Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất thuốc viên nang mềm và một số chế phẩm viên nén chứa dược chất kém ổn định - Phụ lục

7 tiêm đông khô alpha - chymotrypsin Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ làm khô đến chất lượng thuốc tiêm đông khô alpha - chymotrypsin 35 Kết quả độ ổn định của thuốc tiêm đông khôalp

1

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ

DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH

SỐ 119/1999/NĐ-CP CỦA CHÍNH PHỦ

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

SẢN XUẤT THUỐC TIÊM BỘT ĐÔNG KHÔ

ALPHA CHYMOTRYPSIN

2

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về alpha – chymotrypsin 2

1.1.1 Nguồn gốc và tính chất 2

1.1.2 Đơn vị tính 2

1.1.3 Các phương pháp định lượng 3

1.1.4 Tác dụng dược lý 4

1.1.5 Chỉ định 4

1.1.6 Dạng thuốc và hàm lượng 4

1.2 Đại cương về phương pháp đông khô và thuốc tiêm bột đông khô alpha – chymotrypsin 4

1.2.1 Phương pháp đông khô 4

1.2.2 Thuốc tiêm đông khô 7

1.3 Độ ổn định và các biện pháp cải thiện độ ổn định của alpha- chymotrypsin 14

1.3.1 Tính chất hòa tan và độ ổn định của enzym 14

1.3.2 Độ ổn định của alpha – chymotrypsin 17

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.2 Phương tiện 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Xây dựng công thức và phương pháp bào chế 21

2.3.2 Kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm 23

3

2.3.3 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm đông khô alpha -

chymotrypsin 5000 đơnvị 25

2.3.4 Đánh giá độ ổn định của chế phẩm 26

2.3.5 Xử lý số liệu 27

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 28

3.1 Định lượng alpha - chymotrypsin trong thuốc tiêm bột đông khô 28

3.2 Xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin 5000 đơnvị 28

3.2.1 Ảnh hưởng của dung môi 28

3.2.2 Ảnh hưởng của tá dược 30

3.2.3 Ảnh hưởng của pH và hệ đệm 33

3.2.4 Ảnh hưởng của bao bì 34

3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ làm khô 35

3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin 5000 đơnvị 36

3.4 Nghiên cứu độ ổn định của thuốc tiêm bột đông khô alpha – chymotrypsin 37

3.5 Triển khai sản xuất thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin tại công ty cổ phần dược phẩmVĩnh Phúc 39

CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 41

4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ tan của alpha – chymotrypsin 41

4.2 Các biện pháp tăng cường độ ổn định của alpha – chymotrypsin trong quá trình pha chế và bảo quản 42

4.3 Nghiên cứu độ ổn định của thuốc tiêm bột đông khô alpha- chymotrypsin 44

4.3.1 Điều kiện bảo quản để theo dõi độ ổn định của chế phẩm 44

43.2 Kết quả dõi độ ổn định của chế phẩm 44

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46

5.1 Kết luận 46

4

5.2 Đề xuất 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 54

5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HP beta cyclodextrin Hydropropyl beta cyclodextrin

ATEE Ester N-acetyl-L-tyrosin ethyl

PLGA (acid poly lactic-co-glycolic)

20

Bảng 2.2

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu thực nghiệm và sản xuất thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin

21

Bảng 3.3

Độ trong và pH của dung dịch alpha- chymotrypsin sử dụng hỗn hợp 2 dung môi (nước cất và tert - butanol)

29

Bảng 3.4 Độ trong và pH của dung dịch alpha -

chymotrypsin sử dụng nước cất làm dung môi 29

Bảng 3.5

Độ trong và pH của dung dịch alpha - chymotrypsin sử dụng dung dịch HCl 0,001N làm dung môi

30

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tá dược tới một số chỉ tiêu chất

lượng thuốc tiêm đông khô alpha - chymotrypsin 31

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược tới chất lượng thuốc

tiêm đông khô alpha - chymotrypsin 32

34

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nút cao su tới chất lượng thuốc 34

7

tiêm đông khô alpha - chymotrypsin

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ làm khô đến chất lượng

thuốc tiêm đông khô alpha - chymotrypsin 35

Kết quả độ ổn định của thuốc tiêm đông khôalpha

- chymotrypsin bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc

37

Bảng 3.14 Kết quả độ ổn định của thuốc tiêm đông khôalpha

- chymotrypsin bảo quản ở điều kiện bình thường 38

Bảng 3.15

Tóm tắt kết quả một số lô thuốc tiêm đông khô alpha - chymotrypsin sản xuất tại công ty cổ phẩn dược phẩm Vĩnh Phúc

40

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế thuốc tiêm bột

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, trên thế giới, phương pháp đông khô đã được sử dụng rộng rãi trong công nghệ dược phẩm để sản xuất các sản phẩm thuốc tiêm, thuốc nhãn khoa có chứa dược chất kém bền, đặc biệt các chất có nguồn gốc protein Các chế phẩm đông khô không chỉ tăng độ ổn định của thuốc mà còn cải thiện tốc độ hòa tan dược chất khi sử dụng Tuy nhiên đây cũng là một phương pháp đặc biệt tiêu tốn thời gian và năng lượng, nhất là khi quy trình không được tối ưu hóa Có lẽ cũng chính bởi vậy, phương pháp này chưa được triển khai rộng rãi trong ngành Dược nước ta Trong khi đó, nhu cầu về các chế phẩm đông khô ngày một tăng và hiện có mặt trên thị trường nước ta hầu hết vẫn là các sản phẩm nhập khẩu, trong đó có thuốc tiêm đông khô Alpha – chymotrypsin Hơn nữa, xét về mặt công nghệ, với bản chất là một enzym, Alpha – chymotrypsin là một mẫu điển hình để áp dụng công nghệ đông khô vào quá trình bào chế

Trên cơ sở đó, Công ty cổ phần Dược phẩm Vĩnh phúc phối hợp với

trường đại học Dược Hà Nội nghiên cứu, thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy

trình công nghệ sản xuất thuốc tiêm bột đông khô Alpha – chymotrypsin ”

nhằm thực hiện các mục tiêu:

1) Xây dựng được công thức và quy trình công nghệ sản xuất thuốc tiêm bột đông khô Alpha – chymotrypsin 5000UI/lọ quy mô công nghiệp 15 000 lọ/lô 2) Xây dựng, thẩm định tiêu chuẩn cơ sở và nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm

2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về alpha - chymotrypsin

1.1.1 Nguồn gốc và tính chất

Alpha - chymotrypsin là một enzym thủy phân protein, cấu tạo từ 241 acid amin, có khối lượng phân tử 21600, cấu trúc gồm 3 mạch polypeptid liên kết nhau bằng các cầu disulfid [3],[8] Alpha - chymotrypsin được điều chế bằng cách hoạt hoá chymotrypsinogen chiết xuất từ tụy bò [2],[34] Đây cũng

là một enzym được chiết xuất thành công từ rất sớm

Alpha - chymotrypsin có chứa ít nhất 5 microkatal (hoặc 1000 đơn vị USP) trong 1 mg, tính theo dạng khô, có dạng bột kết tinh hoặc vô định hình, màu trắng đến trắng ngà, không mùi, tan một phần trong nước (1g/ 30 - 100 ml) Dạng vô định hình thân nước Dung dịch 1% trong nước có pH 3,0 – 5,0 Dạng dung dịch ổn định ở pH 3,0 và hoạt tính tối đa ở khoảng pH 8,0 [34]

Bảo quản ở 20

C - 80C, trong bao bì kín, tránh ánh sáng [34]

Cơ chất in vivo chủ yếu của alpha - chymotrypsin bao gồm tryptophan, tyrosin, phenylalanin và methionin Ngoài ra, alpha - chymotrypin còn xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester in vitro và do vậy có thể sử dụng một số ester như benzoyl - L - tyrosin ethyl, N - acetyl - L - tyrosin ethyl làm cơ chất trong phản ứng định lượng alpha - chymotrypsin [59], [60]

1.1.2 Đơn vị tính

- Microkatal (theo Dược điển Anh và Dược điển châu Âu)

- Đơn vị USP (theo Dược điển Mỹ)

- Các đơn vị khác: đơn vị FIP, đơn vị Armour, đơn vị Denver [2],[34]

1.1.3 Các phương pháp định lượng

Từ năm 1959, Hummel đã đề ra phương pháp định lượng alpha chymotrypsin dựa trên tốc độ phản ứng thuỷ phân ester benzoyl - L - tyrosin ethyl (BTEE)

-BTEE + H2O alpha - chymotrypsin benzoyl - L - tyrosin + ethanol

3

Tốc độ phản ứng trên được đánh giá bằng độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 256 nm Theo đó, 1 đơn vị BTEE thủy phân 1 micromol ester benzoyl -

L - tyrosin ethyl trong 1 phút ở pH 7,8 và nhiệt độ 250C [60]

Ngày nay, theo dược điển Anh, Mỹ, Châu Âu, alpha - chymotrypsin được định lượng bằng cách so sánh tốc độ thuỷ phân ester N - acetyl - L - tyrosin ethyl (ATEE) của mẫu thử với alpha - chymotrypsin chuẩn trong cùng một điều kiện [35]

ATEE + H2O alpha - chymotrypsin N - acetyl - L - tyrosin + ethanol

* Định lượng bằng phương pháp đo quang: Tốc độ thủy phân ester N - acetyl

- L - tyrosin ethyl của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch cơ chất sau những khoảng thời gian xác định [56]

* Định lượng bằng phương pháp phân tích thể tích: Tốc độ thủy phân ester N

- acetyl - L - tyrosin ethyl của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm pH của dung dịch cơ chất sau những khoảng thời gian xác định [53], [54]

và các cấu trúc khác của mắt Dung dịch chứa 150 đơn vị/ ml thường có tác dụng phân huỷ dây chằng treo thuỷ tinh thể trong khoảng 2 phút và dung dịch chứa 75 đơn vị/ ml có tác dụng trong khoảng 4 phút

Alpha - chymotrypsin cũng được sử dụng nhằm giảm viêm và phù mô mềm do áp xe và loét, hoặc do chấn thương, giúp làm lỏng các dịch tiết đường hô hấp trên ở người bệnh hen, viêm phế quản, các bệnh phổi và viêm xoang [2], [34]

4

1.1.5 Chỉ định

- Hỗ trợ trong phẫu thuật đục thuỷ tinh thể để lấy bỏ nhân mắt

- Điều trị phù nề sau chấn thương hoặc sau mổ [2], [34]

1.1.6 Dạng thuốc và hàm lượng

- Bột để pha dung dịch dùng trong nhãn khoa: 300 đơn vị USP

- Bột để pha dung dịch tiêm bắp: 25 microkatal (hoặc 5000 đơn vị USP), 20

microkatal

- Viên nén: 21 microkatal (uống hoặc đặt dưới lưỡi)

- Viên nén phối hợp: alpha - chymotrypsin 14 microkatal và trypsin 5

microkatal [2], [34]

- Trong những năm gần đây, nhằm làm tăng hiệu quả điều trị, người ta đã

nghiên cứu chế tạo vi nang và nano như một chất mang thuốc [58]

1.2 Đại cương về phương pháp đông khô và thuốc tiêm bột đông khô

alpha - chymotrypsin

1.2.1 Phương pháp đông khô

a) Khái niệm

Đông khô là quá trình làm khô chế phẩm ở nhiệt độ thấp, dưới các điều

kiện cho phép để loại trừ nước bằng cách thăng hoa (thay đổi trạng thái từ thể

rắn sang thể hơi) không phải qua thể lỏng [6], [26], [55]

Có thể tóm tắt nguyên lý quá trình nước bị loại bỏ bằng phương pháp

đông khô như sau:

Nước ở thể lỏng hạ nhiệt độ Nước đá hạ áp suất Hơi nước

(đông lạnh) (thăng hoa)

b) Các giai đoạn của quá trình đông khô và vấn đề tối ưu hóa

Quá trình đông khô gồm 3 giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp, làm

khô thứ cấp

5

 Giai đoạn đông lạnh

Đây là giai đoạn đầu tiên của quá trình đông khô Ở giai đoạn này, hầu hết dung môi (điển hình là nước) được tách ra khỏi các chất hoà tan và đóng băng thành đá, còn các chất tan (dược chất và tá dược) trở nên đậm đặc và cuối cùng tạo thành một khối cô đặc trong đó chỉ còn chứa dưới 1% lượng nước có trong dung dịch ban đầu [19], [43]

Tại giai đoạn này, 2 thông số cần quan tâm là mức độ làm lạnh và tốc

độ làm lạnh Mức độ làm lạnh cần đủ lạnh sâu để chuyển toàn bộ dung dịch thành dạng rắn trước khi chuyển qua giai đoạn làm khô sơ cấp Nhưng mức

độ làm lạnh càng sâu, số nhân hình thành tinh thể đá càng nhiều, dẫn đến giảm kích thước tinh thể đá và làm chậm tốc độ thăng hoa nước đá giai đoạn sau Vì vậy chỉ nên làm lạnh sâu ở mức độ vừa phải Đối với tốc độ làm lạnh, nếu chậm sẽ kéo dài thời gian hoạt chất tồn tại ở trạng thái lỏng và dễ dẫn tới tăng phá hủy hoạt chất, nhưng nếu làm lạnh nhanh quá sẽ dẫn tới tình trạng lạnh không đồng đều giữa các lọ cũng như trong 1 lọ Thông thường tốc độ làm lạnh trong khoảng 0,50

