Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kít để chuẩn đoán các loài ký sinh trùng chủ yếu ở Việt Nam

Multiplex-PCR, một loại hình chẩn đoán phân tử đa gen và đa mồi, ứng dụng phát hiện cùng lúc gen đặc hiệu của nhiều loài, sẽ cho kết quả chính xác từng loài KST gây bệnh để có hướng chẩn

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

PGS.TS LÊ THANH HÒA

Cơ quan chủ trì đề tài

BỘ Y TẾ

9574

Hà Nội - 2012

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới, đặc biệt sinh học phân

tử đã có những định hướng phát triển vượt bậc Một trong những thành tựu lớn là sự phát triển kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) ứng dụng cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh vật, trong đó có ký sinh trùng (Blair et al., 2005; Chandler, Colitz, 2006) PCR đã trở nên một công cụ không thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiên sinh vật, kể cả ký sinh trùng gây bệnh bằng kỹ thuật cao Dễ làm, có tính nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lượng rất ít khuôn ADN của đối tượng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR

đã có thể cho sản phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật nghiên cứu Do đó, với lợi thế như vậy, PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực, trước hết là chẩn đoán các loài gây bệnh (Ishmael, Stellato, 2008)

Thành phần loài ký sinh trùng (KST) ở Việt Nam rất phong phú gồm ký sinh trùng đường ruột, đường hô hấp, thường gây bệnh đối với cộng đồng nghèo (bao gồm: sán lá gan lớn, nhỏ; sán lá phổi; sán dây và ấu trùng sán lợn) và phân bố đa nhiễm trong cơ thể, đặc biệt là ở đường ruột, tồn tại ở dạng trưởng thành hoặc/và các dạng đang phát triển khác Một số loại KST nói trên còn có giai đoạn tồn tại phát triển tại vật chủ trung gian (cá, ốc, cua, tôm) duy trì nguồn gen ký sinh Nếu sử dụng các phương pháp truyền thống là hình thái học hoặc/và huyết thanh học để chẩn đoán xác định, thì sẽ có nhiều lúc chưa chính xác, đặc biệt có một số KST gây bệnh có biểu hiện bệnh lý tương tự nhau, có hình thái gần giống nhau hoặc đang ở trong vật chủ trung gian ở dạng ấu trùng (metacercaria) rất khó phân biệt Bất kỳ ở đâu, đơn hay đa nhiễm, dạng trứng, ấu trùng hay trưởng thành, riêng rẻ hay lẫn lộn (ví dụ: trong đường ruột gồm trứng/con trưởng thành của nhiều loại khác nhau; hay tập hợp metacercaria trong cá/cua/tôm), KST đều cung cấp nguồn gen đích làm khuôn cho phản ứng phát hiện gen đặc hiệu của từng loài Multiplex-PCR, một loại hình chẩn đoán phân tử đa gen và đa mồi, ứng dụng phát hiện cùng lúc gen đặc hiệu của nhiều loài, sẽ cho kết quả chính xác từng loài KST gây bệnh

để có hướng chẩn đoán nhanh nhất, tiết kiệm nhất, điều trị và phòng chống đúng đắn nhất

Đề tài cấp Bộ: “Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kit để chẩn đoán các loài ký sinh trùng chủ yếu ở Việt Nam”, đã được Bộ Y tế phê duyệt, cấp kinh phí, cho

thực hiện trong giai đoạn 2010 – 2011, với một số chủ đích như sau:

Mục tiêu chung của đề tài: Có được các bộ kit chẩn đoán đa gen đối với một số

ký sinh trùng thường gặp

Cụ thể:

1 Xây dựng được kit sinh học phân tử chẩn đoán và phân biệt đối với ký sinh trùng thường gặp trên người ở Việt Nam là sán lá gan lớn (fascioliasis), sán lá gan nhỏ (clonorchiasis), sán lá ruột nhỏ (haplorchiasis), sán lá phổi (paragonimiasis), sán dây và

ấu trùng sán lợn (taeniasis)

2 Trên cơ sở đã chuẩn hoá bộ kit, có thể tiến hành ứng dụng chẩn đoán trên một

số bệnh nhân ở Việt Nam diện hẹp trước khi phát triển ứng dụng qui mô lớn

Từ mục tiêu như vậy, đề tài đã đưa ra một số luận giải cơ bản cho quá trình thực hiện thiết kế phương pháp và xây dựng kit multiplex-PCR, như sau:

i) Phải có mồi đặc hiệu và nhạy cho mỗi một vùng gen đối tượng, do vậy, phải

có trình tự nucleotide của vùng gen đó;

ii) Phải khoanh nhóm đối tượng chẩn đoán, trước hết là nhóm xuất hiện trong

đường ruột (trứng/KST trưởng thành của các loài sán lá sán dây), đường hô hấp (sán lá phổi), metacercaria trong cá/cua, thậm chí ấu trùng trong ốc/vật chủ trung gian;

iii) Kit phải có độ đặc hiệu và độ nhạy cao và cần thử nghiệm đánh giá;

iv) Mẫu bệnh phẩm sử dụng phải là loại lấy từ vật chất thu thập dễ dàng của

đối tượng (ví dụ: sán trưởng thành, trứng, phân, đờm, metacercaria trong cá, cua; cercaria trong vật chủ trung gian);

v) Kit phải được kiểm nghiệm bằng phương pháp giả nghiệm từ các nguồn

khuôn đã xác định trộn lẫn với nhau (in vitro) và có thể được thử nghiệm thực tế (in

vivo), nếu có điều kiện;

vi) Xây dựng qui trình bảo quản, sử dụng đáp ứng yêu cầu;

vii) Triển khai ứng dụng chẩn đoán trên bệnh phẩm của bệnh nhân ở qui mô

hẹp, nếu có điều kiện thực hiện

Trong điều kiện thực tế thực hiện đề tài (2010-2011), chúng tôi đã xây dựng được các kit multiplex-PCR chẩn đoán ký sinh trùng đăng ký trong đề tài: 2 loài sán lá

gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), 2 loài sán lá gan lớn (Fasciola

gigantica; F hepatica), 2 loài sán lá phổi (Paragonimus heterotremus; P ohirai), 2 loài sán lá ruột nhỏ (Haplorchis taichui; H pumilio), 3 loài sán dây/ấu trùng sán lợn (Taenia solium; T saginata; T asiatica) Gen đích chủ yếu tập trung vào chỉ thị phân

tử hệ gen ty thể, dựa vào dữ liệu nucleotide của toàn bộ hệ gen ty thể sán lá gan nhỏ

(Clonorchis; Opisthorchis); của sán lá gan lớn Fasciola spp; của sán lá ruột nhỏ Haplorchis spp; và của sán lá phổi Paragonimus spp

Cơ sở dữ liệu gen/hệ gen ty thể có thể tìm thấy tại GOBASE (xem: http://gobase.bcm.umontreal.ca/) (O’Brien et al., 2009), bao gồm nhiều dữ liệu do chúng tôi và đồng nghiệp xây dựng (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006) Mặt khác, nhiều dữ liệu gen/hệ gen ty thể được cập nhật trong quá trình thực hiện đề tài của sán lá

ruột nhỏ Haplorchis spp (Le et al., chưa công bố; De and Le, 2011) Sử dụng chỉ thị

phân tử ty thể từ nguồn dữ liệu này, các bộ kit đã được nghiên cứu và thực hiện

Tám bộ kit đã được xây dựng, đó là:

i) Bộ kit số 1, ký hiệu bộ kit A(Cs+Ov), 2 loài: Giữa sán lá gan nhỏ Clonorchis

sinensis và Opisthorchis viverrini;

ii) Bộ kit số 2, ký hiệu bộ kit B(Fg+Fh), 2 loài: Giữa sán lá gan lớn Fasciola

hepatica và F gigantica;

iii) Bộ kit số 3, ký hiệu bộ kit C(Ht+Hp), 2 loài: Giữa sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H pumilio;

iv) Bộ kit số 4, ký hiệu bộ kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg), 4 loài: Giữa sán lá gan nhỏ

C sinensis và O viverrini và sán lá gan lớn F gigantica và F hepatica;

v) Bộ kit số 5, ký hiệu bộ kit AC(Cs+Ov+Hp+Ht), 4 loài: Giữa sán lá gan nhỏ

C sinensis và O viverrini và sán lá ruột nhỏ H pumilio và H taichui;

vi) Bộ kit số 6, ký hiệu bộ kit BC(Fh+Fg+Ht+Hp), 4 loài: Giữa sán lá gan lớn F

hepatica và F gigantica và sán lá ruột nhỏ H pumilio và H taichui;

vii) Bộ kit số 7, ký hiệu bộ kit D(Tso+Tsa +Tas), 3 loài: Giữa sán dây T solium

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐÁNH GIÁ VỀ BỆNH KÍ SINH TRÙNG THƯỜNG GẶP THUỘC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1.1.1 Đánh giá tình hình chung về bệnh kí sinh trùng

Hiện nay, đã có hàng trăm loại bệnh KST, trước hết là các bệnh do sán lá (trematode), sán dây (cestode), giun tròn (nematode) và KST đơn bào (protozoa) ở người hoặc truyền từ động vật sang người rồi gây bệnh (zoonotic infection), đã được nghiên cứu sâu sắc ở mọi góc độ nguyên nhân, sinh thái học, hình thái học, đặc tính truyền lây, cơ chế sinh bệnh, vòng đời, điều trị, phòng chống, chẩn đoán ký sinh trùng học, huyết thanh học, gen học và mối quan hệ phả hệ thành phần loài (McCarthya, Moore, 2000; Macpherson, 2005; Graczyk, Fried, 2007; Littlewood, 2008; De Lellis et al., 2008) Nhiều loại bệnh KST mới xuất hiện hoặc tái xuất hiện ((re)-emerging parasitic infections) ở nhiều quốc gia, trong đó có nhiều loại rất nguy hiểm, kháng thuốc nhanh và mức độ kháng thuốc cao đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của y tế thế giới

Sự bùng nổ/tái xuất/đa nhiễm/kháng thuốc/đột biến của nhiều loài KST gây bệnh đã đặt

ra yêu cầu cần có nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác, kinh tế và tiết kiệm thời gian (Hotez et al., 2008; King, Bertino, 2008)

Một số đối tượng KST thường gặp gây bệnh ở Việt Nam gồm các loài truyền lây

từ động vật sang người qua thức ăn (foodborne trematodes/cestodes), là đối tượng để

xây dựng kit chẩn đoán multiplex-PCR thuộc phạm vi đề tài này Hơn nữa, các đối tượng nghiên cứu ở đây thuộc loại tồn tại trong thức ăn (cá, cua, tôm) và có nhiều dạng sinh trưởng tồn tại trong ruột (trứng, sán trưởng thành), rất thuận lợi cho việc phát hiện phân tử bằng kit PCR đa mồi

1.1.2 Một số bệnh thường gặp là đối tượng nghiên cứu của đề tài

1.1.2.1 Sán lá gan nhỏ và bệnh sán lá gan nhỏ

Sán lá gan nhỏ làm đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 2 loài Clonorchis sinensis phân bố ở Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và phía Đông nước Nga Opisthorchis viverrini phân bố ở Đông Nam Châu Á, gặp trên người

Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam, Campuchia và Trung Quốc Bệnh thường gặp nhất

và có vai trò dịch tễ học quan trong nhất của châu Á và thế giới là bệnh sán lá gan nhỏ

(clonorchiasis/opisthorchiasis) do C.sinensis và Opisthorchis viverrini gây ra Một điều đặc biệt hết sức lưu ý là O viverrini và C sinensis được coi là yếu tố tham gia tích cực

trong cơ chế tiến triển gây ung thư biểu mô túi mật (cholangiocarcinoma) với gần như

100% tử vong ở người (Sripa, 2007) Xu hướng phân bố của cả hai loài này là ở châu Á, trong đó C sinensis là ở vùng Đông – Bắc và O viverrini ở vùng Đông – Nam của châu

Á Việt Nam là vùng địa lý có sự tồn tại cả hai loài, cho đến nay, C sinensis phát hiện ở các tỉnh phía Bắc đến Nghệ An; O viverrini phát hiện ở các tỉnh miền trung và phía

