Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Tam Thất Ngũ gia bì chân chim và thử nghiệm quá trình sản xuất sinh khối bằng bioreactor

- Nội dung 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến sinh khối tế bào/sinh khối rễ của cây Tam thất chỉnh không thực hiện - Nội dung 8: Nghiên cứu hiệu quả nuôi cấy si

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI “NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CỦA CÂY TAM THẤT, NGŨ GIA

BÌ CHÂN CHIM VÀ THỬ NGHIỆM QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT

SINH KHỐI BẰNG BIOREACTOR”

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC.04.TN10/11-15

Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:

(ký tên) (ký tên và đóng dấu)

ThS Đặng Thị Thanh Tâm

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ

NỘI

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA

VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 17 tháng 12 năm 2012.

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Tam thất, Ngũ gia bì chân chim và thử nghiệm quá trình sản xuất sinh khối bằng bioreactor”

Mã số đề tài: KC.04.TN10/11-15

Thuộc: Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước, KC.04/11-15

2 Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Đặng Thị Thanh Tâm

Ngày, tháng, năm sinh: 17/01/1985 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Thạc sỹ

Tổ chức: Khoa Công nghệ Sinh học – Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Điện thoại cơ quan: 046-261-7655

Mobile: 094-830-9933

E-mail: thanhtam17_01@yahoo.com

Địa chỉ nhà riêng: Ngô Xuân Quảng, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Điện thoại: 04.38276346 Fax: 04 38276554

E-mail: webmaster@hua.edu.vn

Địa chỉ: Trường ĐHNN Hà Nội - Trâu Quỳ – Gia Lâm - Hà Nội

Họ và tên người đứng đầu tổ chức: PGS.TS Vũ Văn Liết

Số tài khoản: 931 01 002

Ngân hàng: Tại kho bạc nhà nước Gia Lâm Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án: 12 tháng

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012

- Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012

- Được gia hạn (nếu có):

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Quyết định về việc thành lập Hội đồng Khoa học

và Công nghệ tư vấn xét chọn tổ chức và cá nhân chủ trì đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ tiềm năng thực hiện năm 2011 thuộc lĩnh vực Công nghệ Sinh học

Quyết định về việc phê duyệt kinh phí, tổ chức

và cá nhân chủ trì các nhiệm vụ KH&CN bắt đầu thực hiện trong kế hoạch năm 2011 Thuộc chương trình: Nghiên cứu phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học (mã chương trình KC.04/11-

KC.04/11-15 thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước “nghiên cứu phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học”

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia

chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 ThS Đặng Thị

Thanh Tâm

ThS Đặng Thị Thanh Tâm

- Chủ nhiệm

- Nghiên cứu quá trình cảm ứng hình thành rễ của mẫu cấy, ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy, loại môi trường, dịch chiết hữu cơ đến rễ nuôi cấy

- 01 thuyết

minh đề tài

- 05 báo cáo chuyên

đề

- 01 báo cáo tổng kết đề tài

2 KS Nguyễn

Thị Thùy Linh

KS Nguyễn Thị Thùy Linh

- Thư ký

- Nuôi giữ các chủng

vi khuẩn, đánh giá chọn dòng tế bào rễ,

hưởng của ánh sang, hợp chất elicitor trong nuôi cấy rễ tơ

- 03 báo cáo chuyên

-Cố vấn về nội dung nghiên cứu, thiết kế thí nghiệm

- Đánh giá hoạt chất saponin

- 01 báo cáo chuyên

đề

4 TS Nguyễn

Thanh Hải

ThS Phạm Thị Thu Hằng

- Nghiên cứu tác dụng của acid amin đến quá trình nuôi cấy rễ

- 01 báo cáo chuyên

đề

*

5 ThS Nguyễn ThS Nguyễn Thu thập vật liệu - 01 báo

Hữu Cường Hữu Cường nghiên cứu cáo

Thử nghiệm sản xuất sinh khối bằng bioreactor

- 01 báo cáo chuyên

- 02 báo cáo chuyên đề-

8 ThS Phạm

Thị Thu Hằng

ThS Phạm Thị Thu Hằng

- Vào mẫu in vitro, nghiên cứu qua trình cảm ứng hình thành

rễ tơ,

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến nuôi cấy rễ, đánh giá thành phần hợp chất

03 báo cáo

chuyên

đề

- 01 báo cáo tóm tắt

- 01 báo cáo tài chính

* ThS Phạm Thị Thu Hằng thay TS Nguyễn Thanh Hải do TS Nguyễn

Thanh Hải có lý do sức khỏe không bố trí được thời gian để tiến hành chuyên

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm, tên tổ chức

người tham gia )

Ghi chú*

1

2

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

1

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra

khảo sát trong nước và nước ngoài)

hoạch

Thực tế đạt được

Người,

cơ quan thực hiện

- Nội dung 1: Thu thập, lưu giữ

nguồn gen/vật liệu của hai loài dược

liệu nghiên cứu từ các địa phương

- Nội dung 3: Nghiên cứu tạo nguồn

vật liệu khởi đầu in vitro cho 2 loài

dược liệu nghiên cứu

02/2012

02/2012

01/2012-ThS Phạm Thu Hằng ThS.Nguyễn Thị Thủy

1

- Nội dung 4: Nghiên cứu, đánh giá

cảm ứng quá trình phát sinh rễ bằng

nuôi cấy cộng sinh các nguồn mẫu

cấy khác nhau của 2 loài dược liệu

với các chủng vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes

04/2012

04/2012

02/2012-ThS Đặng Thị Thanh Tâm ThS Phạm Thu Hằng

2 - Nội dung 5: Đánh giá và chọn

dòng tế bào rễ tơ chuyển gen của

cây Tam thất

05/2012

05/2012

Thị Thanh Tâm

- Nội dung 6: Đánh giá và chọn

dòng tế bào rễ tơ chuyển gen của

cây Ngũ gia bì chân chim

05/2012

Thị Thanh Tâm

- Nội dung 7: Nghiên cứu ảnh

hưởng của các loại môi trường nuôi

cấy đến sinh khối tế bào/sinh khối rễ

của cây Tam thất

chỉnh không thực hiện

- Nội dung 8: Nghiên cứu hiệu quả

nuôi cấy sinh khối rễ trong các điều

kiện môi trường nuôi cấy khác nhau

(lỏng, lỏng lắc, bán lỏng, rắn)

chỉnh không thực hiện

- Nội dung 9: Xác định tác dụng của

các chất điều tiết sinh trưởng đến

tốc độ sinh trưởng của rễ cây Tam

thất nuôi cấy

chỉnh không thực hiện

Nội dung 10: Xác định tác dụng các

dịch chiết hữu cơ (pepton, dịch chiết

nấm men, casein), đến tốc độ sinh

trưởng của rễ cây Tam thất nuôi

cấy

chỉnh không thực hiện

3 - Nội dung 11: Xác định tác dụng

các loại acid amin (adenine sulphate

…) đến tốc độ sinh trưởng của rễ

cây Tam thất

chỉnh không thực hiện

4 - Nội dung 12: Tìm hiểu ảnh hưởng

của các hợp chất có vai trò là các

chất kích thích quá trình trao đổi

chất thứ cấp (elicitor) như Jasmonas

acid, Heptasaccharide,

octasaccharide, các muối kim loại

nặng trong việc nhân nuôi tế bào rễ

của cây Tam thất

chỉnh không thực hiện

5 - Nội dung 13: Nghiên cứu hiệu quả

nuôi cấy sinh khối rễ trong các điều

kiện thời gian chiếu sáng khác nhau

cho rễ tơ của cây Tam thất

chỉnh không thực hiện

-Nội dung 14: Nghiên cứu thử

nghiệm sản xuất sinh khối rễ cây

Tam thất bằng bioreactor

chỉnh không thực hiện -Nội dung 15: Nghiên cứu ảnh

hưởng của các loại môi trường nuôi

Thị Thanh

cấy đến sinh khối tế bào/sinh khối rễ

của cây Ngũ gia bì chân chim

08/2012 08/2012 Tâm

- Nội dung 16: Nghiên cứu hiệu quả

nuôi cấy sinh khối rễ trong các điều

kiện môi trường nuôi cấy khác nhau

(lỏng, lỏng lắc, bán lỏng, rắn)

