Nghiên cứu khả năng sử dụng cây Kiến Cò (Rhina canthus nasutus) để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CÂY KIẾN CÒ RHINACANTHUS NASUTUS LÊN SÂU XANH VÀ SÂU KHOANG Ở TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM ………....40 3.4... Từ những năm 90 của thế kỷ trước, các nhà

VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CÂY KIẾN CÒ (RHINA CANTHUS NASUTUS) ĐỂ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC

CNĐT: HOÀNG PHƯƠNG LAN

9622

HÀ NỘI – 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ CHUYÊN DỤNG 3

DANH MỤC CÁC BẢNG 4

DANH MỤC CÁC HÌNH 5

MỞ ĐẦU 6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……….8

1.1 ĐẶC ĐIỂM, PHÂN BỐ CỦA CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS) 8

1.2.VÀI NÉT VỀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 10

1.3 MỘT SỐ SẢN PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 11

1.4 RHINACANTHIN 163

1.5.PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT CHẤT CHIẾT TỪ CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)……… . 16

1.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG LIÊN QUAN TỚI CHẤT CHIẾT CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)………18

1.7 VÀI NÉT ĐẠI CƯƠNG VỀ NAPHTOQUINON………23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 235

2.1 VẬT LIỆU 255

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 255

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 255

2.3.1 Định lượng rhinacanthin trên HPLC 265

2.3.2 Qui trình chiết nhanh mẫu để phân tích rhinacanthin trên HPLC 255

2.3.3 Phương pháp thu nhận dịch chiết chứa rhinacanthin nồng độ cao 256

2.3.4 Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu cây Kiến cò 266

2.3.5 Phương pháp đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu sinh hóa của cây Kiến cò 266 2.3.6 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết đối với sâu hại 277

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 288

3.1 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT RHINACANTHIN TỪ CÂY KIẾN CÒ 288

3.1 1 Xác định hàm lượng rhinacanthin trong lá, thân và rễ của cây Kiến cò 288

3.1.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất hoạt chất rhinacanthin 299

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 30

3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 322

3.1.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và bột Kiến cò tới quá trình chiết rhinacanthin 332

3.1.6 Quá trình thu nhận dịch chiết chứa rhinacanthin nồng độ cao 34

3.2 NGHIÊN CỨU XỬ LÝ VÀ BẢO QUẢN NGUYÊN LIỆU CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS) 376

3.2.1. Sự biến đổi hàm lượng tổng các rhinacanthin trong lá, thân và rễ cây Kiến cò sau thời gian bảo quản……….36

3.2.2 Đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu sinh hóa của nguyên liệu cây Kiến cò 37 

3.3 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS) LÊN SÂU XANH VÀ SÂU KHOANG Ở TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM ……… 40

3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS) LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC……… 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 444

TÀI LIỆU THAM KHẢO 485

PHỤ LỤC……….48

HỒ SƠ LIÊN QUAN  

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

VÀ THUẬT NGỮ CHUYÊN DỤNG TIẾNG VIỆT

HPLC High-performance liquid chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao) GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry

(Sắc ký khí khối phổ)

IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

LC50 Lethal concentration ( Nồng độ gây chết)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Hàm lượng rhinacanthin trong lá, thân và rễ cây Kiến cò 288 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các loại dung môi tới hàm lượng cao chiết Kiến cò và hàm lượng tổng các rhinacanthin trong cao chiết Kiến cò 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của độ etanol tới quá trình chiết xuất rhinacanthin……… 31 

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 322 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết xuất rhinacanthin từ cây Kiến cò………… 33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và bột Kiến cò tới quá trình chiết rhinacanthin 346 Bảng 3.7 Sự biến đổi hàm lượng tổng các rhinacanthin trong lá, thân và rễ cây Kiến

cò sau thời gian bảo quản 388 Bảng 3.8 Một số chỉ tiêu sinh hóa của cây Kiến cò 388 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của dịch chiết Kiến cò (chưa pha phụ gia) lên sâu khoang và sâu xanh bướm trắng……….40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Lá và hoa cây Kiến cò……….………8

Hình 1.2 Cấu trúc của rhinacanthin-C 144

Hình 1.3 Cấu trúc của rhinacanthin-D 144

Hình 1.4 Chiết xuất phân đoạn cây Kiến cò………16

Hình 1.5 Xà phòng thảo mộc rhinacanthin làm trắng da 222

Hình 1 5 Kem bôi mặt chứa các thành phần thảo mộc Pueraria Mirifica, Aloe Barbadensis, Emblic Myrabolan Extrac, Rhinacanthus Nasutus 222