C - 10C/ phút [44]

 Giai đoạn làm khô sơ cấp

Đây là giai đoạn nước đá thăng hoa ở điều kiện áp suất buồng đông khô thấp hơn áp suất hơi của đá và nhiệt độ khay sấy tăng lên để cấp nhiệt cho quá trình này Nhờ quá trình này, nước đá được tách khỏi sản phẩm rồi tới buồng ngưng và kết tinh lại trên các đĩa lạnh tại đây [43], [44]

Tốc độ thăng hoa nước đá có thể tính theo công thức sau:

s p

c ice t

m

R R

P P d

6

rệt (tăng khoảng 2 lần khi tăng 50C) Tuy nhiên nhiệt độ sấy luôn phải khống chế ở dưới nhiệt độ phá vỡ cấu trúc sản phẩm Do đó, nên đặt mức nhiệt độ ở mức tối đa của ngưỡng an toàn Bên cạnh đó, thông số áp suất buồng càng thấp, tốc độ thăng hoa càng cao Tuy nhiên, áp suất buồng quá thấp có thể gây

ra một số vấn đề như gây nhiễm vào sản phẩm các thành phần dễ bay hơi của nắp hoặc dầu bơm và cũng làm tăng thêm sự không đồng đều của quá trình truyền nhiệt dẫn đến không đồng đều nhiệt độ giữa các lọ Vì vậy, áp suất buồng càng gần giới hạn tối ưu cho sự đồng đều truyền nhiệt càng tốt (khoảng 0,1- 0,2 Torr) Yếu tố cuối cùng là thời gian làm khô sơ cấp Đây là giai đoạn tốn thời gian nhất của quá trình đông khô nhưng nếu chuyển sang làm khô thứ cấp khi nước đá chưa thăng hoa hết sẽ dẫn đến phá vỡ cấu trúc sản phẩm Vì vậy cần có phương pháp xác định thời điểm kết thúc giai đoạn này Thường dùng một trong các phương pháp như dựa vào nhiệt độ sản phẩm, dựa vào thành phần khí trong buồng đông khô [19], [43], [44], [49]

 Giai đoạn làm khô thứ cấp

Đây là giai đoạn loại bỏ phần nước không đóng băng bằng quá trình phản hấp phụ Mục đích của giai đoạn này là giảm độ ẩm còn lại của sản phẩm tới mức tối ưu, thường dưới 1-2% để đảm bảo độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo quản Trong suốt giai đoạn này, nhiệt độ của giá đỡ và nhiệt độ sản phẩm được tăng lên để tăng tốc độ phản hấp phụ, đạt được độ ẩm còn lại mong muốn

Các sản phẩm dạng vô định hình khó sấy khô hơn các sản phẩm kết tinh, do vậy đòi hỏi nhiệt độ cao hơn và thời gian sấy lâu hơn Giai đoạn này cần dùng nhiệt độ cao hơn nhiều so với giai đoạn làm khô sơ cấp nên với các sản phẩm dạng vô định hình phải hết sức lưu ý đến nhiệt độ chuyển hóa "thủy tinh" Trong thời gian đầu vì độ ẩm còn cao và do vậy nhiệt độ chuyển hóa

"thủy tinh" thấp nên tốc độ gia nhiệt 0,1 - 0,150C/ phút thích hợp với thiết bị đông khô [19], [43], [44], [49]

7

c) Ưu nhược điểm và phạm vi ứng dụng của phương pháp đông khô

Hiện nay, nhiều nhà sản xuất dược phẩm trên thế giới chú ý nghiên cứu công nghệ sản xuất các chế phẩm đông khô dùng theo đường tiêm và nhỏ mắt bởi những ưu điểm nổi bật của dạng bào chế này như:

Quá trình làm khô tiến hành ở nhiệt độ thấp, không qua giai đoạn lỏng trung gian nên có thể hạn chế được quá trình phân huỷ chất

Sản phẩm khô có diện tích bề mặt riêng lớn do đó sẽ nhanh chóng hoà tan trở lại trong dung môi khi sử dụng

Thuốc được phân liều ở dạng dung dịch nên dễ dàng đạt được yêu cầu đồng nhất về hàm lượng dược chất trong từng đơn vị sản phẩm

Dung dịch có thể tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc ngay trước khi đóng

lọ để đông khô do vậy đảm bảo sản phẩm vô khuẩn

Giảm quá trình oxy hoá dược chất vì sản phẩm được làm khô và đóng

lọ trong môi trường chân không hoặc trong dòng khí trơ nên hạn chế sự có mặt của oxy trong quá trình

Do các ưu điểm trên nên phương pháp đông khô được áp dụng với các dược chất dễ bị thuỷ phân [17], dược chất ít tan [36], dược chất nhạy cảm với nhiệt [32], [35], [38] và các thuốc cần dùng trong trường hợp khẩn cấp

Tuy nhiên, phương pháp đông khô có một vài hạn chế như: giá thành tương đối cao (do tiêu tốn nhiều thời gian và năng lượng); độ ổn định của thuốc ở trạng thái rắn thường phụ thuộc vào trạng thái vật lý của sản phẩm (kết tinh hay vô định hình), nếu tạo ra chất rắn vô định hình và dạng này không ổn định thì sẽ không tạo được sản phẩm như mong muốn; một số protein bị phá hủy bởi quá trình đông lạnh hoặc quá trình làm khô [4], [6], [9]

1.2.2 Thuốc tiêm đông khô

a) Khái niệm

8

Thuốc tiêm đông khô là thuốc tiêm ở dạng bột vô khuẩn được pha thành dung dịch hay hỗn dịch ngay trước khi tiêm, được bào chế bằng phương pháp đông khô [4], [6], [9]

b) Thành phần

 Dƣợc chất

Cũng như các dạng thuốc khác, dược chất là thành phần chính trong thuốc tiêm, có tác dụng điều trị hay phòng bệnh Yêu cầu đối với dược chất nói riêng và các thành phần trong thuốc tiêm nói chung là phải có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn của dược điển quy định dùng để pha thuốc tiêm Đồng thời để đảm bảo an toàn và hiệu lực của thuốc, dược chất cũng như chế phẩm thuốc tiêm phải ổn định về vật lý, hóa học và sinh học trong suốt thời hạn sử dụng Tuy vậy, một đặc điểm khá nổi bật của chế phẩm đông khô so với các dạng bào chế khác là các dược chất trong các chế phẩm này thường là dạng kém bền với nhiệt, dễ bị thủy phân hoặc ít tan [44], [55]