07/2012 04-07/2012 ThS Đặng Thị Thanh

04-Tâm

Nội dung 17: Xác định tác dụng của

các chất điều tiết sinh trưởng đến

tốc độ sinh trưởng của rễ cây Ngũ

gia bì chân chim nuôi cấy

07/2012

07/2012

04-ThS Phạm Thu Hằng

Nội dung 18: Xác định tác dụng các

dịch chiết hữu cơ (pepton, dịch chiết

nấm men, casein), đến tốc độ sinh

trưởng của rễ cây Ngũ gia bì chân

chim nuôi cấy

08/2012 04-08/2012 ThS Đặng Thị Thanh

04-Tâm

-Nội dung 19: Xác định tác dụng

các loại acid amin (adenine sulphate

…) đến tốc độ sinh trưởng của rễ

cây Ngũ gia bì chân chim

08/2012 04-08/2012 ThS Phạm Thu Hằng

04 Nội dung 20: Tìm hiểu ảnh hưởng

của các hợp chất có vai trò là các

chất kích thích quá trình trao đổi

chất thứ cấp (elicitor) như Jasmonas

acid, Heptasaccharide,

octasaccharide, các muối kim loại

nặng trong việc nhân nuôi tế bào rễ

của cây Ngũ gia bì chân chim

09/2012

09/2012

04-KS Nguyễn Thị Thùy Linh

- Nội dung 21: Nghiên cứu hiệu quả

nuôi cấy sinh khối rễ trong các điều

kiện thời gian chiếu sáng khác nhau

09/2012

09/2012

04-KS Nguyễn Thị Thùy Linh

- Nội dung 22 Nghiên cứu thử

nghiệm sản xuất sinh khối rễ cây

Ngũ gia bì chân chim bằng

bioreactor

12/2012

06-12/2012

11-ThS Nguyễn Thị Thúy Hạnh

-Nội dung 23: Bước đầu đánh giá

các hoạt chất (saponin) trong sinh

khối rễ của hai loài dược liệu nghiên

cứu

12/2012

12/2012

10-TS Nguyễn Thị Phương Thảo

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

2 Qui trình nhân nuôi rễ tơ

có tốc độ tăng sinh khối

rễ cao

01 01

quá trình nhân nuôi rễ

tơ và hàm lượng hoạt

tính của sinh khối rễ

nuôi cấy làm tiền đề cho

việc nghiên cứu phát

triển hệ thống nhân nuôi

rễ tơ bằng bioreactor

sinh học quốc gia 12/2012

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo Theo kế

hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

Kết quả

sơ bộ

1

2

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình

độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

- Sản phẩm mới trong phòng TN được tạo ra là các dòng rễ tơ cảm ứng sau chuyển gen có tốc độ tăng trưởng lớn hơn các dòng rễ thông thường không chuyển gen và có khả năng điều khiển quá trình tích lũy hợp chất của các dòng rễ này

- Hướng nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật thu sinh khối có chứa các hợp chất thứ cấp là hướng nghiên cứu quan trọng và có nhiều ứng dụng Sản phẩm của đề tài khi thành công có thể ứng dụng ở qui mô công nghiệp để sản xuất các hoạt chất thứ cấp có giá trị cung cấp cho ngành dược phẩm

- Khi tiến hành đề tài, nhóm nghiên cứu có điều kiện để thực hiện ý tưởng nghiên cứu mới của mình, khẳng định được năng lực cũng như nâng cao được năng lực trình độ nghiên cứu của các cá nhân tham gia cũng như của cả nhóm nghiên cứu

- - Hình thành các nhiệm vụ KHCN: Kết quả nghiên cứu của đề tài là bước đệm, bước thăm dò ban đầu quan trọng để đề xuất các nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp cao hơn

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

- Khi đề tài thành công thì các qui trình công nghệ, sản phẩm ban đầu tạo

ra hoàn toàn có thể chuyển giao, hợp tác với các doanh nghiệp sản xuất dược phẩm trong nước

c) Năng lực của cá nhân (hoặc nhóm) chủ trì và tổ chức chủ trì thực hiện

(Nêu tóm tắt kinh nghiệm và năng lực nghiên cứu, tổ chức thực hiện các nhiệm vụ nghiên cứu triển khai)

Trong nhiều năm gần đây, Nhà trường đã nhận được sự quan tâm đầu tư

cơ sở vật chất phục vụ cho đào tạo và nghiên cứu từ Bộ Giáo dục và Đào tạo,

Bộ Khoa học và Công nghệ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và từ các chương trình, dự án hợp tác với nước ngoài Cơ sở vật chất hiện có phục

vụ đào tạo và nghiên cứu về CNSH của Trường gồm khu phòng thí nghiệm trung tâm do tổ chức JICA đầu tư hơn 01 triệu USD giai đoạn 1999-2003; Phòng thí nghiệm về CNSH thực vật và ưu thế lai đầu tư 4,5 tỷ cho Viện Sinh học Nông nghiệp giai đoạn 2000-2002; 03 phòng thí nghiệm nghiên cứu về công nghệ tế bào, công nghệ gen và protein, sinh học phân tử-bệnh lý thực vật đầu tư 11,2 tỷ giai đoạn 2004-2005; phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học

nông nghiệp bao gồm 03 nhóm nghiên cứu là CNSH động vật, CNSH thực vật và CNSH thực phẩm với tổng kinh phí 49,6 tỷ thực hiện trong giai đoạn 2007-2010 Hiện nay, nhờ được đầu tư từ các chương trình và dự án, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã có một cơ sở vật chất, trang thiết bị phục vụ cho đào tạo và nghiên cứu CNSH tương đối hiện đại; bước đầu đảm bảo thực hiện các nghiên cứu thuộc lĩnh vực CNSH nông nghiệp

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội là một trong các trường đi đầu trong nghiên cứu khoa học, đặc biệt là chuyển giao tiến bộ KT phục vụ sản xuất Trong giai đoạn 2006-2010, Nhà trường thực hiện 03 đề tài/dự án thuộc chương trình trọng điểm cấp Nhà nước, 05 đề tài độc lập cấp nhà nước, 07 nhiệm vụ hợp tác theo nghị định thư (với Trung quốc, Rumani, Hungari, Đức

và Nhật Bản), 9 nhiệm vụ nghiên cứu cơ bản, 183 đề tài cấp Bộ và trọng điểm cấp Bộ; 345 đề tài cấp trường và 467 công trình nghiên cứu khoa học do nhóm sinh viên thực hiện; 3 đề tài thuộc chương trình CNSH trong nông nghiệp Các đề tài được nghiệm thu đánh giá loại khá và xuất sắc, được ứng dụng rộng rãi, được Hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận, cho phép triển khai trong sản xuất, góp phần tích cực vào sự nghiệp công nghiệp hoá, hiện đại hoá nông nghiệp và nông thôn

Các thành viên của Nhóm nghiên cứu là những giảng viên có kinh nghiệm trong giáo dục cũng như trong nghiên cứu Nhóm nghiên cứu đã có nhiều năm kinh nghiệm trong lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật và công nghệ gen thực vật Các cá nhân trong nhóm đều được đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ ở các nước tiên tiến như: Mỹ, Nhật, Nga… Nhóm nghiên cứu của Bộ môn CNSH TV đã thành công trong việc chọn lọc, chọn tạo, nhân nhanh và bảo tồn một số cây trồng có giá trị: cây hoa lan, hoa đồng tiền, hoa hồng, trinh nữ hoàng cung, cây cói… Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu cũng có nhiều kinh nghiệm trong công nghệ gen thực vật

Với kinh nghiệm trong nghiên cứu và trong quản lý của các cán bộ khoa Công nghệ Sinh học và trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, chúng tôi đã thực hiện tốt, đáp ứng được các mục tiêu mà đề tài đặt ra

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

chuyên đề nghiên cứu của 6 tháng đầu năm

2012

- Về chất lượng: Các chuyên đề nghiên cứu có

chất lượng tốt Các kết quả nghiên cứu đều có tính mới

- Về tiến độ: Tất cả các nội dung trên cây ngũ gia bì chân chim đều được thực hiện đúng tiến

độ Trên cây Tam thất dô dặc điểm đặc thù của nguồn mẫu nên chậm với tiến độ đã đăng ký

II Kiểm tra

định kỳ

Ngày 16/8/2012

Nhóm nghiên cứu đã triển khai các thí nghiệm,

về cơ bản đúng tiến độ đăng ký trong thuyết minh và hợp đồng cho đến kỳ báo cáo lần I Tuy nhiên, một số thí nghiệm về xác định ảnh hưởng của các loại môi trường, điều kiện môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nhân nuôi rễ

tơ chuyển gen cây Tam thất khi triển khai thực

tế là chậm hơn và có thời gian kéo dài hơn so với thời gian dự kiến nên chưa thu được số liệu cuối cùng Chính vì những nguyên nhân trên

mà một số thí nghiệm sau chuyển gen đã nêu chưa thu được số liệu đúng tiến độ

III Nghiệm

thu cơ sở

24/12/2012 Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung và đạt

được đầy đủ các sản phẩm về số lượng, khối lượng, chủng loại

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết 1

1.2 Mục tiêu (đã điều chỉnh theo quyết định số 3369/QĐ-BKHCN) 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

1.5 Tính mới 3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây Tam thất và cây Ngũ gia bì chân chim 4

2.1.1 Cây Tam thất 4

2.1.2 Cây Ngũ gia bì chân chim 6

2.2 Hệ thống tái sinh in vitro và phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 9

2.2.1 Hệ thống tái sinh in vitro của các cây họ Sâm 9

2.2.2 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 12

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi và tích lũy hợp chất thứ cấp của các cây họ Sâm 19

