Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 ở quy mô phòng thí nghiệm

Đặc điểm chủng 0822 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 83... Do tính trầm trọng của bệnh và khả năng bùng phát dịch lớ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

CHƯƠNG TRÌNH KHCN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC.10/11-15

“ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ TIÊN TIẾN

PHỤC VỤ BẢO VỆ CHĂM SÓC SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG”

ThS Vũ Hồng Nga GS TSKH Nguyễn Thu Vân

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

Hà Nội - 2012

1.5 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮCXIN PHÒNG BỆNH

TAY CHÂN MIỆNG EV71

19

1.5.2 Công nghệ sản xuất vắcxin tiềm năng 23

1.6.1 Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắcxin 24

1.7 CHỦNG GIỐNG VIRÚT SỬ DỤNG TRONG

SẢN XUẤT VẮCXIN

29

1.8 QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

VẮCXIN PHÒNG EV71 TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO

30

1.8.1 Quy trình sản xuất vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào 30 1.8.2 Kiểm tra chất lượng vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào 32

2.1 THIẾT LẬP HỆ THỐNG CHỦNG EV71 GIỐNG GỐC

2.1.2.3 Thử nghiệm kiểm tra các virut ngoại lai trên tế bào 40

2.1.4 Kiểm tra chất lượng chủng giống gốc và chủng sản xuất 43

2.1.4.1 Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai trên

động vật thí nghiệm

43

2.1.4.8 Xác định nhận dạng EV71 bằng phương pháp

hiển vi điện tử

56

2.2 QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

VẮCXIN EV71 TRÊN TẾ BÀO VERO

57

2.2.1.3 Cô đặc, bất hoạt, tinh chế virút, pha bán thành phẩm

cuối cùng

59

2.2.2.3 Thử nghiệm kiểm tra hiệu quả bất hoạt trên tế bào 65

2.2.3.2 Phương pháp kiểm tra chất gây sốt 68

3.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG CHỦNG GIỐNG EV71

CHO SẢN XUẤT VẮCXIN

82

3.1.2.1 Tế bào Vero sản xuất chủng EV71 giống gốc

và giống sản xuất

84

3.1.2.2 Kiểm tra tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng EV71

giống gốc và giống sản xuất

3.1.5.2 Hình ảnh chủng EV71 trên kính hiển vi điện tử 88

3.1.5.3 Tính ổn định di truyền của chủng gốc giống (MSV),

chủng giống sản xuất (WSV)

89

3.1.5.4 Kết quả kiểm tra các tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch

chủng giống gốc và chủng giống sản xuất

91

3.1.5.5 Kết quả đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt thí nghiệm 94

3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

VẮCXIN PHÒNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG EV71 Ở QUY

MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

97

3.2.2.2 Xác định liều gây nhiễm và thời gian gian nhân lên thích hợp của EV71 trên tế bào Vero

103

3.2.3.1 Kết quả nuôi cấy EV71 theo thời điểm thay môi trường

duy trì tế bào

105

3.2.3.2 Kết quả nuôi cấy EV71 trên các dạng chai nuôi cấy 107

3.2.7.1 Loại ADN tồn dư 112

3.3 SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN EV71 Ở QUY MÔ

PHÒNG THÍ NGHIỆM

118

3.3.7 Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng và sản xuất

vắcxin thành phẩm

122

3.3.9 Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng cho vắcxin EV71

trên nuôi cấy tế bào Vero

124

3.3.10 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin EV71 trên nuôi cấy

tế bào Vero

125

3.4 ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÍNH SINH MIỄN

DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

126

3.4.1 Tính an toàn của vắcxin EV71 trên động vật thí nghiệm 126

3.4.2 Tính sinh miễn dịch của vắcxin EV71 trên động vật

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATTC Ngân hàng tế bào của Mỹ (American type culture

collection) ADN Axít desoxyribonucleic (Desoxyribonucleic acid)

ARN Axít ribonucleic (Ribonucleic acid)

CPE Hủy hoại tế bào (Cytopathetic Effect)

CT Scan Chụp cắt lớp vi tính (Computed Tomography scan)

ImmunoSorbent Assay) EV71 Virút đường ruột typ 71(Enterovirus 71)

FBS Huyết thanh bê bào thai (Fetal Bovin serum)

GMT Hiệu giá trung bình nhân (Geometric Mean Titer)

MEM Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential

medium) MOI Liều gây nhiễm (Multiplicity of Infection)

MRC5 Dòng tế bào nguyên bào sợi phổi người lưỡng bội (Human

diploid lung fibroblasts)

MSV Chủng virút giống gốc (Master seed virus)

MRI Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic resonance

imaging)

PBS Đệm muối phốt phát (Phosphate-buffered Saline)

PBS-T Đệm muối phốt phát Tween (Phosphate-buffered

Saline-Tween) PCR Phản ứng khuyếch đại gen (Polymerase chain reaction)

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

SDS-PAGE Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis)

TCID50 Liều gây nhiễm 50% tế bào (Tissue Culture Infectious Dose

50) TCYTTG Tổ chức y tế thế giới (WHO)

VABIOTECH Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1

WCB Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank)

WSV Chủng virút giống sản xuất ( Working seed virus)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 Phân bố kiểu gen EV71 trên thế giời từ năm 1997-2010 15 1.3 Thống kê số ca mắc và tử vong do EV71 khu vực Châu

Á từ 1997-2009

16

1.4 Kết quả phân tích các typ virút gây bệnh tay chân

miệng năm 2011 tại Việt Nam

18

1.5 Một số vắcxin EV71 bất hoạt toàn hạt virút dự tuyển

đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng

21

3.1 Đặc điểm chủng 0822 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam

sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71

83

3.2 Tế bào Vero sản xuất chủng EV71 giống gốc và giống

sản xuất

84

3.3 Kết quả kiểm tra vô khuẩn, Mycoplasma trong tế bào

Vero sử dụng cho sản xuất chủng giống gốc và chủng giống sản xuất

3.6 Kết quả kiểm tra vô khuẩn, Mycoplasma trong hỗn dịch

chủng giống gốc và chủng giống sản xuất

91

3.7 Kết quả kiểm tra các tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch

chủng giống gốc và chủng giống sản xuất bằng phương pháp PCR

92

3.8 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên nuôi cấy tế bào 92 3.9 Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột lang thí nghiệm 93 3.10 Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trắng

thí nghiệm

93

3.12 Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/C4 95 3.13 Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/C5 95 3.14 Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/B5 96 3.15 Kết quả nuôi cấy tế bào Vero trong môi trường MEM

với các nồng độ huyết thanh bào thai bê (FBS)