Hình 1.6 Chè hòa tan từ cây Kiến cò 222

MỞ ĐẦU

Hiện nay, dư lượng thuốc trừ sâu hóa học trong các sản phẩm nông nghiệp tăng cao, gây mất an toàn cho người sử dụng, ảnh hưởng xấu tới môi trường và sức khỏe cộng đồng Ngoài ra, các sản phẩm làm ra không thể xuất khẩu được nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập của nông dân Đây cũng là một thách thức lớn cho nông dân Việt Nam khi gia nhập WTO

Để giảm thiểu tác động xấu của thuốc trừ sâu đến môi trường và cộng đồng, xu hướng sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học đang thay thế dần thuốc hóa học Các thuốc trừ sâu sinh học là một trong những lĩnh vực mà Hóa học xanh quan tâm và hướng tới Do đó việc nghiên cứu, tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học luôn luôn được thúc đẩy

Nguồn nguyên liệu là cây Kiến cò (Rhinacanthus nasutus) hy vọng sẽ mở ra

hướng nghiên cứu ứng dụng khả quan cho thuốc trừ sâu sinh học Chất chiết rhinacanthin từ cây Kiến cò đáp ứng đầy đủ của một thuốc trừ sâu tự nhiên,

nó có khả năng phân hủy trong môi trường ánh sáng sau 8 tuần, không độc hại

cho con người [14]

Trong Rhinacanthus nasutus chứa các hoạt chất rhinacanthin như là rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, rhinacanthin-N,…có hoạt tính diệt sâu bọ,

kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, chống viêm, hoạt tính chống dị ứng, ngăn ngừa khối u phát triển [5] Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng dung môi etyl axetat, etanol, methanol,…đều có thể chiết tách được rhinacanthin từ

Rhinacanthus nasutus [4,6]

Từ những năm 90 của thế kỷ trước, các nhà nghiên cứu Việt Nam tại Viện Công nghệ sinh học đã đề cập đến việc sử dụng chất chiết cây Kiến cò làm thuốc trừ sâu, nhưng chưa đi sâu nghiên cứu về chất chiết rhinacanthin Gần đây nhất 9/2012 các nhà nghiên cứu Thái Lan đã nghiên cứu sử dụng

chất chiết rhinacanthin từ Rhinacanthus nasutus phục vụ trong nông nghiệp

[14]

Đề tài này là hướng nghiên cứu thăm dò nhằm khai thác và ứng dụng hiệu quả hoạt tính diệt sâu hại của hoạt chất rhinacnathin từ cây Kiến cò tại Việt Nam

Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất rhinacanthin từ cây Kiến cò

- Nghiên cứu xử lý và bảo quản nguyên liệu cây Kiến cò

- Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết cây Kiến cò lên sâu xanh và sâu khoang ở trong phòng thí nghiệm

- Đánh giá khả năng ứng dụng cây Kiến cò làm thuốc trừ sâu sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM, PHÂN BỐ CỦA CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)

Mô tả : Là cây nhỏ mọc thành bụi, cao 1-2m, có rễ chùm Thân non có

lông mịn Lá mọc đối, có cuống, phiến hình trứng thuôn dài, mặt trên nhẵn, mặt dưới hơi có lông mịn Hoa nhỏ, mọc nhiều hoa ở nách lá hoặc đầu cành hay ngọn thân Hoa màu trắng nom như con hạc đang bay nên có tên gọi là Bạch hạc Quả nang dài, có lông

Cây rất dễ trồng, mùa xuân hoặc mùa thu, trồng bằng cành, ra hoa tháng 8

Hình 1.1 Lá và hoa cây Kiến cò

Thông thường sử dụng phần lá, cành và rễ cây[19]

Đặc điểm phân loại [5,7,11]

Phân giới Viridaeplantae Phân họ Acanthoideae

Ngành Tracheophyta Giống Rhinacanthus

Phân ngành Euphyllophytina Tên Latin nasutus - (L.)

Lớp Magnoliopsida Tên thực vật Rhinacanthus nasutus (L.)

Liên bộ Lamianae

Tại các quốc gia trên thế giới cây Kiến cò còn được gọi bằng những tên địa phương khác nhau [5,11]:

Malaysia Chabai Emas

English (Anh) Snake Jasmine, Dainty spurs

Indonesia Akar Teriba, Daun Burung

Philippines Ibon-ibonan, Tagak-tagak (Tagalog)

China (Trung quốc) Bai He Ling Zhi, Pai Ho Ling Chih, Hsuan-tsao

India (Ấn Độ)

Palakjuhi, Jahipani (Hindi); Gajkarni (Marathi);

Uragamali, Nagamalle (Tamil); Nagamulla, Puzhukkoli (Malayam); Nagamalle (Telagu);

Nagamallige, Doddapatika (Kannada); Juipana (Bengali) Damari (KonKani); Palakjuhi (Urdu);

Yudhikaparni, Yoodhikaparni (Sanskrit)

