Nghiên cứu các phương pháp chuẩn đoán nhằm hỗ trợ điều trị phòng ngừa nhiễm vi sinh vật ở các bệnh nhân bị các bệnh dạ dày có liên quan đến Helicobacter pylori

LỜI CẢM ƠN Tập thể cán bộ khoa học tham gia thực hiện nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Hoa Kỳ “Nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán nhằm hỗ trợ điều trị, phòng ngừa nhiễm vi sinh vật ở

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐOÁN

NHẰM HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ PHÒNG NGỪA NHIỄM VI SINH VẬT

LỜI CẢM ƠN

Tập thể cán bộ khoa học tham gia thực hiện nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Hoa Kỳ “Nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán nhằm hỗ trợ điều trị, phòng ngừa

nhiễm vi sinh vật ở các bệnh nhân bị các bệnh dạ dày liên quan đến Helicobacter

pylori” xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành tới Vụ Khoa học tự nhiên và Xã hội, Vụ

Hợp tác quốc tế, Vụ kế hoạch – Tài chính Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban kế hoạch Tài chính, Viện công nghệ sinh học, GS Blaser MJ và PGS Guillermo IPP, Trường Đại học Tổng hợp New York, GS Fred K, GS David SP, Viện nghiên cứu sức khỏe New Jersey (Mỹ), Viện NCKH Y

Dược Lâm sàng 108, Viện Vệ sinh dịch tễ học Trung ương, Bệnh viện Bưu điện,

Trường Đại học Y khoa Hà Nội, GS-TS Trương Nam Hải, Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, PGS-TS Trần Đình Mấn, Trưởng khoa Vật liệu sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và các Thành viên của Hội đồng nghiệm thu các cấp Cơ sở & Nhà nước, đặc biệt là GS Tạ Long đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện nhiệm vụ

Hà Nội tháng 8 năm 2012

Sunday, September 01, 2013

PHẦN I BÁO CÁO TỔNG KẾT THỐNG KÊ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 200

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VIỆT-MỸ TỪ THÁNG 1/2010 ĐẾN THÁNG 6/2012

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài/dự án: “Nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán nhằm hỗ trợ điều trị,

phòng ngừa nhiễm vi sinh vật ở các bệnh nhân bị các bệnh dạ dày liên quan đến

Helicobacter pylori”

Thuộc: Nghị định thư với nước Hoa Kỳ

- Chương trình (tên, mã số chương trình): 50 /2010/HĐ-NĐT

- Dự án khoa học và công nghệ (tên dự án): Nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và

công nghệ theo Nghị định thư - Khoá họp ngày 26 tháng 2 năm 2008 tại Washington

2 Chủ nhiệm đề tài/dự án

- Họ và tên : Nguyễn Thị Nguyệt

- Ngày, tháng, năm sinh : 06/02/1977 Nam/ Nữ: Nữ

- Học hàm, học vị: Tiến sĩ

- Chức vụ: Nghiên cứu viên

- Điện thoại : Tổ chức: 84-4-8344691 Nhà riêng: 38373578 Mobile: 0942783559

- Fax: 88363144

- E-mail: nguyetnt6897@ yahoo.com

-Tên tổ chức đang công tác:Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Địa chỉ: Số18, Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

- Địa chỉ nhà riêng: Thôn Phú Mỹ, Xã Mỹ Đình, Từ Liêm, Hà Nội

- Địa chỉ: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

- Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS-TS Trương Nam Hải

- Số tài khoản: 301 01 039

- Ngân hàng: Tại Kho bạc Nhà nước Ba Đình, Hà Nội

- Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Công nghệ

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án

- Theo Hợp đồng đã ký kết: Từ tháng 1 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012

- Thực tế thực hiện: Từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 6 năm 2012

- Được gia hạn (nếu có): Không

2 Kinh phí và sử dụng kinh phí

a) Tổng số kinh phí thực hiện:1800 triệu đồng

+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 1800 triệu đồng

+ Kinh phí từ các nguồn khác: Không

+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): Không

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi

Đối với đề tài

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Số TT

Số, thời gian ban hành

1 168/QĐ-KHCNVN

09/02/2010 Quyết định giao chỉ tiêu kế hoạch năm 2010

18/11/2009 Quyết định phê duyệt danh mục và kinh phí các nhiệm vụ hợp tác Quốc tế về Khoa học và Công

nghệ theo nghị định thư bắt đầu thực hiện năm

2010

28/6/2012 Quyết định thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở Quy trình sản xuất Kít