100

3.16 Kết quả gây nhiễm EV71 ở nồng độ virút 1; 0.1; 0.01;

0.001 MOI tại các thời điểm gặt 24; 36; 48; 60h

104

3.17 Kết quả nuôi cấy EV7 theo thời điểm thay môi trường

và không thay môi trường nuôi cấy

3.23 Hàm lượng ADN tế bào Vero tại các điều kiện phản

ứng của enzym khác nhau

3.28 Kết quả thu hoạch và tinh sạch hỗn dịch virút của các

loạt sản xuất thử nghiệm

3.33 Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ

sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào Vero

3.36 Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin EV71 126

1.3 Cấu trúc di truyền virút đường ruột và các sản phẩm 6 1.4 Phân bố số mắc, tử vong do bệnh tay chân miệng năm

2011-2012 theo tháng

18

3.3 Hình ảnh virút đường ruột typ 71 Hỗn hợp miễn dịch

kháng thể đơn dòng kháng VP1-EV71 gắn các hạt vàng bao quanh hạt EV71

89

3.4 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh sạch được

tổng hợp từ cặp mồi đặc hiệu vùng VP1 - EV71

89

3.5 Sự tương đồng về trình tự axít amin của các chủng

EV71 gốc, MSV, WSV và chủng vắcxin

90

3.6 Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng

bệnh tay chân miệng EV71 ở quy mô phòng thí nghiệm

98

3.7 Đồ thị tăng trưởng của tế bào nuôi cấy trong môi trường

MEM 5% FBS và MEM 10% FBS

101

3.8 Hiệu giá virút ở các môi trường DMEM, MEM, LH3E,

M199 ở nhiệt độ nuôi cấy 35°C và 37°C

103

3.9 Xác định hàm lượng ADN tồn dư trong mẫu trước và

sau tinh chế của loạt sản xuất thử nghiệm

113

3.12 Hình ảnh hiển vi điện tử các hạt EV71 sau tinh chế 116

MỞ ĐẦU

Vi rút đường ruột typ 71 (EV71) là một trong những căn nguyên gây ra các vụ dịch tay chân miệng trên toàn thế giới Khác với Coxsakie A16 thường chỉ gây các bệnh cảnh lâm sàng nhẹ của bệnh tay chân miệng như sốt, ban ngoài da, nổi mụn phỏng loét trợt ở miệng, tay, chân, EV71 thường gây thêm các bệnh cảnh về thần kinh cấp tính bao gồm liệt mềm giống với bại liệt, viêm não, viêm màng não vô khuẩn, phù phổi Các bệnh do EV71 gây ra thường để lại các di chứng về thần kinh nghiêm trọng và có tỷ lệ tử vong cao

Những năm gần đây các vụ dịch tay chân miệng nghiêm trọng bùng phát trên quy mô lớn với nhiều trường hợp biến chứng thần kinh và tử vong thường xảy ra tại Việt Nam và các nước trong khu vực châu Á - Thái Bình Dương Số ca mắc và tử vong do EV71 tăng nhanh và diễn biến bệnh ngày càng phức tạp tại Việt Nam đang là vấn đề y tế nổi trội gây ảnh hưởng đến sức khỏe và tổn thất về kinh tế Bệnh xẩy ra quanh năm và lưu hành ở hầu khắp các địa phương trên cả nước Đến nay chưa có thuốc kháng virút hay vắcxin hiệu quả nào được sử dụng để điều trị và phòng bệnh tay chân miệng EV71 Một số các vắcxin EV71 dự tuyển trên thế giới đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng tuy nhiên hiện vẫn chưa vắcxin nào được cấp phép lưu hành, do đó việc phát triển vắcxin EV71 tại Việt Nam được ưu tiên hàng đầu

để có thể giảm giá thành, chủ động trong công tác phòng chống dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Do tính trầm trọng của bệnh và khả năng bùng phát dịch lớn của virút EV71do tính cấp thiết về sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71, chúng tôi tiến hành đề tài với 3 mục tiêu:

1 Xây dựng được hệ thống chủng giống cho sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 tại Việt Nam

2 Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 trên nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm

3 Đánh giá một số đặc tính về mặt an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 trên động vật thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 VIRÚT ĐƯỜNG RUỘT TYP 71

Virút đường ruột typ 71 (EV71) được phát hiện lần đầu tiên tại California, Mỹ vào năm 1969 sau đó được xác định có liên quan đến bệnh tay chân miệng vào năm 1974 Chủng virút được phân lập từ não của một bé trai năm tuổi tử vong do viêm não [1]

Hình 1.1: Hình ảnh virút đường ruột typ 71 dưới kính hiển vi điện tử

1.1.1 Phân loại

Virút đường ruột typ 71 thuộc nhóm vi rút đường ruột typ huyết thanh

A, là thành viên thuộc chi các virút đường ruột, họ Picornaviridae

Họ Picornaviridae được chia thành 12 chi: Enterovirus, Cardiovirus,

Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Koburirus, Teschovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus, Avihepatovirus

Chi Enterovirus bao gồm 10 loài [25]

Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Enterovirus [25]

1 Human enterovirus A Enterovirus A

6 Porcine enterovirus B Enterovirus G

7 Simian enterovirus A Enterovirus H

Enterovirus A bao gồm 22 typ huyết thanh: coxsackievirus A2

(CV-A2), CV-A3, CV-A4, CV-A5, CV-A6, CV-A7, CV-A8, CV-A10, CV-A12,

CV-A14, CV-A16, enterovirus A71 (EV-A71), EV-A76, EV-A89, EV-A90,

EV-A91, EV-114 và simian enteroviruses EV-A92, SV19, SV43, SV46 và A13

1.1.2 Hình thái học

Điển hình của một loại virút Picornaviridae, EV71 là một virút nhỏ không có vỏ ngoài, đường kính khoảng 27 - 28nm, tốc độ lắng 156S , tỉ trọng của virút là 1,33g/cm3

trong CsCl

Cấu trúc đặc trưng của virút trong nhóm này có 20 mặt, tuy nhiên virút

có hình cầu ở độ phóng đại thấp hơn Bao bọc xung quanh ARN là vỏ capsit,

có tác dụng bảo vệ genom chứa mã di truyền

Capsit bao gồm 60 tiểu thể được cấu tạo từ VP1, VP2, VP3 và VP4 (Hình 2) Mỗi protein VP1, VP2, VP3 gồm khoảng 270 axit amin, cấu trúc bậc hai của chuỗi axít amin này sắp xếp theo kiểu bản  8 chuỗi phản song

song với liên kết jelly-roll tạo thành protein bề mặt của virút [18] VP4 chỉ gồm khoảng 70 axit amin và nằm sâu phía trong vỏ capsit [5]

Protein bề mặt VP1, VP2, VP3 quyết định khả năng hấp phụ của virút lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể đặc hiệu [19] Sự liên kết của các protein trên capsit tạo ra hình dạng không gian 3 chiều đặc trưng rất quan trọng cho khả năng sinh miễn dịch

