong nghiên cứu của Rantalainen và cộng

sự thì mỡ hải cẩu có thể tách được bằng các phương pháp thẩm thấu qua gel, xử lý với axit sunphuric để làm đông tụ chất béo và thẩm tách bằng màng bán thấm với hiệu suất đạt tới hơn 90% Kết quả cho thấy là phương pháp thẩm tách bằng màng bán thấm cho kết quả tốt hơn hẳn hai phương pháp còn lại [51]

- Phương pháp hấp phụ trên mùm cưa hoặc vỏ cây: Đối với những dung dịch

có ít lipit thì người ta dùng mùn cưa, vỏ cây đã được xử lý để hấp phụ phần lipit này

Vỏ cây đầu tiên được xử lý sinh học và hóa học sau đó được bão hòa với các ion kim lọai để tránh hòa các hợp chất hữu vào dung dịch xử lý Hiệu suất hấp phụ chất béo của vỏ cây đã được xử lý là 0,2 đến 2g chất béo/ gram chất hấp phụ khô [27]

- Phương pháp lọc màng: Hiện nay trong công nghệ sản xuất dầu thực vật, quá trình tách dầu bằng màng lọc dưới các điều kiện nhiệt độ thấp được đánh giá là phương pháp thay thế có triển vọng cho các phương pháp truyền thống trước đây

Nó có ưu điểm hơn về giá thành và ít độc hại hơn đối với môi trường [29]

- Phương pháp tách pha: Dầu cá và các sản phẩm có tương tự như là triglycerides, các axit béo tự do và các dạng methyl cũng như ethyl ester của axit béo, cholesterol, α-tocopherol, phospholipids, squalene …được tách bằng các dung dịch chất lỏng khác nhau dựa trên độ hòa tan khác nhau của chúng vào các pha lỏng này [52] Một trong những cách truyền thống thông dụng đó là dùng phễu chiết dựa trên trọng lượng khác nhau giữa lipit và dịch thủy phân

Mặc dù nhược điểm của phương pháp tách pha là việc tách lipit triệt để có thể làm hao hụt một phần dich thủy phân, song đây là phương pháp đơn giản, dễ thao tác lại cho hiệu suất cao, gíá đầu tư ban đầu thấp nhất Vì vậy, phương pháp tách pha sẽ được lựa chọn trong nghiên cứu này

1.5 Nghiên cứu giải pháp làm sạch dịch thủy phân

1.5.1 Đặc điểm của dịch cá thủy phân

Dịch thủy phân cá chứa rất nhiều chất khác nhau Màu sắc của dịch thuỷ phân còn tối, còn nhiều vẩn lắng lơ lửng, mùi vị thì vẫn còn vị tanh nồng đặc trưng của cá Trong khi đó, màu sắc, mùi vị của dịch thủy phân ảnh hưởng rất lớn đến giá trị cảm quan của sản phẩm cuối cùng Nhằm để nâng cao chất lượng cảm quan của sản phẩm cuối và tạo ra sản phẩm có màu sáng đẹp và có hương vị dễ chịu thì dich thủy phân được qua quá trình làm sạch

1.5.2 Một số phương pháp làm sạch dịch thủy phân

Có nhiều cách khác nhau để tách chất béo và một số phương pháp làm sạch dịch thủy phân phổ biến gần đây là

Làm sạch dịch thủy phân bằng than hoạt tính

Than hoạt tính có một hệ thống mạng lưới các lỗ rất nhỏ với bề mặt bên trong lớn, do đó nó có thể hấp phụ rất nhiều các hợp chất Than hoạt tính có khả năng hấp phụ không thuận nghịch của các hợp chất ức chế và làm giảm dần dần các chất trao đổi chất độc hại và sự tích lũy các sản phẩm phụ thuộc nhóm phenolic, hấp phụ các hợp chất tạo màu nâu trong quá trình do đó màu sắc của dung dịch giảm đi rõ rêt [11; 15] Than hoạt tính đã được ứng dụng để làm sạch các hợp chất phenolic trong dịch thủy phân bã mía [13] Nó cũng được dùng để hấp phụ và lọai

bỏ các chất như phenol, ortho- và metachlorophenol, furan, endosulfan, iốt, axit tannic, ra khỏi dịch lỏng [13] Các loại than hoạt tính có khả năng hấp phụ cao các ion kim loại chủ yếu là nickel, sắt, chrom và silicon [13] Trong nghiên cứu thu hồi dich thủy phân protein để thu chitin bằng phương pháp enzym từ phế thải sản xuất tôm các tác giả đã sử dụng than hoạt tính để làm sạch và làm mất màu dịch thủy phân [7]

