Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo lai KL2, LK20 và KLT A3 Viện Nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

DANH MỤC ĐĂNG KÝ SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI tỷ 5-7% Xác định được chất khử trùng mẫu, thời gian khử trùng, phương pháp khử trùng mẫu thích hợp đạt tỷ 8,7-13,0% 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi m

BỘ CÔNG THƯƠNG TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ INVITRO BA DÒNG KEO LAI

KL2, KL20 VÀ KLTA3

Thực hiện theo Hợp đồng số 143.12.RD/HĐ-KHCN ngày 29/03/2012

giữa Bộ Công Thương và Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

Mục lục

Mục lục .i

Biểu thông tin ii

Danh mục đăng ký sản phẩm của đề tài .iv

Quyết định Hội đồng nghiệm thu v

Bài phản biện 1 và 2 vi

Danh mục bảng biểu 9

Tóm tắt đề tài 5

Chương 1 Tổng quan tài liệu 11

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 11

1.1.1 Trong nước 11

1.1.2 Ngoài nước 12

1.2 Cơ sở lý thuyết 13

Chương 2 Thực nghiệm 15

2.1 Mục tiêu của đề tài 15

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng 16

2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu xác định ảnh hưởng của mùa vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy…… 17

2.2.2.3 Phương pháp nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu 18 2.2.2.4 Thu thập và xử lý số liệu 19

2.3.Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 20

Chương 3 Kết quả và bình luận 21

1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng 21

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL2 21

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL20 23

3.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với

dòng KLTA3 24

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy 26

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KL2 26

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KL20… 27

3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KLTA3 28

3.3 Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu 29

3.3.1 Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu đối với dòng KL2 29

3.3.2 Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu đối với dòng KL20 30

3.3.3 Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu đối với dòng KLTA3 31

3.3.4 So sánh về hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu giữa các dòng nghiên cứu 32

Chương 4 4.1 Kết luận 33

4.2 Kiến nghị 33

Tài liệu tham khảo 35

I Tiếng việt 35

II Tiếng Anh 35

BIỂU THÔNG TIN

1 Tên đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo

lai KL2, KL20 và KLTA3

2 Mã số :

3 Thời gian thực hiện : 12 tháng

Từ tháng 1 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012

4 Kinh phí : 160.000.000 đồng (Một trăm sáu mươi triệu đồng chẵn)

5 Họ và tên chủ nhiệm đề tài : PHẠM ĐỨC HUY

Học vị : Thạc sĩ

Ch c danh : Phó Tr ng phòng

Điện thoại : 0977.942.884;

Email : duchuyfrc@gmail.com

Địa chỉ cơ quan : xã Phù Ninh – Phù Ninh – Phú Thọ

6 Cơ quan chủ trì : Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

i n tho i : 02103.829.241 ; Fax : 02103.829.384

Email : nlgiay_pnpt@vnn.vn

Địa chỉ cơ quan : xã Phù Ninh – Phù Ninh – Phú Thọ

7 Danh sách những người thực hiện chính

TT Họ và tên Học vị, học hàm

1 Phạm Đức Huy Thạc sĩ Lâm nghiệp Viện NC cây NLG

2 Nguyễn Thanh Bình Cử nhân Sinh học Viện NC cây NLG

3 Nguyễn Thị Thìn Kỹ sư Lâm nghiệp Viện NC cây NLG

4 Phạm Văn Hưng Kỹ sư Lâm nghiệp Viện NC cây NLG

5 Phạm Thị Hạnh Kỹ sư CN sinh học Viện NC cây NLG

7 Mục tiêu của đề tài

- Xác định được kỹ thuật, điều kiện khử trùng mẫu thích hợp đối với giai đoạn tạo chồi nuôi cấy mô invitro cho ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 nhằm đạt tỷ lệ mẫu nảy chồi từ 5-7%

- Xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu

8 Nội dung nghiên cứu chính

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu

- Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh và tạo nguồn vật liệu ban đầu

DANH MỤC ĐĂNG KÝ SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI

tỷ 5-7%

Xác định được chất khử trùng mẫu, thời gian khử trùng, phương pháp khử trùng mẫu thích hợp đạt tỷ 8,7-13,0%