Nam từ Quảng Trị, Thừa Thiên – Huế đến Phú Yên, Đắc Lắc (Le et al., 2006; Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2006) Vùng giao nhau có thể là các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, đó cũng là việc cần xác định thêm cho chính xác (Le et al., 2006), điều này càng có ý nghĩa khi sử dụng kit multiplex-PCR để sàng lọc nguồn bệnh trên đối tượng là người và cá tại các địa bàn có thể có giao nhau của 2 loài (Lê Thanh Hoà

Sán lá gan nhỏ C sinensis có dạng hình lá, thân dẹt, màu đỏ nhạt, dài từ 10 – 20

mm, chiều ngang từ 2 – 4 mm, có hai mồm hút Mồm hút phía trước có đường kính

khoảng 600 µm, đường kính của mồm hút phía sau khoảng 500 µm Ống tiêu hoá chạy dọc hai bên thân Lỗ sinh dục ở gần mồm hút vùng giữa Tinh hoàn chia nhánh gần chiếm hết phía thân sau Buồng trứng ở khoảng giữa thân, tử cung là một ống ngoằn

nghèo gấp khúc (Hình 1.1A) Trứng sán C sinensis thường có hình bầu dục hoặc hình

bóng đèn điện, màu vàng nâu, kích thước trung bình khoảng (27 x 15) µm (Hình 1.1B)

Số lượng trứng C sinensis đẻ hàng ngày phụ thuộc vào vật chủ và thời gian nhiễm

Sán lá gan nhỏ O viverrni trưởng thành còn sống màu trong suốt và có màu hồng

hoặc màu đỏ, đầu phía trước nhỏ có hấp khẩu miệng nằm gần tận cùng, một hấp khẩu bụng hình chén nằm ở mặt bụng, khoảng 1/5 về phía trước cơ thể Kích thước trung bình của sán trưởng thành dài 7,4 mm (5,5 – 9,55 mm) và rộng 1,47 mm (0,77 – 1,65

mm) (Hình 1.2A) Trứng của sán lá gan nhỏ O viverrini và C sinensis rất giống nhau,

khó phân biệt về hình thái Trứng hình oval hay bóng đèn, màu vàng nhạt, có nắp nhô lên, kích thước trung bình (27 – 15 µm) ( Hình 1.2B)

1.1.2.2 Sán lá gan lớn và bệnh sán lá gan lớn

Bệnh sán lá gan lớn là bệnh chung của người và gia súc chủ yếu do hai loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 và Fasciola gigantica Cobbold, 1856 (thuộc họ Fasciolidae) gây nên Fasciola spp gây bệnh chủ yếu trên động vật ăn cỏ trâu, bò, cừu, dê… tuy nhiên Fasciola spp vẫn thích ứng và gây bệnh cho người (Kumar, 2001; Lofty

et al., 2008; Nguyen et al., 2009) Sự phân bố của hai loài F hepatica và F gigantica khác nhau trên thế giới, loài F hepatica gây bệnh ở các vùng có nhiệt độ ôn đới trong khi F gigantica có mặt rộng rãi ở các châu lục, đặc biệt ở vùng có khí hậu nhiệt đới

(Mas-Coma et al., 2005; 2009) Sự phân bố theo vùng như thế này không phải là tuyệt

đối, vì cả hai loài F hepatica và F gigantica đều cùng tồn tại ở một số nước thuộc

vùng Trung và Đông Nam Á như: Pakistan, Iran, Nhật Bản và Trung Quốc (Kumar, 2001; Ashrafi et al., 2006; Mas-Coma et al., 2009) Những nghiên cứu gần đây ở Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc, Iran khẳng định sán lá gan lớn thuộc loài lưỡng bội, tam bội và đa bội (diploid, triploid và “mixoploid”), nhiều khi tồn tại ở dạng hình thái học trung gian (intermediate form) và hầu như thuộc loại khuyết sản (Itagaki

et al., 2005; Xuan et al., 2005; Le et al., 2007; 2008; Nguyen et al., 2009; Choe et al., 2011) Tại Việt Nam, trường hợp người bị nhiễm sán lá gan lớn được ghi nhận càng ngày càng nhiều bằng phương pháp chẩn đoán hình thái học, huyết thanh học và sinh học phân tử (Tran et al., 2001), trong đó có một số trường hợp có sự di chuyển hết sức

đặc biệt của chúng ở người (Xuan et al., 2005; Le et al., 2007) Nghiên cứu di truyền

học hệ gen ty thể và hệ gen nhân cho thấy có sự lẫn tạp di truyền và lai tự nhiên giữa F hepatica và F gigantica trong quần thể sán lá gan lớn ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn

Quốc và Việt Nam (Agatsuma et al., 2000; Itagaki et al., 2011; Le et al., 2008) Do vậy,

việc thẩm định loài F hepatica và F gigantica, đặc biệt đối với các mẫu sán có hình

dạng trung gian nhất thiết cần sử dụng phương pháp sinh học phân tử (Huang et al., 2004; Itagaki et al., 2005; Le et al., 2008; Mas-Coma et al., 2009) Toàn bộ hệ gen ty

thể của F hepatica và F gigantica đã được giải mã (Le et al., 2001; 2002) cũng như rất

nhiều chuỗi ITS-2 trong Ngân hàng gen cung cấp dữ liệu quan trọng và chính xác để

thẩm định loài của quần thể Fasciola spp (xem Le et al., 2008)

Hình 1.3 Sán lá gan lớn F hepatica trưởng thành (A), F gigantica trưởng thành (B) và trứng sán

Fasciola spp trên tiêu bản thu nhận bằng phương pháp Kato-Katz (B)

Sán lá gan lớn trưởng thành hình chiếc lá, thân dẹt, bờ mỏng, kích thước 20-30 x 10-12 mm, màu trắng hồng hoặc xám đỏ; ở người, sán ký sinh trong đường mật, bất thường có thể ký sinh lạc chỗ như trong cơ bắp, dưới da, phúc mạc (Le et al., 2007; 2008) (Hình 1.3A,B) Sán lá gan trưởng thành tồn tại 2 thể: nhị bội (diploid) và tam bội (triloid), đẻ trứng theo đường mật xuống ruột và ra ngoài theo phân Trứng có dạng hình oval thường chụm lại với nhau (Hình 1.3C) Trứng xuống nước, nở ra ấu trùng lông (miracidium), khi nhiệt độ thích hợp (15 - 25°C), trong vòng 9 - 21 ngày Miracidium

tiếp tục ký sinh trong ốc thuộc giống Lymnaea và phát triển thành ấu trùng đuôi

(cercaria), sau đó cercaria rời khỏi ốc và bám vào các thực vật thủy sinh để tạo nang trùng (metacercaria) hoặc bơi tự do trong nước (khoảng 1 giờ) Người hoặc trâu bò ăn phải thực vật thủy sinh hoặc uống nước lã có ấu trùng này sẽ bị nhiễm sán lá gan lớn (Mas-Coma et al., 2005; 2009; Ashrafi et al., 2006) Metacercaria vào vật chủ chính qua đường miệng, thoát kén, xuyên thành ruột, xuất hiện trong ổ bụng, tiếp tục xuyên vào gan, đến gan vào ngày thứ 6 sau khi thoát kén, sau đó chúng di hành đến ký sinh trong

đường mật, trưởng thành đẻ trứng và tiếp tục vòng đời Tuổi thọ của sán lá gan lớn ở người từ 9 - 13,5 năm (Kumar, 2001) Do vòng đời với nhiều giai đoạn phát triển tại nhiều vật chủ khác nhau, việc chẩn đoán sinh học phân tử phát hiện và phân biệt

Fasciola spp là thuận lợi (Mas-Coma et al., 2005; 2009)

1.1.2.3 Sán lá ruột nhỏ và bệnh sán lá ruột nhỏ

Sán lá ruột nhỏ phần lớn truyền qua cá phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, bao gồm 69 loài sán lá ruột nhỏ được biết là ký sinh ở người, đáng chú ý nhất là sán lá ruột truyền qua cá chủ yếu thuộc họ Heterophyidae và Echinostomatidae (WHO/WR, 2002)

Trong họ Heterophyidae các loài trong giống Haplorchis được đặc biệt quan tâm Đối với Haplorchis spp, trong những năm gần đây, về dịch tễ học ở các nước châu Á có số

lượng người nhiễm ngày càng tăng, do sự phân bố rộng trên thế giới và phương thức truyền lây qua cá nước ngọt, một nguồn protein chủ yếu ở các nước đang phát triển Có

5 loài thuộc giống Haplorchis được thông báo gây bệnh trên người, bao gồm H taichui,

H pumilio, H yokogawai, H pleurolophocerca, and H vanissimus Haplorchis pumilio

Loss, 1986 được phát hiện ký sinh trên người ở Đài Loan, Trung Quốc, Philippines, Ai

Cập, Thái Lan, Australia, Việt Nam (De, Le, 2011) (Hình 1.4A) Haplorchis taichui

Nishigori, 1924 được phát hiện ký sinh trên người ở Philippines, Thái Lan, Lào, Đài Loan, Bangladesh, Việt Nam (Dung et al., 2007) (De, Le, 2011) (Hình 1.4B)

Haplorchis yokogawai Katsuta, 1932 được phát hiện ký sinh trên người ở Philippines,

Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan

Hình 1.4 Sán lá ruột nhỏ trưởng thành và trứng của H pumilio (A); Sán trưởng thành và trứng của H

taichui (B)

Haplochis spp là loài sán lá ruột nhỏ để hoàn thành vòng đời chúng phải trải qua

nhiều loài vật chủ phức tạp (vật chủ chính, vật chủ trung gian) nên thường ít được quan tâm (kể cả y tế, thú y và thủy sản) Sán trưởng thành ký sinh ở ruột, đẻ trứng và trứng theo phân ra ngoài, rơi vào môi trường nước, trứng nở ra ấu trùng lông chui vào ốc để

phát triển thành ấu trùng đuôi Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi phát triển thành nang trùng rồi ký sinh ở trong thịt hoặc mang của cá (mắt thường khó nhìn thấy) Người hoặc động vật ăn phải cá có ấu trùng nang chưa được nấu chín, ấu trùng này chui vào dạ dày, đến ruột phát triển thành sán trưởng thành và ký sinh tại đây

những bệnh ký sinh trùng từ động vật truyền sang người (parasitic zoonosis) Hiện nay

loài T solium gây bệnh ấu trùng sán lợn ở người, gọi là bệnh ấu trùng sán lợn

(cysticercosis) được coi là bệnh nguy hiểm nhất do sán dây gây ra (Willingham, Engels,

2006; Willms, 2008) Trong thời gian rất lâu, loài T saginata và T asiatica chưa được phân biệt thành hai loài riêng biệt và T asiatica được coi là dưới loài của T saginata với tên gọi là T saginata asiatica (Eom, 2006) Trong 5 năm trở lại đây, loài sán dây T asiatica được chính thức phân loại là sán dây gây bệnh trên người, tuy nhiên vòng đời

và một số đặc tính sinh học của loài mới này vẫn đang còn nghiên cứu (Eom, 2006)

Các phương pháp SHPT đã được áp dụng trong việc giải mã hệ gen ty thể và nhiều hệ gen nhân tế bào và những chỉ thị phân tử có giá trị trong chẩn đoán, phân loại và nghiên cứu di truyền quần thể và thẩm định các loài đã có và loài mới phát hiện (Le et al., 2002; Yamasaki et al., 2006)

a) Sán dây bò Taenia saginata: T saginata dài khoảng 2 – 12 m, gồm 1000 –

2000 đốt, đầu không có chùy và không có vòng móc, có 4 giác bám, tử cung chia 12 –

32 nhánh Nang ấu trùng sán dây bò hình bầu dục, màu hồng, kích thước 0,6 – 0,8 x 0,3 – 0,5 cm chứa dịch màu đỏ và đầu sán với 4 giác bám không có vòng móc (Hình 1.5)