 Dung môi

Dung môi chủ yếu dùng để pha thuốc tiêm đông khô là nước cất pha tiêm Tuy nhiên, với các dược chất ít tan hay không ổn định trong môi trường nước, có thể sử dụng một số dung môi đồng tan với nước như ethanol, alcol benzylic, DMSO, tert - butanol [19], [50] Hỗn hợp dung môi tert - butanol

và nước (20:80) thường được dùng để tăng nhanh tốc độ hòa tan trở lại của bột đông khô vì nó tạo ra bề mặt tiếp xúc lớn sau quá trình đông khô, mặt khác tert - butanol còn có tác dụng sát khuẩn do vậy đảm bảo độ vô khuẩn cho thuốc tiêm đông khô [32], [37], [39], [60]

 Các tá dƣợc

Để cải thiện hình thức, độ tan, hiệu quả điều trị, đảm bảo độ ổn định của chế phẩm đông khô (cả về mặt vật lý, hóa học và tác dụng sinh học) trong suốt quá trình bào chế và quá trình bảo quản, thường sử dụng một số tá dược trong thành phần [44]

9

+ Tá dược độn (tạo khối)

Dược chất trong chế phẩm đông khô thường dùng ở mức liều rất nhỏ không tạo được bánh đông khô có hình dạng xác định, vì vậy cần dùng tá dược độn như manitol, glycin, lactose để tạo ra khuôn cho dược chất phân tán [13], [29], [61]

Trong một số trường hợp, tá dược độn còn được lựa chọn sao cho đảm nhiệm được thêm một số vai trò khác như làm tăng nhiệt độ phá vỡ cấu trúc bánh thuốc và do vậy có thể tăng nhiệt độ sấy, rút ngắn chu trình mà vẫn đảm bảo được hình dạng bánh thuốc, giúp ổn định hình thức chế phẩm trong quá trình sấy (ví dụ như: dextran, tinh bột biến tính, gelatin) hoặc tạo ra mạng tinh thể mang dược chất tồn tại ở dạng vô định hình và do vậy sản phẩm vừa có hình thức đẹp, dễ sấy khô và dễ hòa tan trở lại (ví dụ như: manitol, glycin…) [18], [44], [62]

+ Hệ đệm

Hệ đệm được sử dụng để ổn định pH của chế phẩm đông khô Việc lựa chọn hệ đệm trong phương pháp đông khô phải được cân nhắc vì chính các hệ đệm cũng là đối tượng có thể kết tinh trong quá trình đông lạnh và làm thay đổi pH đáng kể Có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách sử dụng hệ đệm với nồng độ thấp, hệ đệm làm thay đổi pH tối thiểu trong giai đoạn đông lạnh như đệm citrat và histidin [19], [40], [44]

10

+ Chất bảo vệ

Trong công thức các chế phẩm đông khô nói chung và đặc biệt là các chế phẩm đông khô protein cần có thêm các chất bảo vệ để duy trì độ ổn định vật lý và hóa học, sinh học của chế phẩm Như trên đã đề cập, hệ đệm và chất diện hoạt cũng đóng vai trò bảo vệ chế phẩm [36], nhưng đặc biệt còn phải kể đến các chất chống oxy hóa, chất ổn định quá trình đông lạnh, làm khô và bảo quản [41], [44], [46]

++ Chất chống oxy hóa

So với các dạng bào chế khác, dạng thuốc đông khô được coi là ít tiếp xúc với oxy bởi quá trình làm khô và đậy nút đều thực hiện trong môi trường chân không hoặc khí trơ Tuy nhiên không thể loại trừ hoàn toàn oxy từ khi còn ở dạng dung dịch (kể cả khi đóng thuốc vào lọ có sục khí trơ) Do vậy vẫn có oxy tồn tại trong dung dịch chất tan vô định hình sau giai đoạn đông lạnh và không thể loại bỏ hoàn toàn trong giai đoạn làm khô Bởi vậy các chất chống oxy hóa như acid ascorbic, L - cystein , chất tạo phức với kim lọai như natri edetat, acid citric, vẫn cần sử dụng trong một số trường hợp [44]

++ Chất ổn định giai đoạn đông lạnh

Nếu sự phá hủy dược chất chỉ xảy ra ở giai đoạn đông lạnh và việc thay đổi các thông số kỹ thuật trong giai đoạn này không giải quyết được vấn đề thì cần phải tìm một chất ổn định giai đoạn đông lạnh thích hợp: nếu do sự kết

tụ, cần sử dụng chất diện hoạt không ion hóa Nếu thay đổi pH do hệ đệm bị kết tinh, ngoài cách giảm nồng độ hệ đệm hoặc thay hệ đệm khác, còn có thể thêm một tá dược (ví dụ saccarose hoặc trehalose) để cản trở sự kết tinh hệ đệm [23] Ngoài ra, một số chất tan, ví dụ như các acid amin, đường đôi, polyol (polyethylen glycol) và một số nhóm chất khác có tác dụng tăng độ ổn định nhiệt động trong quá trình đông lạnh [22], [44], [63]

++ Chất ổn định giai đoạn làm khô

11

Quá trình loại nước ra khỏi chế phẩm dẫn đến làm mất đi các cầu nối hydro giữa protein và nước trong quá trình làm khô Việc sử dụng các chất thay thế nước làm chất ổn định quá trình đông khô sẽ tạo ra tương tác dạng cầu hydro giữa protein và chất thay thế nước, giúp ổn định nhiệt động cấu trúc ban đầu và giữ được hoạt tính protein Các đường đôi, đường ba không khử như saccarose, trehalose, rafinose thường là các chất ổn định giai đoạn làm khô rất tốt [31], [44]

++ Chất ổn định trong quá trình bảo quản

Vấn đề ổn định trong quá trình bảo quản liên quan chủ yếu đến các yếu

tố sau: 1) tối ưu hóa pH và lưu ý đến các ảnh hưởng về hóa học ví dụ phản ứng oxy hóa; 2) tạo được một khối phân tán, trong đó protein và các chất ổn định đều ở pha "thủy tinh", có nhiệt độ chuyển hóa "thủy tinh" cao hơn nhiệt

độ bảo quản; 3) sử dụng công thức sao cho protein duy trì được cấu trúc ban đầu [31], [35], [44]

c) Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm đông khô

Sản phẩm đông khô cần đạt các yêu cầu như: ổn định trong thời gian dài, thời gian hoà tan trở lại ngắn, tồn tại ở dạng bánh, duy trì được những đặc tính ban đầu (các đặc tính của dung dịch, cấu trúc của protein,…) Các yêu cầu về chất lượng đó có đạt được hay không phụ thuộc vào nhiều yếu tố [52]

và nồng độ đậm đặc, nếu xảy ra quá trình kết tinh có thể dẫn tới hậu quả làm nứt vỡ lọ Khi sản phẩm ở dạng vô định hình sau quá trình đông lạnh, nếu

12

tăng nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ phá vỡ cấu trúc sản phẩm sẽ bị chảy

và phá vỡ cấu trúc (bị co lại hoặc mất hẳn cấu trúc hình bánh) [18], [23], [43]