2 Nghiên cứu ảnh hưởng

của tuổi mẫu cấy và

thời vụ cấy mẫu

Xác định được mùa lấy mẫu và tuổi mẫu thích

hợp

Xác định được mùa lấy mẫu thích hợp là vụ hè và tuổi mẫu hiệu quả là 2 tuần tuổi

3 Nghiên cứu xác định

môi trường tái sinh và

tạo nguồn vật liệu

ban đầu

Xác định môi trường tái sinh và tạo nguồn vật liệu ban đầu

Xác đinh được môi trường dinh dưỡng MS cho hệ số nhân chồi từ 1,24 đến 1,32 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu

từ 20% đến 21,2%

4 Tạo bình giống gốc Tạo được 15 bình

giống gốc cho 3 dòng nghiên cứu (mỗi dòng

5 bình)

Đã tạo được 37 bình giống gốc cho 3 dòng nghiên cứu, trong đó:

- Dòng KL2: 10 bình

- Dòng KL20: 16 bình

- Dòng KLTA3: 11 bình

Mở đầu

Hiện nay, gỗ là nguồn nguyên liệu chính phục vụ cho sản xuất của Tổng công ty giấy Việt Nam Nhu cầu nguyên liệu hàng năm của Tổng công ty là khoảng 500.000m3, trong khi đó các công ty lâm nghiệp mới chỉ cung cấp được khoảng 60% nhu cầu trên Thêm vào đó diện tích đất trồng các loài cây nguyên liệu giấy ngày càng bị thu hẹp do nhu cầu trồng các loài cây công nghiệp và nông nghiệp khác Vì vậy việc nghiên cứu nâng cao năng suất và chất lượng rừng ngày càng cấp thiết Trong khi đó nhiều diện tích rừng trồng trong Tổng công ty giấy còn thấp và không đạt yêu cầu, một trong những nguyên nhân chính là giống đưa vào trồng rừng sản xuất có chất lượng không cao Do đó việc tăng năng suất rừng trồng bằng sử dụng nguồn giống có chất lượng là việc làm cần thiết

Trong những năm gần đây, bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã công nhận ba giống keo lai KL2, KL20 và KLTA3 do tập thể cán bộ Trung tâm nghiên cứu cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy chọn tạo là giống tiến bộ kỹ thuật Đây là những giống rất thích hợp cho trồng rừng vùng Trung tâm Bắc Bộ và các vùng có điều kiện sinh thái tương tự Thực tế cho thấy rừng trồng các dòng keo lai nêu trên tại vùng Trung tâm Bắc

Bộ cho năng suất cao, chất lượng rừng đồng đều và ổn định hơn tương đối nhiều

so với các loài khác

Khi đã có giống năng suất cao thì việc nhân nhanh và đưa các giống đã được chọn lọc và trồng rừng sản xuất là vô cùng quan trọng Trong các kỹ thuật nhân giống hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho hiệu qua cao nhất, đặc biệt là chất lượng di truyền của cây giống được đảm bảo và khả năng cung cấp số lượng lớn cây giống ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, ba giống keo lai nêu trên chưa được tiến hành nghiên cứu bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để góp phần nâng cao năng suất và duy trì tính ổn định của rừng trồng thì việc làm chủ công nghệ nuôi cấy mô ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là cần thiết Do vậy cần sớm thực hiện nội

dung nghiên cứu: “Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo lai KL2, KL20

và KLTA3” là cần thiết

Danh mục bảng biểu

Bảng 01 Công thức khử trùng mẫu cấy 17

Bảng 02 Công thức thí nghiệm tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu 18

Bảng 03 Công thức thí nghiệm xác định môi trường tái sinh chồi 19

Bảng 04 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL2 21

Bảng 05 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL20 23

Bảng 06 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KLTA3 25

Bảng 07 Kết quả nghiên cứu thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KL2 27

Bảng 08 Kết quả nghiên cứu thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KL20 28

Bảng 09 Kết quả nghiên cứu thời vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy đối với dòng KLTA3 29

Bảng 10 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng KL2 30

Bảng 11 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng KL20 31

Bảng 12 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng KLTA3 32

Tóm tắt đề tài

Ba giống keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là những giống năng suất cao đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật Nhằm tạo cây giống chất lượng cao của những giống trên vào trồng rừng sản xuất, năm 2012 đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy mô invitro ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3” đã được phê duyệt và thực hiện, đề tài dự kiến thực hiện trong 3 năm từ 2012-2014