Nang ấu trùng sán dây không ký sinh ở người (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010) b) Sán dây lợn Taenia solium: Sán dây lợn T solium dài khoảng 4 – 8 m, có

khoảng 900 đốt gồm 3 phần (phần đầu, phần cổ là nơi sinh ra đốt non, phần thân chứa

trứng và bộ phận sinh dục) Vật chủ trung gian là lợn (ký sinh chủ yếu ở cơ và não) (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010)

c) Sán dây châu Á Taenia asiatica: T asiatica dài khoảng 3,9 m (1,35 – 8,21 m)

gồm 600 đốt (186 – 1148 đốt) Đầu hình cầu, kích thước 0,959 mm (0,525 – 1,975 mm)

x 0,790 mm (225 – 1800 mm), có mỏ chày (lồi hoặc lõm) và có 2 vòng móc nhỏ bao quanh, có 4 giác bám Trứng sán dây có hình cầu, kích thước 20 – 50 micromet, có vỏ dày, màu sẫm, nhân có vết móc (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010)

d) Ấu trùng sán lợn: Bệnh ấu trùng sán lợn (cysticercosis) ở người do ăn phải

trứng sán dây lợn, ấu trùng chủ yếu ký sinh ở cơ vân, cơ tim, trong não, trong mắt, dưới

da Nang ấu trùng hình bầu dục, màu trắng đục, chứa dịch trắng đục và đầu sán với 4 giác bám và 2 vòng móc Ấu trùng sán lợn ở lợn có kích thước 0,3 mm sau gây nhiễm 6 ngày; kích thước 6 – 9 mm sau gây nhiễm 60 – 70 ngày; kích thước 8 – 15 mm sau gây nhiễm 177 – 325 ngày Nang ấu trùng sán lợn khi ký sinh ở người có kích thước to hơn khi ký sinh ở lợn, nang dưới da kích thước từ 0,5 x 1,5 – 2 mm, có nang sau hàng chục năm phát triển tới kích thước 10 – 15 cm và chứa 50 ml dịch (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010)

Bệnh sán dây/ấu trùng sán lợn phân bố rải rác nhiều nước trên thế giới với khoảng 100 triệu người nhiễm bệnh, bắt đầu tăng mạnh vào những năm 1980 Một số quốc gia ở châu Âu có số ca mắc cao là Tây Ban Nha, Mexico

Hình 1.5 Sán dây trưởng thành (A) và trứng của sán dây bò T saginata (B)

Hiện nay, tại Việt Nam, theo báo cáo từ các nhà khoa học đã phát hiện có ít nhất

51 tỉnh, thành có ca bệnh sán dây/ấu trùng sán lợn, bao gồm các tỉnh Lai Châu, Lào Cai,

Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Bắc Cạn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên, Bắc Giang, Ninh Bình,

Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ

An, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Đăk Lăk, Khánh Hòa, Lâm Đồng, Bình Thuận, Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Bình Dương, thành phố Hồ

Chí Minh, Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long, Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang Điều tra cộng đồng tại Bắc Ninh, tỷ lệ nhiễm sán dây 12% và nhiễm ấu trùng sán lợn 5,7% (Nguyễn Văn Đề và cs, 2006) Sán dây trưởng thành sống ký sinh trong ruột người Sán lưỡng tính và những đốt sán ra ngoài môi trường bị thối rữa giải phóng trứng Trâu, bò, lợn ăn phải trứng và đốt sán phát tán trong môi trường hoặc ăn phân người có sán, trứng vào dạ dày và ruột (của trâu, bò, lợn), nở ra ấu trùng; chui qua thành ống tiêu hóa vào máu và tới các cơ vân tạo

kén ở đó, gọi là “bò gạo”, “lợn gạo” Người ăn phải thịt “bò gạo”, “lợn gạo” còn sống

thì ấu trùng sán vào ruột nở ra sán dây trưởng thành Lúc mới nở sán dây chỉ có đầu và một đoạn cổ Sán lớn lên và phát triển bằng cách nẩy chồi, sinh đốt mới từ đốt cổ và sán

dài dần ra (Hình 1.5) (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010)

1.1.2.5 Sán lá phổi và bệnh sán lá phổi

Bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) là bệnh ký sinh trùng do giống sán lá phổi

Paragonimus gây nên, có tới trên 50 loài thuộc giống Paragonimus (Digenea:

Paragonimidae) đã được mô tả, trong đó hơn 10 loài ký sinh gây bệnh ở người, đó là các

loài P westermani, P skrjabini, P heterotremus, P ohirai và một số loài khác (Blair et

al., 1999; 2005) Bệnh thường xảy ra ở nơi có tập quán ăn các món ăn có cua, tôm sống hoặc cua hoặc tôm sống làm thuốc chữa bệnh Bệnh được phân bố chủ yếu ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ Trung Quốc là nước ở Châu Á có nhiều triệu người mắc bệnh và

nhiều loài gây bệnh nhất thế giới, ngoài ra Paragonimus còn được phát hiện ở Nhật

Bản, Triều Tiên, Đài Loan, Thái lan, Lào, Philippin, Việt Nam (Liu et al., 2008) Tại

Việt Nam, loài chính thức gây bệnh trên người được giám định là P heterotremus (Le

et al., 2006), một số loài mới khác cũng được phát hiện gần đây trên vật chủ trung gian

là P proliferus và P vietnamensis sp nov (Doanh et al., 2007; 2008), đặc biệt gần đây

là loài P westermani phát hiện trên vật chủ trung gian (Doanh et al., 2009) Như vậy cho đến nay, ít nhất có 4 loài, trong đó có một loài (P heterotremus) gây bệnh trên

người tại Việt Nam Do đặc điểm địa lý, Việt Nam có thể còn có một số loài gây bệnh

trên người khác cần phát hiện, kể cả P westermani và P ohirai (Doanh et al., 2009)

Sán lá phổi trưởng thành dài 8 – 16 mm, chiều ngang 4 – 8 mm, dày 3 – 4 mm,

có màu nâu đỏ, có thể thấy bằng mắt thường và rất giống như một hạt cà phê (Hình 1.5) Trứng sán rất nhỏ và có nắp, màu sẫm, dài từ 80 – 100 cm, chiều ngang từ 50 – 67 cm, chỉ phát hiện được dưới kính hiển vi (Hình 1.5)

Hình 1.6 Sán lá phổi trưởng thành (A); và trứng của sán (B) (Nguồn: CDC)

Sán lá phổi trưởng thành thông thường khu trú ở phổi của ký chủ ký sinh cuối cùng là các loài có vú, trong đó có người, chủ yếu là ở các nước châu Á, một số nước Nam Mỹ và vài nước châu Phi Ước tính có khoảng 20 triệu người bị nhiễm sán phổi (Toscano et al., 1995) ngày nay có thể trên 30 triệu (Blair et al., 2005) Loài quan trọng

nhất gây nhiễm hàng chục triệu người ở châu Á là P westermani Kerbert, 1878, tiếp đến là P skrjabini Chen, 1959 và P heterotremus Chen and Hsia, 1964 Cho đến nay,

có nhiều các bài viết đề cập đến sán lá phổi với nhiều khía cạnh khác nhau của sán phổi

(Paragonimus) và bệnh sán phổi (paragonimiasis), do tầm quan trọng ngày càng lớn của

loại ký sinh trùng này và có trên 1000 công trình nghiên cứu về sán phổi được công bố trong hơn 40 năm qua (Blair et al., 2005)

1.2 ĐÁNH GIÁ VỀ MULTIPLEX-PCR

1.2.1 Đặt vấn đề sử dụng multiplex-PCR

Khi KST cùng tồn tại ở một vị trí, một vùng trong cơ quan của cơ thể (ví dụ: cùng

ở trong máu, cùng trong đường/khoang ruột, cùng trong phổi/dịch phổi, cùng trong vật chủ trung gian ), thì việc cùng lúc phát hiện và phân biệt nhiều loài gây bệnh mang lại tính kinh tế và lợi ích cao hơn nhiều so với thực hiện đơn lẻ (Edwards, Gibbs, 1994) Mỗi một lần làm chẩn đoán sử dụng PCR đơn gen (uniplex-PCR) để phát hiện thì tiêu tốn thời gian, nguồn khuôn, công sức, tiền của và chưa được kinh tế, hơn nữa làm chậm tiến độ chẩn đoán Do vậy, gần đây người ta đã phát triển ứng dụng PCR đa mồi phát hiện đa gen (multiplex-PCR) cùng lúc phát hiện sự có mặt của nhiều sinh vật trong một nguồn bệnh phẩm, cho dù đó là khuôn DNA tổng số gồm nhiều loại khác nhau, lấy từ các cá thể khác nhau cần chẩn đoán (Elnifro et al., 2000) Nhiều trường hợp, người ta sử dụng mồi phát hiện một lúc 6 nguồn khuôn (hexaplex-PCR) (Singh, 2003), hay xác định

7 loài khác nhau (Fernandez et al., 2003), thậm chí có nhiều kit phát hiện đến 14 loại virus khác nhau với độ nhạy và chính xác cao (Coiras et al., 2004)

Về nguyên tắc, trong multiplex-PCR đa mồi, cùng lúc các chuỗi gen của cùng đối tượng gây bệnh hay của các đối tượng khác đều có thể nhân lên được, bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu trong một phản ứng Mỗi một cặp mồi đặc hiệu sẽ tìm kiếm chính xác vùng gen đích và nhân vùng gen đó để cho sản phẩm Nếu thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho mỗi vùng gen đích cần chẩn đoán (của cùng loài hay khác loài), nếu sản phẩm PCR thu được có kích thước chênh lệch nhau, thì khi hiển thị sản phẩm trên agarose, rất dễ dàng đánh giá phân biệt (Deng et al., 2000; Kaderali, 2007) Nhờ những lợi thế đó, multiplex-PCR đã chứng tỏ là phương thức chẩn đoán phân tử tiết kiệm thời gian, công sức, nguồn khuôn từ bệnh phẩm, đa dụng, phát hiện đa bệnh, dễ làm, tiện ích (Edwards, Gibbs, 1994; Elnifro et al., 2000) Chính vì vậy, ngày nay, chẩn đoán phân tử dựa trên cơ sở chuỗi nucleotide (DNA và RNA) bằng kỹ thuật đa mồi PCR (đối với khuôn là DNA) hoặc/và RT-PCR (đối với khuôn là RNA), kể cả kỹ thuật định lượng nguồn gen (real-time PCR) đã được ứng dụng, trong đó có phân tích gen/hệ gen, phân tích đa hình, chẩn đoán và phân tích nhiễm sắc thể, chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh, ký sinh trùng, nấm, vi khuẩn, độc tố, kháng thuốc, định lượng RNA, đánh giá chất lượng sản phẩm, xác định sinh vật chuyển gen và nhiều mục đích khác (Deng et al., 2000; Kubista et al., 2006; Ono et al., 2007; De Lellis et al., 2008)

1.2.2 Những điều kiện với multiplex-PCR được lưu ý khi thực hiện đề tài

1.2.2.1 Điều kiện về mồi

Sử dụng trong multiplex-PCR ít nhất có số lượng từ 3 mồi (primer) trở lên, nhiều trường hợp có vài cặp mồi trong cùng một phản ứng Do vậy, mồi thiết kế phải tuân thủ một số điều kiện :

i) Có kích thước khoảng 20 – 24 nucleotide, tỷ lệ (%) GC trong tổng số nucleotide của mồi chiếm khoảng 40 – 60%, để đảm bảo tính bắt cặp (pairing) với khuôn được tốt ; nhiệt độ nóng chảy của mồi không quá 65oC và chênh lệch không quá

4 – 6oC (ví dụ : trong 4 mồi sử dụng, mồi có nhiệt độ chênh lệch thấp nhất cho phép là

55oC, mồi cao nhất là không quá 60oC

ii) Các mồi không được bắt cặp với chính chuỗi mồi hoặc với các mồi khác, nếu trường hợp này xảy ra, mồi sẽ bị vô hiệu hoá, không cho sản phẩm PCR dễ dẫn đến âm tính giả

iii) Tính đặc hiệu của mồi phải đạt cao nhất, tránh bắt nhầm khuôn, hoặc nhầm gen đích, vì nguồn khuôn sử dụng là hỗn hợp, dễ cho dương tính giả; do vậy, sau khi

xây dựng, kit multiplex-PCR phải được thử nghiệm/khảo nghiệm giả nghiệm hoặc thực

tế, trên nhiều loại đối tượng khuôn có thể, để đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy cho phép

