Nghiên cứu chế tạo hệ thống đo đạc và phân tách các phân tử sinh học đặc hiệu - protein-ADN - Phụ lục

Hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ : Để thuận lợi cho quá trình gắn kết cả protein và ADN lên hạt nano sắt từ, chúng tôi sử dụng phương pháp gắn dẫn xuất của aminosilane được theo sau bằng

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC

“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ

CƠ KHÍ VÀ TỰ ĐỘNG HÓA”, MÃ SỐ KC.03.TN/11-15”

PHỤ LỤC

ĐỀ TÀI KHCN TIỀM NĂNG

“Nghiên cứu chế tạo hệ thống đo đạc và phân tách các phân tử sinh học đặc hiệu – protein/ADN”

MÃ SỐ: KC.03.TN10/11-15

Chủ nhiệm đề tài : TS Cao Xuân Hữu

Cơ quan chủ trì : Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng

9805-1

Hà Nội, năm 2012

Hình ảnh bộ phận phân tách bằng từ trường (a); mẫu sinh học trước phân tách (b); và mẫu

sinh học sau phân tách (c)

II Một số bo mạch điện tử đã nghiên cứu chế tạo:

Hình ảnh hai bo mạch xử lý tín hiệu (trước và sau khi tối ưu) đã thiết kế chế tạo

Hình ảnh một bo mạch nguồn sử dụng cho hệ thống đo đạc

Hình ảnh sensor GMR chế tạo bằng công nghệ MEMS đã hoàn thành

3-Aminopropyltriethoxysilane, Glutardialdehyde được mua từ công ty Sigma Các

hóa chất thông thường khác dùng để pha đệm như  NaOH,  sodium phosphate

dibasic, NaCl … được cung cấp bởi công ty Merck

- Protein được sử dụng thí nghiệm này gồm có enzyme Alcalase của hãng

Sigma, và kháng thể kháng IgM của hãng Teco Diagnostics

- ADN trong trường hợp này là các oligopeptide có gắn nhóm amino tại đầu 5’

được cung cấp bởi Shanghai Sangon Biological Engineering Technology and

02 Máy đồng hóa mẫu bằng sóng siêu âm

3 Quy trình gắn kết các phân tử sinh học lên hạt nano sắt từ

3.1 Tạo hạt nano sắt từ :

3.1.1 Quy trình thực hiện:

Hình 1: Quy trình tạo hạt nano sắt từ trong phòng thí nghiệm

3.1.2 Các bước thực hiện như sau :

• Chuẩn bị 200 ml NaOH 5 M (S2)

• Cho 100 ml nước cất và cốc thủy tinh 1 L và khuấy ở tốc độ 1000 rpm

• Cho S1 và S2 vào cốc thủy tinh và tiếp tục khuấy trong 5 phút

• Rửa dung dịch 3 lần với khoảng 600 ml NaCl, rửa tiếp 3 lần với khoảng 600 ml nước cất Dùng HCl 1M điều chỉnh pH dung dịch đến 7-8 Trong quá trình rửa, hạt ôxit sắt từ được hình thành, hút bỏ phần dịch

• Phần dịch lỏng còn lại khoảng 200 ml

• Thêm 800 ml methanol vào hỗn hợp trên Sau khi khuấy trộn, hạt sắt từ được tạo thành, loại phần dịch

• Rửa lại 2 lần bằng methanol, mỗi lần khoàng 400 ml methanol để loại hêt nước

~ 1 % v/v, thể tích dung dịch cuối cùng thu được khoảng 250 ml

3.2 Hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ :

Để thuận lợi cho quá trình gắn kết cả protein và ADN lên hạt nano sắt từ, chúng tôi sử dụng phương pháp gắn dẫn xuất của aminosilane được theo sau bằng việc phủ glutardialdehyde như đã được mô tả bởi Hubbuch và cs (2001) để họat hóa bề mặt của chúng Dẫn xuất aminosilane sẽ tạo lên trên bề mặt hạt sắt từ một lớp các nhóm amino

glutardialdehyde Nhóm –CHO còn lại của phân tử glutardialdehyde sẽ là cầu nối gắn với phân tử protein thông qua các nhóm amino, sulfhydryl, phenolic hoặc vòng imidazole …, hoặc với các nhóm amino đã được gắn lên trên các phân tử oligonuleotide