Năm 2012, đề tài tiến hành nghiên cứu một số bước của giai đoạn tạo nguồn vật ban đầu gồm: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng mẫu và thời gian khử trùng; Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu và thời vụ cấy mẫu; Nghiên cứu xác định môi tái sinh chồi tạo nguồn vật liệu ban đầu Qua một năm nghiên cứu và tiến hành các thử nghiệm đề tài đã thu được những kết bước đầu và tạo được bình giống gốc của ba dòng nghiên cứu Đây là những kết quả vô cùng ý nghĩa để từng bước hoàn thiện và làm chủ công nghệ nhân giống invitro cho ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

Chương 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu

1.1.1 Trong nước

Cây keo lai tự nhiên đã được phát hiện tại Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Australia, nam Trung Quốc và một số nước khác ở vùng Châu Á - Thái Bình Dương, ở vĩ độ 8 - 22o Bắc, độ cao 5 - 300 m trên mặt biển, nơi có lượng mưa hàng năm 1500 - 2500 mm/năm, nhiệt độ trung bình năm 23 - 27o C, nhiệt độ tối cao trung bình tháng nóng nhất 31 - 34o C, nhiệt độ tối thấp trung bình tháng lạnh nhất 15 - 22o C

Vùng trồng Keo lai thích hợp là các tỉnh từ Bắc Trung Bộ đến Nam Bộ (đặc biệt là các tỉnh Nam Bộ) và Tây Nguyên Keo lai cũng sinh trưởng tốt ở vùng thấp các tỉnh Bắc Bộ Ở những nơi đất tốt và trồng thâm canh có thể đạt năng suất 25- 35 m3/ha/năm

Cây keo lai được xác định là một trong những loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng hiện nay ở Việt Nam (Cẩm nang lâm nghiệp, Chương: Chọn loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng ở Việt Nam, 2004) Hiện nay, có rất nhiều dòng keo lai đã được công nhận giống quốc gia là BV10, BV16, BV32, các dòng được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật là BV5, BV29, BV33, TB6, TB12, KL2, KL20 và KLTA3 Trong đó, có 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 là 3 dòng được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy tuyển chọn và nhân giống đưa vào sản xuất phục vụ trồng rừng

Các dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 được công nhận là giống tiến bộ

kỹ thuật theo Quyết định số 2722 QĐ/BNN-KHCN, ngày 07/09/2004; Quyết định số 1773 QĐ/ BNN-KHCN, ngày 17/07/2005 và Quyết định số 1686 QĐ/BNN-KHCN, ngày 09/06/2006

Kết quả khảo nghiệm ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 (Nguyễn Quang Đức, 2005) cho thấy rừng trồng dòng KLTA3 đạt năng suất trung bình

40 m3/ha/năm (vượt đối chứng keo tai tượng 3.3 lần), rừng trồng dòng KL2 đạt năng suất 38.6 m3/ha/năm (vượt đối chứng 3.2 lần), dòng KL20 đạt năng suất 27

m3/ha/năm (vượt đối chứng 3 lần)[5] Tuy nhiên, hiện nay mới chỉ sản xuất được cây giống 3 dòng keo lai nói trên bằng phương pháp giâm hom, vẫn còn chưa có các nghiên cứu nuôi cấy mô cho 3 dòng trên

Đoàn Thị Thanh Nga và Phạm Thị Kim Thanh (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình nhân chồi cây keo lai Báo cáo cho thấy, chồi mẫu cây keo lai được đưa vào ống nghiệm trong điều kiện xử lý với HgCl2 0.1% trong 15 phút với tỷ lệ đạt 5% Môi trường nhân chồi hữu hiệu là môi trường M7274 bổ sung 3% saccharose, CH500, PVP, 0.3 mg/l IAA, 5 mg/l KT và 0.3 mg/l IBA Môi trường tạo rễ hoàn chỉnh cây keo lai trong ống nghiệm là môi trường ½ M7274 bổ sung 0.7 mg/l IBA

Đoàn Thị Mai và cộng sự (2007) đã nhân thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô cho một số dòng keo lai mới chọn tạo như BV71, BV73 và BV75

Báo cáo cho thấy (i) điều kiện khử trùng mẫu hữu hiệu là HgCl2 0.1% trong 8

phút với tỷ lệ đạt khoảng 10%, (ii) môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường

MS cải tiến bổ sung BAP 1.5 mg/l và NAA 0.5 mg/l, (iii) môi trường ra rễ thích

hợp là ½ MS cải tiến bổ sung IBA 1.5 mg/l

Ngoài ra, hiện nay cây keo lai mầm mô các dòng BV10, BV16, BV32 đã được ứng dụng nhân giống và sản xuất thành công tại nhiều cơ sở trong nước

như Trung tâm Ứng dụng khoa học và sản xuất lâm - nông nghiệp Quảng Ninh,

công ty TNHH Nguyên Hạnh ở Bình Định (quy mô 4 triệu cây/năm), Trung tâm Ứng dụng - chuyển giao công nghệ Phú Yên

Cây keo lai nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô có những ưu điểm như các cây con đồng nhất về mặt di truyền, mang đầy đủ những ưu thế lai của cây mẹ, hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất, trong 1m2nền có thể để được 18,000 cây Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh nên đảm bảo các cây giống sạch bệnh Cây keo lai cấy mô sau khi trồng có tốc độ sinh trưởng nhanh và đồng đều, thân lên thẳng, ít phân nhánh, không chẻ thân, có rễ cọc chắc chắn, thân không giòn, chịu được gió mạnh, ít đổ ngã nên có thể trồng thành cây lâu năm lấy gỗ, nâng cao giá trị kinh

tế Cây Keo lai cấy mô khắc phục được những nhược điểm của Keo lai hom như

dễ đổ (cây mô có dễ cọc), mục ruột (cây mô khử trùng không có mầm bệnh)

có tính trung gian giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm Lá (giả) đơn, mọc cách 3 -

4 gân song song xuất phát từ gốc lá Hoa tự bông đuôi sóc nhỏ, màu trắng vàng Quả đậu, mặt cắt ngang hình bầu dục Quả chín tự khai Hạt đen, hình elip, dài 4

- 5 mm, rộng 2.5 - 3.5 mm Sinh trưởng nhanh hơn Keo tai tượng và Keo lá tràm Gỗ giác màu xám trắng, gỗ lõi màu nâu nhạt, tỷ trọng gỗ khô tự nhiên 0.56

- 0.63, tỷ trọng gỗ khô kiệt 0.48 - 0.54, hiệu suất bột giấy 0.49 - 0.52 Gỗ keo lai rất thích hợp để làm giấy, làm ván dăm và ván MDF, có thể làm gỗ xẻ và đồ mộc Rễ có nhiều nốt sần rất thích hợp để cải tạo đất, hoa dùng để nuôi ong

Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi nhân

giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in

vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây đang được dùng phổ biến để nhân

giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp Các bộ phận được dùng để nuôi cấy

có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) v.v Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng

Hiện nay, đã có rất nhiều các loài cây lâm nghiệp được nhân giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào như các loài Acacia, các loài

Eucalyptus, Trong đó, cây keo lai Acacia hybrid là một trong những đối

tượng chính, được nhân giống thành công ở nhiều nước như Malaysia, Ấn Độ

R.Yasodha (2004) đã nghiên cứu tái sinh cây keo lai bằng phương pháp

nuôi cấy mô tế bào cho kết quả (i) sử dụng chất khử trùng HgCl2, (ii) mùa tốt nhất để vào mẫu là tháng 5 và tháng 8, (iii) sử dụng môi trường MS bổ sung

IBA 3.0-5.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 3.0 mg/l là tốt nhất với dòng No.10; sử dụng môi trường MS bổ sung IBA 2.0-4.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 2.0 - 3.0 mg/l là tốt nhất với dòng No.32

S Mohan Jain, Katsuaki Ishii (2003) tổng hợp các kết quả nghiên cứu

nuôi cấy mô các loài keo trong cuốn “Micropropagation of woody trees and

fruits” Trong đó có dẫn, keo lai A mangium x A auriculiformis được nhân tạo

chồi thành công từ chồi nách cây mẹ 1 tháng tuổi trên môi trường MS bổ sung 2.22 µM BA sau 30-60 ngày, ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh trên môi trường Seradix 3 bổ sung 0.8% IBA Những dòng được dẫn về từ cây trưởng thành có thể được nhân giống thành công trên môi trường MS bổ sung 4.4 µM BA sau 30

- 60 ngày, ra rễ và tạo cây con hoàn chỉnh trên môi trường Seradix 3 bổ sung 0.8% IBA [Darus, 1991]

Christine Le Roux et al (2009) đã lựa chọn chồi nách từ cây mẹ 1.5 năm

tuổi, các chồi được khử trùng và vào mẫu thành công Đầu tiên tác giả sử dụng Tween 20 để rửa mẫu, khử trùng trong cồn 700 trong 30s để khử trùng bề mặt Sau đó tiến hành khử trùng sâu với HgCl2 0.1% trong 1-2 phút Các chồi in vitro