1.2.2.2 Chất lượng nguồn khuôn

Chất lượng khuôn DNA có vai trò quyết định đến kết quả đối với PCR Nguồn khuôn kém chất lượng cho sản phẩm PCR không đồng nhất, đặc biệt khi nhân đoạn gen có kích thước dài so với đoạn gen có kích thước ngắn Khi sử dụng cặp mồi với gen đích cho sản phẩm ngắn hơn, thông thường rất dễ dàng nhận được sản phẩm so với sản phẩm có kích thước dài hơn; và như vậy, ảnh hưởng đến kết quả

multiplex-1.2.2.3 Số lượng nguồn khuôn

Phản ứng multiplex-PCR phụ thuộc vào số lượng nguồn khuôn ban đầu và hiệu ứng kết quả được xác định bằng cách tăng số chu kỳ và điều chỉnh điều kiện phản ứng Chuẩn độ số lượng khuôn hay nói cách khác, đánh giá độ nhạy của multiplex-PCR cần thực hiện cùng với số lượng khuôn tương đương của đối chứng, số chu kỳ phản ứng và tính toán hiệu ứng ngăn cản của sản phẩm (số DNA sinh ra) sau mỗi chu kỳ thực hiện Khi vùng gen đích của một đối tượng có thể có đột biến (đứt đoạn hoặc thêm vào) trong

tế bào, thì nguồn khuôn tổng số sẽ chứa 2 hay nhiều vùng đích khác nhau cho multiplex-PCR Do vậy, rất có thể hoặc số lượng băng DNA sẽ giảm, hoặc số lượng số băng ước tính không thay đổi, nhưng hàm lượng DNA của một số băng DNA thay đổi

1.2.2.4 Số lượng chu kỳ multiplex-PCR

Số lượng chu kỳ để thực hiện multiplex-PCR cũng cần xác định để sử dụng, vì

nếu số chu kỳ quá nhiều, số lượng DNA sinh ra sẽ bị bão hoà, do vậy, hàm lượng DNA của mỗi băng DNA sẽ khác nhau và cũng có trường hợp một số băng DNA biến mất hoặc một số khác xuất hiện Một số phản ứng PCR ngược (RT-PCR) đa năng sử dụng nguồn khuôn là RNA (bao gồm RNA của hệ gen hay RNA thông tin), cũng giống như multiplex-PCR sử dụng nguồn khuôn là DNA, rất phụ thuộc vào số lượng khuôn ban đầu Nếu số lượng chu kỳ thực hiện, điều kiện phản ứng không chuẩn hoá, thì kết quả sinh ra sẽ không phản ánh trung thực thực tế

1.2.2.5 Hiệu suất multiplex-PCR

Phản ứng multiplex-PCR cùng lúc có thể cho kết quả phát hiện ít nhất 2 gen đích cần chẩn đoán, do vậy, multiplex-PCR tiết kiệm nguồn khuôn, thời gian, kinh phí, hoá chất so với sử dụng đơn lẻ từng phản ứng PCR (uniplex-PCR) Tính hiệu quả kinh tế

còn ở chỗ chỉ cần một lần tách chiết DNA tổng số làm khuôn, hoặc được sử dụng riêng

rẽ với các cặp mồi tìm kiếm vùng đích trên một khuôn này; hoặc trộn lẫn nhiều khuôn

để thực hiện multiplex-PCR với nhiều cặp mồi tìm kiếm vùng đích trên một hay nhiều khuôn có trong một phản ứng

1.2.2.6 Kích ứng và tăng cường multiplex-PCR

Do có nhiều thành phần, đặc biệt là khuôn DNA tổng số có thể không được tinh khiết 100%, lẫn một số vết protein hoặc chuỗi xoắn kép của khuôn có nhiều cấu trúc bậc hai (secondary structure) làm cản trở mồi bám và hoạt động của enzyme DNA-polymerase, phản ứng multiplex-PCR cần bổ sung một số thành phần kích ứng Thành phần được sử dụng nhiều nhất đối với các loại PCR (kể cả RT-PCR) là DMSO (Dimethyl sulfoxide) có công thức là (CH3)2SO DMSO cho vào phản ứng khoảng 5% cho thấy chất lượng sản phẩm PCR tăng rất cao, hàm lượng DNA nhiều gấp 1,5 – 2 lần (Frackman et al., 1998) Điều này rất có ý nghĩa đối với phản ứng đa mồi, đa khuôn như multiplex-PCR

1.3 ƯU ĐIỂM CỦA MULTIPLEX-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỀU LOÀI KÝ SINH TRÙNG

Do đặc tính sinh học, sinh thái, cơ chế bệnh sinh, biểu hiện bệnh lý của các loài KST gây bệnh ở người có nhiều nét đặc thù riêng và khó chẩn đoán chính xác nguyên nhân gây bệnh nên việc nghiên cứu kit chẩn đoán đa mồi multiplex-PCR là cần thiết, mới, độc đáo và khoa học do có độ chính xác ở mức cao, bởi lẽ:

i) Chẩn đoán phân tử, trong đó có multiplex-PCR chỉ cần một lượng khuôn DNA nhỏ làm khuôn, nếu tinh sạch thì tốt, nếu có bị lẫn tạp (rất dễ xảy ra trong thực tế) thì

multiplex-PCR đặc hiệu vẫn thực hiện được, với bất kỳ vùng DNA nào trong hệ gen

cùng hay khác loài Tất cả mọi phương pháp chẩn đoán truyền thống (hình thái học, tổ chức học, bệnh tích học, huyết thanh học, gây nhiễm thực nghiệm ) đều đòi hỏi đối tượng chẩn đoán phải tồn tại và sinh trưởng phát triển với số lượng lớn và bắt buộc phải

có biểu hiện các sản phẩm cho các đặc tính kiểu hình

ii) Chẩn đoán phân tử sử dụng multiplex-PCR cũng dễ dàng thực hiện ngay cả khi

lượng vật chất đối tượng cần chẩn đoán có rất ít, dưới bất kỳ trạng thái sinh trưởng nào của đối tượng (ví dụ: trứng sán lẫn tạp nhiều loài, ký sinh trùng lẫn với tổ chức vật chủ, KST trong vật chủ trung gian) Đối tượng cung cấp khuôn DNA chẩn đoán còn là thể cộng sinh/ký sinh trong KST (ví dụ: Wolbachia pipientis cộng sinh trong nematode),

hoặc các gen “độc” của các loài gây bệnh chuyển nạp vào vi khuẩn thông qua plasmid,

cũng như các gen kháng thuốc hỗn hợp trong việc phát hiện đa kháng Đây cũng là các tính độc đáo có hiệu quả và là lợi thế của chẩn đoán multiplex-PCR mà không có phương pháp nào đối sánh được

iii) Chẩn đoán bằng kit đa gen (multiplex PCR) có tính chính xác rất cao, đặc biệt

có thể phân biệt một lúc nhiều loài ký sinh trùng nhiễm phối hợp trong cùng một bệnh

phẩm, thể hiện tính ưu việt trong ứng dụng

iv) Cho đến nay, ở Việt Nam, phương pháp multiplex-PCR, còn rất ít được ứng

dụng Một số bệnh ở người, ở động vật lây sang người, bệnh mới nảy sinh ở Việt Nam, bệnh gây thiệt hại nặng nề đối với sức khoẻ và nền kinh tế mà lẽ ra nếu được chẩn đoán sớm sẽ tránh được rủi ro, thiệt hại và lây lan Áp dụng chẩn đoán multiplex-PCR ở Viêt Nam trên một số bệnh giun sán thường gặp và tiếp tục thực hiện trên các loại hình bệnh tật khác ở người và động vật truyền sang người sẽ là loại hình mới ứng dụng trong thực

tế

Từ những năm 2000 đến nay, nhiều nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng bằng hình thái học kết hợp thẩm định bằng sinh học phân tử và phát triển kit chẩn đoán để xác định một số loài sán lá, sán dây chủ yếu ở Việt Nam Kết quả bước đầu đã có hàng chục công trình nghiệm thu và hàng trăm bài báo đăng tải trên tạp chí, tuy nhiên, vẫn còn rất ít các kit multiplex-PCR xây dựng và ứng dụng Một số kit chẩn đoán virus và vi khuẩn đã có kết quả thành công nhất định, trong đó cũng có những phát triển kit chẩn đoán phân biệt ký sinh trùng (Le et al., 2006)

Đối với KST, cho đến nay đã có hàng chục phương pháp và kit chẩn đoán multiplex-PCR sử dụng phát hiện nhiều loài gây bệnh Multiplex-PCR đã được xây

dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài sán lá sán dây (platyhelminth), bao

gồm sán lá gan nhỏ C sinensis and O viverrini (Le et al., 2006); sán lá gan lớn F hepatica từ ốc vật chủ trung gian (Magalhães et al., 2004; 2008); sán lá phổi Paragonimus spp (Sugiyama et al., 2006; Le et al., 2006); sán dây T saginata, T solium, T asiatica và ấu trùng sán lợn (González et al., 2004; Yamasaki et al., 2004; Trachsel et al., 2007); sán chó Echinococcus multilocularis (Davidson et al., 2009)

Multiplex-PCR cũng được sử dụng phát hiện và phân biệt các loại giun tròn

(nematode) trong đó có Trichinella và nematode đường ruột (Zarlenga et al., 1999; 2001a,b); phân biệt Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Oesophagostomum

bifurcum (Verweij et al., 2007) hoặc các loài Oesophagostomum spp ở lợn (Lin et al., 2008); phát hiện và phân biệt Brugia malayi và Wuchereria bancrofti với nhau (Mishra

et al., 2007) và với ký sinh trùng sốt rét (Rao et al., 2008); hay các loài giun tròn khác

cũng được phát hiện bằng multiplex-PCR trong đó có Toxoplasma gondii (Ajzenberg et

al., 2005; Nowakowska et al., 2006)

Multiplex-PCR tỏ ra sử dụng rất hữu hiệu chẩn đoán phân biệt nhiều nhóm ký sinh trùng đơn bào (protozoa), chủ yếu tập trung vào nhóm ký sinh trùng đơn bào

đường ruột như Cryptosporidium và Giardia (Guy et al., 2003); Cyclospora và Eimeria (Fernandez et al., 2003); đặc biệt là ký sinh trùng đơn bào máu, chủ yếu tập trung ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp, trước hết là phân biệt 4 loài gây bệnh chủ yếu ở người đó là P falciparum, P vivax, P malariae, P ovale, theo từng nhóm hoặc cả 4 loại từ máu (Veiga et al., 2006; Rao et al., 2008) hoặc từ vector là muỗi Anopheles (Lardeux et al., 2008) Một loại KST khác thường có trong máu là Leishmania spp cũng

được chẩn đoán phân biệt bằng multiplex-PCR từ máu, dưới da hay từ nguồn truyền lây

vector là loài muỗi cát Lutzomyia (de Pita-Pereira et al., 2008) hay KST đường máu lê dạng trùng Babesia caballi và B equi ở động vật (Alhassan et al., 2005)

Multiplex-PCR còn được ứng dụng chẩn đoán lỵ amíp do khả năng phát hiện nhanh,

chính xác phân biệt các loài gây bệnh với nhiều loài khác có hình thái tương tự, trước hết là

Entamoeba histolytica và Entamoeba dispar từ phân người bệnh (Haque et al., 2007)

1.4 CÁC LOẠI UNI-, MULTIPLEX-PCR VÀ CHỌN LỰA GEN ĐÍCH TRONG NGHIÊN CỨU

1.4.1 Các loại PCR

Được sử dụng nhiều nhất là loại phản ứng multiplex-PCR sử dụng nhiều cặp mồi, mà mỗi cặp phát hiện đặc hiệu mỗi một gen đích với độ nhạy cao, nhưng nhờ sản phẩm PCR thu được có kích thước khác nhau, do vậy, khi điện di trên thạch agarose các sản phẩm phân biệt dễ dàng ứng với mỗi loài đích cần chẩn đoán (Deng et al., 2000) Nghiên cứu phát triển multipex-PCR theo hướng này, đòi hỏi thiết kế mồi và thử/kiểm nghiệm phản ứng phải hết sức chuẩn xác (Kaderali et al., 2007)