3.2.1 Quy trình gắn 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) lên hạt sắt từ: a) Nguyên tắc phản ứng:

b) Quy trình thực hiện:

Hình 2: Quy trình gắn dẫn xuất aminosilane lên bề mặt hạt nano sắt từ

c) Thuyết minh quy trình:

• Hỗn hợp hạt sắt từ trong methanol (khoảng 250 ml) đã được chuẩn

bị ở trên được đồng nhất bằng cách khuấy 5 phút ở tốc độ 2000 rpm bằng thiết bị đồng hóa mẫu

• Bổ sung 10 ml 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) vào và bổ sung thêm 5 ml axit gracial acetic ngay lập tức Hỗn hợp tiếp tục được đồng nhất bằng cách khuấy 10 phút ở tốc độ 13000 rpm và sau đó khuấy

120 phút ở tốc độ 6000 rpm

• Hỗn hợp phản ứng trên được cho vào cốc 500 ml đã có chứa 200

Trong suốt quá trình này hỗn hợp được khuấy ở tốc độ 600 rpm

• Cuối cùng, hỗn hợp phản ứng được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng

• Tiến hành rửa 3 lần với 200 ml NaCl 0,2M Sau đó, rửa tiếp 3 lần nữa với nước cất

• Sau khi rửa thì hỗn hợp hạt đã được gắn với APTES sẽ được bảo

3.2.2 Phủ hạt nano sắt từ bằng Glutardialdehyde :

a) Nguyên tắc phản ứng:

b) Quy trình thực hiện:

Hình 3 : Quy trình phủ Glutardialdehyde lên hạt nano sắt từ có gắn aminosilane

c) Thuyết minh quy trình :

• 10 g hạt nano sắt từ có gắn aminosilane đã chuẩn bị ở trên được khuyếch tán trở lại trong cốc thủy tinh có chứa sẵn 1200 ml nước cất, có khuấy nhẹ để phân tán đều hạt vào dung dịch

• Bổ sung 70 ml dung dịch Glutardialdehyde 50% Điểu chỉnh để đạt giá trị pH =

11 bằng NaOH 1M

• Giữ yên hỗn hợp trong khoảng 1 h để phản ứng diễn ra (hình bên dưới) Lưu ý theo dõi giá trị pH, điều chỉnh nếu cần thiết để giữ pH = 11

• Sau khi hoàn tất phản ứng, hạt nano sắt được giữ lại bằng từ trường và loại bỏ dung dịch phản ứng Hạt sau đó được rửa 3 lần bằng 500 ml NaCl 0.2M Giữ hạt trong 500 ml nước cất

• Hạt nano sắt từ đã đựợc họat hóa bề mặt sẵn sàng cho các quá trình gắn protein

3.3 Gắn các phân tử sinh học lên trên hạt nano sắt từ đã được họat hóa bề mặt

3.3.1 Gắn kết các phân tử protein

Quy trình gắn kết các phân tử protein với hạt nano sắt từ như sau :

• Pha loãng dung dịch protein để có nồng độ 1 mg/ml bằng dung dịch đệm phosphate 0.01M pH 8.5 (hòa tan 0.71 g sodium phosphate dibasic trong 500 ml nước cất)

• Rửa 8 mg hạt nano sắt từ đã họat hóa bề mặt bằng 500 ml đệm phosphate 0.01M, 3 lần

• Bổ sung 300 µl dung dịch protein đã được pha loãng vào 8 mg hạt nano sắt từ đã được họat hóa bề mặt