được ra rễ thành công trên môi trường MS giảm ½ nồng độ muối đa lượng, bổ sung với 0.1 mM NaFe-EDTA, 1.03 µM NAA và 58.4 µM succharose, pH của môi trường được điều chỉnh ở mức 5.7 và môi trường được ổn định bằng Phytagel 0.3% Điều kiện vật lý trong quá trình nuôi cấy là 280C, 16h chiếu sáng

ở cường độ 60 µmol.m2.s1

1.2 Cơ sở lý thuyết

Nguyên lý cơ bản của nhân giống in vitro là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom) Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất

là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó

có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau Các

mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định là nhờ vào sự phân hoá

Phân hoá tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hoá có thể biểu diễn như sau:

Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hóa, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một

số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong AND của tế bào

Chương 2 Thực nghiệm 2.1 Mục tiêu của đề tài

Ứng dụng quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô invitro để nhân nhanh và tạo thành công cây mầm mô 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 gồm:

- Xác định môi trường dinh dưỡng và điều kiện vật lý thích hợp cho nhân

giống in vitro 3 dòng keo lai nói trên

- Tạo cây mầm mô keo lai 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 chất lượng cao phục vụ trồng 2-3ha mô hình

- Xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro 3 dòng nghiên

cứu

- Xác định được kỹ thuật , điều kiện khử trùng mẫu thích hợp đối với giai đoạn tạo chồi nuôi cấy mô invitro cho 3 dòng keo lại KL2, KL20 và KLTA3 nhằm đạt tỷ lệ mẫu nảy chồi từ 5-7%

- Xác định được môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

Nhằm đạt được mục tiêu chung của đề tài, các nội dung nghiên cứu dự kiến được thực hiện trong 3 năm từ 2012 đến 2014 như sau:

1) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu đối với

ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

2) Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu cho ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

3) Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh và tạo nguồn vật liệu ban đầu cho

ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

1) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hóa học đến nhân nhanh 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

2) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường vật lý đến nhân nhanh chồi 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

3) Nghiên cứu xác định môi trường tạo rễ 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

4) Xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy mô cho 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng

Chồi mẫu keo lai được sử dụng là chồi nách và chồi đỉnh của cây mẹ được trồng tại vườn cấp dòng của đề tài Chồi mẫu có kích thước dài 3-5cm, đường kính 1-3mm, có từ 2 nách lá trở lên Mẫu được cắt vào buổi sáng khi không còn sương (hay nước) đọng trên lá (khoảng 8h-9h sáng) và để hạn chế sự

nhiễm khuẩn khi đưa mẫu vào in vitro thì trước khi cắt mẫu trời phải nắng ráo từ

2 ngày trở lên Mẫu sau khi cắt được đựng trong cốc nước cất

Thí nghiệm nghiên cứu mẫu cấy từ 25-30 ngày tuổi Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 4/2012 đến tháng 10/2012

Chồi được khử trùng bề mặt theo phương pháp khử trùng:

- Rửa nhiều lần qua nước sạch, rửa bằng xà phòng và nước cất;

- Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng và tiến hành thao tác khử trùng, cấy mẫu;

+ Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 trong 1 phút Sau đó, rửa lại bằng nước cất khử trùng 3-4 lần

+ Khử trùng sâu bằng một trong các công thức: i) HgCl2 0.1% hoặc ii)

HgCl2 0.5% trong các khoảng thời gian khác nhau 2 phút, 5 phút, 8 phút và 10 phút Sau đó, rửa lại bằng nước cất khử trùng 5-6 lần

+ Cấy mẫu chồi vào ống nghiệm, 1 chồi/1 ống nghiệm

- Các chồi sau khi được đưa vào trong ống nghiệm được bảo quản lạnh ở

40C trong 24-48h nhằm mục đích giảm hoạt động trao đổi chất (giảm shock đối với chồi mới được xử lý), tăng khả năng sống và tái sinh của chồi, giảm tỷ lệ nhiễm Sau đó, các chồi được chuyển sang chăm sóc ở điều kiện 27±20C, độ ẩm 50±5%, cường độ ánh sáng 0-500lux