Làm sạch dịch thủy phân bằng cacbon hoạt tính

Vật liệu xốp cacbon được cho là một vật liệu hết sức hứa hẹn trong ứng dụng thu hồi các chất phân tử lượng lớn như các chất xúc tác và các ứng dụng trong hóa dược Kennedy và cộng sự đã sử dụng lớp vỏ trấu được xử lý trong nghiên cứu loại

bỏ phenol khỏi dung dịch lỏng Hiệu xuất loại bỏ được phenol là 2.35 × 10−4 mol/g

ở 200 và pH 2,7 [7] Methane được hấp phụ bằng cacbon xốp có kích thước lỗ trung bình từ dung dịch Kết quả đạt tốt hơn là than hoạt tính với độ hấp phụ tăng hơn 30% Cơ chế của việc tăng cường hấp phụ methane có thể là do sự hình thành

có bị giảm khi hấp phụ TCE từ nước pha đất mặt [3, 4]

Phương pháp lọc màng

Dựa trên kích thước khác nhau của các phân tử trong dung dịch mà phương pháp này dùng để lọai bỏ các phân tử có kích thước lớn hơn ra khỏi dung dịch Phương pháp này được ứng dụng để loại bỏ axit acetic tạo ra trong quá trình tiền xử

lý vật liệu lignocellulosic [29]

Đối với dịch thủy phân protein cá dung cho người, phương pháp khử mùi và mầu cho sản phẩm bằng than hoạt tính là phương pháp rẻ tiền, không độc hại, dễ thực hiện và đang được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực sản xuất các sản phẩm thực phẩm sẽ được lựa chọn trong nghiên cứu này

1.6 Một số phương pháp sấy để tạo chế phẩm dạng bột

1.6.1 Bản chất của quá trình sấy [5]

Sấy là sự bốc hơi nước của sản phẩm bằng nhiệt ở nhiệt độ bất kỳ Là quá trình khuếch tán do chênh lệch hàm ẩm ở bề mặt và bên trong vật liệu hay nói cách khác là do chênh lệch áp suất hơi riêng phần ở bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh Mục đích của quá trình sấy là làm giảm khối lượng của vật liệu, làm tăng độ bền, bảo quản tốt hơn

Tác nhân sấy: Là những chất dùng để chuyên chở lượng ẩm tách ra từ vật sấy Trong quá trình sấy, không khí trong buồng sấy luôn được bổ sung ẩm từ vật sấy thoát ra Nếu lượng ẩm này không được mang đi thì độ ẩm tương đối trong buồng

sấy tăng lên, đến một lúc nào đó sẽ đạt đến sự cân bằng giữa vật sấy và môi trường trong buồng sấy và quá trình thoát ẩm sẽ ngừng lại Do đó, cùng với việc cung cấp nhiệt cho vật để hóa hơi ẩm lỏng cần thiết phải tải hơi ẩm ra khỏi buồng sấy Người

ta sử dụng các tác nhân sấy để làm nhiệm vụ này Các tác nhân sấy thường là các chất khí như: Không khí, khói, hơi quá nhiệt Không khí là loại tác nhân sấy có sẵn trong tự nhiên, không gây độc hại và không làm bẩn sản phẩm sấy Trong quá trình sấy, tác nhân sấy tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với thực phẩm làm thực phẩm nóng lên và tách ẩm khỏi thực phẩm Tùy thuộc vào bản chất của vật liệu sấy mà lựa chọn phương pháp sấy phù hợp Có hai phương pháp sấy: Sấy tự nhiên và sấy nhân tạo [6]