• Sau khi kết thúc phản ứng, hạt nano sắt từ được giữ lại bằng từ trường, loại bỏ dung dịch phản ứng Hạt sau đó được rửa để loại bỏ các phân tử protein không tạo liên kết

• Quá trình rửa: rửa 3 lần bằng 500 ml NaCl 0.2M, rửa lại 3 lần bằng 500 ml nước cất

3.3.2 Gắn kết các oligonucleotide :

Các phân tử oligonucleotide, thực chất là một đoạn của phân tử ADN, được gắn

• Rửa 8 mg hạt nano sắt từ đã họat hóa bề mặt bằng 500 ml đệm phosphate 0.01M, 3 lần

• 8 mg hạt nano sắt từ này được khuếch tán vào trong 300 µl dung dịch đệm phosphate 0.01M

• Bổ sung thêm 10 µM oligonucleotide

• Sau khi kết thúc phản ứng, hạt nano sắt từ được giữ lại bằng từ trường, loại bỏ dung dịch phản ứng Hạt sau đó được rửa để loại bỏ các oligonucleotide không tạo liên kết

• Quá trình rửa : rửa 3 lần bằng 500 ml NaCl 0.2M, rửa lại 3 lần bằng 500 ml nước cất

Lưu ý : Các thao tác cần tiến hành chính xác và nhanh chóng, tránh để hạt bị khô

SẢN PHẨM DẠNG III

BÀI BÁO KHOA HỌC ĐĂNG TRÊN TẠP CHÍ TRONG NƯỚC

(Bài báo tiếng Anh)

Cao Xuan Huu, Pham Van Tuan, Dang Duc Long, Nguyen Thi Minh Xuan,

Measurement of Biological Concentration Using Magnetic Agents,

Journal of Science and Technology, University of Danang, Vol.12 (61) 2012, p 40-46

PHỤ LỤC 2: MẠCH XỬ LÝ TÍN HIỆU VÀ KẾT QUẢ MÔ PHỎNG

MẠCH THEO TÍN HIỆU THỰC PL2.1 Mạch xử lý tín hiệu tổng quát

Mạch xử lý tín hiệu tổng quát Các điểm lấy tín hiệu sau các tầng tại điểm khoanh tròn

PL2.2 Các kết quả mô phỏng theo tín hiệu thực

TÍN HIỆU GỐC – SENSOR Output

TÍN HIỆU SAU TẦNG LỌC THÔNG THẤP 1 (Tại Vout1)

TÍN HIỆU SAU TẦNG LỌC THÔNG THẤP 2 (Tại Vnext)

TÍN HIỆU SAU TẦNG KHUẾCH ĐẠI (Tại Vout3)

TÍN HIỆU TẠI TẦNG CUỐI (Tại Vout4)

PHỤ LỤC 3: BẢN VẼ THIẾT KẾ CỦA MỘT SỐ THÀNH PHẦN CỦA

HỆ THỐNG ĐO ĐẠC PL3.1 Giá sensor

PL3.2 Giá cuộn dây nam châm điện (Coil former)

PL3.3 Thanh trượt

PL3.4 Actuator

PL3.5 Giá lưu chuyển

Khối lưu chuyển 1

PL3.5 Giá lưu chuyển

Khối lưu chuyển 2

PL3.5 Giá lưu chuyển

Ốc trượt và đệm long đen

PL3.6 Yoke

PL3.7 Giá lực hồi phục

PL3.8 Đế kim loại

PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ KIỂM TRA TÍNH CHẤT HẠT NANO TỪ

(X-RAY, SEM, TEM, VSM, FTIR) PL4.1 X-Ray: Fe 3 O 4

PL4.2 X-Ray: Fe 3 O 4 + SiO 2

PL4.2 SEM (Scanning Electron Microscopy)

PL4.3 TEM (Transmission Electron Microscopy)