 Đặc điểm của bao bì đóng gói trực tiếp

Các đặc điểm của bao bì như kích thước và hình dạng lọ, các loại nút đóng, chiều cao dung dịch trong lọ,…đều ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm đông khô Nút càng kín, sự tiếp xúc giữa thuốc với môi trường bên ngoài càng hạn chế nên thuốc càng ổn định Sử dụng nút có tráng silicon sẽ giúp đóng nút nhanh hơn và kín hơn so với các nút chưa được xử lý Tốc độ làm khô phụ thuộc vào kích thước lọ và thể tích dung dịch thuốc trong lọ Tốc độ thăng hoa từ dung dịch đông lạnh phụ thuộc vào diện tích lỗ hổng ở miệng lọ cũng như sự cản trở tốc độ lưu thông hơi nước của lớp sản phẩm khô Nếu chiều cao của dung dịch trong lọ lớn và hàm lượng chất rắn cao, sự cản trở việc thoát hơi nước càng lớn [43], [44]

 Các thông số kỹ thuật về nhiệt độ và độ chuyển khối

Nhiệt lượng cần thiết cho sự thăng hoa là 670 calo/g trong sự kết hợp giữa quá trình truyền nhiệt và quá trình chuyển khối Có 3 phương thức truyền nhiệt cơ bản gồm tiếp xúc, đối lưu và bức xạ Trong đó, truyền nhiệt

do tiếp xúc là quan trọng nhất Quá trình truyền nhiệt do tiếp xúc bị cản trở bởi bề dày của đáy lọ, lớp sản phẩm đông lạnh, khay kim loại sử dụng Quá trình này phụ thuộc vào áp suất buồng đông khô nên việc kiểm soát áp suất rất quan trọng để duy trì sự đồng nhất giữa các lô

Độ chuyển khối trong quá trình đông khô chính là lượng nước từ quá trình thăng hoa đi qua những kẽ hở của lớp chất rắn khô, khoảng trống của lọ, khe hở của nút và buồng đông khô tới bộ phận ngưng tụ Sự cản trở của lớp chất rắn khô tăng lên khi độ dày và độ đậm đặc của chất rắn trong lớp này tăng, giai đoạn đông lạnh nhanh hơn cũng có xu hướng tạo ra sức cản lớn hơn trong lớp chất rắn khô [33], [43], [44], [64]

13

 Đặc điểm thiết kế của thiết bị đông khô, khả năng và công suất

Cần lưu ý các thiết bị kiểm tra, kiểm soát nhiệt độ, áp suất và khả năng của bộ phận ngưng tụ, đề phòng hiện tượng quá tải trong quá trình [43], [44]

 Điều kiện bảo quản

Các yếu tố thuộc về điều kiện bảo quản bao gồm độ ẩm còn lại của chế phẩm, thời gian và nhiệt độ bảo quản…

Hàm lượng nước còn lại là một đặc điểm chính của sản phẩm có liên quan tới độ ổn định vật lý và hoá học của chế phẩm đông khô, đặc biệt với các chất rắn vô định hình Các chế phẩm đông khô thường được bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh, nhưng chỉ một thay đổi nhỏ

về độ ẩm có thể gây ra sự thay đổi lớn của nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh và

do đó ảnh hưởng tới nhiệt độ bảo quản Sự thay đổi đó có thể dẫn tới sự không ổn định về trạng thái vật lý như bánh thuốc bị co lại hay bị nát và xúc tiến tốc độ của các phản ứng hoá học, do vậy chế phẩm không ổn định [43], [44]

d) Các sản phẩm đông khô trên thị trường

Hiện nay, tại Việt Nam, nhu cầu về các chế phẩm thuốc đông khô ngày một tăng nhưng hầu như là các chế phẩm nhập từ nước ngoài Trong số các chế phẩm đông khô được nghiên cứu và có mặt trên thị trường thế giới, có thể

kể tới một số nhóm dược chất:

1 Hỗn hợp vitamin Ví dụ: Terneurin H5000, Cernevit

2 Chống viêm phi steroid: Ketoprofen, lornoxicam, tenoxicam, parecoxib

3 Corticosreroid : Methyl prednisolon, hydrocortison natri succinat

4 Thuốc điều trị bệnh ung thư Ví dụ: Zemcitabin, acid zoledronic,idarubicin, methotrexat, carboplatin, oxaliplatin, pamidronat

5 Kháng sinh Ví dụ: natri cefalexin, tobramycin

ưu hóa quá trình đông khô vẫn là nhiệm vụ quan trọng với các nhà nghiên cứu trong quá trình phát triển sản xuất các chế phẩm đông khô Tại Việt Nam, đông khô hiện chủ yếu mới chỉ được triển khai trong công nghệ sản xuất vaccin, quá trình áp dụng đông khô vào công nghệ dược phẩm vẫn còn tương đối mới

1.3 Độ ổn định và các biện pháp cải thiện độ ổn định của alpha- chymotrypsin

1.3.1 Tính chất hòa tan và độ ổn định của enzym

Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn với tính đặc hiệu cao nhờ vào một cấu tạo phân tử tinh

vi và phức tạp [8]

a) Tính chất hòa tan của enzym

Với bản chất protein, enzym trong nước tồn tại dưới dạng keo nhờ vào

2 yếu tố:

15

- Hiện tượng hydrat hóa các tiểu phân: các tiểu phân hút các phân tử nước lưỡng cực hình thành nên một lớp áo nước bao quanh các tiểu phân và ngăn cách chúng

- Các tiểu phân protein (enzym) mang điện tích cùng dấu nên đẩy nhau Khi làm mất 2 yếu tố hòa tan trên (làm mất lớp áo nước và trung hòa điện tích), enzym sẽ tụ lại và gây tủa Có nhiều tác nhân gây tủa protein bao gồm pH của môi trường (đưa về điểm đẳng điện pHi), lực ion, nhiệt độ, dung môi hữu cơ [8]

b) Độ ổn định của enzym

Do cấu tạo protein quyết định hoạt tính xúc tác của enzym nên mọi yếu

tố làm biến đổi cấu trúc protein - gọi là các tác nhân gây biến tính protein, đều gây ức chế hoạt tính enzym [8], [61]

Các tác nhân gây biến tính protein bao gồm:

- Tác nhân hóa học: pH (acid hoặc kiềm mạnh), muối kim loại nặng (Ag+,

Pb2+, Hg+), một số dung môi hữu cơ (alcol, aceton), một số chất tan (ure), chất làm thay đổi sức căng bề mặt pha

- Tác nhân vật lý (nhiệt độ, áp suất, tia UV)

- Tác nhân sinh học (các protease)

Đây chính là điểm cần lưu ý khi tiến hành nghiên cứu với đối tượng là một enzym

* Một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến hoạt tính enzym:

 Nhiệt độ

Trong khoảng từ 00C đến 40 - 500C, nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc

độ phản ứng enzym, nhưng khi tăng đến nhiệt độ tới hạn (thường khoảng 60

-700C) thì các enzym mất hẳn hoạt tính (hình 1.1)

Mỗi enzym có nhiệt độ xúc tác tối ưu riêng, tại đó enzym có hoạt tính cao nhất Tính bền với nhiệt của các enzym cũng rất khác nhau, mỗi enzym có một nhiệt độ tới hạn khác nhau và sự biến tính enzym cũng như protein nói

16

chung bao gồm sự bẻ gãy nhiều loại liên kết như liên kết hydro, liên kết kỵ

nước, [8], [61]

Hình 1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ của một enzym

Do đặc điểm enzym bị biến tính khi nhiệt độ môi trường tăng đến nhiệt

độ tới hạn nên cần luôn khống chế nhiệt độ trong quá trình thực nghiệm với enzym Và đây cũng là một trong những lý do quan trọng nhất để lựa chọn đông khô như một giải pháp tối ưu trong bào chế các chế phẩm enzym

 pH

Enzym rất nhạy cảm với pH môi trường Mỗi enzym có một khoảng giá trị pH thích hợp (hình 1.2) pH có tác dụng quyết định đến trạng thái ion hóa của phân tử enzym, đặc biệt là tại các nhóm hoạt động của enzym và do vậy ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym

Cơ chế ảnh hưởng của pH

còn liên quan đến độ tan của

protein (như đã nói ở trên) và do

đó ảnh hưởng tới hoạt tính cũng

như độ ổn định của enzym [8],

[61]

Chính do đặc điểm này,

trong quá trình thực nghiệm cần

Hình 1.2 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt độ của alpha - chymotrypsin

hết sức lưu ý điều chỉnh pH dung dịch để đảm bảo độ ổn định của enzym

17

 Các ion

Vai trò của các ion kim loại đối với hoạt tính của enzym rất khác nhau:

có khi là chất hoạt hóa (làm tăng tác dụng xúc tác của enzym), cũng có khi là chất ức chế (làm giảm tác dụng xúc tác của enzym) Nhưng nói chung, các ion kim loại nặng như Ag+

, Pb2+, Hg+ có độc tính cao với hầu hết các enzym Do vậy, các ion này cần được loại bỏ hoàn toàn khỏi chế phẩm enzym [8]

1.3.2 Độ ổn định của alpha - chymotrypsin

a) Một số kết quả nghiên cứu về độ ổn định của alpha - chymotrypsin

Alpha - chymotrypsin ổn định nhất ở pH 3,0 Tại pH < 3,0 alpha - chymotrypsin bị chuyển dạng thuận nghịch tương tự dạng tiền enzym Tại pH

> 5,0 phản ứng tự phân huỷ enzym xảy ra mạnh hơn Tại pH >10,0 alpha - chymotrypsin bị biến đổi cấu trúc dẫn đến mất hoạt tính enzym

Ion Ca2+ liên kết với alpha - chymotrypsin có tác dụng ổn định hoạt tính enzym Tại nồng độ 0,10 M, Ca2+

làm giảm mạnh phản ứng tự phân huỷ gây mất hoạt tính của alpha - chymotrypsin ở pH 8,0 Các ion kim loại nặng như Cu2+

, Hg+ và Ag+ ức chế hoạt tính alpha - chymotrypsin

Quá trình lắng tụ của alpha - chymotrypsin phụ thuộc rất lớn vào pH, lực ion và nồng độ Tại pH > 6,5, alpha - chymotrypsin kết tụ tạo thành các tập hợp có khối lượng phân tử lớn [42]

b) Một số công trình nghiên cứu cải thiện độ ổn định của alpha - chymotrypsin

Với bản chất protein, alpha - chymotrypsin dễ bị biến tính và dẫn đến mất hoạt tính bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, lực ion Là một enzym thủy phân protein, alpha - chymotrypsin còn bị phá hủy bởi phản ứng tự phân hủy [24] Đây là một điểm rất cần quan tâm trong vấn đề cải thiện độ ổn định của enzym này

Các kết quả nghiên cứu hoạt tính và độ ổn định của alpha - chymotrypsin trong các môi trường khác nhau cho thấy, alpha - chymotrypsin

18

có thể giữ được hoạt tính và độ ổn định cao trong một số dung môi hữu cơ trong khoảng thời gian dài, đặc biệt trong dung môi hữu cơ khan nước, alpha - chymotrypsin vẫn duy trì được hoạt tính và tăng độ ổn định So sánh thời gian bán hủy cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của yếu tố dung môi tới độ ổn định của alpha - chymotrypsin đối với nhiệt độ [61]:

Như vậy, khi đưa vào dung môi hữu cơ đồng tan với nước (như DMSO) alpha - chymotrypsin khô sẽ hòa tan và bị biến tính, nhưng nếu đưa vào dung môi không đồng tan với nước (như n - octan) thì alpha - chymotrypsin không hòa tan mà phân tán thành dạng hỗn dịch và duy trì được hoạt tính enzym

Năm 2003, J Castellanos và Kai Griebenow (Mỹ) đã nghiên cứu cải thiện độ ổn định của alpha- chymotrypsin bằng cách chế tạo vi nang alpha- chymotrypsin với PLGA (acid poly lactic-co-glycolic) bằng phương pháp thay đổi dung môi [14]

+ Bước 1: đông khô dung dịch (alpha - chymotrypsin + PEG) thu được dạng bột mịn

+ Bước 4: lọc nhũ tương để thu lấy vi nang

Trong quá trình trên, khi tạo nhũ tương (bước 3), nếu tỷ lệ pha dầu thấp, hiệu quả tạo vi nang thấp, đồng thời độ ổn định của alpha - chymotrypsin giảm do tốc độ kết tủa polyme chậm tạo điều kiện cho nước đi vào trong vi nang Nghiên cứu này cũng đã chỉ ra ảnh hưởng của các dung môi khác nhau tới hoạt tính của alpha - chymotrypsin: với các dung môi có khả năng đồng tan với nước (ví dụ methyl ethyl keton và ethyl format), hoạt tính của enzym bị giảm đi rõ rệt sau khi tạo vi nang Ngược lại, khi dùng các dung môi ít đồng tan với nước (ví dụ methylen clorid, butyl acetat), alpha - chymotrypsin vẫn duy trì được hoạt tính sinh học ở mức cao [21]