28/6/2012 Quyết định thành lập Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở nhiệm vụ nghị định thư

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án

Nội dung tham gia chủ yếu

3 Xác định tỷ lệ nhiễm H

pylori của ba nhóm bệnh

1.Lựa chọn 589 bệnh nhân và lấy bệnh phẩm

1.Xác định các tổn thương dạ dày

2.Xác định H pylori,

nấm, vi khuẩn non-HP trong sinh thiết dạ dày

3 Xác định tỷ lệ nhiễm các vi sinh vật

6

CNSH

Viện CNSH

1.Viết đề cương 2.Viết 10 chuyên đề

3.Tuyển chọn 500 bệnh nhân và lấy bệnh phẩm

4 Xác định tỷ lệ nhiễm H

pylori ở ba nhóm bệnh

nhân 5.Nghiên cứu kiểu gen

02 mẫu dò huỳnh quang

cho H pylori và C krusei

9.Thiết kế bộ chế phẩm sinh học học chẩn đoán nhiễm vi sinh vật dạ dày

10.Thiết kế mẫu mã Bộ sinh phẩm phát hiện bội nhiễm vi sinh vật dạ dày

11.Sản xuất thử 010 Bộ sinh phẩm

12 Nghiên cứu các điều kiện sử dụng và bảo quản

13.Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên 200 mẫu sinh phẩm

14 Đề nghị các biện pháp

đề phòng và điều trị các vi sinh vật gây nhiễm dạ dày

15.Viết tổng kết các kết qủa nghiên cứu của nhiệm

vụ nghị định thư, 16.Viết 01 báo tiếng Anh

và 0.3 bài báo tiếng Việt

17 01 nghiên cứu sinh

1.Hoàn thành 2.10 chuyên đề

3.589 bệnh nhân và lấy bệnh phẩm

4 Hoàn thành

5 Các số liệu về kiểu

gen cagA/vacA 6.Phân lập 27 chủng H

pylori, 119 chủng

non-HP và định tên & tỷ lệ nhiễm

7 Đã xác định tên của mười một loài nấm từ

dạ dày người bệnh,

8 Hai cặp mồi và hai mẫu dò MB đặc thù đã được thiết kế

9 Thiết kế Bộ sinh phẩm và chỉ dẫn sử dụng

10 Chọn một mẫu mã 11.Đã sản xuất 10 bộ

12 Xác định điều kiện

sử dụng và bảo quản 13.Đã thử nghiêm trên

250 mẫu bệnh

14 Đề nghị biện pháp

đề phòng và điều trị nhiễm vi sinh vật dạ dày

15.Hoàn thành bản tổng kết tổng hợp

16 Một bài báo tiếng Anh, bốn bài tiếng Việt

17 02 Tiến sĩ

- Nguyễn Văn Thịnh

- Nguyễn Thị Nguyệt

4 Đại học

New Yok

(Mỹ)

Đại học New York (Mỹ) và Viện sức khỏe cộng đồng New Jersey (Mỹ)

gen 23S rARN, glmM của

27 chủng H pylori

3.Phân lập, định tên một

số chủng non-HP từ 89 mẫu bệnh phẩm dạ dày chẩy máu

4.Xác định các loài nấm gây nhiễm dạ dày bằng mẫu dò Beacon

5.Bàn bạc số liệu viết báo tiếng Anh

1.27 chủng H pylori từ

89 mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu 2 2.Các số liệu về tính trạng di truyền cagA và