PL4.4 VSM (Vibrating Sample Magnetometer)

-60 -40 -20 0 20 40 60

Đường cong từ trễ điển hình cho hai mẫu hạt nano từ Fe3O4 và Fe3O4 + SiO2

-60 -40 -20 0 20 40 60

PL4.5 FTIR (Fourier Transform Infrared spectroscopy)

00.2

3000.0

5075100

Fe3O4Fe

3 O

4 /SiO 2 SiO2

3390.76 3452.93

138.99

1115.45 1090.59

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CHƯƠNG TRÌNH KHCN TRỌNG ĐIỂM CẤP CẤP NHÀ NƯỚC

“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ CƠ KHÍ CHẾ TẠO”

Mã số KC.03//11-15

  BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ SỐ 1

“NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GẮN KẾT CÁC ADN HOẶC PROTEIN

KS Phạm Thị Kim Thảo

Đà Nẵng – 2012

MỤC LỤC

BẢNG CHÚ THÍCH CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT, THUẬT NGỮ 1

I ĐẶT VẤN ĐỀ 21.1 Khái quát tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến chuyên đề nghiên cứu .21.2 Mục đích yêu cầu của Chuyên đề 4

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 63.1 Tổng hợp hai loại hạt nano từ tính (có và không có lớp hoạt hóa bề mặt) và khảo sát tính chất từ của chúng 6

3.1.1 Tổng quan các phương pháp chế tạo hạt nano 6 3.1.2 Quá trình tổng hợp hai loại hạt nano sắt từ 8 3.1.3 Khảo sát tính chất từ của các hạt nano đã được tổng hợp 11 3.1.4 Các bước tiến hành hoạt hóa bề mặt của hạt nano sắt từ 15

3.2 Khảo sát và thu thập các loại hóa chất và dung dịch sinh hóa (có chứa protein hoặc ADN, kháng thể, kháng nguyên) có đặc điểm phù hợp yêu cầu đo đạc và phân tách 163.3 Nghiên cứu lý thuyết quy trình gắn kết protein/ADN với các tác nhân liên kết sinh học kháng thể, kháng nguyên và hạt nano từ 17

3.3.1 Gắn kết Axit Nucleic lên hạt nano sắt từ 17 3.3.2 Gắn kết Protein lên hạt nano sắt từ 20

3.4 Nghiên cứu thực nghiệm quy trình gắn kết 20

3.4.1 Gắn kết ADN với hạt nano sắt từ 20 3.4.2 Gắn kết Protein với hạt nano sắt từ 21

IV KẾT LUẬN 22TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

1

BẢNG CHÚ THÍCH CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT, THUẬT

NGỮ

Ký hiệu/ Viết tắt/

Microscopy

Hiển vi điện tử quét

Microscopy

Hiển vi điện tử truyển qua

có các ứng dụng rất đa dạng Nó có thể được ứng dụng trong công nghệ thông tin và truyền thông làm vật liệu chế tạo linh kiện điện tử và cảm biến; ứng dụng tạo ra các sensor, các tác nhân dẫn thuốc và các tác nhân tăng độ phân giải cho hình ảnh dùng trong y học, ứng dụng có hiệu quả trong xử lý nước và các chất độc hại, ứng dụng trong công nghệ thực phẩm bằng cách cố định các enzyme, v,v [1],[2],[3] Từ trước đến nay, việc chế tạo các hạt nano từ phần lớn tập trung vào các loại hạt sắt từ nhỏ như Fe3O4 (magnetite), FeIIFe2IIIO4, α-

Fe2O3 (hematite), γ-Fe2O3 (maghemite), FeO (wustite), ε-Fe2O3 and β-Fe2O3; trong đó magnetite và maghemite là phổ biến nhất và ứng dụng tốt nhất trong