Một protomer gồm có 3 protein VP0, VP1, VP3 được sắp xếp cùng nhau và năm protomer tạo thành một pentamer Mười hai pentamer tạo thành một procapsit Hạt virút lây nhiễm VP0 tách thành VP4 và VP2

Hình 1.2: Cấu trúc virút đường ruột [40]

1.1.3 Axít nucleic và protein của virút

Giống như các virút đường ruột, vật liệu di truyền của EV71 là ARN đơn, dương, bao gồm khoảng 7500 nucleotit không kể đuôi poly A

Hình 1.3: Cấu trúc di truyền virút đường ruột và các sản phẩm

Vùng không mã hóa nằm ở đầu 5’, protein VPg gắn với đầu 5’ bằng liên kết đồng hóa trị Cấu trúc bậc hai của vùng không mã hóa đầu 5’ rất quan trọng tạo thành điểm vào bên trong ribosom (IRES) điều khiển dịch mã polyprotein virút Vùng không mã hóa nằm ở đầu 3’ gắn với chuỗi poly A Vùng mã hóa là khung đọc mở lớn duy nhất chịu trách nhiệm mã hóa

polyprotein virút gồm khoảng hơn 2000 axit amin Polyprotein có thể chia thành 3 vùng (P1, P2, P3); mỗi vùng được phân cắt thành các protein nhỏ hơn (như 1A, 1B, 1C và 1D) Protein capsit VP1 (1D), VP2 (1B), VP3 (1C), (và

có lẽ VP4 , 1A), được vùng P1 mã hóa Các protein không cấu trúc được mã hóa bởi vùng P2 và P3 Các protein này gồm một nucleosit triphosphataza (2C) có hoạt tính helicaza; VPg (3A) có thể giữ vai trò tổng hợp ARN mới; một proteaza đặc hiệu virút (3C); một ARN polymeraza phụ thuộc ARN (3D)

Sự phân giải của lypoprotein được điều khiển hoàn toàn bởi 3C [35]

Lipit

Virút đường ruột typ 71 là loại virút trần không có vỏ lipit Do đó nó không bị tác động bởi trichlorotrifluoroethane, dicholorodifluoromethane, chloroform, cồn, ether 20% [19]

1.1.4 Tính chất hóa học

EV71 cũng như các virút đường ruột ổn định ở 4C và bị bất hoạt ở nhiệt độ trên 56C EV71 tăng tính chịu nhiệt khi có mặt MgCl2 1M Virút có thể giữ ở nhiệt độ từ - 20C; - 80C; nitơ lỏng (-196C) trong nhiều năm và vẫn còn hoạt tính sau khi đông khô ít nhất 1 tháng độ ẩm 42% Do không có

vỏ lipit nên các enterovirus đều ổn định trong môi trường của ký chủ như khi tiếp xúc với dịch axit dạ dày, bền vững với pH 3-10 và virút có thể tồn tại nhiều ngày trong nhiệt độ phòng EV71 và các enterovirus đều được tìm thấy trong nước kể cả nước ngầm và suối nước nóng [11], [22] Các virút đề kháng với các chất hòa tan hữu cơ như ether và chloroform, cồn EV71 bị bất hoạt khi sấy ướt (121C, 20 phút); tia cực tím (197 W/cm2); formalin (tỉ lệ 1:4000) [19] Một nghiên cứu cho thấy EV71 cũng bị tác động bởi chất khử virút [9]

1.1.5 Kháng nguyên

Tính kháng nguyên của EV71 cũng như của virút Polio phụ thuộc vào cấu hình của nó Hạt virút có tính kháng nguyên cao, nhưng nếu hạt virút bị phân tách thì tính kháng nguyên của nó trở nên thấp Tính kháng nguyên trung hòa của polypeptit tạo thành hạt virút cũng thấp Tính kháng nguyên của hạt virút toàn vẹn bằng tính kháng nguyên của một hạt rỗng

Việc cấy truyền liên tục virút qua các môi trường nuôi cấy tế bào có kháng thể đơn dòng trung hòa sẽ tạo ra một virút đột biến kháng lại sự trung hòa này Sự thay thế không đồng nhất trong chuỗi bazơ của gen P1 trong biến

dị kháng trung hòa được gọi là vị trí kháng nguyên trung hòa Các vị trí như vậy đã được tìm thấy ở VP1và VP2 Hai péptit tổng hợp SP55 và SP70 có chứa các axit amin 163-177 và 208-222 nằm trong vùng VP1 được gây miễn dịch trên chuột

đã tạo được kháng thể đơn dòng 22A12 có hoạt tính trung hòa EV71 [19], [26]

1.1.6 Sự nhân lên của EV71

Giống như các virút đường ruột khác, chu trình nhân lên của EV71 cũng tương tự như chu trình nhân lên của virút Polio [15] Sự xâm nhập của virút vào tế bào cảm thụ phụ thuộc vào các thụ thể đặc hiệu Một số thụ thể đặc hiệu của EV71 đã được phát hiện trên tế bào bạch cầu, tế bào hệ tiêu hóa,

hệ hô hấp và tế bào đuôi gai [33], [53], [54], [57]

Khi virút đường ruột gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, một loạt các thay đổi cấu trúc xảy ra trên vỏ capsit của virút và tạo thành một lỗ trên màng tế bào ARN của virút thoát khỏi vỏ capsit xâm nhập vào tế bào chất của tế bào vật chủ Do vật liệu di truyền là ARN đơn dương nên ARN của virút mẹ được dùng trực tiếp làm ARN thông tin để dịch mã thành một tiền polypeptit lớn Sau đó, proteaza 2A và 3C phân cắt tiền polypeptit thành

11 protein cấu trúc và không cấu trúc Các protein này sẽ tham gia vào quá trình sao chép ARN của virút Virút sao chép nhờ emzym ARN- polymeraza

phụ thuộc ARN, emzym này hoạt động không chính xác như polymeraza phụ thuộc ADN và không có khả năng đọc sửa nên có tần số đột biến rất cao Vùng gen VP là yếu tố quan trọng quyết định đặc tính kháng nguyên nên bất

kỳ sự thay đổi nào trên vùng VP1 cũng làm thay đổi độc lực của virút [27], [43]

Quá trình tổng hợp, protein của tế bào vật chủ bị ức chế do tác động của enzym Proteaza 2A trong khi tổng hợp protein của virút vẫn không bị ảnh hưởng Quá trình lắp ghép genom với protein để tạo thành hạt virút mới xảy

ra trong tế bào chất của tế bào Đầu tiên là tạo protomer gồm VP0, VP1 và VP3 Năm protomer tạo thành một pentamer, mười hai pentamer tạo thành một procapsit, chứa 60 protomer ARN kết hợp với vỏ capsit tạo provirion (tiền hạt virút) Khi VP0 phân cắt thành VP2 và VP4 thì provirion trở thành hạt virút hoàn chỉnh Các hạt virút mới phá vỡ tế bào vật chủ và thoát ra ngoài, tiếp tục lây nhiễm vào các tế bào khác