vacA của các chủng H

pylori đang lưu hành ở

Việt Nam 3.Phân lập và định tên

119 chủng non-HP từ

89 mẫu bệnh phẩm dạ dày chẩy máu

4 Phát hiện sự dịch chuỷển từ nhiễm nấm

C albican, sang nhiễm

nấm C krusei

5.Một bài báo tiếng Anh đang xem xét, 01 bài đang làm thêm để lấy số liệu

sinh Dịch

tễ

Viện Vệ sinh Dịch

tễ

Xác định hình dạng của một số loài vi khuẩn non-

HP dưới kính hiển thường

và điện tử SEM

Ảnh chụp hình dạng của các chủng vi khuẩn non-HP dưới kính hiển

vi thường và điện tử SEM

Y Trung

ương 108

Viện Quân Y Trung ương 108

1 Phân lập các chủng H

pylori từ các bệnh nhân bị

loét tá tràng và xác định các đột biến gây kháng Clarithromycin

2 Bàn bạc số liệu và cùng viết báo

3 Viết 01 bài báo

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án

được

đăng ký

Thuyết

minh

tham gia thực hiện

1 Nguyễn

Thị

Nguyệt

Nguyễn Thị Nguyệt 1 Thực hiện các công việc hành chính của dự án

2.Tuyển chọn 500 bệnh nhân và lấy 500 bệnh phẩm

3.Xác định tỷ lệ nhiễm H

pylori ở ba nhóm bệnh

4 Nghiên cứu tính trạng di truyền gây bệnh CagA,

7 Sản xuất thử các Bộ sinh phẩm

8.Nghiên cứu các điều kiện

sử dụng và bảo quản Bộ sinh phẩm

9.Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên 200 mẫu sinh phẩm

10 Tham gia viết tổng kết

11 Tham gia viết báo tiếng Việt

1 Hoàn thành 2.Chọn được 589 bệnh nhân và lấy 589 bệnh phẩm

3.Tỷ lệ nhiễm H pylori

ở ba nhóm bệnh 4.Các số liệu về tính trạng gây bệnh cagA

và vacA của các chủng

H pylori đang lưu

hành 5.Phân lập 27 chủng

HP, 119 chủng non-HP

và định tên & tỷ lệ nhiễm

6.Xác định tên của 11 loại nấm

7 Mười bộ sinh phẩm 8.Các điều kiện sử dụng và bảo quản bộ sinh phẩm

9.Kết quả thử nghiêm trên 250 mẫu sinh phẩm

10.Hoàn thành bản tổng kết tổng hợp 11.Một bài tiếng Anh đang xem xét, 04 bài báo tiếng Việt đã được đăng, 01 bài báo đăng trong Proceeding hội nghị Quốc tế về Tiêu hóa ở Đông Nam Á