a Phương pháp sấy tự nhiên: Sử dụng nguồn nhiệt bức xạ của mặt trời, ẩm bay ra được gió và không khí mang đi Phương pháp này thường được dùng để sấy ngũ cốc Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, đầu tư vốn ít, bề mặt trao đổi nhiệt lớn Tuy nhiên sấy tự nhiên có nhược điểm là khó thực hiện cơ giới hóa, chi phí lao động nhiều, cường độ sấy không cao, sản phẩm dễ bị ô nhiễm do bụi, sinh vật và vi sinh vật và đòi hỏi diện tích mặt bằng lớn Đối với sản phẩm giầu dinh dưỡng như dịch thủy phân protein cá phương pháp sấy tự nhiên là không phù hợp

b Phương pháp sấy nhân tạo: Được thực hiện trong thiết bị sấy Có nhiều phương pháp sấy nhân tạo khác nhau Căn cứ vào phương pháp cung cấp nhiệt có thể chia ra các loại sau (bảng 7)

Bảng 7 Một số đặc tính chủ yếu của thiết bị sấy thông dụng [6]

Kiểu thiết bị sấy Cách làm việc Sản phẩm sấy Chế độ sấy Buồng sấy với tuần

hoàn tự nhiên hay

cưỡng bức

Theo chu kỳ Rau quả Nhiệt độ môi chất sấy:

60- 1500C Hầm sấy Sấy liên tục Rau quả Nhiệt độ môi chất sấy

50- 1300C Buông sấy băng tải Liên tục Rau quả Nhiệt độ môi chất sấy

60- 1700C Tháp sấy Vật liệu rơi liên

tục trong tháp Ngũ cốc Nhiệt độ môi chất sấy 60- 180 0 C Thiết bị sấy thùng

quay

Liên tục hoặc theo chu kỳ, thùng quay với số vòng quay n=0,5

tinh

Sấy phun Liên tục Trứng, sữa và các các

loại dung dịch khác Nhiệt độ 130- 150

0 C Sấy tầng sôi Liên tục hoặc chu

kỳ

Vật liệu có độ ẩm cao, bột nhão, hạt kết tinh,

vi sinh vật

Cường độ bay hơi ẩm: A= 100- 300 kg ẩm/

m3giờ

1.6.2 Đặc điểm của phương pháp sấy thăng hoa và sấy phun

- Sấy thăng hoa: Phương pháp này thực hiện bằng cách làm lạnh vật đồng

thời hút chân không để cho vật sấy đạt đến trạng thái thăng hoa của nước Hàm ẩm thoát ra khỏi vật nhờ quá trình thăng hoa mà không thông qua trạng thái lỏng Trước tiên, làm lạnh đông vật liệu sấy ở nhiệt độ khoảng -200C, nước trong vật liệu sấy bị đóng băng thành nước đá ở thể rắn, sau đó đưa vào thiết bị thăng hoa, thiết bị này

có hai chức năng: làm lạnh ở nhiệt độ dưới 00C để giữ nước đá không chảy mà bốc hơi ở điều kiện chân không (10-2 – 10-3 mmHg làm cho nước từ thể rắn chuyển sang thể hơi và bay hơi khỏi vật liệu Sau khi tách hầu hết ẩm sấy khô ở nhiệt độ 270C đến độ ẩm yêu cầu

- Sấy phun: Quá trình sấy thực hiện bằng cách phun vật liệu (chất lỏng) thành

hạt nhỏ và rơi tự do trong buồng sấy Môi chất sấy (không khí nóng, khói v.v) được thổi vào và chuyển động cùng với hạt vật liệu và sấy khô vật liệu Nhờ quá trình phun vật liệu thành hạt nhỏ (đường kính vài chục micron) nên bề mặt tiếp xúc giữa vật liệu và môi chất sấy rất lớn nên cường độ sấy cao, thời gian sấy ngắn (vài giây đến hàng chục giây) Quá trình sấy tiến hành nhanh đến mức không kịp đốt nóng sản phẩm quá nhiệt độ cho phép mặc dù nhiệt độ tác nhân sấy cao hơn nhiều Sấy phun dùng để sấy các dung dịch thành bột như: sữa, trứng, gelatin, albumin, nấm men, một số đồ uống hòa tan v.v