Quá trình dịch mã phụ thuộc vào IRES, phối hợp cùng với vùng không

mã hóa đầu 3’(3’ UTR) kiểm soát chu kỳ nhân lên của virút IRES là yếu tố tác động đến sự hình thành cấu trúc bậc hai và bậc ba của ARN IRES có thể gắn kết trực tiếp các ribosome và đưa vào các vị trí bên trong ARN thông tin, bắt đầu sự dịch mã không cần mũ Việc khôi phục các tiểu đơn vị 40S cũng không cần đến các tiểu đơn vị 4E của yếu tố khởi đầu trong tế bào Eukaryote (eIF4E)

Gần đây, các nhà khoa học chứng minh các protein xuyên màng của người là glyprotein P-selectin ligand-1 (PSGL-1), scavenger receptor class B tuýp 2 (SCARB2) và liên kết polisacarit - axit sialic hoạt động như các thụ thể đặc hiệu cho EV71 Đây là các yếu tố tham gia vào giai đoạn đầu của quá trình nhiễm virút EV71 ở người PSGL-1 là thụ thể đặc hiệu trên tế bào bạch cầu, liên kết với selectin trên lớp nội mạc, gây nhiễm trùng bạch cầu SCARB2 lại là thụ thể của nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm cả các tế bào

thần kinh Nó có thể tham gia trực tiếp và đóng vai trò quan trọng vào quá trình nhiễm EV71 trong não Ngoài ra, các clathrin và dynamin cũng góp phần để SCARB2 hoạt động dễ dàng hơn Nhờ đó, virút gắn vào tế bào vật chủ qua liên kết với các thụ thể trên bề mặt tế bào Sau đó, ARN xâm nhập vào tế bào khi môi trường có tính axit hoặc trung tính Còn liên kết polisacarit

- axit sialic lại là thụ thể đặc hiệu gây nhiễm EV71 trên các tế bào hô hấp hay tiêu hóa Tuy nhiên, sự hiện diện hay vắng mặt của các thụ thể này có liên quan thế nào tới quá trình nhân lên của virút và các đường lây truyền của virút trong cơ thể hoặc có ảnh hưởng gì đến sinh bệnh virút vẫn chưa được nghiên cứu kỹ [39]

1.2 BỆNH TAY CHÂN MIỆNG DO EV71

1.2.1 Đường lây truyền

EV71 xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng hoặc đường hô hấp, từ đó virút nhân lên nhanh chóng trong đường tiêu hóa hoặc đường hô hấp của bệnh nhân Virút có thể tồn tại ở hầu họng bệnh nhân trong vòng 1 tuần Từ đường tiêu hóa hoặc đường hô hấp, virút đi vào máu và đi đến các cơ quan đích như não, tủy sống, da, cơ và gây tổn thương tại đó Virút cũng khu trú vào các mô bạch huyết đường tiêu hóa, các hạch lympho đường hô hấp và từ đó thải ra ngoài theo phân hoặc theo các giọt nhỏ đường hô hấp ra ngoài môi trường Thời gian người bệnh đào thải virút qua phân có thể từ 1 đến 18 tuần

Lây truyền virút theo đường phân - miệng là chủ yếu, qua chính bàn tay người bị nhiễm bẩn Ngoài ra, các nguồn nước bị nhiễm bẩn gây ô nhiễm thức

ăn, nước uống Các loại côn trùng trung gian như ruồi, gián mang virút từ chất thải vào thức ăn đồ uống hoặc đôi khi đường miệng - miệng (người mang virút hôn, mớm thức ăn cho trẻ nhỏ) cũng là nguồn lây truyền bệnh Lây truyền qua các giọt nhỏ do ho, hắt hơi cũng gặp nhưng không phổ biến Hiện chưa có bằng chứng về việc lây truyền virút đường ruột từ động vật sang người [35]

1.2.2 Đặc điểm lâm sàng

Hầu hết các ca mắc tay chân miệng do Coxsakievirus chỉ gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ như sốt, ban ngoài da, nổi mụn phỏng loét trợt ở miệng-tay- chân, diễn biến trong 5 - 7 ngày rồi tự khỏi, tỉ lệ biến chứng nhẹ như bội nhiễm vi khuẩn do gãi vỡ các nốt ban là rất ít Một số báo cáo cho thấy có một số trường hợp tổn thương diễn biến kiểu bán cấp, mạn tính hoặc tái phát

Tuy nhiên, nếu bệnh xảy ra do căn nguyên là EV71 thì thường có tỉ lệ biến chứng nhất định, trong đó có nhiều biến chứng nặng, trầm trọng và có thể gây tử vong Trong vụ dịch ở Sarawark (Malaysia năm 1997) người ta nhận thấy trong số các bệnh nhân tử vong hầu hết đều diễn biến rất nhanh Khởi đầu các bệnh nhân này cũng có các biểu hiện như bệnh nhân tay chân miệng thông thường: sốt nhẹ, loét miệng họng, nổi ban có phỏng nước ở lòng bàn tay, bàn chân, sau một vài ngày đã thấy xuất hiện các biến chứng thần kinh và tim mạch Ngoài ra còn có một số biến chứng khác như: bội nhiễm vi khuẩn ở phổi - phế quản, ở các nốt ban phỏng Các ca hồi phục được qua đợt cấp tính cũng để lại di chứng nhất định về sau [8], [30]

Biến chứng thần kinh của bệnh tay chân miệng do EV71:

- Viêm não do EV71: là một biến chứng trầm trọng có thể dẫn đến tử

vong Viêm não do EV71 có thể hôn mê, co giật, liệt chi Chụp cắt lớp vi tính (CT scan) hoặc cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) não có thể thấy hình ảnh tổn thương Ghi điện não đồ có thể gặp sóng chậm cả

ở vùng trung tâm và vùng đỉnh Các ca ở giai đoạn nặng có xuất hiện vã mồ hôi, rối loạn nhịp thở, nhịp tim, tụt huyết áp… Các bệnh nhân này nếu không được hồi sức tích cực sẽ nhanh chóng dẫn đến

tử vong Khi xét nghiệm giải phẫu bệnh, một số bệnh nhân tử vong

có tình trạng phù não, sung huyết, xâm nhập lympho bào quanh mạch máu và vào tổ chức não, rải rác các ổ thoái hóa, áp xe nhiều ổ nhỏ trong não