PHẦN III: NỘI DUNG KHOA HỌCVÀ CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN 23

CHƯƠNG I: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

1.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

1.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

1.4 Các chỉ tiêu theo dõi 45

1.5 Phương pháp nghiên cứu 46

CHƯƠNG II: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

2.1 Chuẩn bị nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu 47

2.1.1 Thu thập, lưu giữ nguồn gen/vật liệu hai loài dược liệu Tam thất, Ngũ gia bì chân chim từ các địa phương trong nước 47 2.2 Nghiên cứu khảo sát sự cảm ứng hình thành rễ tơ cho 02 loài dược liệu nghiên cứu 56 2.2.1 Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro cho hai loài cây dược liệu 56 2.2.2 Nghiên cứu khảo sát sự cảm ứng hình thành rễ tơ cho hai loài dược liệu nghiên cứu 77 2.3 Đánh giá và chọn dòng tế bào rễ tơ chuyển gen của hai loài dược liệu nghiên cứu 84 2.4 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối rễ của cây Tam thất (được điều chỉnh không thực hiện theo quyết định số 3369/QĐ-BKHCN) 90 2.5 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối rễ của cây Ngũ gia bì chân chim 90 2.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến sinh khối tế bào/sinh khối rễ của cây Ngũ gia bì chân chim 90 2.5.2 Nghiên cứu hiệu quả nuôi cấy sinh khối rễ cây Ngũ gia bì chân chim trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau (lỏng, lỏng lắc, bán lỏng, rắn) 94 2.5.3 Xác định tác dụng của các chất điều tiết sinh trưởng đến tốc độ sinh trưởng của rễ cây Ngũ gia bì chân chim nuôi cấy 96 2.5.4 Xác định tác dụng của các dịch chiết hữu cơ đến tốc độ sinh trưởng của rễ cây Ngũ gia bì chân chim nuôi cấy 99 2.5.5 Xác định tác dụng các loại acid amin (adenine sulphate ) đến tốc độ sinh trưởng của rễ cây Ngũ gia bì chân chim nuôi cấy 101 2.5.6 Tìm hiểu ảnh hưởng của hợp chất elicitor đến sinh tổng hợp hoạt chất mục tiêu trong việc nhân nuôi tế bào rễ của cây Ngũ gia bì chân chim 104 2.5.7 Nghiên cứu hiệu quả nuôi cấy sinh khối rễ cây Ngũ gia bì chân chim trong các điều kiện thời gian chiếu sáng khác nhau 106

2.5.8 Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất sinh khối rễ cây Ngũ gia bì chân chim

bằng bioreactor 109

2.6 Bước đầu đánh giá thành phần, hàm lượng hoạt chất (saponin) trong sinh khối rễ của cây Ngũ gia bì chân chim 110

PHẦN III: KẾT LUẬN 112

PHẦN IV: DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 114

PHẦN V: PHỤ LỤC 124

PHỤ LỤC 1: CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC NGHIÊN CỨU 124 PHỤ LỤC 2: QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ MẪU TAM THẤT VÀ NGŨ GIA BÌ CHUYỂN GEN 126

PHỤ LỤC 3: QUI TRÌNH TIẾN HÀNH SOUTHERN BLOT 129

PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 134

PHỤ LỤC 5: QUI TRÌNH CHUYỂN GEN ROL NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM RHIZOGENES ÁP DỤNG THÀNH CÔNG Ở CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM 138

PHỤ LỤC 6: QUI TRÌNH NHÂN NUÔI SINH KHỐI RẼ TƠ CÓ TỐC ĐỘ TĂNG SINH KHỐI RỄ CAO CHO CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM 141

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HgCl2 Mercuric (II) chloride

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Sự phát triển của vi khuẩn Agrobacterium zhizogenes trên các loại

môi trường 52 Bảng 2: Kết quả kiểm tra sự có mặt của các gen cảm ứng rễ tơ trong các

chủng vi khuẩn Agobacterium rhizogenes nghiên cứu 53

Bảng 3 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có đường kính d ≤ 1,5 cm ( sau 8 tuần theo dõi) 57 Bảng 4: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả khử trùng với lát cắt mỏng củ có đường kính 1,5 cm < d < 2 cm ( sau 8 tuần theo dõi) 59 Bảng 5: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng HgCl2 0,1% và cefotaxime 800 mg/l đến hiệu quả với lát cắt mỏng củ có đường kính d ≥ 2

cm ( sau 8 tuần theo dõi) 61 Bảng 6: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng cảm ứng callus của lát cắt mỏng củ Tam Thất có đường kích d< 2 cm ( sau 9 tuần theo dõi) 63 Bảng 7: Khảo sát ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng cảm ứng hình thành callus của lát cắt mỏng củ Tam Thất có đường kính d > 2 cm 65 Bảng 8: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung 2,4D và Ki đến khả năng cảm ứng callus (sau 9 tuần theo dõi) 68 Bảng 9: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung 2,4D, NAA và BA đến khả năng cảm ứng callus ( sau 9 tuần theo dõi) 70 Bảng 10: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng NaOCl 3% và HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mô lá cây Ngũ Gia Bì Chân Chim 72 Bảng 11: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng bằng NaOCl 3% và HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng đoạn thân cây Ngũ Gia Bì Chân Chim 73

Bảng 12: Ảnh hưởng của loại vật liệu đến khả năng phát sinh hình thái mẫu

trên nền môi trường: MS + 0,2mg/l 2,4D + 1 mg/l BA + 3% sucrose 74

Bảng 13: Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi của đoạn thân mang mắt ngủ của cây Ngũ Gia Bì Chân Chim sau 3 tuần nuôi cấy 76

Bảng 14: Đánh giá khả năng tạo rễ tơ của các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes TR7 (8 tuần sau chuyển gen) 77

Bảng 15: Đánh giá khả năng tạo rễ tơ của chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 11325 78

Bảng 16: Đánh giá khả năng tạo rễ tơ của chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 15834 79

Bảng 17: Khả năng tạo rễ tơ của chủng vi khuẩn TR7 80

Bảng 18: Khả năng tạo rễ tơ của chủng vi khuẩn 11325 81

Bảng 19: Khả năng tạo rễ tơ của chủng vi khuẩn AR15834 83

Bảng 20: Bảng tổng hợp kết quả PCR và hình thái các dòng rễ kiểm tra trên cây Ngũ gia bì chân chim 87

Bảng 21: Sự sinh trưởng của các dòng rễ chuyển gen chủng TR7 của cây Tam thât (theo dõi sau 12 tuần nuôi cấy) 89

Bảng 22: Tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ chuyển gen cây Ngũ gia bì chân chim (theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy) 90

Bảng 23: Ảnh hưởng của môi trường nền nuôi cấy đến sự sinh trưởng phát triển của dòng rễ tơ chủng 15834.1 (sau tuần 4 tuần nuôi cấy) 91

Bảng 24: Ảnh hưởng của môi trường nền nuôi cấy đến sự sinh trưởng phát triển của dòng rễ tơ chủng 11325 (sau 4 tuần nuôi cấy) 92

Bảng 25: Ảnh hưởng của môi trường nền nuôi cấy đến sự sinh trưởng phát triển của dòng rễ tơ chủng TR7 (sau 4 tuần nuôi cấy) 93

Bảng 26: Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của dòng 11325 (kết quả sau 4 tuần theo dõi) 94