Spanish (Tây Ban

Việt Nam Nam uy linh tiên, Bạch hạc [17]

Phân bố: Cây Kiến cò phân bố nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Myanmar, Nhật

Bản và các nước Đông Nam Á khác [1,11] Hiện nay, tại Ấn Độ và Thái Lan

đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân rộng vùng trồng nguyên liệu cây Kiến cò[7]

Tại Việt Nam, cây Kiến cò được trồng ở nhiều nơi từ Bắc đến Nam: Hòa Bình, Phú Thọ, Thường Tín (Hà Nội), Thái Bình,Bình Dương, Kiên Giang…, tuy nhiên cây chưa được trồng thành vùng nguyên liệu, nên khi cần sử dụng

phải thu gom từ nhiều vùng khác nhau

Thành phần hóa học

Trong cây Kiến cò (Rhinacanthus nasutus) có chứa các thành phần hóa học chính là : rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, rhinacanthin-N…, ngoài ra còn có

A, B, E, F,

rhinacanthin-Q, lupeol, b-sitosterol, stigmasterol [2,5,11]

Hàm lượng rhinacanthin trong lá Kiến cò : rhinacanthin-C (1,9%), rhinacanthin-D (0,16%), rhinacathin-N (0,07%) [4,13]

Một số tài liệu lại chứng minh từ lá và cành cây Kiến cò tách chiết được các thành phần flavonoid,benzenoid, coumarin, anthraquinon, quinon, glycoside, cacbohydrate, triterpens, sterol, và chlorophyll Rhincanthone (3,4 dihydro-3,3-dimethyl-2H naptho[1,2-b]pyran-5,6dione) có tác dụng chính chống ung thư Ngoài ra, trong thành phần còn chứa dehydro alapachone, p-hydroxybenzaldehyl, methyl vanillate syringaldehyde, lupeol, wogonin, oroxylin A, praeruptorin và allantoin [4,11,13]

1.2 VÀI NÉT VỀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC

Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học thường được khuyến cáo sử dụng trong các lĩnh vực sản xuất nông nghiệp sạch nói riêng và nền nông nghiệp bền vững nói chung Theo Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học (Biopesticide) là các loại thuốc phòng trừ dịch hại

có nguồn gốc nguyên liệu tự nhiên như thực vật, động vật, vi khuẩn và khoáng chất Khái niệm này bao hàm cả các chất tạo gen được cấy vào đối tượng cây cần bảo vệ nhằm tạo các kháng thể có khả năng phòng trừ dịch hại

- Thuốc trừ sâu vi sinh (Microbial Pesticides): Bao gồm các loại vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus, sinh vật đơn bào hoặc tảo) có khả năng phòng trừ

dịch hại, ví dụ thuốc trừ sâu vi sinh BT (Bacillus thuringiensis)

- Thuốc trừ sâu có nguồn gốc hóa sinh (Biochemical Pesticides) bao gồm các chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng kiểm soát dịch hại theo cơ chế không độc Đó là các chất dẫn dụ (sinh dục hoặc thức ăn), các chất xua đuổi, các chất điều khiển sinh trưởng côn trùng …

- Thuốc trừ sâu có nguồn gốc thảo mộc (Botanical hoặc Plant Pesticides): Hoạt chất là các chất thu được từ cây, cỏ, kể cả tinh dầu, ví dụ: Nicotin trong cây thuốc lào hoặc thuốc lá, D-limonen từ tinh dầu cam, chanh

Gần đây, các nhà nghiên cứu hóa nông đưa ra định nghĩa về thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học đơn giản là các thuốc có nguồn gốc tự nhiên có thể kiểm soát dịch hại theo cơ chế không độc, thân thiện với môi trường sinh thái

và dễ sử dụng

Đặc điểm ưu việt của thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học so với các thuốc

trừ sâu thông thường là:

- Ít độc hơn đối với người, gia súc và không ảnh hưởng tới các loài có ích như chim, cá và các thiên địch

- Phân hủy sinh học nhanh, ít để lại dư lượng trong môi trường và nông phẩm nên thuốc rất thân thiện với môi trường và thường được thay thế các thuốc trừ sâu thông thường trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) [17]

1.3 MỘT SỐ SẢN PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC

- Nguồn gốc thảo mộc: VINEEM 1500 EC – chiết xuất từ nhân hạt

Neem (Azadirachta indica A Juss ) có chứa họat chất Azadirachtin, có hiệu

lực phòng trừ nhiều lọai sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây công nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng

Hoạt chất Rotenone được chiết xuất từ hai giống cây họ đậu là Derris

elliptica Benth và Derris trifoliata có tác dụng diệt trừ sâu rầy trên lúa, ốc

bươu vàng cũng như các lọai cá dữ, cá tạp trong ruộng nuôi tôm

Karanjin – chiết xuất từ cây hoa đào Ấn Độ, Matrine – chiết xuất từ cây khổ sâm, Saponin – bã trà