Co, Mn, Zn, Mg cũng được nghiên cứu [4] Để chế tạo ra hạt nano sắt từ có chất lượng cao, một loạt phương pháp tổng hợp được nghiên cứu và sử dụng nhiều là các phương pháp đồng kết tủa (co-precipitation), phân hủy nhiệt (thermal decomposition), tổng hợp nhiệt ẩm (hydrothermal synthesis), vi nhũ tương (microemulsion), tổng hợp với sự trợ giúp của siêu âm (sonochemical synthesis), và phương pháp sol-gel [3],[5] Ngoài ra, gần đây một số phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ mới hơn cũng đã được nghiên cứu như phương pháp tổng hợp điện hóa (electrochemical synthesis), phương pháp đốt bằng laser (laser pyrolysis), và phương pháp tổng hợp có sự trợ giúp của vi sinh vật

là, khi ngừng tác động của từ trường ngoài, các hạt này sẽ không còn từ tính nữa, đây là một đặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho các ứng dụng y sinh học [8] Hạt nanô từ tính dùng trong y sinh học cần phải thỏa mãn

ba điều kiện sau: tính đồng nhất của các hạt cao, từ độ bão hòa lớn và có tính tương hợp sinh học (có tương tác sinh học phù hợp) Để vật liệu có tương tác sinh học phù hợp thì người ta phải tiến hành chức năng hóa (hoạt hóa) bề mặt của hạt sắt từ Đây là quá trình biến đổi bề mặt và gắn kết các phần tử sinh học thích hợp lên đó Để trợ giúp cho việc ứng dụng hạt nano sắt từ để phân tách các protein, ADN, tế bào, các chất hóa sinh, người ta đã gắn nhiều loại phân tử sinh học như protein, polypeptide, kháng thể (antibody), biotin và avidin, v.v., lên hạt sắt từ một cách trực tiếp hay gián tiếp [9],[10],[11] Khi gắn trực tiếp các phân tử sinh học lên bề mặt, người ta đã dùng các nhóm chức như aldehyde, hydroxyl, carboxyl, amino để hoạt hóa bề mặt sắt từ rồi sau đó qua các nhóm chức này để liên kết hóa trị với các phân tử hoạt động sinh học như antibody, protein, ADN, enzyme Trong phương pháp gắn gián tiếp, các hạt nano sắt từ được bao bọc trong một vỏ hoặc nền phi từ tính có kích thước vài trăm nm (còn gọi là các tiểu cầu chứa hạt nanô) để tránh kết tụ

và tạo ra một bề mặt có tính tương hợp sinh học và dễ dàng chức năng hóa Trên thế giới đã có một số ứng dụng thương mại của hạt nano sắt từ trong sinh học phân tử (để phân tách ADN, protein) và trong y học (tác nhân tăng

độ tương phản trong chụp ảnh y khoa) Các nghiên cứu gần đây trên thế giới

1.2 Mục đích yêu cầu của Chuyên đề

Nghiên cứu chế tạo hạt nano sắt từ với số lượng ở quy mô trung bình trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam Các hạt nano từ này cần đạt yêu cầu chất lượng để sử dụng trong hệ thống sensor đo tín hiệu từ

Mục tiêu tiếp theo của chuyên đề là nghiên cứu thực hiện quá trình chức năng hóa bề mặt của hạt sắt từ và gắn kết các phân tử sinh học ADN, protein lên hạt nano sắt từ để tạo ra các hạt từ có kích thước siêu nhỏ và có chức năng sinh hóa cụ thể Hiệu quả của việc gắn kết này được kiểm nghiệm

và đánh giá trước khi đưa vào sử dụng trong sensor

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu được gắn kết chặt chẽ giữa lĩnh vực hóa vật liệu và sinh học phân tử Nội dung nghiên cứu của đề tài được phân thành các công đoạn chặt chẽ, công đoạn trước làm tiền đề cơ sở để phát triển hoàn thiện công đoạn sau