PCR đơn mồi (uniplex-PCR) sử dụng một cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên một nguồn khuôn từ một loại KST; PCR đa mồi (multiplex-PCR) sử dụng nhiều cặp mồi (ít

nhất 3 mồi trở lên), tìm kiếm sản phẩm trên nhiều vùng đích khác nhau của cùng một khuôn; hoặc của nhiều nguồn khuôn khác nhau; do đó cùng lúc chẩn đoán, phát hiện

nhiều gen của nhiều loại KST khác nhau Tuỳ theo số lượng gen đích cần chẩn đoán mà

multiplex-PCR được chia làm các loại là duplex-PCR, phát hiện 2 vùng đích;

triplex-PCR, phát hiện 3 vùng đích; quadruplex-triplex-PCR, phát hiện 4 vùng đích; PCR, phát hiện 5 vùng đích; hexaplex-PCR, phát hiện 6 vùng đích và có thể nhiều hơn

pentaplex-(Edwards, Gibbs, 1994; Kaderali, 2007) Nói chung, khi sử dụng hơn một cặp mồi để phát hiện 2 vùng đích trở lên, đều gọi là PCR đa mồi và loại hình multiplex-PCR này chính là phương pháp làm nền của việc xây dựng kit chẩn đoán phân tử đáp ứng mục tiêu của đề tài đặt ra trong nghiên cứu này

1.4.2 Chọn lựa gen đích cho multiplex-PCR

Để có vùng gen đích chẩn đoán, nhiều tác giả chọn lựa khai thác hệ gen nhân tế

bào trong đó hướng tới đối tượng gen 18S rRNA phân biệt cầu trùng Eimeria với

Cyclospora (Orlandi et al., 2003), giám định và phân biệt các loài Cryptosporidium (Patel et al., 1999), phát hiện các loài KST sốt rét Plasmodium (Rougemont et al., 2004); hay đối tượng là gen pfcrt, pfmdr1, pfdhfr ở KST sốt rét (Veiga et al., 2006) và

nhiều vùng gen hay vùng giao gen khác; hoặc khai thác đích là hệ gen ty thể

(mitochondrial genome), ví dụ chẩn đoán phân biệt sán dây Taenia spp (Trachsel et al., 2007; Yamasaki et al., 2004; 2006; Jeon et al., 2009); sán lá gan nhỏ C sinensis và O viverrini (Le et al., 2006); sán lá gan lớn F hepatica (Magalhães et al., 2004; 2008);

phân biệt định loài động vật trong thức ăn thực phẩm (Ono et al., 2007)

Clonorchis (sinensis) A Opisthorchis (viverrini)

Haplorchis (taichui) Haplorchis (pumilio)

Taenia (saginata)

Taenia (asiatica)

D

Paragonimus (heterotremus)

Paragonimus (westermani )

E

PHÂN, CHẤT THẢI ĐƯỜNG RUỘT (STOOL)

ĐỜM, CHẤT THẢI ĐƯỜNG HÔ HẤP (SPUTUM)

Hình 1.7 Các bộ kit multiplex-PCR dự kiến xây dựng giữa các giống và loài; và giữa các loài trong cùng giống

A Giữa C sinensis và O viverrini; B Giữa F gigantica và F hepatica; C Giữa H taichui và H pumilio; D

Giữa T solium, T saginata và T asiatica; E Giữa P heterotremus và P westermani; AB Giữa C sinensis, O viverrini và Fasciola spp; AC Giữa : C sinensis, O viverrini và Haplorchis spp; BC Giữa Fasciola spp và

Haplorchis spp

Các loài KST đã lần lượt được giải mã gen/hệ gen ty thể và đăng ký vào Ngân hàng gen thế giới (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) tạo cơ sở dữ liệu để có thể truy cập ứng dụng trong thiết kế mồi đặc hiệu loài cho multiplex-PCR và so sánh phân biệt trong chẩn đoán, giám định và phân loại Hàng trăm hệ gen ty thể đã được giải trình và phân tích, bao gồm nhiều loài quan trọng từ bậc thấp đến bậc cao, từ động vật đơn bào đến động vật đa bào, cung cấp một hệ thống dữ liệu quan trọng cho các quá trình nghiên cứu gen, protein, tiến hoá, lịch sử tiến hoá, di truyền quần thể, quan hệ về loài, giống và nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng khác, trong đó có sử dụng dữ liệu để thiết kế mồi cho multiplex- PCR Ngoài ra còn có thể sử dụng các gen đích của hệ gen nhân trong chiến lược thiết kế multiplex-PCR để chẩn đoán phân biệt

Hướng sử dụng gen ty thể trong multiplex-PCR được coi là có cơ sở vững vàng trong điều kiện hiện nay, do hệ gen ty thể có kích thước nhỏ, nhiều bản sao trong một tế bào (vài trăm/tế bào), cấu trúc vòng DNA khép kín bền vững, cấu trúc đơn gen, thuận lợi cho PCR hoạt động (Robin, Wong, 1988) Hơn nữa, một tế bào cho nguồn khuôn DNA gấp hàng trăm lần so với hệ gen nhân nên PCR có độ nhạy cao hơn Điều này có ý nghĩa khi sử dụng tế bào trứng giun/sán làm nguồn khuôn DNA cho multiplex-PCR, vì chỉ cần một tế bào trứng đã cho hàng trăm phân tử DNA hệ gen ty thể làm khuôn (Le et al., 2012) Nhiều công trình thiết kế multiplex-PCR phát hiện DNA trong trứng giun/sán, tận dụng tính đơn giản khi thu mẫu (chỉ cần phân người bệnh, đối với nhiều KST ở phủ tạng và đường ruột; hay đờm, đối với sán lá phổi), và tận dụng hệ gen ty thể làm vùng gen đích đã được thực hiện với các loài sán dẹt (Le et al., 2006; Trachsel et al., 2007; Davidson et al., 2009)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định xây dựng kit multiplex-PCR dựa trên chỉ thị phân tử hệ gen ty thể (Hình 1.7) Cụ thể, chúng tôi đã có dữ liệu nucleotide của

toàn bộ hệ gen ty thể sán lá gan nhỏ C sinensis, O viverrini; của sán lá gan lớn F gigantica; sán dây Taenia spp, phần lớn hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ H taichui và

H pumilio (Lê Thanh Hoà, số liệu chưa công bố); của sán lá phổi P heterotremus và

một số loài khác

Chương 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu nghiên cứu là các loài KST được thu thập có định hướng dịch tễ và hình thái học (Bảng 2.1), thông qua hợp tác đề tài với:

- Bộ môn Ký sinh trùng, Trường Đại học Y Hà Nội;

- Khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng và Côn trùng Qui Nhơn;

- Viện Thú y trung ương và một số cơ sở khác

Bảng 2.1 Các loài sán lá sán dây được sử dụng trong nghiên cứu của đề tài

Ghi chú: *Thay vì sán lá phổi P westermani (do không có nguồn khuôn), chúng tôi sử dụng P ohirai

(do phía Nhật Bản cung cấp) SLG: sán lá gan; SLR: sán lá ruột; SD: sán dây; SLP: sán lá phổi Một số

mẫu phân có trứng sán lá gan nhỏ C sinensi, O viverrini, sán lá ruột nhỏ H taichui, H pumilio, sán lá gan lớn F gigantica, Taenia spp, riêng biệt hoặc hỗn hợp cũng được nghiên cứu, nhưng không liệt kê ở

đây và không mô tả kết quả

Hợp tác với quốc tế, cụ thể Trường Đại học Y khoa Kochi, Nhật Bản (GS.TS Takeshi Agatsuma); Trường Đại học Khon Kaen, Thái Lan (PGS.TS Banchob Sripa; PGS.TS Paiboon Sithithaworn); Trường Đại học Seoul, Hàn Quốc (PGS.TS Min-Ho Choi; GS.TS Sung-Tae Hong), trong nghiên cứu

Mẫu thu thập ở dạng sán trưởng thành, trứng và metacercaria, phần lớn bảo quản trong cồn 70%, một số thu tươi và vận chuyển trong đá lạnh về phòng thí nghiệm Mẫu sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý Mẫu được cho vào cồn 70oC hoặc dạng tươi

và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi sử dụng

2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị phục vụ nghiên cứu

+ Máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D)

+ Máy PCR (PTC-100) của MJ Research Inc (Mỹ)

+ Máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), có kèm theo máy vi tính

+ Máy tính và các phần mềm tin – sinh học

+ Thiết bị dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hãng Bio-Rad

+ Máy ổn nhiệt, máy lắc có điều nhiệt để nuôi tế bào

+ Lò vi sóng Samsung, box laminair vô trùng, tủ lạnh -200C và tủ ấm Nhật Bản), Máy Vortex

+ Bộ pipetman (10µl, 20µl, 200µl, 1000µl) và đầu côn các loại, ống Eppendorf các loại, đĩa Petri, lọ đựng môi trường, ống nuôi vi khuẩn

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu xây dựng kit multiplex-PCR

2.2.2 Các hóa chất cần thiết cho nghiên cứu

+ Hoá chất bao gồm: Yeast Extract (DIFCO-Mỹ), Trypton (DIFCO-Mỹ), EDTA (Sigma-Mỹ), axit acetic (Merk-Đức), Kanamycin, Ampicilin (Merk-Đức), X-gal (Sigma-Mỹ), agarose (Sigma-Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo-Pháp)…

+ Bộ kit tách chiết DNA tổng số “AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit” (hãng BIONEER) và hoá chất do hãng BIONEER cung cấp

+ Các mồi dùng cho phản ứng PCR

+ Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Invitrogen cung cấp

+ Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR, “AccuPrep® PCR Purification Kit”, của hãng BIONEER (Hàn Quốc)

+ Môi trường dinh dưỡng SOC được cung cấp với bộ “TA-cloning Kit”

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu được trình bày tại Hình 2.1

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

2.3.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô sán trưởng thành hoặc ấu trùng (metacercaria)

DNA tổng số của sán lá và sán dây các mẫu nghiên cứu được tách chiết bằng bộ sinh phẩm “AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit” (hãng BIONEER, Hàn Quốc)

Nguyên lý tách chiết DNA tổng số từ mô: Mẫu sán khi xử lý được nghiền trong

bộ cối chày nhựa, để phá vỡ mô Huyền dịch thu được gồm thành phần chính tế bào và protein hoặc có thể có RNA nên cần phải loại bỏ chúng Loại bỏ protein bằng cách bổ sung proteinase-K, phá huỷ RNA bằng RNase A Các thành phần khác của nguyên sinh chất cần tách riêng khỏi DNA, bằng isopropanol và một số hóa chất khác, rồi thu DNA

khi cho lọc trên màng lọc tích điện dương

Cách thực hiện:

Bước 1: Mẫu vật sau khi xử lý được nghiền trong bộ cối chày nhựa

Bước 2: Thêm 200 µl dung dịch Tissue Lysis buffer (ATL) và tiếp tục nghiền cho đến khi thành huyễn dịch đồng nhất Bổ sung 20 µl Proteinase-K (50mg/ml), ủ

60oC trong 3 giờ cho đến khi mô được ly giải hoàn toàn

Bước 3: Bổ sung 4 µl RNase-A (100mg/ml) và 200 µl dung dịch Binding buffer (AL hoặc GC), lắc mạnh rồi ủ ở 70oC trong 30 phút

Bước 4: Thêm 200 µl dung dịch Isopropanol (96 – 100%), rung lắc trong 15 giây Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 5: Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dung dịch bên dưới

Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới

Bước 7: Thêm 500 µl dung dịch (Washing buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới Ly tâm lại 13.000 vòng/phút trong 1 phút (để làm khô màng)

Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 60 µl dung dịch Elution buffer (EL), để ở nhiệt độ phòng trong 2 – 5 phút Sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong

2 phút Bỏ cột, giữ lại dịch bên dưới

Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng

2.3.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu hỗn hợp trứng trong phân