- Viêm màng não vô khuẩn: bệnh nhân có hội chứng màng não như

đau đầu, cứng gáy , cũng có thể có hội chứng tăng áp lực nội sọ, ở trẻ nhỏ thóp có thể phồng Chọc dịch não tủy thường thấy dịch não tủy trong, áp lực tăng vừa phải Xét nghiệm dịch não tủy thường có

từ vài đến vài trăm tế bào bạch cầu, glucose ở mức bình thường, protein có thể bình thường hoặc tăng đến 2 - 3g/l, nuôi cấy dịch não tủy không tìm thấy vi khuẩn Biến chứng này thường hồi phục tương đối tốt trong vòng 1 đến 2 tuần

- Chứng thất điều tiểu não: bệnh nhân có thể mất khả năng phối hợp

động tác, có thể khó nói hoặc mất hẳn khả năng nói Chụp MRI có thể thấy tổn thương ở tiểu não

- Viêm tủy cắt ngang: bệnh nhân liệt đồng thời cả hai chi dưới hoặc

tứ chi Khám thần kinh có thể thấy tổn thương thần kinh tương ứng với một mức khoanh tủy nhất định Nếu tổn thương ở đốt tủy cao có thể có rối loạn trầm trọng về hô hấp và tuần hoàn Có thể gây tử vong nếu không được hồi sức tốt Chụp cộng hưởng từ hạt nhân có thể thấy các tổn thương cắt ngang tủy

- Hội chứng liệt mềm kiểu Guillain-Barré: bệnh nhân xuất hiện liệt

mềm ưu thế ở ngọn chi hơn gốc chi, giảm hoặc mất phản xạ gân xương Các khảo sát về điện sinh lý cho thấy có tình trạng mất myelin ở nhiều rễ thần kinh Xét nghiệm dịch não tủy thấy protein tăng khá cao Tình trạng liệt hồi phục chậm, có tình trạng liệt trong nhiều tháng, thường hồi phục tay tốt hơn chân

- Biến chứng tim mạch và hô hấp: các ca có biến chứng tim mạch và

hô hấp thường đi kèm với tổn thương não Các biến chứng tim mạch thường gặp như nhịp tim nhanh, suy tim cấp tính Siêu âm tim thấy

có tình trạng giảm sức bơm tim, có thể diễn biến đến loạn nhịp tim

và tim ngừng đập trong thời gian ngắn Tuy nhiên giải phẫu bệnh

những ca tử vong không thấy tổn thương đáng kể ở cơ tim nên người ta cho rằng các rối loạn chức năng tim mạch có thể do yếu tố thần kinh gây ra Tổn thương phổi thường gặp là tình trạng suy hô hấp, phù phổi cấp tính

- Các biến chứng khác: co giật do sốt cao, nhiễm trùng tại các vết

ban phỏng, bội nhiễm vi khuẩn ở các nơi khác như viêm họng, viêm phổi, phế quản; di chứng chậm phát triển tâm thần - vận động sau viêm não do EV71 [12], [24], [34]

1.3 CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Chẩn đoán bệnh tay chân miệng thường dựa trên các biểu hiện lâm sàng với vị trí đặc trưng của ban (tay, chân, miệng và mông) Cần chẩn đoán phân biệt với nhiễm virút herpes ở miệng Dữ kiện lâm sàng, tuổi và yếu tố dịch tễ thường giúp ích cho chẩn đoán phân biệt giữa hai loại bệnh này

Việc phân lập virút từ các bệnh phẩm phết họng hay dịch của các bọng nước rồi nuôi cấy virút trong tế bào thường sau 2 đến 4 tuần mới có kết quả nên không hữu ích cho chẩn đoán mà chỉ có ý nghĩa chẩn đoán hồi cứu và ý nghĩa dịch tễ học

Để chẩn đoán sớm và chẩn đoán phân biệt nhiễm EV71 với các nhiễm

do virút khác, cần sử dụng xét nghiệm phát hiện kháng thể IgM của EV71 Việc phát hiện kháng thể IgM của EV71 có thể giúp chẩn đoán sớm nhiễm virút EV71 với độ nhạy 90% trong ngày đầu tiên xuất hiện triệu chứng của bệnh và độ nhạy này duy trì đến 4 ngày Sau đó, độ nhạy xét nghiệm IgM của EV71 tăng đến 95% -100% trong khoảng hơn một tháng [44], [47]

Xét nghiệm này tuy chỉ cho một giá trị chẩn đoán ban đầu nhưng rất quan trọng trong việc đưa ra phương hướng điều trị của bệnh Sau đó, muốn xác định chắc chắn nhiễm EV71 cần phân lập virút từ các bệnh phẩm phết họng hay dịch của các bọng nước, thực hiện các xét nghiệm sinh học phân tử như PCR; Real-time PCR hoặc kỹ thuật Microarray [28], [42], [58]

1.4 DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

1.4.1 Kiểu gen và đặc điểm lưu hành chung của EV71

EV71 được chia thành 3 nhóm gen A, B và C dựa vào phân tích trình tự gen VP1 [6], và được phân chia sâu hơn với 11 phân nhóm gen (A, B1-B5, C1-C5) Mỗi nhóm có ít nhất 15% nucleotide khác biệt so với những nhóm khác

- Nhóm A chỉ có duy nhất chủng BrCr phát hiện ở California năm

1970 Mãi đến năm 2008, người ta mới tìm thấy chủng này lưu hành bên ngoài nước Mỹ khi phân lập 22 mẫu bệnh phẩm ở trẻ mắc bệnh tay chân miệng trong vụ dịch ở tỉnh An Huy, miền trung Trung Quốc Phân tích trình

tự gen VP1 cho thấy có rất ít sự khác nhau giữa các mẫu phân lập so với chủng BrCr ở Mỹ chứng tỏ chủng này không có nhiều sự thay đổi, tiến hóa trong suốt 40 năm [56]

- Nhóm B chủ yếu được phát hiện ở Malaysia và Singapore Hai phân nhóm B1 và B2 với các nucleotide khác biệt nhau khoảng 12%, lưu hành trong thập niên 1970 và 1980 Phân nhóm B3 và B4 lưu hành từ năm 1997 ở khu vực châu Á [7] Phân nhóm B5 phát hiện ở Nhật và Sarawak (Malaysia)

và gây dịch ở Brunei, Sarawak, Đài Loan trong năm 2006 Mới đây, phân nhóm B2 đã được tìm thấy ở một số bệnh nhân tại TP Hồ Chí Minh - Việt Nam năm 2011