Ngoài ra, một nhóm các nhà khoa học Mỹ còn nghiên cứu chế tạo phức hợp alpha - chymotrypsin với beta - cyclodextrin gọi là "beta - benzym" có hằng số động học phản ứng tương đương nhưng lại thể hiện vượt trội về độ ổn định với nhiệt độ và pH so với alpha - chymotrypsin [12]

c) Độ ổn định của chế phẩm alpha - chymotrypsin và những lưu ý trong sử dụng

Dung dịch alpha - chymotrypsin dùng trong nhãn khoa phải pha ngay trước khi dùng Sau khi pha, nếu dung dịch alpha - chymotrypsin vẩn đục hoặc có tủa thì không được dùng Tiếp xúc với nhiệt nhiều có thể làm enzym bị hỏng Không được hấp tiệt khuẩn dung dịch alpha - chymotrypsin trước khi đông khô hoặc dung dịch pha lại Bơm tiêm và các dụng cụ không được có ethanol hoặc các chất khử khuẩn vì có thể gây bất hoạt enzym Bảo quản trong bao bì kín, tránh ánh sáng và để ở nơi mát [2], [34]

20

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu thực nghiệm và sản xuất thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin được thể hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm và

sản xuất thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin

9 Acid hydrochloric Trung Quốc Tinh khiết hoá học

12 Acid acetic Trung Quốc Tinh khiết hoá học

14 Lọ thủy tinh, nút cao su, nút nhôm Đức Nhà sản xuất

15 Ester N- acetyl- L- tyrosin ethyl Thuỵ Sỹ Tinh khiết hoá học

21

2.2 Phương tiện

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu thực nghiệm và sản xuất thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin được thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu thực nghiệm và sản

xuất thuốc tiêm bột đông khô alpha - chymotrypsin

5 Hệ thống xử lý nước đầu vào Minh Tâm

6 Máy đo pH Pressica

7 Máy hấp tiệt trùng dụng cụ

8 Máy đông khô

9 Máy liền nút nhôm

10 Đèn soi thuốc

11 Máy pha chế

12 Cân điện tử Shimadzu 2kg

11 Hệ thống cung cấp hơi tinh

12 Hệ thống cung cấp gas, oxy, nitơ

13 Tủ vi khí hậu

14 Máy quang phổ hấp thụ tử ngoại

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng công thức và phương pháp bào chế

- Các yếu tố thuộc về công thức thuốc:

+ Dung môi

+ Tá dược độn

+ Hệ đệm

+ pH dung dịch trước khi đông khô

+ Bao bì đóng gói trực tiếp

- Thông số kỹ thuật quy trình:

- Tóm tắt các bước pha chế thuốc tiêm đông khô được trình bày ở hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế thuốc tiêm bột đông khô

Kiểm nghiệm thành phẩm

b) Phương pháp xác định mất nước do làm khô

Dùng phương pháp Karl - Fischer, sử dụng 0,20 g chế phẩm Phép thử tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình [1]

- Dung dịch cơ chất: Hòa tan 23,7mg N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester (loại dùng cho định lượng men) trong 50ml dung dịch đệm phosphat pH 7,0; đun nóng trong cách thủy khoảng 600C để hòa tan Làm nguội nhanh về nhiệt độ phòng, thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,0 vừa đủ 100ml Bảo quản dung dịch ở 0

C

- Dung dịch thử: Hòa tan hoàn toàn 10 lọ bột đông khô, mỗi lọ hòa tan bằng

2ml HCl 0,0012N, trộn đều Hút 2ml của dung dịch này hòa tan vừa đủ trong 50ml HCl 0,0012N Hút 7 ml của dung dịch này hòa tan vừa đủ trong 25 ml HCl 0,0012N

- Tiến hành thử:

+ Hút chính xác 0,2ml dung dịch thử cào cốc đo dày 1 cm, thêm chính xác 3,0ml dung dịch cơ chất, lắc đều (Ghi chú: phải theo đúng thứ tự như trên, tính thời gian ngay sau khi thêm chất nền) Đo độ hấp thụ sau mỗi 30 giây, tổng cộng thời gian không ít hơn 5 phút ở bước sóng 237nm Mỗi dung dịch tiến hành đo ít nhất 2 lần

25

+ Giá trị của độ hấp thụ không quan trọng bằng tỷ lệ biến thiên không đổi của

độ hấp thụ sau mỗi 30 giây Nếu tỷ lệ này thay đổi (không giữ được tỷ lệ biến thiên hằng định trong ít nhất 3 phút), làm lại thí nghiệm, nếu cần có thể pha lại dung dịch thử có nồng độ thích hợp

+ Để xác định sự thay đổi độ hấp thụ trung bình trong mỗi phút, chỉ cần sử dụng các giá trị nằm trên đường biểu diễn có tỷ lệ biến thiên độ hấp thụ không đổi trong 3 phút, vẽ đường biểu diễn sự biến thiên độ hấp thụ theo thời gian

1 đơn vị P chymotrypsin tạo ra sự biến đổi độ hấp thụ 0,0075 trong

m i ph t v i các điều kiện quy định của phương pháp định lượng này

+ Hàm lượng (%) chymotrypsin trung bình của mẫu thử so với lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức:

T: Thời gian giữa A1 và A2 (phút)

D: Độ pha loãng của mẫu thử

2.3.3 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm đông khô alpha - chymotrypsin 5000 đơn vị

Dự thảo tiêu chuẩn bao gồm các chỉ tiêu về lý học (hình thức, độ trong, mất nước do làm khô), hoá học (pH, định tính, định lượng), vi sinh (nội độc

tố, độ vô khuẩn) của chế phẩm Trong phạm vi thực nghiệm và điều kiện thực

tế, chúng tôi chỉ tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu

- Hình thức:

+ Yêu cầu kỹ thuật: Bột đông khô được đóng trong lọ thuỷ tinh đậy kín bằng nút cao su và có nắp nhôm bên ngoài Bột thuốc màu trắng, kết thành bánh

26

+ Phương pháp thử: Bằng cảm quan

- Mất khối lượng do làm khô:

+ Yêu cầu kỹ thuật: Không được lớn hơn 8%

+ Phương pháp thử: Theo mục 2.3.2 b)

- Độ đồng đều khối lượng bột thuốc trong lọ

+ Yêu cầu kỹ thuật: 10,0% so với khối lượng trung bình bột thuốc trong lọ + Phương pháp thử: Theo DĐVN IV, phụ lục 11.3

- Độ trong của dung dịch pha lại:

+ Yêu cầu kỹ thuật: Dung dịch pha lại phải trong

+ Phương pháp thử: Hoà tan lượng thuốc trong lọ với 1 ml nước cất pha tiêm Thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.8, mục B

Trong tủ vi khí hậu (nhiệt độ 400C 2, độ ẩm 75% 5)

- Điều kiện thường:

Nhiệt độ 300C 2, độ ẩm 75% 5

Sau những khoảng thời gian nhất định, kiểm tra một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm:

27

+ Hình thức: quan sát và so sánh hình thức của bánh thuốc, tốc độ tan và độ trong của dung dịch pha lại