Tách DNA tổng số từ phân (stool) sử dụng bộ sinh phẩm AccuPrep® Stool DNA

Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc) Cụ thể tóm tắt như sau:

- Mẫu phân bảo quản trong lạnh được lấy ra và cho 100 mg mẫu vào ống Eppendorf, bổ sung 400 µl dung môi SL buffer, rồi lắc xoáy (vortexing) trong 30 giây, sau đó ủ trong tủ ấm ở 60oC trong 10 phút

- Sau khi ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút, chuyển dịch nổi bên trên (supernatant) được sang ống Eppendorf mới và cho vào đó 400 µl dung môi Binding buffer, rồi ủ trong tủ ấm ở 60oC trong 10 phút

- Sau khi cho 100 µl isopropanol vào, ống mẫu được lắc xoáy (vortexing) trong 5 giây và ly tâm nhanh trong vài giây

- Chuyển dịch nổi bên trên sang màng của cột lọc (binding column) đã lắp trong một ống hứng (collection tube), thực hiện ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

- Chuyển cột lọc sang ống mới, cho vào màng lọc 500 µl dung môi Washing buffer 1 (W1) để rửa và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Sau đó tiếp tục cho lên màng lọc dung môi Washing buffer 2 (W2) để rửa lần 2 và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

- Cuối cùng, chuyển cột lọc sang ống mới, cho lên màng lọc 100 µl dung môi Elution Buffer để ở nhiệt độ trong 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ cột, giữ lại dịch bên dưới, đó chính là DNA tổng số tách được từ trứng có trong phân

Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng

2.3.2 Thiết kế các cặp mồi

Thiết kế mồi dựa trên nguyên tắc cặp mồi nhân vùng gen cho sản phẩm có độ dài chênh lệch nhau giữa các đối tượng chẩn đoán, để đánh giá sử dụng phương pháp điện

di Cặp mồi (primer) dùng trong nhân bản DNA đích bằng phản ứng PCR được thiết kế trên cơ sở các trình tự khác nhau khi so sánh các chuỗi của các loài với nhau

Bảng 2.2 Thành phần nucleotide các mồi dùng trong phản ứng multiplex-PCR

Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’ → 3’) Độ dài (bp) Độ dài của sản phẩm thu được

2.3.3 Thực hiện PCR đơn (uniplex-PCR) và đa mồi (multiplex-PCR)

Phản ứng PCR đơn loài (sử dụng một cặp mồi) được bố trí với dung tích là 25 µl Mỗi loại đều sử dụng 1 µl (10 pmol/µl) cho mỗi phản ứng Nếu là phản ứng uniplex-PCR, chỉ sử dụng 1 cặp mồi; nếu là duplex-PCR sử dụng 2 cặp mồi hoặc 3 mồi (có thể

có 1 mồi chung); nếu là triplex-PCR thì sử dụng 3 cặp mồi hoặc 4 mồi (có 1 mồi chung) cho hỗn hợp trong cùng một phản ứng (Bảng 2.3) với chu trình nhiệt đã được thử nghiệm (Bảng 2.4)

Khuôn DNA tổng số (50 ng/µl) được sử dụng 1 µl cho đơn loài và 2 - 3 -4 µl DNA khuôn trộn chung cho 2 hoặc 3 loài hoặc 4 loài (1 µl cho mỗi loài) theo tỷ lệ bằng nhau (1:1) Các thành phần khác không thay đổi, còn mồi thì tùy loại PCR (uni-, duplex-, triplex-PCR) mà cho các mồi và điều chỉnh nước cho phù hợp dung tích 25 µl hay 50 µl (Bảng 2.3) Thành phần được bổ sung DMSO (dimethyl sulfoxide), có tác dụng tăng cường hoạt động của phản ứng PCR và cho sản phẩm chất lượng cao (Frackman et al., 1998)

Triplex- (3 loài)

Quadruplex- (4 loài)

Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Sản phẩm 4 0 C Nhiệt độ bảo quản sản phẩm

Sản phẩm được bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng Điện di trên thạch agarose 1% để kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR Nếu sản phẩm có đúng kích thước thì chúng ta tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR

Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch lên trên màng của cột lọc, ly tâm 13.000vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch phía dưới cột lọc

Bước 3: Thêm 500 µl dung dịch WB, ly tâm 13.000vòng/phút trong 1 phút, đổ

bỏ dịch dưới, ly tâm lại thêm một lần nữa để làm khô màng

Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, thêm 30 µl dung dịch EL vào chính giữa màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13.000vòng/phút trong 1 phút, thu sản phẩm PCR đã được tinh sạch

2.3.5 Kỹ thuật điện di để kiểm tra sản phẩm PCR

Kiểm tra DNA (DNA tổng số làm khuôn, hay DNA sản phẩm PCR) là bước đánh giá cơ bản của kit multiplex-PCR mà không cần giải trình tự sau khi xây dựng kit Do vậy, lấy 10 µl sản phẩm PCR (multiplex-PCR) điện di kiểm tra trên thạch (gel) agarose 1% có giá trị cung cấp cơ sở đánh giá kết quả của kit

PCR/multiplex-Kiểm tra DNA tổng số (1 µl) hoặc DNA sản phẩm PCR/multiplex-PCR (10 µl) trên thạch (gel) agarose nồng độ 0,8 – 1%, trong điện trường hiệu điện thế 100V, cường

độ 250mA, thời gian 25 – 30 phút Do mang điện tích âm, DNA sẽ dịch chuyển từ cực

âm đến cực dương Chỉ thị phân tử (DNA marker) được dùng là DNA của thực khuẩn

thể Lamda cắt bằng enzyme giới hạn HindIII [λ(HindIII)] tạo thành 8 phân đoạn có độ

dài gồm: 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,3 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,564 kb; 0,125 kb, với lượng

sử dụng là 7 – 10 µl Có một số trường hợp sử dụng thang DNA 1 kb (Fermentas Inc) Sau khi kết thúc, đưa bản gel vào khay nhuộm Ethidium bromide để nhuộm, đặt trên máy lắc 100 vòng/phút, sau đó đưa bản gel rửa sơ bộ qua nước, rồi đặt vào máy soi gel, có nguồn tia cực tím xuyên qua (DOLPHIN, Wealtec, Mỹ) và chụp ảnh lưu giữ mẫu kiểm tra

Các bước tiến hành :

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1% : lấy 0,4 g thạch agarose nguyên chất cho vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40 ml đệm TAE 1 lần (TAE có thành phần: Tris, acid acetic glacial, EDTA) Cho cốc đong vào lò vi sóng (microwave) đặt nóng chảy trong 3 phút sao cho agarose tan chảy hết Gài lược có nhiều răng vào khay của hệ thống điện di, đổ thạch ngập răng lược khoảng 0,5 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng Khi nguội tạo thành thạch, các răng lược sẽ tạo thành các giếng để tra mẫu vật vào điện

di kiểm tra

Bước 2: Dìm ngập khay trong hộp điện di chứa dung dịch đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trường hoạt động)

Bước 3: Tra mẫu: lấy 5 – 10 µl sản phẩm mỗi loại, trộn với 2 µl chỉ thị màu (Loading dye 3X) (thường là hỗn hợp xanh Bromophenol và glycerol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch

Bước 4: Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 7 – 10 µl chỉ thị

phân tử (DNA marker) thường dùng ở đây là DNA của thực khuẩn thể Lamda cắt bằng enzyme giới hạn HindIII

Bước 5: Nối hệ thống điện di với nguồn điện, cực âm ở phía đầu của bản thạch, cực dương ở phía cuối, DNA sẽ chuyển dịch từ cực âm đến cực dương Điện di ở hiệu thế 100 V trong 25 – 30 phút

Bước 6: Rửa thạch bằng nước, sau đó soi qua tia cực tím nhờ máy Dolphin – DOC (Wealtec, USA) và chụp ảnh giữ mẫu kiểm tra

2.3.6 Kiểm tra độ đặc hiệu, xác định độ nhạy của kit với hồn hợp khuôn giả nghiệm

Trong quá trình xây dựng, kit multiplex-PCR được thực hiện kiểm tra kiểm nghiệm:

- Kiểm tra độ nhạy (sensitivity) một số kit đại diện để xác định hàm lượng DNA khuôn thấp nhất mà ở đó còn cho phản ứng PCR (multiplex-PCR) dương tính

- Kiểm tra đặc hiệu (specificity) với DNA khuôn riêng biệt của một loài và giả nghiệm khuôn hỗn hợp của nhiều loài nghiên cứu có các mồi đặc hiệu trong kit

- Kiểm tra đặc hiệu bằng cách thực hiện PCR (multiplex-PCR) với khuôn hỗn hợp và mồi riêng biệt của từng loài

Khảo sát độ nhạy: Độ nhạy của PCR và multiplex-PCR được xác định với độ

pha loãng cao nhất của khuôn DNA có thể thực hiện được Sau khi tách chiết và kiểm tra hàm lượng, nồng độ gốc được pha xác định ở 50 ng/µl Từ nồng độ này, DNA tổng

số được pha loãng theo cơ số 2, gấp đôi liên tục, tức là: 50ng/µl; 25ng/µl; 12,5ng/µl; 6,25ng/µl; 3,125ng/µl; 1.5625ng/µl và tiếp tục Với các độ pha loãng khác nhau như thế này, 1 µl của mỗi một nồng độ được sử dụng cho phản ứng PCR với thử nghiệm uniplex-PCR và duplex-PCR hoặc quadruplex-PCR

Giải trình tự xác định chuỗi gen để khẳng định sản phẩm: Một số sản phẩm PCR

được chọn để tinh sạch (sử dụng kit của hãng Bioneer, Hàn Quốc) Mồi giải trình tự là một

trong hai mồi thực hiện phản ứng Chuỗi thô (chromatogram) được biên tập bằng chương trình SeqEd1.3, sắp xếp bằng AssemblyLIGN và MacVector; so sánh bằng GeneDoc2.5 với các chuỗi đã biết

Giả nghiệm kiểm tra đặc hiệu và hoạt động của kit: Trộn lẫn khuôn pha loãng

và thực hiện phản ứng PCR/multiplex-PCR: Sau khi xác định chính xác ngưỡng hàm lượng khuôn thấp nhất mà uniplex-PCR còn có thể thực hiện được, lúc đó tiến hành thử nghiệm theo phương pháp giả nghiệm với các hỗn hợp DNA tổng số khác nhau Kết quả kiểm tra đặc hiệu cho phép xây dựng kit multiplex-PCR đảm bảo phát hiện loài cần tìm với độ tin tưởng cao nhất

Kiểm tra kit multiplex-PCR với khuôn từ mẫu tham chiếu đã xác định loài và mẫu thực tế: Chúng tôi chọn bộ kit số 2 (bộ kit B(Fg+Fh) là bộ kit triển khai ứng dụng

trước mắt, để thực hiện một số thử nghiệm kiểm tra với DNA tổng số làm khuôn của F hepatica hoặc F gigantica, từ khuôn của các mẫu tham chiếu (reference isolates), từ

trứng sán lấy trực tiếp từ con sán trong phòng thí nghiệm và thu từ phân trâu bò và người

2.4 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN

Đề tài được thực hiện tại Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học; và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen tại Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM UNIPLEX-PCR VỚI TỪNG LOÀI NGHIÊN CỨU DNA tổng số sau khi tách chiết được xác định nồng độ để thực hiện phản ứng PCR đặc hiệu đơn loài (uniplex-PCR), mục đích là kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và của khuôn sẽ được sử dụng trong multiplex-PCR Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng 8 bộ kit chẩn đoán multiplex-PCR hai và ba loài, liên quan đến phát hiện

phân biệt 11 loài là đối tượng nghiên cứu, gồm C sinensis, O viverrini, F hepatica, F gigantica, H pumilio, H taichui, T saginata, T solium, T asiatica, P heterotremus, P ohirai (thay P westermani) Kết quả kiểm tra đơn loài được trình bày ở Hình 3.1; 3.2;

3.3 Hình ảnh điện di cho thấy tất cả các sản phẩm PCR đơn mồi đều cho kết quả là một băng DNA đơn nhất, sáng, rõ và có độ dài tương ứng với dự kiến

Sản phẩm uniplex-PCR được xác định như sau:

- Của hai loài sán lá gan nhỏ C sinensis (mẫu CsND) có độ dài 489 bp và O viverrini (mẫu OvBD) có độ dài 818 bp (Hình 3.1);

- Của hai loài sán lá ruột nhỏ H pumilio (mẫu HpPT) có độ dài 400 bp và của H taichui (mẫu HtYB) có độ dài là 250 bp (Hình 3.2);

- Của hai loài sán lá gan lớn F gigantica (mẫu FspT4V) có độ dài là 615 bp và của F hepatica (mẫu FhAUS) có độ dài 1031 bp (Hình 3.3);

- Của ba loài sán dây T asiatica (mẫu TQN) có độ dài 706 bp, T saginata (TaN3)

có độ dài 629 bp và của T solium (mẫu TsoN1b) có độ dài 474 bp (Hình 3.4);

- Của hai loài sán lá phổi P ohirai (mẫu PoJP) có độ dài 433 bp và của P heterotremus (mẫu PhVN) có độ dài 598 bp (Hình 3.5)

Như vậy, kết quả cho thấy các yếu tố thành phần phản ứng, các cặp mồi thiết kế

và chu trình nhiệt thực hiện là phù hợp

Sau khi hoàn thành các phản ứng PCR đơn loài đã có những dữ liệu về điaàu kiện thực hiện phản ứng, về cơ sở để đánh giá, kit multiplex-PCR đa mồi phát hiện nhiều loài đã được thiết kế để phân biệt các loài với nhau

của C sinensis, 489 bp (mẫu CsND) (giếng 1);

của O viverrini, 818 bp (mẫu OvBD) (giếng 2)

M chỉ thị phân tử DNA của Lambda được cắt

của F gigantica (615 bp), mẫu FspT4V (giếng

1); mẫu FspNB (giếng 3) và F hepatica (1031

bp), mẫu FhAUS (giếng 2); mẫu FhBe (giếng

4) M chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể

Lambda được cắt bằng enzyme HindIII

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm uniplex-PCR

của T saginata (629 bp), mẫu TaN3 (giếng 1), của T asiatica (706 bp), mẫu TQN (giếng 2) và của T solium, 474 bp, mẫu TsoN1b (giếng 3)

M chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể

Lambda được cắt bằng enzyme HindIII

2,0kb 2,3kb 4,3kb

M 1 2

B

400bp 250bp 0,5kb

2,0kb 2,3kb 4,3kb

M 1 2

Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm uniplex-PCR

của P ohỉai (433 bp), mẫu PoJP (giếng 1) và của P heterotremus (598 bp), mẫu PhVN (giếng

2) M chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể

Lambda được cắt bằng enzyme HindIII

2kb

564bp

1031bp 615bp

M 1 2 3 4

2kb

564bp

1031bp 615bp

3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ THỬ NGHIỆM CÁC BỘ KIT MULTIPLEX-PCR CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT GIỮA CÁC LOÀI

3.2.1 Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 1 (kit A(Cs+Ov)) phân biệt hai loài sán lá

gan nhỏ Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini

3.2.1.1 Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 1 (kit A(Cs+Ov))

Kit multiplex-PCR phân biệt hai loài sán lá gan nhỏ C sinensis và O viverrini

(duplex-PCR), được ký hiệu là kit A(Cs+Ov) Kit A(Cs+Ov) được thử nghiệm trên sán

lá gan nhỏ C sinensis (mẫu CsHB, CsND) và O viverrini (mẫu OvBD, OvQT) (liệt kê

ở Bảng 2.1)

Khuôn chung giữa 2 loài C sinensis và O viverrini được hỗn hợp bằng cách pha chung theo tỉ lệ 1:1 và sử dụng các cặp mồi đặc hiệu CsF-CsR (đặc hiệu C sinensis) và Ov5F-OvN3R (đặc hiệu O viverrini) cho một phản ứng multiplex-PCR, tức là sử dụng

4 mồi để phát hiện 2 loài (Bảng 2.2)

Thực hiện giả nghiệm với khuôn chung , được pha như sau:

- Pha khuôn chung CsHB/OvBD: 10 µl (50 ng/µl) CsHB + 10 µl (50 ng/µl) OvBD

- Pha khuôn chung CsND/OvQT: 10 µl (50 ng/µl) CsND + 10 µl (50 ng/µl) OvQT Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.6)

Hình 3.6A Ảnh điện di kiểm tra kết quả phản ứng duplex-PCR giữa C sinensis và O viverrini (bộ kit A(Cs+Ov)) sử dụng 2 cặp mồi CsF-CsR và Ov5F-OvN3R Ghi chú: M chỉ thị phân tử DNA của thực

khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1 mẫu CsHB (sản phẩm 489 bp); Giếng 2

mẫu OvBD (sản phẩm 818 bp); Giếng 3 mẫu OvQT (sản phẩm 818 bp); Giếng 4 Hỗn hợp khuôn CsHB/OvBD (sản phẩm 489 bp và 818 bp); Giếng 5 Hỗn hợp khuôn CsND/OvQT (sản phẩm 489 bp

Kết quả ở Hình 3.6A cho thấy:

- Khi sử dụng khuôn đơn của từng loài, mặc dù có cả 2 cặp mồi CsF-CsR và

Ov5F-OvN3R, nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ thấy xuất hiện một băng DNA có độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với mỗi loài, đó là

hoặc 489 bp của C sinensis (giếng 1) hoặc 818 bp của O viverrini (giếng 2, 3) (Hình

3.6A)

- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn của 2 loài), với 2 cặp

mồi CsF-CsR và Ov5F-OvN3R, khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), kết quả tại giếng 4 (khuôn trộn CsHB/OvBD) cũng như giếng 5 (khuôn trộn CsND/OvQT), cho thấy cả 2 giếng đều xuất hiện cùng lúc 2 băng DNA sản phẩm, một

băng có kích thước 818 bp (của loài O viverrini) và một băng có kích thước 489 bp (của loài C sinensis) tương ứng với sản phẩm mỗi cặp mồi đặc hiệu của mỗi loài có

trong phản ứng (Hình 3.6A)

Như vậy, bộ kit duplex-PCR (multiplex-PCR hai cặp mồi, phát hiện hai loài) đã được thử nghiệm thành công Ở đây, bộ kit A(Cs+Ov), sử dụng 2 cặp mồi là CsF-CsR

và Ov5F-OvN3R phân biệt giữa 2 loài sán lá gan nhỏ C sinensis và O viverrini

3.2.1.2 Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm

DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 5 (Hình 3.6A) được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh

sạch, và gửi đi giải trình tự Sử dụng mồi CsF cho sản phẩm của C sinensis (băng có độ dài 489 bp) và mồi Ov5F cho sản phẩm của O viverrini (băng có độ dài 818 bp) Chuỗi

nucleotide thu nhận được trình bày ở Hình 3.6B

C sinensis

ATACCTTTGCGTGGTGGGAGGAGAGATAAGTTAAGTTGAATAAACTGTGTGATTCATGCTCATAAAATACGTTTTTCGTTTTCTCCTATGTTTGT

TTCTCGTTTGTTTGGGGTGTTTGATTATTTCTCTTTGATAATCCGAGGTGGGTTGTGTAGACCTTTTTATCGTTTGTCTTTATTTTTGTTGCTTG GGGGGTTTTTAAGGTTGCGCTTGCCTTATGTTTACGGTATGGGAGGTTTTGTTCTGTTTATTTTTTTTATTGTGTGTCCGTTGTTTTGTGGCCTT TTTTTTTCTCGGGTGCTAGATGGGGGTTTGAGTTGTTTTGTTTCATGCTTTGTGCCGATGGGTACTCCACTTTGGATAGCTCCATTTGTTTGTTT

CAATTTAGTAGTCTAACAAGGATGTGAGCTTTGGGAGTTCGTGGTCTCTTTATTGAGC

Hình 3.6B Trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gen sản phẩm từ C sinensis (489 bp) và từ O viverrini

(818 bp) được giải trình tự để xác định sản phẩm đặc hiệu loài của phản ứng duplex PCR Chuỗi

nucleotide ngắn ở mỗi đầu là ứng với chuỗi mồi CsF/CsR (C sinensis) và Ov5F/ Ov13R (O viverrini)

3.2.1.2 Sản xuất và hướng dẫn sử dụng bộ kit số 1 (kit A(Cs+Ov))

a) Mô tả bộ kit

Bộ kit A(Cs+Ov) chẩn đoán phân biệt sán lá gan nhỏ C sinensis, O viverrini

bao gồm 5 thành phần đựng trong các ống Eppendorf được dùng để thực hiện phản

ứng PCR nhân đoạn DNA đặc hiệu của sán lá gan nhỏ C sinensis và O viverrini từ

nguồn DNA làm khuôn được tách từ mẫu bệnh phẩm (Hình 3.6C)

DNA tổng số được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm, sử dụng bộ sinh phẩm của hãng Bioneer (Hàn Quốc) gồm AccuPrep DNA Extraction kit (đối với mẫu mô của sán) hoặc AccuPrep Stool DNA Extraction kit (đối với mẫu bệnh phẩm là phân có trứng

sán) Quy trình tách chiết DNA tổng số theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

Hình 3.6C Hình ảnh bao gói bộ kitA(Cs+Ov)) để thực hiện duplex-PCR chẩn đoán phân biệt giữa sán

lá gan nhỏ C sinensis và O viverrini

b) Thành phần bộ kit

- PCR master mix

- Mồi hỗn hợp (OV5F- OVN3R- CSF-CSR)

- Mẫu đối chứng dương (phức hợp plasmid mang gen đích)

- Nước tinh khiết DEPC (diethyl pyrocarbonate) khử trùng

- DMSO (Dimethyl sulfoxide)

d) Kiểm tra sản phẩm và đánh giá kết quả

- Sản phẩm multiplex-PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên thạch agarose 1% có kèm theo thang DNA chuẩn để xác định kích thước; bản điện di được nhuộm bằng Ethidium Bromide và quan sát dưới đèn có tia cực tím

+ Sản phẩm PCR tạo thành vệt trắng không rõ băng thì tiến hành thực hiện lại PCR lần hai

e) Bảo quản và hạn sử dụng

Bảo quản bộ kit ở -200C

Hạn sử dụng: 1 năm kể từ ngày sản xuất

3.2.2 Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 2 (bộ kit B(Fg+Fh)) phân biệt hai loài sán

lá gan lớn Fasciola gigantica với F hepatica

3.2.2.1 Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 2 (bộ kit B(Fg+Fh))

Kit multiplex-PCR phân biệt hai loài sán lá gan lớn F gigantica và F hepatica

(duplex-PCR), được ký hiệu là kit B(Fg+Fh) Kit B(Fg+Fh) được thử nghiệm trên sán

lá gan lớn F gigantica (mẫu FspT4V) và F hepatica (mẫu FhAUS) (liệt kê ở Bảng

2.1)

Hình 3.7A Ảnh điện di kiểm tra phản ứng duplex-PCR giữa F gigantica và F hepatica (bộ kit B(Fg+Fh)) sử dụng 2 cặp mồi FGF-FHGR và FHF-FHGR Ghi chú: M chỉ thị phân tử DNA của thực

khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1 mẫu FspT4V (sản phẩm 615 bp); Giếng 2

Mẫu FhAUS (sản phẩm 1031 bp); Giếng 3 Hỗn hợp khuôn FspT4V/FhAUS (sản phẩm 615 bp và 1031 bp)

Khuôn chung giữa 2 loài F gigantica và F hepatica được hỗn hợp bằng cách pha chung theo tỉ lệ 1:1 và sử dụng các cặp mồi đặc hiệu FGF-FHGR (đặc hiệu F gigantica) và FHF-FHGR (đặc hiệu F hepatica) cho một phản ứng multiplex-PCR, tức

là sử dụng 3 mồi để phát hiện 2 loài (Bảng 2.2)

Thực hiện giả nghiệm với khuôn chung FspT4V/FhAUS, được pha như sau: 10

µl (50 ng/µl) FspT4V + 10 µl (50 ng/µl) FhAUS

Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.7A)

Kết quả ở Hình 3.7A cho thấy:

- Khi sử dụng khuôn đơn của từng loài, mặc dù có cả 2 cặp mồi FGF-FHGR và

FHF-FHGR, nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ thấy xuất hiện một băng DNA có độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với mỗi loài, đó là

hoặc 615 bp của F gigantica (giếng 1) hoặc 1031 bp của F hepatica (giếng 2) (Hình

3.7A)

- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn của 2 loài), với 2 cặp

mồi FGF-FHGR và FHF-FHGR, khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), kết quả tại giếng 3 (khuôn trộn FspT4V/FhAUS) cho thấy, xuất hiện cùng lúc

2 băng DNA sản phẩm, một băng có kích thước 615 bp của F gigantica và một băng có kích thước 1031 bp của F hepatica, tương ứng với sản phẩm mỗi cặp mồi đặc hiệu của

mỗi loài có trong phản ứng (Hình 3.7A)

M 1 2 3

2kb

564bp

1031bp 615bp

M 1 2 3

2kb

564bp

1031bp 615bp

Như vậy, bộ kit duplex-PCR (multiplex-PCR 3 mồi, phát hiện hai loài) đã được thử nghiệm thành công Ở đây, bộ kit B(Fg+Fh) được sử dụng 2 cặp mồi là FHF-FHGR

và FGF-FHGR, trong đó chung mồi ngược FHGR, phân biệt giữa 2 loài sán lá gan lớn

F gigantica và F hepatica

3.2.2.2.Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm

DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 3 (Hình 3.7A) được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh

sạch và gửi đi giải trình tự Sử dụng mồi FHF cho sản phẩm của F hepatica (độ dài

1031 bp) và mồi FGF cho sản phẩm của F gigantica (độ dài 1031 bp) Chuỗi

nucleotide thu nhận được trình bày ở Hình 3.7B

F hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)

GTTTTTTAGTTGTTTGGGGTTTGTTGGGGGGTTAGTTTAGGTATTTTTAGAATTCTGCTTTTGTAAAGCAGAGGTGGTTTTTGGCTGCTCTCTAT

GTTTTATTGGCTGTGAGGTTGATTTTATTTGGGTTTCGTTTTTTAGATTACCTTTTGCATCATGATTTGTTGATTTTTGGTTTGGATTGATTGTT TCCGAAGAGTACTGATTTTTGTTTTGCTTGCTTAGGGTTGTTTTGGAGGTGAGTAACTTTTTGTAGAGCTTAATTGAGGTTGTGATAGGTGATTC GGAGTACTTGATATCTGATTTTGAGTAGATTTTGTTGGCATATTGCGGCTTAGTTATGATATTAGGTCGTTGGTAAGATCAGGATTTTGTGCTTT TTGTAATAGGGATTAAAATTCTCCTGATTTTAGGTGTGTGTTATTATTCGTTTGTGGCTCTGTCTAGGATTTATATGAATCTACTCTTAGCTAAT AGGGTTTGATAATGATAGAATAAGTAGGTGTTTTGATTAGCTTTATTTTTTCTTGGTCTTCCTCGGTCTGTTTATTAAAAACATTTCTATTCGGA TTTATGAATAGTAGTGCCTGCCCAGTGCTTTGTAAATGGCCGCAGTATTTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATTAGTTGCCTCATAATTGGAGGA TTGTTTGAAAGGTTTGACTTGAGGATTTGACTAGATTAGGGCTTGGGCTGAAATTGGAGTTGAGGTGCAGATCCCTCGGATTTTTAATAAGACGG AAAGACCCCGAGATCTTTATATTGTGTTATTTGTTTGGGGTAAAATGCTATGTTTTATGTTATTTTTGATCCTAATGGATAAAAGGTTTAAGTTA CCTCGGGGATAACTAGGTAAAAAATAAGGAGAGGTCGGATCGATTTATTTTATTGCTATCTCGATGTTGACTTGGGGAAAAGTAGAGGGGTGTAG

GAGTTTCTTTACTGGGTCTGTTCGACCGTAGTTTCTCTCATGAGTTGAGTTAAGACCGGCGTGAGCCAGGTCGGTTCTTAT

F gigantica (multiplex-PCR) 615 bp (16S)

TGTTATGATTCATTGTTTGTAGTTTTTATGTGGTTTATGTGGGTCTACTTTTGGTTAATATGGTTGGATAATGGTAGAATAAGTAGGTGTTGTGA

TTGGTCTTGTTTTTTCTCGGCTGTTCTCGGTCTGTTTATTAAAAACATTTCTATTCGGATTTATGGATAGTAGTGCCTGCCCAGTGCTTTGTAAA TGGCCGCAGTATTTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATTAGTTGCCTCATAATTGGAGGATTGTTTGAAGGGTTTGACTTGGGAATTTGGCTAGAT TTGGGCTTGGGCTGAAATTGGAGTTGGGGTGCAGATCCCTCGGTTTGTTAATAAGACGGAAAGACCCCGAGATCTTTATATTGTGTTATTTGTTT GGGGCAAAATGTTATGTTTTATGTGATTTTTGATCCTAAGGGATAGAAGGTTTAAGTTACCTCGGGGATAACTAGGTAAAAAATAAGGAGAGGTC GGATCGATTTATTTTATTGCTATCTCGATGTTGACTTGGGGAAAAATAAGGGGGTGTAGGAGTTTCTTTGTTGGGTCTGTTCGACCGTAGTTTCC

CTCATGAGTTGAGTTAAGACCGGTGTGAGCCAGGTCGGTTCTTAT

Hình 3.7B Trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gen sản phẩm từ F hepatica (1031 bp) và từ F

gigantica (615 bp) được giải trình tự để xác định sản phẩm đặc hiệu loài của phản ứng duplex PCR Chuỗi nucleotide ngắn ở mỗi đầu là ứng với chuỗi mồi FHF/FHGR (F hepatica) và FGF/FHGR (F gigantica)

3.2.2.3 Sản xuất và hướng dẫn sử dụng bộ kit số 2 (bộ kit B(Fg+Fh))

a) Mô tả bộ kit

Bộ kit B(Fg+Fh) chẩn đoán phân biệt sán lá gan lớn F gigantica và F hepatica

bao gồm 5 thành phần đựng trong các ống Eppendorf được dùng để thực hiện phản ứng

PCR nhân đoạn DNA đặc hiệu của F gigantica và F hepatica từ nguồn DNA làm

khuôn được tách từ mẫu bệnh phẩm (Hình 3.7C)

DNA tổng số được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm, sử dụng bộ sinh phẩm của hãng Bioneer (Hàn Quốc) gồm Accuprep DNA Extraction kit (đối với mẫu mô của sán) hoặc Accuprep Stool DNA Extraction kit (đối với mẫu bệnh phẩm là phân có trứng sán) Quy trình tách chiết DNA tổng số theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

Hình 3.7C Hình ảnh bao gói bộ kit B(Fg+Fh)) để thực hiện duplex-PCR chẩn đoán phân biệt giữa sán

lá gan lớn F gigantica và F hepatica

b) Thành phần bộ kit

- PCR master mix

- Mồi hỗn hợp (FHF – FGF – FHGR)

- Mẫu đối chứng dương (phức hợp plasmid mang gen đích)

- Nước tinh khiết (nước DEPC)

- DMSO (Dimethyl sulfoxide)

d) Kiểm tra sản phẩm và đánh giá kết quả

- Sản phẩm multiplex-PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên thạch agarose 1% có kèm theo thang DNA chuẩn để xác định kích thước; bản điện di được nhuộm bằng Ethidium Bromide và quan sát dưới đèn có tia cực tím

+ Sản phẩm PCR tạo thành vệt trắng không rõ băng thì tiến hành thực hiện lại PCR lần hai

e) Bảo quản và hạn sử dụng

Bảo quản bộ kit ở -200C

Hạn sử dụng: 1 năm kể từ ngày sản xuất

3.2.3 Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 3 (bộ kit C(Hp+Ht)) phân biệt hai loài sán

lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio và H taichui

3.2.3.1 Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 3 (bộ kit C(Hp+Ht))

Kit multiplex-PCR phân biệt hai loài sán lá ruột nhỏ H pumilio và H taichui

(duplex-PCR), được ký hiệu là kit C(Hp+Ht) Kit C(Hp+Ht) được thử nghiệm trên sán

lá ruột nhỏ H pumilio (mẫu HpPT) và H taichui (mẫu HtYB) (liệt kê ở Bảng 2.1) Khuôn chung giữa 2 loài H pumilio và H taichui được hỗn hợp bằng cách pha chung theo tỉ lệ 1:1 và sử dụng các cặp mồi đặc hiệu và HPUF-HPUR (đặc hiệu H pumilio) và HTAF-HTAR (đặc hiệu H taichui) cho một phản ứng multiplex-PCR, tức

là sử dụng 4 mồi để phát hiện 2 loài (Bảng 2.2)

Thực hiện giả nghiệm với khuôn chung HpPT/HtYB, được pha như sau: 10 µl (50 ng/µl) HpPT + 10 µl (50 ng/µl) HtYB

Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.8A)

Kết quả ở Hình 3.8A cho thấy:

- Khi sử dụng khuôn đơn của từng loài, mặc dù có cả 2 cặp mồi HPUF-HPUR

và HTAF-HTAR, nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ thấy xuất hiện một băng DNA có độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với mỗi loài, đó là

hoặc 250 bp của H taichui (giếng 1) hoặc 400 bp của H pumilio (giếng 2) (Hình 3.8A)

- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn của 2 loài), với 2 cặp

mồi HPUF-HPUR và HTAF-HTAR, khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), kết quả tại giếng 3 (khuôn trộn HpPT/HtYB) cho thấy, xuất hiện

cùng lúc 2 băng DNA sản phẩm, một băng có kích thước 400 bp của H pumilio và một băng có kích thước 250 bp của H taichui, tương ứng với sản phẩm mỗi cặp mồi đặc

hiệu của mỗi loài có trong phản ứng (Hình 3.8A)

Hình 3.8A Ảnh điện di kiểm tra phản ứng duplex-PCR giữa H pumilio và H taichui (bộ kit

C(Hp+Ht)) sử dụng 2 cặp mồi HPUF-HPUR và HTAF-HTAR Ghi chú: M chỉ thị phân tử DNA của

thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1 mẫu HpPT (sản phẩm 400 bp); Giếng

2 mẫu /HtYB (sản phẩm 250 bp); Giếng 3 Hỗn hợp khuôn HpPT/HtYB (sản phẩm 400 bp và 250 bp)

Như vậy, bộ kit duplex-PCR (multiplex-PCR 4 mồi, phát hiện hai loài) đã được thử nghiệm thành công Ở đây, bộ kit C(Hp+Ht) được sử dụng 2 cặp mồi là HPUF-

HPUR và HTAF-HTAR phân biệt giữa 2 loài sán lá ruột nhỏ H pumilio và H taichui

3.2.3.2.Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm

DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 3 trên Hình 3.8A, được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh sạch và gửi đi giải trình tự Sử dụng mồi HPUF cho sản phẩm của H pumilio (độ dài 400 bp) và mồi HTAF cho sản phẩm của H taichui (độ dài 250 bp) Chuỗi nucleotide thu

nhận được trình bày ở Hình 3.8B

H pumilio

TCTTGGGGTTGGTAGTGTTGACTCGGTTATGAGACTCAAGGGGGTTGGTTGATATTGTGGGTTGATAGGGATTTTATTACTTTTCGTGGGGGTTT

GTGTGAGGCCTCATGCGGTTTACCTAAGCCCTTATATTGGGGTGTTGGGTGTTTTTGGGTTTGATGTAGTTAGCTTTTATCTGTGTCTGCTGTCG TTGATTCTGGGGTTGTCCATTTGATTTTGGTTTAGGAGTATGAGGGGCTTGAGGTCTTTTTTGATTTTGACGAGGATTCTAAGTTCTTTGCTGTG

Hình 3.8B Trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gen sản phẩm từ H pumilio (400 bp) và từ H taichui (250 bp)

được giải trình tự để xác định sản phẩm đặc hiệu loài của phản ứng duplex PCR Chuỗi nucleotide ngắn ở mỗi đầu