- Nhóm C được tìm thấy ở vùng Đông Á giữa những năm 1980, sau này phát triển mạnh ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, đặc biệt ở Trung Quốc và Việt Nam Phân nhóm C1 là nguyên nhân gây bệnh ở Sydney vào năm 1986 và C2 gây dịch ở Perth - Australia năm 1999 C3 được phát hiện ở Nhật Bản (1994) và Hàn Quốc (2000) C4 được phát hiện ở Trung Quốc từ năm 2000 sau đó ở Nhật Bản, Việt Nam và Đài Loan Phân nhóm C5 lưu hành ở Việt Nam và Đài Loan [40]

Bảng 1.2: Phân bố kiểu gen EV71 trên thế giời từ năm 1997-2010 [32]

Chữ in đậm là kiểu gen chiếm ưu thế

Các hệ thống giám sát thiết lập tại nhiều quốc gia cho thấy sự tiến hóa của virút tay chân miệng (Bảng 1.2) Ở Sarawak (Malaysia), dịch có chu kỳ 3 năm từ 1997 Các chủng virút phân lập được chủ yếu thuộc nhóm B [36] Hiện tượng tương tự cũng thấy xảy ra ở Fukushima (Nhật bản) từ năm 1984 đến 2003 do 8 phân nhóm từ B1 đến B5 và từ C1 đến C4 gây ra [21] Có lẽ các chu kỳ dịch trùng hợp với số lượng trẻ em mới sinh chưa có tiếp xúc với virút, do đó rất nhạy cảm với dịch tay chân miệng Ở Hà Lan, các virút nhóm

B chiếm ưu thế trước những năm 1986, nhưng từ năm 1987 lại thấy virút nhóm C lưu hành Các phân nhóm B và C gây ra dịch bệnh ở Nhật Bản và Đài Loan trong những khoảng thời gian khác nhau Năm 2008, virút gây bệnh tay chân miệng tại Đài Loan cũng đã từng biến đổi từ phân nhóm C4 sang B5, khiến diễn biến bệnh phức tạp hơn

Trong vài năm gần đây, bệnh tay chân miệng có xu hướng tăng cao tại nhiều nước trên thế giới Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, khu vực

Tây Thái Bình Dương bệnh tay chân miệng vẫn đang tiếp tục được ghi nhận tại Nhật Bản, Đài Loan (Trung Quốc) Ma Cao (Trung Quốc), Trung Quốc, Singapore, Hàn Quốc, Thái Lan, Campuchia… Đồng thời, số ca mắc và tử vong do EV71 cũng tăng và diễn biến bệnh ngày càng phức tạp

Bảng 1.3: Thống kê số ca mắc và tử vong do EV71 khu vực Châu Á từ năm

1997-2009 [32]

* Các quốc gia khác nhau sẽ có những định nghĩa và hệ thống giám sát khác nhau Vì vậy, các dữ liệu chỉ là tương đối

1.4.2 Dịch tễ học bệnh ở Việt Nam

Đầu năm 2003, một số bệnh viện ở TP Hồ Chí Minh tiếp nhận những bệnh nhi có biểu hiện viêm não và tử vong nhanh Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh đã tiến hành xét nghiệm 12 mẫu bệnh phẩm từ các bệnh nhi này Kết quả xác định, những trẻ mắc bệnh với các biểu hiện nổi phỏng nước ở miệng, lòng bàn tay, bàn chân, đầu gối, hay giật mình khi ngủ, biến chứng thần kinh là do bệnh tay chân miệng, mà tác nhân gây bệnh chính là EV71 Đây được xem là những trường hợp mắc EV71 đầu tiên được xác nhận tại Việt Nam

Năm 2005 xảy ra vụ dịch tay chân miệng tại các tỉnh phía Nam với 764 trẻ nhập viện Hầu hết các trường hợp là trẻ dưới 5 tuổi Kết quả nghiên cứu của Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cho thấy, virút gây bệnh phân lập được quanh năm Virút Cosxackie A16 (CVA16) xuất hiện nhiều vào các tháng 3,4

và 5 trong khi EV71 tăng mạnh vào các tháng 10, 11 và 12 42% ca bệnh có căn nguyên là do EV71 và 52% là do CA16, trong số các trường hợp bệnh do EV71 gây ra có 29,5% ca bệnh có biểu hiện lâm sàng trầm trọng, 3 trường hợp tử vong Ở các tỉnh phía Nam có cả 3 phân nhóm C1, C4 và C5 lưu hành;

và virút nhóm C5 gia tăng mạnh vào 6 tháng cuối năm [45]

Năm 2006, có 305 trường hợp được chẩn đoán bệnh liên quan đến thần kinh, trong đó có 36 trường hợp (11%) và 3 trường hợp tử vong (0,01%) có liên quan với EV71 Trong giai đoạn 2007-2009, mỗi năm cũng có đến hàng chục ngàn ca mắc, tỷ lệ tử vong là 0,23%

Tại miền Bắc, một bệnh nhân bị viêm não cấp tính đã được xác định nhiễm EV71/C4 trong năm 2003 Giữa năm 2005 và 2007, EV71/C5 được tìm thấy trong mẫu bệnh phẩm của 7 bệnh nhân bị liệt mềm cấp [48] Theo báo cáo, năm 2008 đã có 55 ca bệnh (1/3 là do virút EV71 gây ra) tại 13 tỉnh

và không có ca tử vong Đa số các trường hợp mắc bệnh cũng là trẻ dưới 5 tuổi [4]

Trong năm 2011, cả nước đã ghi nhận 112.370 trường hợp mắc tay chân miệng tại 63 địa phương, trong đó đã có 169 trường hợp tử vong tại 30 tỉnh, thành phố, tập trung nhiều ở các tỉnh phía Nam Dịch tăng cao trong các tháng 8; 9; 10 Các trường hợp tử vong do tay chân miệng hiện nay chủ yếu

có liên quan đến EV71 (Bảng 1.4)

Bảng 1.4: Kết quả phân tích các typ virút gây bệnh tay chân miệng năm 2011

Trong năm 2012, có 157.654 trường hợp mắc bệnh tay chân miệng ở

63 tỉnh thành trên cả nước với 45 ca tử vong [1]

Hiện nay các vụ dịch tay chân miệng tập trung vào khu vực Châu Á Thái Bình Dương nhưng với sự giao lưu rộng rãi, di chuyển dễ dàng thì các vùng khác đều có nguy cơ mắc bệnh

1.5 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮCXIN PHÒNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG EV71

1.5.1 Các vắcxin EV71 dự tuyển

Bệnh tay chân miệng do virút EV71 gây ra ngày càng bùng phát mạnh

và diễn biến phức tạp tại Việt Nam và nhiều quốc gia trong khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, nhưng đến nay vẫn chưa có được một thuốc kháng virút hay một vắcxin có hiệu quả nào được sử dụng để điều trị và phòng bệnh tay chân miệng EV71 Việc kiểm soát dịch bệnh EV71 muốn đạt được hiệu quả cần có sự cố gắng và hợp tác giữa nhiều quốc gia trên thế giới Phát triển vắcxin được xem là ưu tiên hàng đầu trong chiến lược kiểm soát dịch bệnh