Chế phẩm Đầu trâu Bihopper ( hoạt chất Rotenone ) diệt tuyến trùng và chế phẩm Olicide (Oligo – Sacarit) tăng sức đề kháng bệnh của cây trồng

- Nguồn gốc vi sinh: Thuốc trừ sâu vi sinh BT (Bacciluss Thuringiensis

var.) có nguồn gốc vi khuẩn, phổ diệt sâu rộng và hữu hiệu đối với các loại sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp… Sản phẩm thương mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc …

- Nguồn gốc nấm: sản phẩm VIBAMEC với hoạt chất Abamectin được phân lập từ quá trình lên men nấm Steptomyces avermitilis Diệt trừ sâu vẽ

bùa, nhện, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ phấn; Ngoài ra cũng trong nhóm này Vivadamy, Vanicide, Vali… có hoạt chất là Validamycin A, được chiết xuất

từ nấm men Streptomyces hygroscopius var jingangiesis Đây là nhóm thuốc

trừ bệnh có nguồn gốc kháng sinh đặc trị các bệnh đốm vằn trên lúa, bệnh nấm hồng trên cao su, bệnh chết rạp cây con trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, bông vải…

Sản phẩm LUT 5.5 WDG (Mỹ) với hoạt chất là Methylamine

avermectin, phổ tác động rất rộng (có thể trừ được nhiều loại sâu, bọ gây hại: sâu tơ, sâu xanh, sâu vẽ bà, sâu đục quả, sâu đục than, nhện đỏ, nhện gié, bọ trĩ, bọ xít xanh…)

Các chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma vừa có tác dụng đề kháng một số

nấm bệnh gây hại trên bộ rễ cây trồng như: bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi

là bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmirova gây ra Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari,

Pythium sp, Sclerotium rolfosii

Hai chế phẩm nấm trừ côn trùng Metarhizium anisopliae (nấm xanh) và

Beauveria bassiana (nấm trắng) là sản phẩm của Viện Lúa đồng bằng sông

Cửu Long với các tên thương mai: Ometar và Biovip

- Nguồn gốc virus: sản phẩm chiết xuất từ virus

Nucleopolyhedrosisvirus (NPV), loại virus có tính rất chuyên biệt, chỉ lây

nhiễm và tiêu diệt sâu xanh da láng ( Spodoptera exigua ) rất hiệu quả trên

một số cây trồng như bông, đậu đỗ, ngô, hành, nho …

Hai chế phẩm NPV (Nuclear polyhedrosis Virus) trừ sâu hại rau màu

và cây công nghiệp là sản phẩm của Viện BVTV với các tên thương mại: ViS

và ViHa

- Pheromone: Là một nhóm chế phẩm sinh học có tác dụng dẫn dụ giới

tính, được sử dụng rộng rãi trong hệ thống bảo vệ thực vật cây trồng Sản phẩm tiêu biểu là Vizubon – D với hoạt chất Methyl Eugenol dẫn dụ đối với ruồi đực rất mạnh Trong sản phẩm có pha trộn thêm chất diệt ruồi Naled Đối

với sâu đục vỏ trái cam quýt (Prays citri Milliire) cũng đã được sử dụng

pheromone có hoạt chất Z(7)- Tetradecenal

- Nguồn gốc tuyến trùng: tuyến trùng EPN (Entomopathogenic

nematodes) ký sinh và gây bệnh cho côn trùng, là tác nhân có nhiều triển

vọng bởi có khả năng diệt sâu nhanh, phổ diệt sâu rộng rộng, an toàn cho người, động vật và không gây khả năng “kháng thuốc” ở sâu hại Nhóm các nhà khoa học ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ VN đã sản xuất thử nghiệm 6 chế phẩm EPN có tên từ Biostar-1 đến Biostar-6, trong đó Biostar-3 và Biostar-5 được sản xuất hàng trăm lít để

thử nghiệm rộng rãi trên đồng ruộng[ 17]

1.4 RHINACANTHIN

Rhinacanthin là các dẫn xuất của naphtoquinon được tìm thấy trong cây

Kiến cò (Rhinacanthus nasutus), bao gồm các C,

rhinacanthin-D, rhinacanthin-N…, ngoài ra còn có rhinacanthin-A, rhinacanthin-B, rhinacanthin-E, rhinacanthin-F, rhinacanthin-Q

Các rhinacanthin tan trong nước, và các dung môi hữu cơ như etanol, etyl axetate, metanol…

Chất chiết rhinacanthin được bảo quản ở nhiệt độ 40C-300C±2 trong điều kiện kín, tránh ánh sáng trực tiếp Theo dõi thấy, sau khi cho tiếp xúc với ánh sáng, chất chiết rhinacanthin sẽ mất tính ổn định sau một tuần Ở nhiệt độ