Bảng 27: Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của dòng

15834 (kết quả sau 4 tuần theo dõi) 94 Bảng 28: Ảnh hưởng GA3 đến sự sinh trưởng phát triển của rễ tơ cây Ngũ gia

bì chân chim (sau 4 tuần nuôi cấy) 97 Bảng 29: Ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến sự sinh trưởng phát triển của rễ tơ cây Ngũ gia bì chân chim 98 Bảng 30: Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (yeast extract) đến sinh trưởng của dòng rễ tơ 11325 (kết quả sau 4 tuần theo dõi) 99 Bảng 31: Ảnh hưởng của pepton đến sinh trưởng của các dòng rễ tơ 11325 (kết quả sau 4 tuần theo dõi) 100 Bảng 32: Ảnh hưởng của adenine sunphate đến tốc độ sinh trưởng của rễ cây Ngũ gia bì chân chim dòng 15834 (kết quả sau 4 tuần theo dõi) 102 Bảng 33: Ảnh hưởng của Phenylalanin đến tốc độ sinh trưởng của rễ cây Ngũ gia bì chân chim dòng 15834 (kết quả sau 4 tuần theo dõi) 103 Bảng 34: Ảnh hưởng Jasmonic axit đến sự tích lũy hợp chất saponin tổng số ở

rễ tơ dòng 11325 cây Ngũ gia bì chân chim (theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy) 105 Bảng 35: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến sự sinh trưởng của dòng TR7 (kết quả sau 8 tuần theo dõi) 107 Bảng 36: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến sự sinh trưởng của dòng

15834 (kết quả sau 8 tuần theo dõi) 107 Bảng 37: Sự sinh trưởng của rễ tơ Ngũ gia bì chân chim trên hệ thống ngập chìm gián đoạn tự động (sau 20 ngày nuôi cấy) 109 Bảng 38 Đánh giá hàm lượng saponin tổng số trên nguồn rễ chuyển gen cây Ngũ gia bì chân chim 111

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1: Hình ảnh Ngũ Gia Bì Chân Chim 48Hình 2: Nguồn gen cây Tam Thất thu thập tại Hà Giang 50Hình 3: Nguồn gen cây Tam Thất thu thập tại Sapa 50Hình 4.4a: Kết quả nhân dòng gene 18S rRNA trên mẫu giống thu thập ở Sa

Pa với cặp mồi 18S-F, 18S-R 51Hình 4.4b: Kết quả nhân dòng gene 18S rRNA trên mẫu giống thu thập ở Hà Giang với cặp mồi 18S-F, 18S-R 51

Hình 5 : Vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes nuôi cấy trên môi trường YM

đặc thu sinh khối 53

Hình 6: Kết quả PCR chạy mồi rol A của các chủng Agobacterium rhizogenes

nghiên cứu 54

Hình 7: Kết quả chạy môig rolC với các chủng Agrobacterium rhizogenes

TR7, EGFP, TR107, 11325, 15834 55Hình 8 : Kết quả chạy PCR kiển tra sự có mặt của gen rol A và rol B trên các chủng TR7, 11325, 15834, EGFP 55Hình 9 : Callus hình thành trên môi trường có chứa 2,4D 65Hình 10: Callus hình thành trên môi trường CT5: MS + 1 mg/l 2,4D 66Hình 11: Callus hình thành trên môi trường P3: MS + 2 mg/l 2,4D 67Hình 12: Callus hình thành trên môi trường P4: MS + 3 mg/l 2,4D 67Hình 13: Callus hình thành trên môi trường P5: MS + 4 mg/l 2,4D 67Hình 14: Callus hình thành trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,1 mg/l Ki 69Hình 15: Callus hình thành trên môi trường2mg/l 2,4D + 0,5 mg/l Ki 69Hình 16: Callus hình thành trên môi trường MS + 4mg/l 2,4 D 71Hình 17: Callus hình thành trên môi trường MS + 4mg/l 2,4D + 0,5 mg/l BA 71Hình 18: Callus hình thành trên môi trường MS + 4 mg/l α NAA + 0,5 mg/l BA .71

Hình 19: Sự phát sinh hình thái callus của các loại mẫu khác nhau trên nền môi trường MS + 0,2 mg/l 2,4D + 1 mg/l BA + 3% sucrose sau 3 tuần tuổi 75Hình 20: Chồi Ngũ gia bì in vitro trên môi trường 1 mg/l BA sau 3 tuần tuổi 76Hình 21: Mẫu chuyển gen nuôi cấy trên môi trường MS (sau 10 tuần chuyển gen) 78

Hình 22: Dòng rễ tơ cảm ứng bởi chủng vi khuẩn Agrobacterium

Hình 25: Kết quả tách chiết DNA tổng số (A) và chạy PCR với mồi rolA xác

định dòng rễ chuyển gen chủng TR7 (B) của cây Tam thất 85Hình 26: Kết quả PCR chạy kiểm tra các dòng rễ cảm ứng 86Hình 27: Kết quả PCR chạy kiểm tra các dòng rễ cảm ứng 87Hình 29 : Ảnh hưởng của GA3 đến sự sinh trưởng của rễ tơ dòng 11325.3 97Hình 30 : Sự phát triển của rễ dòng 11325.2 trên môi trường B5 + 300 mg/l Phenylalanin 104Hình 31: Rễ tơ chủng 11325.1 nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm gián đoạn tự động 110Hình 32: Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin Triterperoid của sinh khối rễ của cả rễ tơ và rễ đối chứng111

chuyển gen thành công bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, trong đó có

một lượng lớn các cây thuốc Có thể nói, đây là cách tiếp cận cập nhật trên thế giới tuy nhiên ở Việt Nam những nghiên cứu trên cây dược liệu theo cách tiếp cận này vẫn còn rất ít Đặc biệt, trong các cây dược liệu quý ở nước ta, hai loài cây tổng hợp các hợp chất saponin là Tam thất, Ngũ Gia bì chân chim, là những đối tượng đáng quan tâm Có thể nói đây là một trong các đối tượng nghiên cứu còn khá mới mẻ đối với cộng đồng khoa học trên thế giới

Chính vì vậy, hướng tiếp cận của đề tài sẽ là sử dụng nguồn gen hai loài cây thuốc bản địa chứa hợp chất saponin có giá trị là Tam thất và Ngũ gia

bì chân chim, lợi dụng quá trình chuyển gen tự nhiên của vi khuẩn mang gen cảm ứng sinh rễ nhằm nâng cao hiệu quả nuôi cấy in vitro sinh khối rễ tơ ở các cây dược liệu này Các cơ sở dữ liệu khi tiến hành đề tài là những thông tin mới, chưa hề được công bố trong nước, làm cơ sở khoa học quan trọng cho việc tiếp cận công nghệ cao của công nghệ tế bào là thiết lập các hệ thống bioreactor trong sản xuất các sản phẩm dược liệu quí nói chung và các hợp chất saponin nói riêng

1.2 Mục tiêu (đã điều chỉnh theo quyết định số 3369/QĐ-BKHCN)

Thiết lập được qui trình công nghệ nuôi cấy rễ tơ (hair root) bằng vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên cây dược liệu Ngũ gia bì chân chim

làm tiền đề cho việc sản xuất các hợp chất trong nhóm saponin bằng bioreactor

trên

+ Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi

cấy đến khả năng sinh sinh khối của hệ thống nuôi cấy rễ tơ đã được cảm ứng

+ Bước đầu thiết lập qui trình nhân nuôi rễ tơ dựa trên các chỉ tiêu,

thông số kỹ thuật đã khảo sát

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về quá trình sử dụng vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes để cảm ứng tạo ra rễ tơ trên hai đối tượng

Ngũ gia bì chân chim và Tam thất Các kết quả thu được sẽ góp phần cung cấp tài liệu cho nghiên cứu và giảng dạy

1.5 Tính mới

Hướng tiếp cận của đề tài sử dụng vi khuẩn Agobacterium rhizogenes

và hai nguồn gen cây thuốc bản địa (Tam thất và Ngũ gia bì chân chim) để tạo

ra các rễ tơ chuyển gen có tốc độ tăng trưởng sinh khối cao là một hướng tiếp cận mới, cập nhật và có nhiều ý nghĩa khoa học

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 Giới thiệu chung về cây Tam thất và cây Ngũ gia bì chân chim

2.1.1 Cây Tam thất

¾ Nguồn gốc và phân loại

Tam Thất hoang –Panax stipuleanatus thuộc họ Nhân sâm –

Araliaceae, chi Panax, nhánh Pseudoginseng Trong dân gian Tam Thất còn

có tên gọi khác là Tam Thất lá xẻ, Vũ diệp Tam Thất

Theo Hui-Lin Li (1942) [26] nhiều cây thộc họ Araliaceae được phân

bố chủ yếu ở Trung, Nam và Tây Trung Quốc cho tới Ấn Độ Trong đó Tam Thất có mặt nhiều huyện Văn Sơn, Nghiên Sơn, Tây Trù, Mã Quan, Phú Ninh, Quảng Nam tỉnh Vân Nam, vùng Điền Dương trong chuyên khu Bạch Sắc, các huyện Tĩnh Tây, Đức Bảo, Lục Biên (khu tự trị dân tộc Choang tỉnh Quảng Tây) Ngoài ra còn được trồng tại các tỉnh Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Giang

Tây (www.caythuocquy.info.vn) [75]