+ Hàm lượng alpha - chymotrypsin

+ Mất khối lượng do làm khô

α = 0,95)

Giá trị trung bình n

x X

n i

n i

Sai số tương đối . .100

.

n X

S t

R sd  

n X

28

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

3.1 Định lượng alpha - chymotrypsin trong thuốc tiêm đông khô bằng phương pháp đo quang cải tiến

Chế phẩm thuốc tiêm bột đông khô alpha chymotrypsin được định lượng theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.2.c) Phương pháp đã được thẩm định và chứng minh là phù hợp với chế phẩm

3.2 Xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô alpha

- chymotrypsin 5000 đơn vị

Để xây dựng công thức và quy trình bào chế, chúng tôi chọn lựa một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm, so sánh và đánh giá sản phẩm tạo thành dựa trên một số chỉ tiêu như: mất nước do làm khô, độ trong và pH của dung dịch pha lại, hàm lượng dược chất

Trong các kết quả trình bày sau đây, chúng tôi ghi ký hiệu một số tá dược như sau:

3.2.1 Ảnh hưởng của dung môi

Alpha - chymotrypsin ít tan trong nước Tuy nhiên, ở dạng dung dịch nước, alpha - chymotrypsin không bền, do vậy chúng tôi đã thử nghiệm sử dụng hỗn hợp dung môi để pha dung dịch trước khi đông khô

29

a) Kết quả sử dụng hỗn hợp 2 dung môi: nước cất và tert - butanol

Tiến hành pha chế dung dịch alpha - chymotrypsin với tá dược theo các CT 1.1, 1.2 bằng hỗn hợp 2 dung môi (nước cất, tert- butanol) Tiến hành đông khô theo phương pháp ghi trong mục 2.3.1 Mỗi mẻ pha chế 50 lọ Kết quả được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Độ trong và pH của dung dịch alpha - chymotrypsin sử dụng hỗn

hợp 2 dung môi (nước cất và tert - butanol)

Tert - butanol (%)

Trư c khi lọc

Sau khi pha lại

Như vậy, dù đã giảm tỷ lệ tert - butanol trong hỗn hợp dung môi nhưng alpha - chymotrypsin không hoà tan hết Do đó, chúng tôi không dùng hệ dung môi này để pha chế thuốc tiêm alpha - chymotrypsin trong những nghiên cứu tiếp theo

b) Kết quả sử dụng nước cất làm dung môi

Tiến hành pha chế dung dịch alpha - chymotrypsin với CT 1.3, 4, 5, 8,

10, 15, sử dụng nước cất làm dung môi và các tá dược khác nhau Tiến hành đông khô theo phương pháp ghi trong mục 2.3.1 Mỗi mẻ pha chế 50 lọ Kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Độ trong và pH của dung dịch alpha - chymotrypsin sử dụng

nước cất làm dung môi

30

Kết quả cho thấy mẫu dung dịch alpha - chymotrypsin sử dụng nước cất làm dung môi pha dung dịch trước khi đông khô có tốc độ tan khác nhau nhưng đều tan tốt và thời gian dung dịch trong ít nhất là15 phút Tuy nhiên, alpha - chymotrypsin ổn định ở pH 3,0, vì vậy chúng tôi thử dùng dung dịch HCl 0,001N làm dung môi hoà tan

c) Kết quả sử dụng dung dịch HCl 0,001N làm dung môi

Tiến hành pha chế dung dịch alpha - chymotrypsin theo CT 1.4, 11, 12,

13, 15.2, 16, 17, sử dụng dung dịch HCl 0,001N làm dung môi, với các tá dược khác nhau Tiến hành đông khô theo phương pháp ghi trong mục 2.3.1 Mỗi mẻ pha chế 50 lọ Kết quả được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Độ trong và pH của dung dịch alpha - chymotrypsin sử dụng

dung dịch HCl 0,001N làm dung môi

3.2.2 Ảnh hưởng của tá dược

Với mục đích bào chế được sản phẩm hình thức bánh thuốc đẹp, dễ hòa tan trở lại trong dung môi và có độ ổn định cao (đảm bảo hàm lượng và độ

31

trong của dung dịch pha lại sau khi đông khô và trong quá trình bảo quản), chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của một số tá dược

a) Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại tá dược

Tiến hành pha chế dung dịch alpha - chymotrypsin theo CT với các tá dược khác nhau Tiến hành đông khô theo phương pháp ghi trong mục 2.3.1 Mỗi mẻ pha chế 50 lọ Kết quả được trình bày ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tá dược tới một số chỉ tiêu chất lượng thuốc tiêm

đông khô alpha - chymotrypsin

Độ trong dung dịch sau khi pha lại

Kết quả trong bảng 3.6 cho thấy:

- Về mặt hình thức, có 2 mẫu bột đông khô đạt yêu cầu: mẫu pha theo CT1.4

và CT16, với tỷ lệ manitol (tá dược số 1) lần lượt là 100% và 80% Điều đó chứng tỏ khả năng tạo khối của tá dược số 1 tốt hơn so với các tá dược khác

- Về độ trong của dung dịch sau khi pha lại, bột đông khô pha theo CT5 cho dung dịch trong với thời gian lâu nhất (kéo dài 30 phút), chứng tỏ tác dụng ổn định protein của tá dược số 3 Tuy nhiên, xét cả độ trong và thời gian ổn định

32

độ trong, bột đông khô pha theo CT11 (sử dụng hỗn hợp tá dược số 1, số 2, số 3) tốt hơn cả, chứng tỏ tác dụng làm tăng độ tan và ổn định protein của hệ tá dược phối hợp trong công thức này Với các CT đông khô còn lại, nói chung không thể hiện ảnh hưởng rõ rệt của tá dược tới độ trong dung dịch sau khi pha lại

- Về hàm lượng, mẫu pha theo các CT đều đạt tiêu chuẩn về hàm lượng, trừ mẫu pha theo CT 5 hàm lượng quá thấp (81,0%) do alpha - chymotrypsin hoà tan không hoàn toàn Điều này càng cho thấy vai trò làm tăng độ tan của tá dược số 2 khi sử dụng đồng thời tá dược số 1 và số 3 trong công thức (CT11)

b) Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược

Từ kết quả sơ bộ lựa chọn tá dược, chúng tôi sử dụng CT8 và CT11 để tiếp tục nghiên cứu thay đổi tỷ lệ tá dược nhằm đạt tới yêu cầu về hình thức bánh thuốc và cải thiện tốt hơn độ trong dung dịch khi pha lại Kết quả được trình bày ở bảng 3.7

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược tới chất lượng thuốc tiêm đông khô

alpha - chymotrypsin

CT

lượng  chy (%)

-Hình thức

Độ trong dung dịch pha lại

Độ ẩm (%)

số 1

(mg)

số 2 (mg)

số 3 (mg)