450C, độ ẩm 75%, sau 8 tuần thì chất chiết rhinacanthin sẽ mất tính ổn định

Dịch chiết rhinacanthin từ cây Kiến cò bằng methanol ở pH=5,5 ổn định hơn so với pH=7 và pH=8

Rhinacanthin có hoạt tính diệt sâu hại, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, chống viêm, có hoạt động chống dị ứng và gây độc tế bào [3,8,14] Rhinacanthin- C dạng dầu, màu vàng, có công thức phân tử là C25H30O5, trọng lượng phân tử 410,51

Tên hóa học:

3-(1-Hydroxy-3,4-dioxo-3,4-dihydro-2-naphthalenyl)-2,2-dimethylpropyl (2E,6E)-2,6-dimethyl-2,6-octadienoate

Hình 1.2 Cấu trúc của rhinacanthin-C

Rhinacanthin –D dạng tinh thể đỏ, có công thức phân tử là C23H20O7, với trọng lượng phân tử 408,4

Tên hóa học : [3-(3-hydroxy-1,4-dioxo-2-naphthyl)-2,2-dimethyl-propyl]

nhân HIV đẩy nhanh tiến triển thành AIDS và tử vong, loại vi rút này cũng gây bệnh ở trẻ sơ sinh Đặc biệt rhinacanthin-C còn có khả năng chống lại

một loạt các vi khuẩn S.mutans, P.acnes, H.pylori, S.aureus, S.epidermidis và

Cấu trúc hóa học của rhinacanthin-A,-B và –O Các rhinacanthin C, D, N, Q

Ngoài các rhinacanthin trên, tác giả Ấn Độ Suman Bukke (2011) còn cho rằng trong cây Kiến cò chứa nhiều loại rhinacanthin khác mang những hoạt tính sinh học [11]:

1.5 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT CHẤT CHIẾT TỪ CÂY KIẾN CÒ

(RHINACANTHUS NASUTUS)

       Theo các patent số JP6234694 (A) ,JP4193874 (A), và JP2002087939(A);

đã đưa ra phương pháp chiết xuất các dẫn xuất của naphtoquinon từ lá, cành,

rễ khô của Rhinacanthus nasustus bằng methanol trong 5 giờ, nhiệt độ chiết

38-400C, sau đó ly tâm loại bỏ cặn, được dịch chiết, cô hút chân không ở nhiệt độ thấp loại dung môi, thu cao chiết, hòa cao chiết đó vào một lượng nhỏ methanol và nước, rồi cho qua cột sắc ký hấp phụ, dung giải chất hấp phụ

bằng 80% methanol Dịch thu được qua cột sắc ký, đem cô đặc và phân tích hàm lượng các chất trong đó bằng HPLC

Theo tác giả Haruka Horri và cộng sự (2011) đưa ra phương pháp chiết tách các phân đoạn chiết từ cây Kiến cò như sau: Phần lá và cành, rễ đều được chiết bằng methanol ba lần trong ba giờ Các phần dịch chiết trong ba lần được phối trộn với nhau và đem cô bay hơi chân không đến khô thu được cao chiết lá và cành, cao chiết rễ Cao chiết rễ đem hòa vào 0,75l methanol và 75ml nước, sau đó phân chia bằng n-hexan, etyl axetat, n-butanol [4]:

Rễ cây R.nasutus (1,18kg)

Chiết bằng methanol 3 giờ, 3 lần

Cao chiết methanol (83,1g)

Phân đoạn n-hexan (6,55g) Lớp dung dịch chứa methanol

Phân chia giữa etyl axetat/ H2O

Phân đoạn etyl axetat (17,0g) Lớp H 2 O

Phân chia giữa n-Butanol/ H 2 O

Phân đoạn n-Butanol(11,7g) Phân đoạn H 2 O

Hình 1.4 Chiết xuất phân đoạn chất chiết cây Kiến cò

Tác giả R.Nirmaladevi và cộng sự (2010) cũng sử dụng methanol để chiết các thành phần có hoạt tính sinh học từ lá Kiến cò và sấy cao chiết ở 600C, tránh ánh sáng Tác giả đã dùng phép phân tích HPLC, GC-MS và phổ hồng ngoại IR nhằm nhận dạng các thành phần tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa trong cao chiết Kiến cò [4,13]