Cây Tam Thất đã được di thực trồng ở nước ta vào những năm 1960 -

1970 tại các vùng núi cao trên 1200m thuộc huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ, Hoàng Su Phì (Hà Giang), Mường Khương, Bắc Hà, Xi Ma Kai, Sapa (Lao Cai) và các tỉnh Cao Bằng, Lai Châu

¾ Đặc điểm thực vật học

Tam Thất hoang là cây thân nhỏ, sống lâu năm Thân rễ (củ nạc) dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân lụi hàng năm để lại Thân mọc thẳng, cao 30- 50 cm, thường lụi vào mùa khô Lá kép chân vịt, gồm 2- 3 cái mọc vòng

Lá chét, 5- 7 cái dài, xẻ thuỳ không đều, mép có răng cưa, có lông Hoa màu trắng lục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân Hoa ra vào mùa tháng 4 – 8 dương lịch Quả mọng, khi chín màu đỏ, chứa 1- 2 hạt (www.tudienthuoc.net [80])

Ở một số tỉnh miền núi phía bắc cây chủ yếu được trồng bằng hạt Từ

khi gieo hạt đến khi cây non mọc phải mất 3 tháng sau đó mới đem trồng Cây

trồng 3 năm mới ra hoa, sau đó ra hoa kết quả đều hàng năm Cây trồng được

7 năm mới có thể thu hoạch củ có chất lượng

Tam Thất là loại cây rất khó trồng đòi hỏi điều kiện ngoại cảnh rất khó khăn Cây chỉ sống được ở vùng núi cao và lạnh quanh năm Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là20oC- 25oC Nếu đem xuống đồng bằng thì chỉ 1-2 ngày là cây bị chết Cây quanh hợp trong điều kiện mát không chịu được ánh sáng chiếu toàn phần, ánh sáng thích hợp là ánh áng tán

xạ nửa tối

¾ Thành phần hóa học và công dụng

Trong Tam Thất có chứa rất nhiều các hợp chất hóa học trong đó saponin là hợp chất chính quyết định đến phẩm chất của Tam Thất Hàn lượng saponin trong cây cũng rất khác nhau thấp nhất là 2,5% trong thân cây

và cao nhất là 12% trong nụ hoa, trong củ chỉ chiếm 9,5% Saponin trong Tam Thất gồm có hai loại chính là saponin Nhân Sâm (Gensenosid) và saponin Tam Thất (Notoginsenosid) Bên cạnh đó Tam Thất còn chứa 0,9% dencichin và các acid hữu cơ như octanoic, nonanoic, palmitic, acetic Trong

củ còn có các acid amin như aspartic, glutamic, lysine và tinh dầu tạo mùi thơm đặc trưng của Tam Thất

Rễ củ Tam Thất thường được sử dụng làm thuốc Theo đông y, rễ củ có

vị đắng ngọt, tính ấm vào hai kinh can và vị có tác dụng bổ huyết, cầm máu, giảm đau, tiêu ứ huyết (www.tudienthuoc.net [80]) Bên cạnh đó Tam Thất còn có tác dụng giúp lưu thông tuần hoàn máu, giảm lượng cholesterol trong máu, hạ đường huyết, kích thích hệ miễn dịch, ức chế vi khuẩn và siêu vi khuẩn, chống viêm tấy giảm đau Gần đây, Tam Thất được dùng trong một số trường hợp ung thư (máu, phổi, vòm họng, tiền liệt tuyến, tử cung, vú) với những kết quả ban đầu khả khả quan (www.suckhoevadoisong.org)

2.1.2 Cây Ngũ gia bì chân chim

¾ Đặc điểm thực vật học

Ngũ Gia Bì Chân Chim còn gọi là chân chim, sâm nam, cây chân vịt

tên khoa học là Schefflera heptaphylla là một loại cây có kích cỡ trung bình,

luôn luôn xanh cao trên 25 m, thân cây có đường kính khoảng 80 cm Các lá hình chân vịt có khoảng 6-8 (-11) lá chét, cuống lá dài 8-35 cm, các lá có hình ovate, chiều dài lá khoảng 7-20 cm, chiều rộng lá khoảng 3-6 cm, lá cây rất mỏng, toàn bộ mép lá còn nguyên vẹn, nhẵn nhụi, cuống lá không đồng đều

có chiều dài đạt từ 1-5 cm Cụm hoa chùm tán, hoa nhỏ hay đơn lẻ màu trắng,

số cánh hoa và nhị bằng nhau thường là 5 Bao phấn 2 ô, bầu hạ 5-6 ô Quả hình cầu, đường kính 3-4 mm, khi chín có màu tím sẫm đen, có khoảng 6-8 hạt Đặc điểm của cây Ngũ Gia Bì Chân Chim thường rất dễ sinh trưởng, tốc

độ phát triển nhanh và chúng là loài ưa ánh sáng mặt trời, tên khoa học được

sử dụng từ năm 1890 là Schefflera octophylla (Lour.) Sau đó được chuyển thành S.heptaphylla (L.) Frodin Ngũ Gia Bì Chân Chim (Schefflera

heptaphylla) có nguồn gốc từ China, India, Malaysia, Taiwan, các tỉnh thành

của Trung Quốc (Forst và cs, 2005) [20]

¾ Phân bố

Ngũ Gia Bì mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta, hay gặp nhất là

ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Sapa (Lào Cai), Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây, Tuyên Quang Có mọc ở Trung Quốc (Quảng Châu, Tứ Xuyên) (Đỗ Tất Lợi, 2003) [1]

bì có khả năng chống ô nhiễm và khử được khí formaldehyd độc trong nhà (http//www.caythuocquy.info.vn [75]) Trong đông y, Ngũ Gia Bì Chân Chim

là một vị thuốc quý có tác dụng làm mạnh gân cốt, trừ phong, đau nhức xương khớp, đau bụng, trẻ em vận động cơ bắp yếu, hạn chế đi lại Có tác dụng tốt đến hệ thần kinh trung ương, chống suy nhược thần kinh, giúp tăng trí nhớ, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt Ngũ Gia Bì Chân Chim và Ngũ Gia

Bì Nhiều Gai đã được dân gian dùng từ lâu, có tác dụng rất tốt trong điều trị các bệnh mãn tính ở người cao tuổi, tăng sức đề kháng, bồi dưỡng sức khỏe, trị đau nhức khớp ở phụ nữ tuổi tiền mãn kinh Tác dụng tốt với bệnh nhân suy giảm chức năng gan, rối loạn men chuyển transaminase cao cả hai chỉ số OT/SGPT, rối loạn nhẹ bilirubin máu toàn phần Nhưng lại cấm chỉ định với những bệnh nhân đường máu thấp Rượu Ngũ Gia Bì chữa đau nhức khớp xương, giúp ăn ngủ ngon (http//www.camnangsuckhoe.vn) [74]

Có tác dụng tăng cường miễn dịch của cơ thể như tăng khả năng thực bào của hệ tế bào nội bì võng, tăng nhanh sự hình thành kháng thể, làm tăng trọng lượng của lách Thuốc còn có tác dụng kháng virus, kháng tế bào ung thư, điều chỉnh miễn dịch (http://www.caythuocvn.com [76])

Ngũ Gia Bì có tác dụng an thần, điều tiết sự cân bằng giữa hai quá trình ứ chế và hưng phấn của trung khu thần kinh Tác dụng hưng phấn của thuốc không làm ảnh hưởng đến giấc ngủ bình thường, (http://www.caythuocvn.com [76])

Ngũ Gia Bì có tác dụng kháng viêm cả đối với viêm cấp và mãn tính,

có tác dụng giãn mạch, làm tăng lưu lượng máu động mạch vành và hạ huyết

áp (http://www.caythuocvn.com [76])

¾ Đặc thù về mặt dược học

Saponin có trong nhiều loài thực vật, cả thực vật hoang dại lẫn thực vật gieo trồng Có hai loại saponin, đó là saponin acid (triterpenoid saponin) và saponin trung tính (steroid saponin) Saponin acid có mặt chủ yếu trong thực vật gieo trồng còn saponin trung tính có mặt chủ yếu trong thực vật hoang dại,

đặc biệt là trong thảo dược Nhóm cây đậu như đậu tương, đậu Hà lan, cỏ luzern… và một số cây cỏ có tính chất tạo bọt như rễ cây xà phòng (soap root), vỏ cây xà phòng (soap bark)… khá giầu saponin Saponin khi thủy phân cho glycon (gốc đường, bao gồm glucose, arabinose, xylose và acid glucoronic) và aglycon (gốc sapogenin, bao gồm saponin trung tính và

saponin acid)