Mỗi ống nghiệm chứa 10-15ml môi trường dinh dưỡng cơ bản là môi trường Murashige & Skoog (MS) có bổ sung các chất vitamin, 3% sacrose và 5.0g/l Agar Agar (Hải Long) bổ sung 0.5 mg/l hoocmon BAP để tăng khả năng tái sinh chồi Môi trường được khử trùng tại 1210C, áp suất 1.4atm trong 20 phút Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 5.8-6.0

Bố trí thí nghiệm theo dạng 2 nhân tố, khối ngẫu nhiên đầy đủ (bao gồm

18 công thức thí nghiệm) Mỗi công thức thí nghiệm bao gồm 50 mẫu/1 lần lặp

và được lặp lại ít nhất 3 lần

Bảng 01 Công thức khử trùng mẫu cấy

Ký hiệu công thức thí nghiệm

2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu xác định ảnh hưởng của mùa vụ cấy mẫu và tuổi mẫu cấy

Chồi mẫu keo lai được sử dụng là chồi nách và chồi đỉnh của cây mẹ được trồng tại vườn cấp dòng của đề tài Chồi mẫu có kích thước dài 3-5cm, đường kính 1-3mm, có từ 2 nách lá trở lên Mẫu được cắt vào buổi sáng khi không còn sương (hay nước) đọng trên lá (khoảng 8h-9h sáng) và để hạn chế sự

nhiễm khuẩn khi đưa mẫu vào in vitro thì trước khi cắt mẫu trời phải nắng ráo từ

2 ngày trở lên Mẫu sau khi cắt được đựng trong cốc nước cất

Thí nghiệm nghiên cứu mẫu cấy ở các tuần tuổi 2, 3 và 4 tuổi Thời vụ cấy mẫu được được chia làm 2 vụ bao gồm: Vụ hè (từ tháng 4 đến tháng 7/2012)

và vụ thu (từ tháng 8 đến tháng 10 năm 2012)

Chồi được khử trùng như sau:

• Khử trùng bề mặt

- Rửa nhiều lần qua nước sạch, rửa bằng xà phòng và nước cất;

- Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng và tiến hành thao tác khử trùng, cấy mẫu;

- Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 trong 1 phút Sau đó, rửa lại bằng nước cất khử trùng 3-4 lần

• Khử trùng sâu bằng HgCl2 cho từng dòng với các nồng độ như sau:

- Dòng KL2: HgCl2 0,5% trong 8 phút

- Dòng KL20: HgCl2 0,5% trong 5 phút

- Dòng KLTA3: HgCl2 0,1% trong 10 phút

Sau đó, rửa lại bằng nước cất khử trùng 5-6 lần

+ Cấy mẫu chồi vào ống nghiệm, 1 chồi/1 ống nghiệm

- Các chồi sau khi được đưa vào trong ống nghiệm được bảo quản lạnh ở

40C trong 24-48h nhằm mục đích giảm hoạt động trao đổi chất (giảm shock đối với chồi mới được xử lý), tăng khả năng sống và tái sinh của chồi, giảm tỷ lệ nhiễm Sau đó, các chồi được chuyển sang chăm sóc ở điều kiện 27±20C, độ ẩm 50±5%, cường độ ánh sáng 0-500lux

Mỗi ống nghiệm chứa 10-15ml môi trường dinh dưỡng cơ bản là môi trường Murashige & Skoog (MS) có bổ sung các chất vitamin, 3% sacrose và 5.0g/l Agar Agar (Hải Long) bổ sung 0.5 mg/l hoocmon BAP để tăng khả năng tái sinh chồi Môi trường được khử trùng tại 1210C, áp suất 1.4atm trong 20 phút Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 5.8-6.0

Bố trí thí nghiệm theo dạng 2 nhân tố, khối ngẫu nhiên đầy đủ (bao gồm 6 công thức thí nghiệm) Mỗi công thức thí nghiệm bao gồm 50 mẫu/1 lần lặp và được lặp lại 3 lần

Bảng 02 Công thức thí nghiệm tuổi mẫu cấy và thời vụ cấy mẫu

KT12 Vụ thu (tháng 8-10/2012) 2 tuần tuổi

KT13 Vụ thu (tháng 8-10/2012) 3 tuần tuổi

KT14 Vụ thu (tháng 8-10/2012) 4 tuần tuổi

Thí nghiệm đo đếm và quan sát 4 tuần sau khi cấy Các chỉ tiêu về tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nảy chồi, số chồi tái sinh, hình thái và màu sắc mẫu