Theo tác giả M.Upendra Rao và cộng sự (2010) các hoạt chất rhinacanthin

của Rhinacanthus nasutus được chiết bằng etanol và etyl axetat Rễ cây được

rửa sạch, để khô ở 30-400C, nghiền thành bột thô Chiết bột thô bằng

methanol trong thiết bị soxhlet Phần chiết methanol được cô ở dưới 450C, điều kiện áp suất giảm, thu dịch khan, dùng cho dược Hoặc dùng etyl axetat chiết 200 gam bột lá trong 1 giờ, dịch chiết được cô lại tới khan thu được 9,6g chất chiết thô Lấy 5g chất chiết này đem sắc ký bằng silicagel dùng clorofom dung giải để thu các phân đoạn khác nhau Sau đó một phân đoạn được sắc ký tiếp bằng cột sephadex LH-20, dùng methanol dung giải thu được ba phân đoạn Phân đoạn 1 và 2 được sắc ký tiếp trên cột sephadex LH-20, cuối cùng thu được rhinacanthin-C (1,450 mg) và rhinacanthin-N (3,14 mg) Phân đoạn khác được tinh chế trên cùng cột sephadex để thu rhinacanthin-D (2,25mg) Cấu trúc của rhinacanthin-C, rhinacanthin-N, rhinacanthin-D phân tích, so sánh với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR)[5]

1.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG LIÊN QUAN TỚI CHẤT

CHIẾT CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)

Đã có khá nhiều công trình nghiên cứu hiện đại về cây Kiến cò

(Rhinacanthus nasutus) của các nhà khoa học Thái Lan, Nhật Bản, Ấn Độ,

Trung Quốc, và một số nước khác Họ đã chứng minh trong cây Kiến cò chứa những dẫn chất mang nhiều hoạt tính sinh học giá trị, mở ra hướng ứng dụng triển vọng

Hoạt tính diệt sâu

Từ những năm 90 của thế kỷ trước các nhà khoa học Việt Nam tại Viện Công nghệ sinh học, Nguyễn Hoàng Tỉnh và cộng sự (1998), đã nghiên cứu thấy trong cây Kiến cò chứa hàm lượng glucozit cao tới 2,3%, và đã chứng minh dịch chiết thô Kiến cò có hiệu lực trừ sâu xanh và sâu tơ Cụ thể là dịch chiết thô đó được pha loãng 10,20,50,100,200 lần rồi phun lên sâu tơ và sâu xanh, kết quả cho thấy ở nồng độ pha loãng 20 lần, sau 4 giờ, cả sâu xanh và sâu tơ đều chết 100%, càng pha loãng thì hiệu lực diệt sâu càng giảm Pha loãng đến 200 lần thì hiệu lực diệt sâu rất thấp

Gần đây nhất, tháng 9/2012, các nhà khoa học tại đại học Madihol (Thái

Lan), Pethuan S và cộng sự công bố rằng trong cây Kiến cò (Rhinacanthus

nasutus) chứa ba thành phần rhinacanthin-A, -B, và –C đều có hoạt tính diệt

sâu khoang (Spodoptera frugiperda) và ức chế muỗi gây bệnh sốt rét

Anopheles minumus[14]

Hoạt tính kháng vi rút

Từ lâu, tác giả người Thái Lan Anna SendlA và cộng sự (1996) đã chứng minh hai napthoquinone, rhinacanthin-C và rhinacanthin-D tách chiết từ cây Kiến

cò (Rhinacanthus nasutus) có khả năng ức chế vi rút CMV (cytomegalovirus)

Rhinacanthin E và F có hoạt tính kháng vi rút cúm tuýp A [5,11]

với nồng độ là 4-32mcg/ml, kháng vi khuẩn hiếu khí gram dương

Streptococcus aureus, Streptococcus epidermidis với nồng độ tương ứng 256

và 512mcg/ml Chỉ có chất chiết thô mới có khả năng kháng vi khuẩn gram

âm hiếu khí Helicobacter pylori với nồng độ 512mg/ml Cao chiết Kiến cò

chứa hàm lượng rhinacanthin cao tới 70% có hoạt tính diệt khuẩn tốt Sở dĩ như vậy có thể là do tác dụng cộng hưởng của các rhinacanthin[5,11]

Hoạt tính kháng nấm

Kodam et.al.(2007) đã tách được một dẫn xuất của napthopyran dihydro-3,3-dimethyl-2H-naphtho[2,3-b]pyran-5,10dione) từ cây Kiến cò có hoạt tính kháng nấm Cao chiết Kiến cò dạng cô đặc chứa hàm lượng tổng

(3,4-rhinacanthin cao khoảng 75% ức chế các loại nấm Trichophyton rubrum,

Trichophyton mentagrophytes và Microsporum gypserum Khả năng kháng

nấm, nhất là nấm ngoài da của chất chiết thô và rhinacanthin-C là tương đương [5,2,11]