Schefflera heptaphylla là một thành viên của họ nhân sâm Nó là một

cây thân gỗ sống lâu năm Các gốc rễ của cây được biết đến với đặc tính có lợi của chúng Những đặc tính này là do sự hiện diện của các hợp chất saponin là thành phần quan trọng thuộc nhóm glycoside Các sản phẩm của nhân sâm có chứa nhiều hữu ích chứa các thành phần như ginsenosides (saponin triterpene), polyacetylenes, các hợp chất polyphenolic và có tính axit polysaccharides Trong số các thành phần này, ginsenosides được coi là các hợp chất chính được tích lũy trong rễ của họ nhân sâm (Kim và cs, 2009 [29])

Trong nhân sâm đã được chứng minh là có loại saponin dammarane (tetracyclic glycosides tnterpenoid), thường được gọi ginsenosides, là thành phần chính của chất chuyển hóa (Shibata và cs, 1985 [51]) Theo nghiên cứu hiện nay có hơn 30 ginsenosides (Smith và cs, 1996 [53]) Ginsenosides có nồng độ thay đổi ở các bộ phận khác nhau của cây Các ginsenoside trong họ nhân sâm được tích lũy trong nụ hoa> rễ> lá> thân rễ> hạt giống (Nah và cs,

1997 [38]) Các bộ phận khác nhau của gốc cũng có ginsenoside khác nhau: như nhân sâm 5-6 năm tuổi thường chứa từ 0,7 - 3,0% saponin tổng số (Soldati và cs, 1984 [54]) Những ảnh hưởng từ môi trường ảnh hưởng đến khả năng tạo các hợp chất saponin của cây nhân sâm Ảnh hưởng này bao gồm nồng độ chất dinh dưỡng và kết cấu của chất dinh dưỡng, độ ẩm của đất

và không khí, và điều kiện ánh sáng (Begoniasing và cs, 2001) [11]

Các nghiên cứu trên đối tượng Ngũ Gia Bì Chân Chim cho thấy:

Vỏ thân cây chứa 0,9-1% tinh dầu Các saponin thuộc nhóm ursan và olean Cho đến nay, có 12 saponin chia ra 6 cặp tương ứng, với ursan 12-ene glycosid và olean 12-ene glycosid đã biết Nghiên cứu các glycosid này có sự tham gia của các nhà nghiên cứu Việt Nam, đặc biệt lần đầu tiên Sung cùng với các nhóm tác giả khác (1992) đã phân lập xác định được asiticosid có mặt trong vỏ thân cây Ngũ Gia Bì Chân Chim của Việt Nam với hàm lượng 0,005% (http://www.duoclieu.org.vn [77]

Lá cây Ngũ Gia Bì Chân Chim có các saponin chủ yếu thược nhóm lupan, trong đó chất có hàm lượng cao nhất là 3-α-hydroxylup-20ene-23 (http://www.duoclieu.org.vn [77])

2.2 Hệ thống tái sinh in vitro và phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

2.2.1 Hệ thống tái sinh in vitro của các cây họ Sâm

Nhân Sâm (Panax ginseng) là một loại thảo dược lâu năm được sử dụng

rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá Từ năm 1973, Furuya và cs [22] đã nuôi cấy mô callus Nhân Sâm để phân lập saponins và sapogenins Năm

1994, Choi [13] bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy Nhân Sâm trên quy mô công nghiệp Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất

Theo tính toàn năng của tế bào thực vật Haberlandt (1902) [24] thì mọi

tế bào mang đầy đủ vật chất di truyền đều có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Với các cây họ Sâm thì callus cũng có thể cảm ứng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây như rễ củ, đoạn thân, cuống lá, lá, hạt Để tạo nguồn vaatl liệu sạch cho cảm ứng callus thì nhiều chất khử trùng khác nhau đã được sử dụng để khử trùng trên các cây họ Sâm nhưng Javen và HgCl2 0,1% là hai chất được sử dụng nhất Như trên cây Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis) thì củ 3-4 năm tuổi sau khi mẫu được thu về thường được

khử trùng bằng Javen ở các nồng độ khác nhau từ 10-30 phút sau khi đã rửa sạch và

khử trùng bằng cồn 70o trong vòng 2 phút (Nguyễn Thị Liễu và cs, 2011) [4]

Đối với củ 4 năm tuổi của Nhân Sâm Bắc Mỹ (Panax quinquefolius L.) thì lại

được ngâm 15 phút trong NaClO 10% thêm một vài giọt của Tween 20 sau khi đã khử trùng bằng cồn 70o trong vòng 1 phút (Samuel và cs, 2011 [46]) Lá của Sâm Ngọc Linh dùng để cảm ứng mô sẹo thường được khử trùng bề mặt bằng cồn 70o trong vòng 30 giây Mẫu sau đấy có thể tiếp tục khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% trong vòng 5 phút (Nhut và cs, 2011 [40]) Đối với Nhân

Sâm Hàn Quốc (Panax ginseng CA Meyer) thì hạt cây thường được khử trùng

bằng NaOCl với thời gian thay đổi tùy theo nồng độ sử dụng Với NaOCl 1% thì thường khử trùng 20 phút sau khi đã tráng qua cồn 70o trong 1 phút (Sathiyamoorthy và cs, 2011 [48]) Còn với NaOCl 4% thì thời gian khử trùng chỉ còn 15 phút sau khi đã tráng qua cồn 70o trong 1 phút (Kim và cs,

2005 [28])

Mẫu sau khi khử trùng sẽ được cấy sang môi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau tùy theo mục đích Có rất nhiều môi trường khác nhau được sử dụng để nuôi cấy nhưng môi trường MS thường được sử dụng nhiều nhất và chỉ thay đổi các thành phần khoáng đa lượng cho phù hợp với từng loại mẫu Đối với các cây họ Sâm do tính đa dạng về chủng loại và phân bố nên khả năng cảm ứng callus của các loài cũng khác nhau trên các môi trường khác nhau Nhưng nhìn chung đối với đa số các loài họ Sâm thì callus thường được cảm ứng trên môi trường MS có bổ sung 2,4 D (Furuya và cs, 1983 [21]; Wang, 1990 [59]; Nhut và cs, 2012 [41])

Trên Sâm Ngọc Linh thì sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu cấy trên môi trường có nồng độ 2,4 D cao hơn 1 mg/l bắt đầu có sự hình thành mô sẹo (callus) Mẫu cấy trên môi trường bổ sung 1 mg/l 2,4 D thì hình thành sẹo sau 10 ngày nuôi cấy Tuy nhiên mô sẹo hình thành trên môi trường có nồng độ 2,4 D cao hơn 1 mg/l thì sau hai tháng nuôi cấy mô sẹo phát triển chậm và bắt đầu có dấu hiệu già hóa trong khi

đó callus hình thành trên môi trường có bổ sung 1 mg/l 2,4 D callus vẫn phát triển

tốt ,cứng, ít xốp và bắt đầu hình thành rễ bất định Môi trường thích hợp cho sự hình thành sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy củ Sâm Ngọc Linh là môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4 D, 50 g/l sucrose, 8 g/l agar (Nguyễn Thị Liễu và cs, 2010) [4] Tái sinh phôi, mô sẹo và rễ cũng được thực hiện thành công trên Sâm Ngọc Linh Môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 0,1 mg/l 2,4 D đã có hiệu quả trong việc tái sinh chồi dưới điều kiện 16 giờ chiếu sáng trong ngày Trong khi môi trường MS

có bổ sung 2 mg/l α-NAA trong bóng tối là điều kiện tối tối ưu cho sự tái sinh

rễ Mô sẹo được cảm ứng từ rễ củ trên môi trường MS có chứa 0,2 mg/l BA và 1 mg/l 2,4 D dưới điều kiện 16 giờ chiếu sáng hoặc môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2,4 D và 0,1 mg/l TDZ trong điều kiện tối (Nhựt và cs, 2012)

Trên Nhân Sâm Bắc Mỹ (Panax quinquefolius L.) là loại Nhân Sâm phổ

biến ở Bắc Mỹ thì môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4 D và 0,1 mg/l Ki cho hiệu quả tái sinh cũng như khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp lớn sau 12 tuần nuôi cấy (Samuel và cs, 2011 [46]) Phôi soma của Nhân Sâm Bắc Mỹ cũng được hình thành từ lát cắt củ trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l 2,4 D và 1 mg/l Ki Mô sẹo sinh tưởng tốt trên môi trường có bổ sung 1,5 mg/l dicamba Cây in vittro được tạo thành trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l α-NAA và 0,5 mg/l IBA (Wang,