Cách tiếp cận nghiên cứu của chuyên đề dựa trên các nguyên tắc sau: Tổng quan đầy đủ tài liệu: Tập hợp đầy đủ các bài báo, sách, patent trong và ngoài nước liên quan đến các nội dung nghiên cứu của đề tài thông

5

quan hệ thống internet, thư viện điện tử, trao đổi qua quan hệ hợp tác trong và ngoài nước để tìm tình hình thực tế và các hướng phát triển mới trong việc nghiên cứu chế tạo hạt nano sắt từ và gắn kết loại vật liệu này với các phân tử sinh học

Kế thừa các kết quả nghiên cứu và ứng dụng trước đây: chuyên đề này

kế thừa các kinh nghiệm và kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới và của chính nhóm thành viên của chuyên đề về các phương pháp chế tạo, hoạt hóa

và gắn kết cho loại hạt nano sắt từ Ngoài ra chuyên đề còn kế thừa các kinh nghiệm về việc ứng dụng hạt nano sắt từ tạo nên hệ biosensor trên thế giới

Gắn kết giữa lý thuyết hóa học và thực nghiệm: Từ việc xây dựng quy trình chế tạo, hoạt hóa rồi gắn kết cho hạt nano sắt từ và quy trình sử dụng các hạt từ tính trong đo đạc, chuyên đề thực hiện việc đánh giá khoa học cơ bản với phân tích điều kiện thực tế một cách vững chắc

Tiến trình nghiên cứu của Chuyên đề được thực hiện theo thứ tự sau Thu thập tài liệu nghiên cứu, bao gồm tài liệu lý thuyết và thực nghiệm Nghiên cứu xây dựng và thực hiện quy trình tối ưu trong điều kiện thực

tế để tổng hợp hạt nano sắt từ

Nghiên cứu xây dựng và thực hiện quy trình tối ưu trong điều kiện thực

tế để gắn kết ADN và protein lên hạt nano sắt từ

6

III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

3.1 Tổng hợp hai loại hạt nano từ tính (có và không có lớp hoạt hóa bề mặt) và khảo sát tính chất từ của chúng

3.1.1 Tổng quan các phương pháp chế tạo hạt nano

3.1.1.1 Phương pháp nghiền

Phương pháp nghiền được phát triển từ rất sớm để chế tạo hạt nanô từ tính dùng cho các ứng dụng vật lý như truyền động từ môi trường không khí vào buồng chân không, làm chất dẫn nhiệt trong các loa công suất cao, Trong những nghiên cứu đầu tiên về chất liệu từ, vật liệu từ tính ô-xít sắt

SDS) và dung môi (dầu, hexane) Chất hoạt động bề mặt giúp cho quá trình nghiền được dễ dàng và đồng thời tránh các hạt kết tụ với nhau Sau khi nghiền, sản phẩm phải trải qua một quá trình phân tách hạt rất phức tạp để có được các hạt tương đối đồng nhất

Phương pháp nghiền có ưu điểm là đơn giản và chế tạo được vật liệu với khối lượng lớn Việc thay đổi chất hoạt động bề mặt và dung môi không ảnh hưởng nhiều đến quá trình chế tạo Tuy nhiên cũng có những nhược điểm

là tính đồng nhất của các hạt nanô không cao vì khó có thể khống chế quá trình hình thành hạt nanô Hạt nanô từ tính chế tạo bằng phương pháp này thường được dùng cho các ứng dụng vật lý

3.1.1.2 Phương pháp đồng kết tủa

Phương pháp đồng kết tủa là một trong những phương pháp thường được dùng để tạo các hạt ô-xít sắt Có hai cách để tạo ô xít sắt bằng phương pháp này đó là hydroxide sắt bị ô xi hóa một phần bằng một chất ô xi hóa nào

môi nước Phương pháp thứ nhất có thể thu được hạt nanô có kích thước từ 30

nm – 100 nm Phương pháp thứ hai có thể tạo hạt nanô có kích thước từ 2 nm