Hoạt tính chống ung thư

Tác giả Pongpun Siripong và cộng sự (2006,2009) chứng minh rằng các rhinacanthin từ rễ và lá Kiến cò đều có khả năng chống ung thư và chống tăng sinh tế bào Rhinacanthin-D, -C và –Q chiết tách từ rễ đều có khả năng ức chế

sự tăng sinh của tế bào HeLa (tế bào bất tử - có thể phân chia hoàn chỉnh bên ngoài cơ thể), tạo nên hướng điều trị bệnh ung thư cổ tử cung ở người có sử dụng các rhincanthin sẽ rất triển vọng và hứa hẹn thành công [8,9,15,16] Tác giả Nhật Bản Haruka Horii và cộng sự (2011) phát hiện cao chiết từ rễ Kiến

cò có hoạt tính ngăn phân bào tốt hơn cao chiết từ ngọn Phân đoạn chiết bằng etyl axetate ức chế chất hoạt hóa cơ quan thụ quan có hiệu quả nhất, tiếp theo

là phân đoạn chiết bằng n-hexan, n-butanol và phân đoạn chiết bằng nước Cao chiết rễ Kiến cò bằng etanol và methanol đều chứa chất điều khiển tế bào hủy xương [4]

Hoạt tính kháng viêm

Supinya Tewtrakul và cộng sự (2009) nhận thấy ba dẫn xuất naphthoquinone (rhinacanthin A, D, N) tách chiết từ lá có hoạt tính chống viêm rất mạnh Hoạt tính chống viêm biểu hiện thông qua quá trình ức chế

NO (nitơ oxit) và sự giải phóng prostaglandin E2 [15] Một nghiên khác của

tác giả Punturee K (2004) cho thấy chất chiết từ lá Rhinacanthus nasutus có

thể làm cho các đại thực bào tăng hoặc giảm sinh ra NO thông qua biểu hiện của TNF-alpha (Tumor Necrosis Factor-alpha) – một protein tế bào có thể kích thích trực tiếp quá trình viêm Tuy nhiên tác giả Kupradinun P và cộng

sự (2009) lại cho rằng dịch chiết Rhinacanthus nasutus từ rễ không có hiệu

quả đối với viêm đại tràng [15,11]

Hoạt tính chống dị ứng

Supinya Tewtrakul và cộng sự (2009) chứng minh ba dẫn chất

naphtoquinon: rhinacanthin-C,-D,-N chiết từ lá Rhinacanthus nasutus có khả

năng chống dị ứng rất tốt, chúng kháng lại kháng nguyên sinh enzym hexosaminidaza đánh dấu quá trình mất hạt nhỏ trong các tế bào bạch cầu ưa kiềm RBL-2H3 Ba chất này cũng kháng lại kháng nguyên sinh các protein

β-TNF-alpha và IL-4 (Interleukin-4) [5,16,11]

Tác nhân diệt ấu trùng muỗi

Yupha Rongsriyam và cộng sự (2006) đã công bố chất chiết

Rhinacanthus Nasutus có thể ức chế ấu trùng muỗi Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus Chế phẩm dạng viên chứa 5-10% chất chiết thô và lactose

thể hiện khả năng diệt muỗi Aedes aegypti khác nhau nhiều, nồng độ gây chết

LC50 trong 48 giờ tương ứng là 13,6 và 14,2 mg/l Khả năng diệt muỗi Culex

quinquefasciatus cũng tương tự, liều gây chết LC50 là 18,7 và 17,3 mg/l (p>0,05) Trong khi đó cả hai nhóm ấu trùng đều không bị chết vì dung dịch đường lactose và nước dechlorinate [5,11]

Ngoài ra, hai tác giả Ấn Độ, Pasupuleti Visweswara Rao và Malepati Dhananjaya Naidu (2010) nghiên cứu trên hai nhóm chuột mắc bệnh tiểu

đường và chuột bình thường sau khi được tiêm cao chiết lá Rhinacanthus

Nasutus với liều lượng 200mg/kg, theo dõi sau 8 giờ lượng đường trong máu

ở cả hai nhóm giảm đáng kể, đây là tín hiệu tốt cho việc sản xuất thuốc trị bệnh tiểu đường [12]

Trên thế giới, từ lâu cây Kiến cò đã được nghiên cứu và ứng dụng vào

ngành y học cổ truyền Rhinacanthus Nasutus được biết đến là cây thuốc dân

gian đã được sử dụng hàng nghìn năm nay ở Ấn Độ Lá và rễ cây Kiến cò được sử dụng nhiều ở các nước Đông Nam Á điều trị các bệnh ngoài da, lao phổi, mụn rộp [1,2,5,11] Đây là cây thuốc dân gian Việt Nam, dùng để chữa eczema, hắc lào, lang ben, đau thần kinh tọa do lạnh, trị đau nhức khớp do phong hàn thấp [19] Cách thức dùng khá đa dạng Ở Ấn Độ, rễ và lá tươi giã nát trộn với nước cốt chanh bôi lên vùng da bị nhiễm trùng Người Philipin sử dụng nhựa từ rễ và lá hoặc sắc lấy nước để trị bệnh tiểu đường, bệnh viêm gan, bệnh huyết áp, trong khi người Thái lấy rễ và lá ngâm với cồn hoặc dấm Người Malayxia phối trộn nước ép của rễ và lá Kiến cò với benzoin và sulphua để trị bệnh ecpet mảng tròn Ở Ấn Độ theo phương pháp cổ truyền,

rễ của cây Kiến cò còn dùng để giải độc vết rắn cắn Dịch chiết lá bằng ete dầu có tác dụng diệt muỗi [1,2,5,11]