Do dịch bệnh đe dọa chủ yếu trẻ em tại các nước đang phát triển, nên vắcxin phòng EV71 lý tưởng cần có giá thành rẻ, an toàn, dễ sử dụng và dễ được các bậc cha mẹ chấp nhận Tuy nhiên, các nước phát triển (nơi có nguồn lực tiên tiến về nghiên cứu và phát triển vắcxin) lại không xem vắcxin này như một trọng tâm đáng chú ý Hiện nay, một số vắcxin dự tuyển do các nước trong khu vực như Trung Quốc, Đài Loan, Singapore nghiên cứu phát triển đều đã qua các giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng, bắt đầu các nghiên cứu lâm sàng trên người Tuy nhiên hiện chưa có vắcxin nào được cấp phép lưu hành

Thành công từ việc có được vắcxin bại liệt sống giảm độc lực và bất hoạt trong thanh toán bệnh bại liệt và đẩy lùi virút bại biệt cho thấy một tiềm năng trong việc dự phòng EV71 bằng vắcxin Một loạt các vắcxin phòng tay chân miệng EV71 đã được nghiên cứu và phát triển như vắcxin toàn hạt virút bất hoạt nhiệt hoặc formaldehyde; vắcxin tiểu thể dạng virút (virus-like

particles - VLP); protein tái tổ hợp vùng VP1; vắcxin ADN vùng VP1; vắcxin peptide vùng tạo ra kháng thể trung hòa; vector vi khuẩn hay virút biểu hiện VP1 và vắcxin phòng EV71 sống giảm độc lực thích ứng trên tế bào [13], [32]

Vắcxin toàn hạt virút bất hoạt nhiệt hoặc formaldehyde

Vắcxin EV71 toàn hạt virút bất hoạt sản xuất tại Matxcơva áp dụng tương tự quy trình sản xuất vắcxin bại liệt bất hoạt được thử nghiệm ở Bulgaria trong năm 1976 sau khi có vụ dịch EV71 vào năm 1975 Vắcxin này được dung nạp tốt và sinh miễn dịch ở trẻ em 1-4 tuổi Tuy nhiên, do không

có thêm ổ dịch mới, vắcxin không được tiếp tục phát triển và đánh giá hiệu quả lâm sàng, hiệu lực và định lượng kháng nguyên Nghiên cứu so sánh mức

độ bảo vệ của các vắcxin EV71 (toàn hạt virút bất hoạt nhiệt; protein tái tổ hợp E coli - VP1 và ADN vùng VP1) dự tuyển sản xuất từ các công nghệ khác nhau cho thấy qua thử nghiệm thử thách chuột sơ sinh có miễn dịch thụ động từ vắcxin bất hoạt đáp ứng bảo vệ 80% với liều virút thử thách là 2,3x103LD50 Các vắcxin tiểu đơn vị không có hiệu quả bảo vệ với liều thử thách này cho dù cả 3 loại vắcxin trên đều tạo ra kháng thể trung hòa Theo

Wu và cộng sự, vắcxin toàn hạt virút bất hoạt nuôi cấy trong môi trường có và không có huyết thanh, sử dụng công nghệ microcarrier, hấp phụ nhôm đều có tính sinh miễn dịch Một vài nghiên cứu sâu hơn cho thấy vắcxin EV71 bất hoạt sử dụng công nghệ nuôi cấy trên tế bào Vero, ở quy mô lớn có tính sinh miễn dịch cao, kháng thể trung hòa sinh ra khi gây miễn dịch với vắcxin này

có khả năng bảo vệ khỉ và chuột khi được thử thách với virút độc lực Dựa trên những kết quả ban đầu này, các vắcxin EV71 bất hoạt đã được thử nghiệm lâm sàng ở Trung Quốc, Singapore, Đài Loan Các vắcxin này đều là vắcxin toàn hạt virút bất hoạt, nuôi cấy trên các dòng tế bào Vero và KMB-17[32]

Bảng 1.5: Một số vắcxin EV71 bất hoạt toàn hạt virút dự tuyển đang tiến

(Trung Quốc)

Tế bào Vero Virút bất

hoạt

Đang tiến hành giai đoạn 3 Cao đẳng Y khoa Bắc

Kinh (Trung Quốc)

Tế bào

KMB-17

Virút bất hoạt

Đang tiến hành giai đoạn 2 Viện Nghiên cứu Sức

khỏe (Đài Loan)

Tế bào Vero Virút bất

hoạt

Hoàn thành giai đoạn 1

Vắcxin tiểu thể dạng virút (virus-like particles-VLP)

Vắcxin tiểu thể dạng virút (VLP) (VP4, VP2, VP3, và VP1) và vắcxin protein tái tổ hợp vùng VP1 đã được kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch, bảo vệ chống lại virút thử thách ở chuột Đánh giá tính sinh miễn dịch của vắcxin tiểu thể dạng virút (VLP) tinh khiết; vắcxin toàn hạt virút bất hoạt nhiệt và vắcxin tiểu thể dạng virút biến tính đều tạo ra kháng thể trung hòa 90% số chuột ổ được truyền miễn dịch thụ động từ mẹ có khả năng bảo vệ khi thử thách với liều 250 LD50 cho tất cả các loại vắcxin Tuy nhiên, khi liều thử thách nâng lên đến 1000 LD50, tỉ lệ sống sót giảm với nhóm tiêm vắcxin tiểu thể dạng virút biến tính (10/22); vắcxin toàn hạt virút bất hoạt nhiệt (11/19) và tỉ lệ sống sót của nhóm tiêm vắcxin tiểu thể dạng virút VLP tinh khiết ở mức (16/18)

Vắcxin protein tái tổ hợp vùng VP1

Vắcxin protein tái tổ hợp giữa E.coli và vùng VP1 tạo ra IgG đặc hiệu vùng VP1 và các đáp ứng kháng thể trung hòa cũng được nghiên cứu Tuy nhiên, vắcxin protein tái tổ hợp vùng VP1 chỉ có khả năng bảo vệ chuột ổ với liều thử thách là 2,3x102

LD50, thấp hơn so với vắcxin tiểu thể dạng virút Vắcxin protein tái tổ hợp tiểu đơn vị đường ăn uống cũng được thử nghiệm Chuột sau khi ăn cà chua biến đổi gen biểu hiện protein đặc hiệu vùng VP1 phát hiện thấy IgA và IgG trong huyết thanh ở niêm mạc Nghiên cứu này mở

ra hướng sản xuất vắc xin truyền qua đường ăn uống thông qua việc sử dụng các sản phẩm thực phẩm biến đổi gen Vắc xin EV71 đường uống cũng được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện protein vùng VP1 trong sữa của chuột biến đổi gen Chuột sơ sinh uống sữa có chứa protein vùng VP1 có khả năng kháng EV71, không bị các tổn thương ở da hay tê liệt tứ chi Ngoài ra, huyết thanh của chuột uống sữa chứa protein vùng VP1 cũng có phản ứng trung hòa EV71 trong thử nghiệm invitro