2 Nguyễn

Thị Hồng

Hạnh

Nguyễn Thị Hồng Hạnh

1 Viết đề cương 2.Viết muời chuyên đề

3.Nghiên cứu tính trạng di

1.Hoàn thành 2.Hoàn thành 3.Các kết quả nghiên

truyền gây bệnh CagA,

6.Thiết kế các cặp mồi và mẫu dò huỳnh quang MB

cho H pylori và C krusei

7.Thiết kế Kit chẩn đoán bội nhiễm vi sinh vật dạ dày

8.Thiết kế mẫu mã Bộ sinh phẩm

9.Sản xuất thử các Bộ sinh phẩm

10.Nghiên cứu điều kiện sử dụng và bảo quản Bộ sinh phẩm

11.Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên 200 mẫu sinh phẩm

12 Đưa ra các biện pháp đề phòng và điều trị vi sinh vật gây bội nhiễm dạ dày

13.Viết tổng kết tổng hợp 14.Viết 01 báo tiếng Anh

và 0.3 bài báo tiếng Việt

15.Hướng dẫn 02 nghiên cứu sinh

cứu tính trạng gây bệnh cagA và vacA

4.Phân lập 27 chủng H

pylori,119 chủng

non-HP và định tên & tỷ lệ nhiễm

5.Xác định tên của 11 loại nấm

6.Thiết kế xong cặp mồi và hai mẫu dò MB đặc thù

7.Bộ sinh phẩm với chỉ dẫn sử dụng

8.Mẫu mã của Bộ sinh phẩm

9 Mười bộ sinh phẩm 10.Các điều kiện sử dụng và bảo quản bộ sinh phẩm

11.Thử nghiêm trên

250 mẫu sinh phẩm 12.Đề nghị biện pháp

đề phòng & điều trị nhiễm vi sinh vật dạ dày

13.Bản tổng kết tổng hợp

14 Một bài báo tiếng Anh, 04 bài báo tiếng Việt đã đăng,

15 Hai tiến sĩ bảo vệ năm 2010 và 2011

3 Dương

Thu

Hương

Dương Thu Hương 1.Nghiên cứu tính trạng di truyền gây bệnh CagA,

nấm dạ dày

4 Nghiên cứu điều kiện sử dụng và bảo quản Bộ sinh phẩm

5.Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên 200 mẫu sinh phẩm

6 Tham gia viết tổng kết 7.Tham gia viết 01 báo tiếng Anh và 2 bài báo tiếng Việt

3.Xác định tên của 11 loại nấm dạ dày

4.Các điều kiện sử dụng và bảo quản bộ sinh phẩm

5 Kết quả thử nghiêm trên 250 mẫu sinh phẩm

6 Bản tổng kết

7.Một bài tiếng Anh đang được xem xét, 02 bài báo tiếng Việt đã đăng, 01 bài đã được đăng trong Proceeding Hội nghị Quốc tế về Tiêu hóa Đông Nam Á lần 9 năm 2012

4 Nguyễn

Văn

Thịnh

Nguyễn Văn Thịnh

1.Khám nội soi và lựa chọn

500 bệnh nhân 2.Lấy 500 sinh thiết dạ dày

và lưu trữ cho nghiên cứu

3.Thực hiện 500 test thử urease

1.Chọn589 bệnh nhân

2 Lấy 589 sinh thiết

và lưu trữ cho nghiên cứu

3.Thực hiện 500 test thử urease

5 Trần Văn

Hợp Trần Văn Hợp 1.Chuyển đúc và vùi nến 500 mẫu sinh thiết dạ dày

2.Tiến hành nghiên cứu mô bệnh học

1.Đã hoàn thành chuyển đúc và vùi nén

500 mẫu sinh thiết

2.Tiến hành nghiên cứu

Nghiên cứu hình dạng của một số chủng vi khuẩn non-

HP bằng kính hiển vi điện

tử SEM

Xác định hình dạng của các chủng vi khuẩn non-HP.dưới SEM

7 Guillerm

IPP Guillermo IPP 1.Phân lập H pylori và vi khuẩn non-HP+ định tên

2.Nghiên cứu hình thái của các chủng vi sinh vật dưới

1.Hướng dẫn và cùng

phân lập 27 chủng H

pylori và 119 chủng vi

khuẩn và định tên

5.Viết báo cáo chung về nghiên cứu trong thời gian làm việc tại Mỹ hè 2011

6.Cùng viết bài báo tiếng Anh

2.Xác định đa số các vi khuẩn non-HP là gram dương

3.Hướng dẫn nghiên cứu một số tính trạng

di truyền cagA, vacA,

Glm, IR của H pylori 4.Tham gia xác định C

krusei trong sinh thiết

dạ dày

5.Cùng viết báo cáo nghiên cứu và một bài báo đang được xem xét

Perlin 2,Yanan Z

1.Thiết kế mẫu dò Beacon

và các điều kiện phân tích

2.Xác định các vi sinh vật gây bệnh bằng kỹ thuật Beacon

3.Cùng bàn luận viết bài báo tiếng Anh

1.Năm mẫu dò Beacon xác định nấm gây bệnh

thuộc chi Candida

2.Phát hiện các vi sinh vật với các mẫu dò MB 3.Một bài đã được gửi xem xét đăng

Thị Thanh Bình

Sử lý số liệu viết báo về nhiễm nấm 01bài báo tiếng Anh đã được gửi xem xét

Song

Nghiên cứu tính kháng Clairthromycin của H

điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn,

số lượng người tham gia )

Thực tế đạt được (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên

tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia )

1 Học phương pháp lấy bệnh phẩm

dạ dày trên bệnh nhân trong 15 Hoàn thành khóa học

New York, một đoàn, 3 người

Đã tiến hành các nghiên cứu trong hai tháng 6 và 7 /2011 tại Đại học Tổng hợp New York và ở Viện y tế cộng đồng New Jersey (Hoa Kỳ)