2.2.2.3 Phương pháp nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu

Những mẫu sống không nhiễm nấm khuẩn và nảy chồi sau 28 ngày nuôi cấy trong ống nghiệm được cấy chuyển sang môi trường chứa trong bình tam giác 250ml chứa môi trường cơ bản để tiến hành các thí nghiệm về nhân chồi

Các môi trường dinh dưỡng nhân chồi cơ bản được thử nmghiệm là McCOWN’s Woody Plant (WPM), Schenk & Hildebrandt (SH); Murashige & Skoog (MS), ½ MS (môi trường MS giảm ½ hàm lượng các chất đa lượng), M4 (môi trường tái sinh chồi cây bạch đàn) Thành phần chi tiết nồng độ các chất đa lượng, vi lượng, vitamin theo phụ lục 02 Môi trường được khử trùng tại 1210C,

áp suất 1.4atm trong 20 phút Điều chỉnh pH môi trường sau khử trùng khoảng 5.8-6.0

Bố trí thí nghiệm: các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương pháp thực nghiệm so sánh với 3 lần lặp lại theo thời gian Mỗi công thức thử nghiệm 10 bình x 5 mẫu/bình

Thí nghiệm đo đếm và quan sát sau 4 tuần nuôi cấy Đo đếm các chỉ tiêu

về hệ số nhân chồi, tỷ lệ chồi hữu hiệu và hình thái chồi Các công thức nghiên cứu được mô tả ở bảng 01

Bảng 03 Công thức thí nghiệm xác định môi trường tái sinh chồi

Ký hiệu

công thức thí

nghiệm

Môi trường tái sinh chồi

NC4 ½ MS (môi trường MS giảm ½ hàm lượng các chất đa

∑ Số mẫu bị nhiễm

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x100%

∑ Số mẫu đưa vào

∑ Số mẫu sạch không này chồi

Tỷ lệ mẫu sạch không nảy chồi (%) = x100%

∑ Số mẫu đưa vào

∑ Số mẫu nảy chồi

Tỷ lệ mẫu nảy chồi (%) = x100%

∑ Số mẫu đưa vào

∑ Số chồi tạo thành

Hệ số nhân chồi (lần) =

∑ Số chồi ban đầu

∑ Số chồi hữu hiệu

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = x 100

∑ Số chồi tạo thành

Chồi hữu hiệu là những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus Thu thập tình trạng phát triển của chồi gồm: hình thái của chồi, màu sắc chồi và mức độ sinh trưởng của chồi

Khi sử dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm

ở giữa 2 cấp Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng ở 2 cấp chứng tỏ chỉ tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân

tố kiểm tra không lớn)

2.3.Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

- Panh, kéo nuôi cấy mô

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác

Chương 3 Kết quả và bình luận 1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL2

Kết quả nghiên cứu về chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu của dòng KL2 được tổng hợp ở bảng 04

Bảng 04 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL2

chết

Mẫu nhiễm khuẩn

Mẫu sạch

và không nảy chồi

Mẫu sạchvà có nảy chồi

Kết quả nghiên cứu trong bảng 04 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch nảy chồi và không nảy chồi có sự dao động rất lớn giữa các công thức thí nghiệm

Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng (diệt khuẩn) khác nhau Chuyên đề tiến hành phân tích và so sánh theo các nhóm chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, hiệu quả diệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi

Đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, qua bảng 01 chúng ta nhận thấy nồng độ chất khử trùng càng tăng, thời gian khử trùng càng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết càng cao Công thức khử trùng với HgCl2 0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 56%, các công thức khử trùng với HgCl2 0.1% trong 2 phút, 5 phút và 8 phút có tỷ lệ mẫu chết thấp nhất là 1.3%

Khi thời gian khử trùng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng Như chúng ta đã biết, Hg++có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với

các protein màng (Walsh et al., 1988) Khi thời gian khử trùng kéo dài thì lượng

Hg++thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với mẫu cần xử lý càng cao

Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu chết tăng rõ rệt khi nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng cùng tăng và khi thời gian khử trùng thay đổi từ 8 phút lên 10 phút thì ta nhận thấy tỷ lệ mẫu chết tăng rõ rệt ở các nồng độ chất khử trùng khác nhau (đối với công thức HgCl2 0.1% thì tỷ lệ này tăng từ 1.3% lên 22% và đối với công thức HgCl2 0.5% thì tỷ lệ này tăng từ 18% lên 56%)