1990 [59]) Mô sẹo Nhân Sâm Bắc Mỹ cũng được hình thành từ các lát cắt củ và lá sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường B5 có chứa 2 mg/l α-NAA, 2,25 mg/l 2,4 D và 2,12 mg/l Ki trong điều kiện tối Sau đấy chúng lại tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4 D Phôi được tạo thành khi cấy chuyển mô sẹo sang môi trường MS có bổ sung 1 mg/l GA3 và 1 mg/l BAP trong điều kiện sáng Phôi trưởng thành (dài 2-3 mm) được cấy chuyển sang môi trường 1/2MS và 0,1 mg/l IBA để sinh trưởng tốt hơn (Dolinski và cs, 2004) [18]

Trên Nhân Sâm Hàn Quốc (Panax ginseng CA Meyer) theo nghiên cứu

đánh giá khả năng cảm ứng mô sẹo trên nền môi trường 1/2MS có bổ sung kinetin, 2 iP, α-NAA và IBA của Choi và cs (2001) [14], thì mô sẹo tạo hình thành và phát triển tốt trên môi trường 1/2MS có bổ sung 2 mg/l α-NAA và 2 mg/l

2 iP Mô sẹo hình thành từ thân, cuống lá, lá và củ Nhân Sâm Hàn Quốc trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/l 2,4 D và 1,5 mg/l BA Bên cạnh đó môi trường MS

có bổ sung 1 mg/l BA và 1,5 mg/l Ki là môi trường tốt nhất cho cảm ứng rễ (Wang,

2008 [60])

Môi trường MS + 1 mg/l 2,4 D + 0,5 mg/l BA; MS +1,5 mg/l 2,4 D + 1,5 mg/l Ki; MS + 0,5 mg/l 2,4 D + 0,5 mg/l α-NAA đã được sử dụng để nghiên cứu khả năng cảm ứng callus trên cây Nhân Sâm Hàn Quốc và Nhân sâm Bắc Mỹ Kết quả cho thấy môi trường MS + 1 mg/l 2,4 D + 0,5 mg/l BA thích hợp cho cảm ứng callus ở cây Nhân Sâm Hàn Quốc còn môi trường MS + 0,5 mg/l 2,4 D + 0,5 mg/l α-NAA thích hợp cho cây Nhâm sâm Bắc Mỹ (www.china-papers.com/?p=70114) Hạt của cây Nhân Sâm Hàn Quốc cũng có thể cảm ứng tạo mô sẹo khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP và 3 mg/l α-NAA (Kim và cs, 2005 [28]) Mô sẹo Nhân Sâm Hàn Quốc cũng được hình thành do sự cảm ứng của rễ củ

2 tuổi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4 D và 0,1 mg/l Ki Mô sẹo được hình thành sau đó được tiếp tục cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung 2 mg/l IBA và 0,1 mg/l Ki, đây là môi trường tốt nhất cho sản xuất ginsenoside trong mô sẹo (Nguyễn thị Hạ Hương, 2011) [3]

2.2.2 Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

¾ Các chủng Agrobacterium rhizogenes và khả năng tạo rễ tơ

Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn đất gram (-) có khả

năng lây nhiễm vào các mô thực vật và dẫn đến sự hình thành của rễ ngẫu được gọi là "rễ tơ" Bộ gen của vi khuẩn có chứa các Ri plasmid (PRI) Trong

PRI, khu vực VIR tập trung 6-8 gen liên quan đến việc chuyển giao DNA

T-DNA có vùng bờ trái và bờ phải (T R-DNA và T L-DNA ) của PRI chính là các trình tự biên, là những khu vực được chuyển giao cho cây Khu vực PRI có

chứa các gen rol A, B, C và D, và các gen có vai trò tăng cường tổng hợp auxin (tms1 và tms2 chỉ đạo tổng hợp của IAA), cytokinin Trong đó, gen rol

A không có vai trò nhiều trong việc cảm ứng rễ tơ trên hầu hết các đối tượng,

mặt khác còn cho kiểu hình bất thường nên gen này không có ứng dụng nhiều

trong thực tế ngoại trừ việc tạo ra gốc rễ lùn Gen rol B có vai trò quan trọng

trong việc cảm ứng tạo rễ tơ, làm tăng khả năng tăng trưởng và phân nhánh

của rễ bằng cách tạo ra auxin Gen rol C thì có ảnh hưởng nhiều tới hình thái

của rễ tạo thành làm tăng khả năng phân nhánh Gen này cũng chính là gen

rol duy nhất hoạt động tác động tới cây thông qua tác động của cytokinin do

chúng tạo ra Nếu có mặt của cả 3 gen rol ABC thì khả năng cảm ứng và tổng

hợp các hợp chất thứ cấp cũng tăng hơn rất nhiều Tuy nhiên do sự tương tác của cả 3 gen nên khả năng biểu hiện và cảm ứng rễ tơ đôi khi không tốt bằng

sự biểu hiện của một mình gen rol A Gen rol D chỉ có rất ít trong các chủng

Agrobacterium rhizogenes và chúng là gen duy nhất không có khả năng cảm

ứng hình thành rễ tơ mà chỉ có tác động hỗ trợ các gen rol khác (Christensen

và cs, 2009) [15]

Hầu hết các nguyên liệu thực vật như lá cây, thân cây, cuống lá, lá mầm hoặc củ đều có thể được sử dụng để tạo ra nguồn rễ tơ chuyển Quá trình lây

nhiễm bởi chủng Agrobacterium rhizogenes đặc trưng bởi bốn bước sau đây:

+ Thực vật bị thương tạo ra các hợp chất phenolic là các chất độc vết thương nhằm làm cứng vết thương, đây cũng chính là chất dẫn dụ vi khuẩn

+ Vi khuẩn xâm nhập vào bên trong tế bào qua các vết thương

+ Hoạt hóa các gen vùng Vir hoạt động

+ Chuyển giao và hội nhập của các DNA vi khuẩn (T-DNA) vào hệ gen thực vật (Zupan và Zambryski, 1997 [72])

Nhiều chủng Agrobacterium rhizogenes hoang dã đã được sử dụng để

tạo nguồn rễ tơ tạo dược liệu, chúng có thể được phân loại theo cách thức

biểu hiện gồm: Chủng Agropine (ví dụ: A4, 15834, 1855, LBA 9402) sản xuất agropine, mannopine và axit agropinic Chủng Mannopine (8196) và chủng Cucumopine chỉ sản xuất ra một sản phẩm tương ứng là mannopine và cucumopine Khi xâm nhập vào mô thực vật chủng Agropine chuyển cả T L-

DNA và T R-DNA vào bộ gen của cây trồng, trong khi các chủng Mannopine và

Cucumopine chỉ chuyển T L-DNA (Petit và cs, 1983 [44]) Việc lựa chọn các chủng vi khuẩn để tạo rễ tơ còn phụ thuộc vào khả năng nhiễm khuẩn của các loài thực vật và độ độc của vi khuẩn đó Ví dụ: sử dụng lây nhiễm các chủng

Agrobacerium lên cây một lá mầm khó khăn hơn trên cây hai lá mầm Chủng Agrobacterium rhizogenes LBA 9402 đã không thành công khi chuyển gen

vào hypervirulent do tính nhạy cảm cao nhưng đã sử dụng thành công trong việc tạo rễ tơ trên Hyoscyamus (Bensadek và cs, 2008)

Bên cạnh việc sử dụng các chủng hoang dã, các chủng vi khuẩn biến đổi gen với trình tự PRI đã được sửa đổi kết hợp với plasmid của

Agrobacterium tumefaciens tạo thành các vector đồng liên hợp hoặc nhị hợp

cũng được sử dụng Các chủng này được cải tiến có chứa promoter mạnh như

CaMV35S và các gen chỉ thị dễ phát hiện như gen GFP (Agrobacterium rhizogenes GFP), gen β-glucuronidase, gen mã hóa hạn chế các enzyme: tryptophan decarboxylase (TDC) và strictosidine synthase (str)

¾ Các điều kiện chuyển gen vào thực vật và khả năng tạo rễ tơ trên các

cây họ Sâm bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Chuyển gen là một hiện tượng ngẫu nhiên nên xác suất rất khác nhau trong các lần chuyển Để quá trình chuyển gen thành công phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như mẫu thực vật, nồng độ vi khuẩn, các chất kháng sinh, chất dẫn dụ vi khuẩn

Thông thường chuyển gen người ta có thể sử dụng tất cả các nguồn vật liệu thực vật nhưng các vật liệu non sẽ cho hiệu quả cao hơn do khả năng cảm ứng tốt hơn và sự xâm nhập của vi khuẩn vào các mẫu non cũng dễ dàng hơn

Như chuyển gen thành công vào phôi soma ở cây Astragalus sinicus L và tái

sinh tạo ra nguồn rễ tơ trên môi trường có bổ sung 7,5-10 mg/l 2,4 D Các

chồi Robinia pseud oacacia L sau khi được bắn gen và cho tái sinh trên môi

trường có bổ sung 10 mg/l α-NAA và 5 mg/l BA cũng đã tạo được nguồn rễ

tơ (Hu và Du, 2006) [25]