Cao chiết từ cây Kiến cò sử dụng làm mỹ phẩm rất tốt Xà phòng tắm có chứa hoạt chất rhinacanthin được dùng ở châu Á nhiều thế kỷ nay Hiện tại, hãng mỹ phẩm BeautiqueThai của Thái Lan sử dụng cao chiết rhinacanthin từ cây Kiến cò vào một số sản phẩm như xà phòng tắm trắng cho cả nam và nữ,

có tác dụng kháng khuẩn, làm sạch da tốt, sản phẩm có tính bazơ nhẹ làm ổn định cân bằng pH tự nhiên của da, được người tiêu dùng rất ưa chuộng [22]

Công ty Lanna Health Hub (Thái Lan) đã tung ra thị trường loại kem

dưỡng da Teen Face, thành phần chứa cao chiết Rhinacanthus Nasutus, làm

đẹp da, sạch khuẩn, không bị mụn trứng cá, được giới trẻ rất ưa chuộng

Hình 1.6 Kem bôi mặt chứa các thành phần thảo mộc Pueraria Mirifica, Aloe Barbadensis, Emblic Myrabolan Extrac, Rhinacanthus Nasutus

Công ty Rasksa Thai Herbs của Thái Lan có sản phẩm chè thảo mộc

Rhinacanthus Nasutus dùng cho người bị dị ứng với thuốc men và thịt muối

[23]

Hình 1.7 Chè hòa tan từ cây Kiến cò

Chất chiết cây Kiến cò được ứng dụng nhiều vào các sản phẩm phục vụ con người như vậy, nên khi sử dụng chất chiết này để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học sẽ có độ an toàn cao, và thân thiện với con người

1.7 VÀI NÉT ĐẠI CƯƠNG VỀ NAPHTOQUINON

Hoạt chất rhinacanthin từ cây Kiến cò là dẫn xuất của naphtoquinon, nên cần có hiểu biết sơ lược về naphtoquinon

Naphtoquinon là dẫn xuất của naphthalen, có màu vàng, vàng cam hoặc đỏ

Ba đồng phân của napthtoquinon là: 1,2- napthtoquinon, 1,4- napthtoquinon (có dẫn xuất là vitamin K), và 2,6- napthtoquinon Ngoài ra trong tự nhiên còn nhiều dẫn xuất của naphtoquinon như: juglone, plumbagin, droserone Các dẫn xuất của naphtoquinon mang nhiều hoạt tính sinh học quan trọng: diệt sâu hại, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi rút, chống viêm, hạ sốt Các thực vật chứa naphtoquinon phổ biến ở Trung Quốc, các nước Đông Nam á,

và Nam Mỹ Thường dùng trị bệnh ác tính và ký sinh trùng

Naphtoquinon được ứng dụng rộng rãi: nguyên liệu sản xuất các loại thuốc bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, thuốc diệt ve, chất sát trùng), dùng làm chất ức chế trùng hợp, làm nguyên liệu sản xuất thuốc sốt rét, sản xuất vitamin K, vật liệu sản xuất nhựa, chất xúc tác khử lưu huỳnh, xúc tác làm chất nhuộm [24]

1,2- napthtoquinon còn gọi là ortho-naphthoquinone, là hợp chất hữu cơ

chứa nhiều vòng thơm

1,4-naphtoquinon là tinh thể hình kim, vàng dễ bay hơi, mùi hăng, cay

tương tự benzoquinon Hầu như không tan trong nước lạnh, tan nhẹ trong ether dầu, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ phân cực: tan tốt trong rượu nóng, benzen, ether, chloroform, cacbon dioxit Tan trong axit sulfuric Trong dung dịch kiềm nó tạo ra màu nâu đỏ

1,2- napthtoquinon 1,4-naphtoquinon

Naphtoquinon là cấu trúc cơ bản của nhiều hợp chất tự nhiên Hai loại vitamin K1(phylloquinone) và vitamin K2( menaquinone) đều là dẫn xuất của naphtoquinon

Vitamin K3 là dẫn xuất của naphtoquinon đơn giản hơn hai loại trên, gọi

là 2-methyl-1,4-naphtoquinon, có hoạt tính tương đương vitamin K1 và K2