Trong các phương pháp trên, sấy thăng hoa có ưu điểm là đảm bảo được màu sắc và hương vị tự nhiên của sản phẩm, đồng thời còn bảo toàn lượng vitamin Tuy nhiên, do giá thành sản phẩm còn khá cao, đòi hỏi thiết bị hiện đại và khá tốn năng lượng nên các phương pháp này ít được áp dụng rộng rãi, trong thực tiễn sản xuất thường chỉ dùng để sấy các sản phẩm cao cấp

Vì vậy, trong nghiên cứu này phương pháp sấy phun được lựa chọn

1.7 Một số chất bảo quản được phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm

Khí sunfurơ dioxít (SO 2 )

Khí SO2 ảnh hưởng đến các quá trình oxy hóa trong tế bào vi sinh vật, đồng thời cũng có tác dụng tương hỗ với các nhóm cacboxyl của các hợp chất đặc biệt có

trong thành phần của chất nguyên sinh, làm thay đổi trạng thái lý, hóa học của chất nguyên sinh

Các dạng sử dụng sunfurơ dioxít: khí SO2, axít sunfurơ (H2SO3), các loại muối như Natri bisunfít NaHSO3, Kali bisunfít KHSO3, Canxi bisunfít Ca(SO3)2, Natri sunfít Na2SO3, Kali sunfít K2SO3

SO2 có tác dụng bảo vệ ở nồng độ 0,1- 0,3%

Nitrat (NO 3 )

Nitrat được sử dụng làm chất sát khuẩn và giữ màu cho thịt, các sản phẩm thịt, cá và phomát Tuy nhiên, khi ăn phải thức ăn chứa nhiều nitrat có thể gây ngộ độc do nitrat bị vi khuẩn đường ruột chuyển hóa thành nitrit

Nitrat thường được sử dụng dưới dạng muối của Na và K (NaNO3, KNO3) với liều lượng:

- Không hạn chế 0 - 5 mg/kg thể trọng

- Có điều kiện 5 - 10 mg/kg thể trọng

Axit benzoic, muối benzoat

Chất này có tác động lên màng tế bào nấm, ức chế quá trình hô hấp của tế bào, ức chế quá trình oxy hóa glucose và pyruvate, ức chế quá trình biến dưỡng các hợp chất đa lượng (N, P,…) của sinh vật Axit benzoic và muối benzoat có tác dụng

ức chế mạnh nấm men và nấm mốc, có tác dụng yếu đối với vi khuẩn Một số loài

vi sinh vật có thể sử dụng Axit benzoic trong quá trình trao đổi chất để loại bỏ các chất độc ra khỏi tế bào

Axit benzoic được sử dụng nhiều trong bảo quản trái cây và rau quả Nếu sử dụng ở nồng độ cao sẽ làm thay đổi mùi vị sản phẩm, ảnh hưởng tới thận của người

sử dụng

Nồng độ axit benzoic sử dụng trong thực phẩm là: 0,05- 0,15%

Nồng độ benzoat trong sản phẩm có tác dụng bảo quản là: 0,07- 0,1%

Axit sorbic (C5H7COOH)

Các dạng thường sử dụng làm chất bảo quản: Axit sorbic (C5H7COOH), Natri sorbat (C5H7COONa), Canxi sorbat (C5H7COO)2Ca, Kali sorbat (C5H7COOK)

Axit sorbic và Kali sorbat có tác dụng ức chế nấm mốc và nấm men, ít có tác dụng với vi khuẩn Chất này ảnh hưởng tới protein trên màng tế bào nấm mốc, gây ảnh hướng đến quá trình vận chuyển các ion âm qua màng: làm chuyển đổi pH bên ngoài tế bào, thay đổi sự vận chuyển của các axít amin, làm giảm sinh tổng hợp

Axit sorbic và kali sorbat không độc đối với cơ thể con người, dùng trong bảo quản thực phẩm không gây ra mùi vị lạ, không làm mất mùi tự nhiên Chúng được sử dụng nhiều trong chế biến rau quả, rượu vang, sản xuất đồ hộp, chế biến sữa, bảo quản và chế biến cá, thịt, sản phẩm bánh mì, bảo quản nước mắm, nước chấm, cá ngâm dấm