Sử dụng các dòng vi khuẩn khác nhau và mật độ khác nhau của chúng cũng ảnh hưởng rất nhiều tới kết quả chuyển gen Trong chuyển gen vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường MS, LB, YM đặc hoặc lỏng lắc ở 28oC sau đó thu sinh khối và đo mật độ vi khuẩn (OD600) trước lây nhiễm Trên cây

Fagopyrum tataricum nguồn rễ tơ đã được tạo thành sau 30 ngày lây nhiễm

bằng chủng Agrobacterium rhizogenes R1000 với mật độ vi khuẩn OD600=

0,5 (Nam và cs, 2011 [39]) Papaver somniferum L., 4-5 tuần sau lây nhiễm với các chủng Agrobacterium rhizogenes 13333, 15834, C58C1, R1000, và

R1200 sẽ tạo ra nguồn rễ tơ với mật độ vi khuẩn OD600= 0,5 khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường LB lỏng và OD600= 1 khi nuôi cấy trên môi trường B5

(Park và cs, 2000 [43]) Chủng Agrobacterium rhizogenes 1855 được nuôi ở

28°C trên YMB trong thời gian từ 24-36 giờ để thu được OD600= 0,4 sử dụng lây nhiễm trên các loại cây ăn quả như hạnh nhân, táo, mận Kết quả sau 3 tuần thì rễ tơ đã bắt đầu xuất hiện (Damiano và Simona, 1998) [17] Các chủng

Agrobacterium rhizogenes R1601, ATCC15834, A4, được nuôi trên YMB sau

24 giờ OD600= 0,2 – 1,5 được dùng lây nhiễm trên lá ngô H99 và sau 2-3 tuần nuôi cấy trên môi trường tái sinh đã tạo ra nguồn rễ tơ (Xu và cs, 2006 [62])

Nhân Sâm là cây thảo lâu năm, có phản ứng rất nghiêm nghặt với điều kiện canh tác Việc trồng chúng trong tự nhiên gặp rất nhiều khó khăn Thông

qua sự lây nhiễm các Agrobacterium rhizogenes để tạo ra nguồn rễ tơ cung

cấp một lượng lớn saponin đã góp phần khắc phục những khó khắn đó Nhiều

chủng Agrobacterium rhizogenes đã được sử dụng thành công để chuyển gen trên cây Nhân Sâm như các chủng Agrobacterium rhizogenes hoang dại TR7,

15834, A4 hay các chủng Agrobacterium rhizogenes đã được cải tạo di truyền

như LBA 9402, KCTC 2703 ( Yu và cs, 2000 [65]; Yang và cs, 2000 [63]; Wang và cs, 2008 [60]) Để tạo ra nguồn rễ tơ chuyển gen phụ thuộc rất nhiều

vào quá trình lây nhiễm Ví dụ chủng Agrobacterium rhizogenes A4 khi lây

nhiễm vào Nhân Sâm Hàn Quốc thì để tăng hiệu quả lây nhiễm trên rễ thì rễ được gây tổn thương cơ học, sau đó cho lây nhiễm với mật độ vi khuẩn OD600 = 0,6 (http://www.rescancer.com/stomach-cancer/9609.html [78]) Rễ

tơ Nhân Sâm cũng được tạo ra bằng cách lây nhiễm chủng Agrobacterium

rhizogenes KCTC 2703 với các lát cắt củ dày 5 mm từ củ Nhân Sâm 6 tuổi

sau khi được khử trùng sạch (Sivakumar và cs, 2005 [50]) Tuy nhiên, chủng

vi khuẩn khác nhau cũng có khả năng cảm ứng khác nhau Khi chuyển gen

vào các phần cuống lá của Panax ginseng bằng vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes ATCC 15834 và MAFF 03-01.724 Kết quả cho thấy các chủng vi

khuẩn khác nhau có khả năng cảm ứng khác nhau và chủng Agrobacterium

rhizogenes ATCC 15834 cho cảm ứng rễ tơ tốt hơn đồng thời khả năng tổng

hợp ginsenosides cũng nhiều hơn (Shu và cs, 1999 [52]) Bên cạnh đó khả

năng cảm ứng rễ tơ của các gen rol cũng rất khác nhau Các gen rol A và rol

B có ảnh hưởng rất nhỏ tới khả năng cảm ứng và tổng hợp các hợp chất thứ

cấp trong khi đó gen rol C lại đóng vai trò quan trọng trong việc tăng tổng

hợp ginsenosides trong rễ tơ Nhân Sâm (Gorpen và cs, 2006) [23]

Quá trình lây nhiễm vi khuẩn tạo ra các hợp chất opines như acetosyringone để làm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào thực vật Chính vì thế trong chuyển gen nhân tạo thì việc sử dụng nồng độ acetosyringone bao nhiêu là rất cần thiết cho việc làm tăng hiệu quả lây nhiễm Nồng độ acetosyringone tối ưu sử dụng để chuyển gen thường thay đổi khác nhau phụ thuộc vào các đối tượng thực vật khác nhau Ví dụ: Đối

với Torenia fournieri, chỉ cần nồng độ acetosyringone thấp (10-30 mM) đã làm tăng cường quá trình chuyển đổi Nhưng đối với Nicotiana

tabacum hoặc Papaver somniferum L thì nồng độ acetosyringone sử dụng khá

cao 50 - 150 mM mới cho hiệu quả (Kumar và cs, 2006 [31]) Theo Ngô Thị Tú Trinh (2011) [2] khi sử dụng chuyển gen trên cây Đinh lăng thì nồng độ acetosyringone thường sử dụng cho lây nhiễm để tạo ra nguồn rễ tơ là 200 µM

Sau quá trình đồng nuôi cấy vi khuẩn thường được loại bỏ bằng kháng sinh sau đó tiếp tục được nuôi trên môi trường chọn lọc có kháng sinh để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Cefotaxime (250-500 mg/l) và Timentin (200-300 mg/l) thường được sử dụng để loại bỏ vi khuẩn Tuy nhiên nồng độ này có sự thay đổi đối với các đối tượng thực vật khác nhau Ví dụ: Trên các loại cây ăn quả như hạnh nhân, táo, lê thì sau khi nuôi cấy trên môi trường

MS chúng được chuyển sang môi trường có chứa cefotaxime 250 mg/l để loại

bỏ hoàn toàn vi khuẩn (Damiano và Simona, 1998) [17] Bốn chủng thuộc

loài Hyoscyamus được loại bỏ vi khuẩn bằng cách rửa trong môi trường có chứa 500 mg/l cefotaxime (Akramian và cs, 2008) [7] Đối với cây Rhodiola

sachalinensis ngoài 500 mg/l cefotaxime thì môi trường rửa khuẩn còn bổ

sung thêm 250 mg/l carbenicilin (Zhou và cs, 2003 [70])

Vi khuẩn tiếp tục được loại bỏ khỏi mẫu trên môi trường chọn lọc Do lượng vi khuẩn trên mẫu đã được rửa qua kháng sinh nên trên môi trường chọn lọc thường có bổ sung kháng sinh với nồng độ thấp Trong thời gian nuôi cấy vi khuẩn sẽ bị ức chế phát triển và mẫu sẽ cảm ứng tạo nguồn rễ tơ Tuy nhiên trên nhiều loại cây khác thì quá trình cảm ứng phải được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung thêm các phytohormone kết hợp với các

yếu tố khác Như Fagopyrum tataricum được cấy chuyển sang môi trường

MS có bổ sung vitamin ( 0,5 mg/l acid nicotinic, 0,5 mg/l pyridoxine HCl, 0,1 mg/l thiamine-HCl, và 2,0 mg/l glycine), 30 g/l sucrose, 500 mg/l cefotaxime,

và 8 g/l agar Rễ tơ đã được quan sát thấy nổi lên từ vết thương trong vòng 2

tuần trong bóng tối ở 25°C (Akramian và cs, 2008) [7] Papaver somniferum

L sau khi lây nhiễm được chuyển sang môi trường B5 có bổ sung 30 g/l

sucrose, 50 mg/l paromomycin, 200 mg/l timentin và 8 g/l phytagar Rễ tơ hình thành trong điều kiện bóng tối ở 25°C sau 4 tuần trên các vết thương (Park và cs, 2000 [43]) Trên cây ngô, rễ tơ hình thành sau 3 tuần cấy chuyển sang môi trường MS + 1,6 mg/l ZT + 0,3 mg/l α-NAA trong điều kiện tối ở

28oC (Xu và cs, 2006 [62])