Đối với khả năng diệt khuẩn của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, ta nhận thấy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng thấp thì tỷ lệ mẫu chết

do chất khử trùng càng cao Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức HgCl2 0.5% trong 10 phút là 40.7% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là 56% và tỷ lệ mẫu sạch đạt thấp nhất là 3.3%

Đối với hiệu quả tạo mẫu sạch vô trùng có nảy chồi của chất khử trùng qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch

có nảy chồi cao nhất là công thức khử trùng với HgCl2 0.5% trong 8 phút đạt tỷ

lệ 17.3% Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi thấp nhất là công thức khử trùng với HgCl2 0.5% trong 10 phút đạt tỷ lệ 0.0%

Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt biệt là tỷ

lệ mẫu sạch có nảy chồi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau Công thức khử trùng với HgCl2

0.5% trong 8 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với dòng keo lai KL2 với

tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi là 17.3% Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ tiêu được tổng hợp trong phụ lục 03

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL20

Bảng 05 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL20

Mẫu sạchvà có nảy chồi

Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng (diệt khuẩn) khác nhau Chuyên đề tiến hành phân tích và so sánh theo các nhóm

chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, hiệu quả diệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi

Đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, qua bảng 05 chúng ta nhận thấy nồng độ chất khử trùng càng tăng, thời gian khử trùng càng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết càng cao Công thức khử trùng với HgCl2 0.5% trong 10 phút có tỷ lệ mẫu chết cao nhất đạt 36.7%, các công thức khử trùng với HgCl2 0.1% trong 2 phút có tỷ lệ mẫu chết thấp nhất là 0.0%

Khi thời gian khử trùng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng Như chúng ta đã biết, Hg++có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với

các protein màng (Walsh et al., 1988) Khi thời gian khử trùng kéo dài thì lượng

Hg++thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với mẫu cần xử lý càng cao

Đối với khả năng diệt khuẩn của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, ta nhận thấy tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn càng thấp thì tỷ lệ mẫu chết

do chất khử trùng càng cao Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn thấp nhất ở công thức HgCl2 0.5% trong 10 phút là 57.3% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại là cao nhất là 36.7%

Đối với hiệu quả tạo mẫu sạch vô trùng có nảy chồi của chất khử trùng qua các khoảng thời gian khác nhau: Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch

có nảy chồi cao nhất là công thức khử trùng với HgCl2 0.5% trong 5 phút đạt tỷ

lệ 8.7% Công thức thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi thấp nhất là công thức khử trùng với HgCl2 0.1% trong 2 phút đạt tỷ lệ 0.7%

Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn và đặt biệt là tỷ

lệ mẫu sạch có nảy chồi phụ thuộc vào các công thức thí nghiệm các chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau Công thức khử trùng với HgCl2

0.5% trong 5 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đối với dòng keo lai KL20 với tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi là 8.7% Kết quả phân tích thống kê cho các chỉ tiêu được tổng hợp trong phụ lục 03

3.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KLTA3

Kết quả nghiên cứu trong bảng 06 cho thấy, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm khuẩn, mẫu sạch nảy chồi và không nảy chồi đối với dòng keo lai KLTA3 cũng tương tự như đối với dòng KL2, các chỉ tiêu theo dõi có sự dao động rất lớn giữa các công thức thí nghiệm Chất khử trùng và thời gian khử trùng khác nhau có hiệu quả khử trùng (diệt khuẩn) khác nhau Chuyên đề tiến hành phân tích và so sánh theo các nhóm chỉ tiêu sau nhằm xác định rõ hơn hiệu quả của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với khả năng gây chết mẫu của chất khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau, hiệu quả diệt khuẩn của chất khử trùng ở từng công thức thí nghiệm và tỷ lệ mẫu sạch có nảy chồi

Bảng 06 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KLTA3

chết

Mẫu nhiễm khuẩn

Mẫu sạch

và không nảy chồi

Mẫu sạchvà có nảy chồi

là 2.0% Khi thời gian khử trùng kéo dài thì tỷ lệ mẫu chết tăng theo tương ứng Như chúng ta đã biết, Hg++có tác động lên màng tế bào thông qua liên kết với

các protein màng (Walsh et al., 1988) Khi thời gian khử trùng kéo dài thì lượng

Hg++thẩm thấu vào các mô và tế bào càng lớn dẫn đến khả năng gây chết đối với