Nồng độ axit sorbic và muối sorbat sử dụng trong bảo quản thực phẩm là: 0,1

- 0,2%

Nisin

Nisin là một bacteriocin được sinh ra bởi Lactococcus lactis và Streptococcus lactis Nisin liên kết với anion phospholipit di chuyển vào tế bào gây

rối loạn quá trình trao đổi ion và làm chết vi sinh vật Nisin có tác dụng với một số

vi khuẩn (Enterococcus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botulinum ), nhưng không có tác dụng với nấm men, nấm mốc

Nisin được dùng trong công nghiệp chế biến phomát, bảo quản đồ hộp, nước

ép quả đóng hộp, rau quả tươi Liều dùng trong thực phẩm là 20 UI/g thực phẩm

Từ những thông tin trên, SO2 thường thích hợp cho các sản phẩm đồ uống, muối nitrat khi sử dụng với hàm lượng cao có thể gây ngộ độc do nitrat bị vi khuẩn đường ruột chuyển hóa thành nitrit Vì vậy, các chất bảo quản được đề tài hướng tới

là axit benzoic và muối benzoate, axit sorbic và kali sorbet và nisin

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Alcalase: pH hoạt động 6,5 – 8,5; nhiệt độ hoạt động 55- 600C Giá bán là 40 USD/kg

- Flavourzyme: pH hoạt động 6,5 – 7,0; nhiệt độ hoạt động 50 – 550C Giá bán: 60 USD/kg

- Neutrase: pH hoạt động 5,5 - 7,5, nhiệt độ 45-550C Giá bán: 25 USD/kg

2.1.2 Hóa chất

- Axit trichloaxetic (Merck), casein (Merck), Na2CO3 (Merck), Folin (Merck)

- Môi trường sử dụng trong nghiên cứu: Sử dụng các môi trường có sẵn của Hãng Satorius

Môi trường Endo: Dùng để phát hiện Coliforms và E.coli

Môi trường Plate Count Agar: Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí

Môi trường Malt glucose: Dùng để nuôi cấy nấm men, nấm mốc

Môi trường WL: Để phát hiện vi sinh vật hiếu khí tổng số

Môi trường Cao gan: Để phát hiện Clostridium

Môi trường trứng muối manitol: Để phát hiện Staphylococcus aureus

Thiết bị: Máy ổn nhiệt Memmert (Đức), máy so mầu UV-vis (Shimadzu, Nhật), cân phân tích Precisa XT 320M (Thụy Sĩ), máy đo pH MP 200R (Thụy Sĩ), tủ ấm, tủ sấy (Anh), nồi hấp âp lực Tommy (Nhật), kính hiển vi Olympus (Nhật), máy sấy phun (Trung Quốc), tủ sấy đối lưu tuần hoàn nhiệt (Việt Nam), tủ sấy chân không (Việt Nam)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp thu thập thông tin điều tra khảo sát

Việc thu thập thông tin được thực hiện bằng phương pháp trả lời các câu hỏi trong phiếu điều tra Phạm vi điều tra: Các cơ sở thu mua và chế biến cá tạp, các nhà máy chế biến hải sản thuộc ba miền Bắc, Trung, Nam Số lượng phiếu gửi đi 50 phiếu Việc xử lý thông tin sử dụng phương pháp thống kê

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu lấy ngẫu nhiên, tại các cơ sở thu mua và chế biến thủy sản thuộc hai tỉnh Quảng Ninh, Đồng Tháp và thành phố Hải Phòng, đại diện cho miền Bắc và miền Nam

2.2.3 Phương pháp phân tích

- Hàm lượng nước trong mẫu được xác định theo TCVN 4326-2001

- Protein tổng số được xác định theo TCVN 4328-2001

- Hàm lượng lipit được xác định theo TCVN 4331-2001

- Hàm lượng chất tro tổng số được xác định theo TCVN 4327-1993

- Hàm lượng gluxit xác định theo TCVN 1545-1993

- Hàm lượng thủy ngân được xác định theo TCVN 7993:2009

- Hàm lượng chì được xác định theo TCVN 7929:2008

- Hàm lượng asen được xác định theo TCVN 7601:2007

- Phương pháp xác định độ đục: Đo màu ở bước sóng 600nm

- Phương pháp xác định độ màu: Đo màu ở bước sóng 400nm

- Thành phần axit amin trong dịch thủy phân được phân tích trên máy HPLC

1090, Hewlept Packard, Mỹ Columm Hyperfil AA-ODF 2.1× 200mm

- Hàm lượng axit amin tổng số được phân tích bằng phương pháp so màu tyrozin:

Nguyên tắc: Định lượng axit amin tạo thành trong dịch thuỷ phân bằng phản ứng màu giữa axit amin với thuốc thử Folin Sau đó, dựa vào đường cong chuẩn của tyrozin để tính ra lượng axit amin

Mẫu được pha loãng đến nồng độ thích hợp Cho vào ống nghiệm: 1ml dịch thủy phân đã pha loãng, 2,5 ml dung dịch Na2CO3 0,5M và 0,5 ml dung dịch Folin pha loãng 5 lần Đặt ống nghiệm vào bể ổn nhiệt ở 370C trong 30 phút Đo cường

độ màu ở bước sóng λ = 660nm Sử dụng đường cong chuẩn tyrozin để tính ra lượng axit amin có trong dịch thuỷ phân Lưu ý: Với mẫu đối chứng thay 1ml dịch thủy phân bằng 1ml nước cất

Dựng đường chuẩn tyrozin

Cân 10mg tyrozin tinh khiết, thêm 1ml dung dịch HCl 1N, làm tan và cho hỗn hợp vào bình định mức, thêm nước cất đến vạch 200ml Từ dung dịch gốc này pha thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng 0,1x10-4M đến 0,4x10-4

Lấy 1ml dung dịch chuẩn, 5ml dung dịch Na2CO3 0,5M và 1ml Folin cho vào ống nghiệm lắc đều rồi để ở 370C trong 30 phút Đo cường độ màu của dung dịch hỗn hợp đối ngược với mẫu đối chứng (1ml nước cất thay thế 1ml dung dịch chuẩn) ở bước sóng λ = 660 nm Từ số liệu thu được dựng đường chuẩn tyrozin

Phương trình đường chuẩn tyrozin có dạng:

y = 0,0873x – 0,0475

Trong đó:

y: giá trị OD có được khi đo ở λ = 660 nm

x: lượng tyrozin có trong mẫu phân tích (µmol)

Đánh giá cảm quan sử dụng phương pháp mô tả (TCVN 3215-79): Số lượng mẫu

lấy 5kg/mẫu Thời gian lấy mẫu: Tháng 8 – 9/2009 dựa trên phiếu gửi mẫu và phiếu trả kết quả Hội đồng thống nhất phương pháp lựa chọn cần đánh giá (các chỉ số về mùi, mầu sắc, trạng thái của cơ thịt và hình thái bên ngoài) Hội đồng thực hiện các phép thử sơ bộ và thống nhất cách sử dụng thang cường độ đã đưa ra (trong thí nghiệm là tháng 10 điểm) Đánh giá cường độ trên thang

2.2.4 Phương pháp công nghệ

a) Phương pháp xác định hệ vi sinh vật gây thối trong nguyên liệu và giải pháp ức chế

Bước 1 Khảo sát hệ vi sinh vật có trong nguyên liệu cá tạp bao gồm hệ vi

sinh vật hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí (Clostridium), nhóm vi sinh vật chỉ thị (Coliforms,

E coli), nhóm vi sinh vật gây bệnh thường xuất hiện trong nguyên liệu cá (Staphylococcus aureus) v.v Những nhóm vi sinh vật này được phân lập và giữ

trong các ống nghiệm thạch nghiêng

Bước 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các giải pháp ức chế sự phát triển của các vi sinh vật trên như sử dụng kháng sinh (nisin, oxytetracycline), giải pháp pH, gia nhiệt, bổ sung NaCl

Bước 3 Ứng dụng các giải pháp ức chế đã được lựa chọn vào quá trình thuỷ phân cá

Phương pháp phân lập vi khuẩn hiếu khí có trong nguyên liệu

Để kiểm tra sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn hiếu khí có trong nguyên liệu ta tiến hành trang mẫu cần phân tích trên các môi trường kiểm tra

Phương pháp phân lập vi khuẩn kỵ khí (Clostridium)