Vắcxin ADN vùng VP1

Nghiên cứu vắc xin ADN vùng VP1 cho thấy vắc xin này có khả năng tạo ra IgG đặc hiệu vùng VP1 và kháng thể trung hòa kháng EV71 ở chuột Tuy nhiên, khả năng bảo vệ chuột sơ sinh thấp hơn nhiều so với vắcxin toàn hạt virút bất hoạt Ngoài ra vắcxin protein tái tổ hợp và vắcxin ADN đều có mức biểu hiện kháng nguyên thấp Đây là điểm quan trọng cần khắc phục của

2 loại ứng viên vắcxin này

Vắcxin peptide vùng tạo kháng thể trung hòa

Fooet cùng nhóm nghiên cứu đánh giá miễn dịch của kháng nguyên toàn hạt virút bất hoạt nhiệt và peptide tổng hợp vùng VP1 (15 amino acid) cho thấy peptide tổng hợp vùng VP1 sinh miễn dịch thấp hơn

Vector vi khuẩn hay virút biểu hiện VP1

Sử dụng vector virút khác để biểu hiện EV71 là một tiềm năng cho các phương pháp tiếp cận phát triển vắcxin phòng EV71 Vắc xin tiểu đơn vị VP1 Salmonella-EV71 giảm độc lực cũng cho kết quả bảo vệ Một cách tiếp cận khác: vắcxin tái tổ hợp vỏ capsit của virút gây bệnh ở Newcastle có chứa 1 đoạn EV71 VP1 cũng gây ra đáp ứng kháng thể ở thỏ mặc dù các kháng thể thiếu vị trí quyết định kháng nguyên trung hòa Kể từ khi xác định mục tiêu chính sử dụng vắc xin phòng EV71 là trẻ em thì việc sứ dụng vector vi khuẩn hay virút biểu hiện VP1 được nghiên cứu nhiều hơn vì tăng khả năng an toàn

Vắcxin phòng EV71 sống giảm độc lực

Vắcxin sống giảm độc lực phòng EV71 nhóm A (từ chủng BrCr) đã được nghiên cứu trên khỉ 3/3 khỉ sau khi tiêm vắcxin đã có những đáp ứng miễn dịch, kháng thể trung hòa được chủng EV71 cùng nhóm ở mức cao còn với các chủng EV71 nhóm khác thì thấp hơn (thấp nhất là phân nhóm C2) Tuy nhiên, các nhà khoa học quan sát thấy ở một số khỉ có có triệu chứng thần kinh nhẹ và phân lập được EV71 từ tủy sống, chứng tỏ chủng virút này chưa được giảm độc lực hoàn toàn [23]

1.5.2 Công nghệ sản xuất vắcxin EV71 tiềm năng

Kết quả chung cho thấy các vắcxin toàn hạt vi rút bất hoạt cho tính sinh miễn dịch cao hơn so với vắcxin VP1 tái tổ hợp và vắcxin ADN [32] Đồng thời vắcxin EV71 sống giảm độc lực uống cần có một quy trình giảm độc lực triệt để hơn để đảm bảo tính ổn định của hệ gen trước khi sử dụng cho thử nghiệm lâm sàng, nên dạng vắcxin toàn hạt virút bất hoạt là lựa chọn khả thi nhất trong giai đoạn hiện nay Với việc bảo tồn cấu trúc bậc 3 của protein đối với vắcxin bất hoạt bằng formaldehyde tốt hơn so với phương pháp bất hoạt nhiệt nên vắcxin phòng EV71 bất hoạt bằng formaldehyde được xem là dạng vắcxin dự tuyển tiềm năng đối với việc dự phòng EV71 [23] Hiện toàn bộ các vắcxin dự tuyển đang và sẽ được tiến hành thử nghiệm lâm sàng đều là

các vắcxin toàn hạt virút bất hoạt Vào tháng 5 năm 2011 công ty Sinovac Biotech, Trung Quốc đã công bố kết quả thực địa lâm sàng giai đoạn I của vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 toàn hạt virút bất hoạt cũng đã cho kết quả tốt về tính an toàn và hiệu lực bảo vệ trên người tình nguyện Đầu năm 2012, Công ty phát triển văcxin Inviragen kết hợp với hệ thống y tế thuộc Đại học Quốc gia Singapore cùng Trường Giáo dục y khoa Duke-NUS cũng thông báo cuộc thử nghiệm lâm sàng giai đoạn đầu của vắcxin INV21 phòng EV71 cho kết quả khả quan Vắcxin INV21 đã chứng minh được tính sinh miễn dịch qua thử nghiệm lâm sàng trên đối tượng người lớn INV21 là vắcxin bất hoạt toàn hạt virút, có độ tinh khiết cao, sản xuất từ chủng EV71 độc quyền, sử dụng công nghệ nuôi cấy trên tế bào Vero và có thể tạo ra phản ứng miễn dịch chéo với một số chủng thuộc nhóm gen EV71 lưu hành phổ biến Thử nghiệm lâm sàng trên trẻ em dự kiến sẽ thực hiện vào cuối năm

2012 [16], [31]

Do vậy, việc lựa chọn công nghệ sản xuất văcxin toàn hạt virút bất hoạt bằng formaldehyde là một công nghệ khả thi đảm bảo sớm cho ra đời vắcxin EV71 an toàn và hiệu quả tại Việt Nam Đồng thời, việc lựa chọn công nghệ sản xuất vắcxin EV71 trên tế bào Vero cũng là một định hướng đúng đắn vì hiện nay hầu hết các văc xin EV71 dự tuyển đang được phát triển cũng được sản xuất trên dòng tế bào Vero (Bảng 1.5)

1.6 TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT VẮCXIN

1.6.1 Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắcxin

Tế bào là một trong những nguyên liệu nguồn quan trọng sử dụng trong sản xuất vắcxin và các chế phẩm sinh học, Tiêu chí để lựa chọn dòng tế bào cho sản xuất vắcxin là phải đảm bảo được tính an toàn cho người sử dụng sán phẩm Tế bào lựa chọn để sản xuất vắcxin phải được kiểm tra, đánh giá về các mặt: nguồn gốc của tế bào; các đặc tính của tế bào; chất lượng của tế bào và

hệ thống ngân hàng tế bào giống gốc và giống sản xuất