Môi trường nuôi vi khuẩn kỵ khí phải đảm bảo khô, không có không khí Các bước tiến hành như sau: Hút 0,1 ml mẫu cho vào chính giữa đĩa petri sạch đã được sấy vô trùng Rót vào mỗi đĩa 15ml môi trường cao gan ở 44 - 470C, trộn đều mẫu với môi trường bằng cách xoay nhẹ đĩa và quay ngược trở lại Khi môi trường

đã đông thì phủ thêm một lớp thạch Chờ đông đặc lại đặt các đĩa vào bình kỵ khí nuôi ở 370C trong 24 giờ Đếm các khuẩn lạc mọc kị khí dưới lớp thạch và có màu đen sậm

Phương pháp nhuộm Gram

Để kiểm tra xem một loại vi khuẩn là Gram âm hay Gram dương ta dùng phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi Các bước tiến hành như sau:

Cố định mẫu vi sinh vật trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm bằng dung dịch crystal violet 1% (C25H30ClN3) trong 1 phút Sau đó nhỏ thêm dung dịch Lugol, chờ trong 1 phút Tiến hành rửa mẫu dưới vòi nước và rửa lại bằng cồn cho đến khi thuốc nhuộm không còn phai ra nữa sau đó lau khô Nhỏ dung dịch Safanin 1% lên trên vết bôi và để yên trong 30 giây Sau đó rửa lại dưới vòi nước Làm khô trên ngọn lửa đèn cồn và mang đi soi kính hiển vi với độ phóng đại 100

Phương pháp xác định giải pháp ức chế vi sinh vật gây thối

Cá được xay nhuyễn, trộn đều sau đó cho vào các bình schott Bổ sung dung dịch đệm thích hợp với tỷ lệ 1:1 Bổ sung enzym flavouzym 0,5% và các giải pháp

ức chế vi sinh vật tương ứng Tiến hành thủy phân trong 24 giờ ở nhiệt độ 500C

Tiến hành lấy mẫu theo thời gian tại các thời điểm 0, 6, 12, 18 và 24 giờ Mẫu được sử dụng để khảo sát hệ vi sinh vật hiếu khí, nhóm vi sinh vật chỉ thị

Coliforms và E.coli, vi khuẩn kị khí Clostridium, vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus Đồng thời tiến hành phân tích hàm lượng axit amin của

dịch thuỷ phân

b) Phương pháp thủy phân

Cá tạp (hoặc phế liệu nhà máy chế biến cá) đã xay được cho các bình schoot

và bổ sung enzym vào Tiến hành thủy phân ở 500C trong thời gian 24 giờ

Hoạt lực của enzym và lượng axit amin tạo thành được xác định dựa trên phản ứng màu của axit amin với thuốc thử folin Cường độ màu được đo ở bước sóng λ= 660 nm Dựa vào đường chuẩn tyrozin để xác định lượng axit amin được tạo thành

Quy hoạch thực nghiệm theo kế hoạch bậc hai trực giao [19]

Khi mô hình là phi tuyến, thì để xác định các thông số của nó ta phải dùng kế hoạch phi tuyến Kế hoạch bậc hai trực giao của Box- Wilson được hình thành với nhân kế hoạch 2k có số thực nghiệm là: N = 2k + 2k + no

Trong đó:

k: số yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu

2k: số thực nghiệm ở cánh tay đòn sao α

no: số thực nghiệm ở tâm

Biến mã hóa:

xi = (Zi – Zoi)/∆Zi Zoi = (Zmin + Zmax)/2

∆Zi = (Zmin - Zmax)/2

Zmin: giá trị dưới

Zmax: giá trị trên

Các bước tiến hành:

Lựa chọn và thu hẹp miền khảo sát các thông số ảnh hưởng

Xây dựng ma trận thực nghiệm và tiến hành thí nghiệm theo ma trận

Tính toán và kiểm định sự có nghĩa của các hệ số hồi qui

Kiểm định sự tương thích của mô hình

Tối ưu hóa chập mục tiêu

Bảng 8 Mục tiêu và tầm quan trọng của các yếu tố

Các yếu tố và hàm mục tiêu Mục tiêu Tầm quan trọng