- Lý do thay đổi (nếu có)

Năm 2012, không có đoàn vào do GS Guillermo IPP bận giảng dạy không sang Việt Nam được

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị

hoạch

Thực tế đạt được

Người, cơ quan thực hiện

13

Các nội dung, công việc thực

hiện chủ yếu 8 / 2009 1 / 2010 8 / 2009 1 / 2010 Viện CNSH

2 Lấy sinh thiết dạ dày bằng

phương pháp nội soi và lưu trữ

cho nghiên cứu

8/2010-Đại học Tổng hợp New York (Mỹ)

4 Nghiên cứu tính trạng di truyền

gây bệnh CagA, VacA chủng 1-12/2010 1-12/2010 Viện CNSH

H pylori phân lập từ các bệnh

nhân thuộc ba nhóm bệnh

5 Phân lập các vi khuẩn gây

nhiễm ở điều kiện kị khí và xác

định tỷ lệ nhiễm

8/2010 6/2011

8/2010 6/2011

1.Bệnh viện Bưu Điện

2.Đại học Y Hà Nội

6 Nghiên cứu xác định các tổn

thương dạ dày và sự hiện diện

của các vi sinh vật (H pylori,

nấm, vi khuẩn khác) trong sinh

thiết dạ dày bằng phương pháp

10 Thiết kế các mẫu dò Beacon và

các điều kiện phân tích

2/2012 2/2012 Viện CNSH

11 Thiết kế, chế tạo và sản xuất

sinh phẩm chẩn đoán bội

nhiễm vi sinh vật dạ dày

1/2012 1/2012 Viện CNSH

12 Thiết kế mẫu mã Bộ sinh

13 Nghiên cứu điều kiện sử dụng

và bảo quản Bộ sinh phẩm 1- 4/2012 1-4/2012 Viện CNSH

14 Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên

17 Viết báo cáo tổng kết 6/2012 6/2012 Viện CNSH

- Lý do thay đổi (nếu có): Không

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Qui trình sản xuất Kít chẩn đoán sử

2 Báo cáo phân tích hiệu quả của bộ

sinh phẩm chẩn đoán sử dụng mẫu dò

Beacon

3 Đề xuất một số phương pháp điều trị

các bệnh dạ dày do nhiễm vi sinh vật

phẩm Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản)

1 Bài báo - 03 bài báo trong

nước - 05 bài báo -Tạp chí khoa học tiêu hóa Việt Nam V(19):

1265-1272 (2010)

- Tạp chí Y học thực hành

712 ( 4): 20-22 (2010) -Tạp chí Y dược lâm sàng

8 (3) 669:14-23 (2011)

-01 bài báo nước ngoài

-01 bài báo với Mỹ đang đệ trình

-01 bài báo đang làm thêm để đăng

-Tạp chí khoa học Tiêu hóa Việt Nam VII (27): 1783-1789(2012)

-Tạp chí y học Medical Mycolgy ( Hoa Kỳ) đang nhận xét bài báo về

1 Tiến sĩ

Bệnh viện Bưu Điện (2010) 2.Tiến sĩ Nguyễn Thị Nguyệt, Viện CNSH (2011)

3.Cử nhân Dương Thu Hương, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội (2010)

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng

Kết quả

Số TT Tên sản phẩm đăng ký Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ

Các cán bộ khoa học tham gia dự án đã nắm vững, làm chủ được nhiều kỹ thuật y sinh học ở mức độ quốc tế như:

1.Phân lập và định tên thành thạo các vi sinh vật bằng giám định gen 16S rARN

2 Thiết kế thành thạo các mẫu dò Beacon và điều kiện qPCR

3 Sử dụng tin sinh học trong nghiên cứu y sinh học

Trong quá trình thực hiện dự án, các nhà khoa học Việt Nam đã trao đổi kinh

nghiệm, bí quyết kỹ thuật trong nuôi cấy H pylori, thiết kế mẫu dò phân tử MB cũng

25/3/2012 Tiến độ triển khai của Nhiệm vụ cho đến

thời điểm kiểm tra cơ bản là đạt yêu cầu

Cụ thể:

- Thu thập 589 mẫu bệnh phẩm

- Phân lập được 119 chủng vi sinh vật từ mẫu bệnh phẩm và xác tên chúng bằng kỹ thuật giám định gen

- Xác định tên 11 loài nấm trong dạ dày người bệnh bằng phương pháp giám định gen

-Xác định sự hiện diện của nấm C krusei

trong người bệnh bị viêm dạ dày xuyết huyết bằng phương pháp nuôi cấp thông thường và qPCR với mẫu dò phân tử đặc thù

- Có một cơ sở dữ liệu về quần thể vi sinh vật có trong dạ dày người bệnh

- 01 quy trình sản xuất Bộ sinh phẩm chuẩn đoán nhiễm vi sinh vật dạ dày

- 03 bài báo đã đăng và 02 nghiên cứu sinh đã bảo vệ thành công luận án tiến sỹ

- Một cử nhân thủ khoa Đại học Khoa học

Tự nhiên Hà Nôi Dương Thu Hương đạt giải nhất về nghiên cứu khoa học tại trường Đại học Tự nhiên Hà Nội năm

2009

III Nghiệm thu cơ sở 6/2012 - Nghiệm thu 01 quy trình sản xuất Kit

chẩn đoán nhiễm vi sinh vật dạ dày

- Nghiệm thu đề tài cấp cơ sở

Chủ nhiệm đề tài

(Họ tên, chữ ký) Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

TS Nguyễn Thị Nguyệt PGS.TS Trần Đình Mấn

MỤC LỤC

Helicobacter pylori

a Các đặc điểm sinh học

b Hệ gen của vi khuẩn

c Độc tố protein VacA (vacuolating cytotoxin- gene A)

d Đọc tố màng ngoài HP1125

e Độc tố protein CagA (cytotoxin – associated gene A)

h Xác định tình trạng nhiễm H pylori (HPstatus) của bệnh nhân

29

Nấm Candida

a Hai dạng sinh học của nấm Candida

b Các loài nấm Candida gây bệnh cho người

c Bệnh học

d.Các loài nấm Candida đã tìm thấy trong dạ dày người bệnh

e Các phương pháp phát hiện nấm Candida

Tình hình nghiên cứu nhiễm vi sinh vật dạ dày ở Việt Nam 38

Các nguyên nhân dẫn đến nhiễm vi sinh vật của dạ dày 39

Mẫu dò Beacon và ứng dụng trong qPCR

a.Phát minh mẫu dò Beacon

b.Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của một mẫu dò Beacon

c Ứng dụng của các mẫu dò Beacon

41

Sơ đồ nghiên cứu

a.Nghiên cứu tình trạng nhiễm H pylori và nhiễm vi sinh vật dạ dày

ở các bệnh nhân bị viêm, loét và ung thư dạ dày

b.Nghiên cứu chế tạo Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm vi sinh vật,

dạ dày, sử dụng đầu dò dựa trên công nghệ Beacon,

a Thiết bị máy móc

b Hóa chất nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu

a Test thử urease

b Nuôi cấy H pylori

c Nuôi cấy vi khuẩn non-HP và xác định tính khử nitrate và nitrite

m Nghiên cứu hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi

- Kính hiển vi thường Olympia

- Kính hiển vi điện tử quét SEM

n Xác định tên của vi khuẩn non-HP

- qPCR phát hiện H pylori và C krusei

- Xây dựng đường chuẩn test phát hiện H pylori và C krusei

- Tính độ nhậy và độ đặc thù lý thuyết của các phản ứng PCR

- Nghiên cứu bảo quản Bộ sinh phẩm

46

Nhiễm H pylori

a.Tỷ lệ nhiễm H pylori trong các nhóm bệnh nhân

b.Khảo sát kiểu gen CagA và VacA của các chủng H pylori

55

Nhiễm vi khuẩn non-HP

a Phân lập các chủng non-HP

b.Hình dạng các chủng non-HP dưới kính hiển vi thường và SEM

c Định tên các chủng vi khuẩn non-HP

d Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn non-HP

e.Một số điểm sinh học của các chủng vi khuẩn non-HP

56

a Phát hiện nấm trong dạ dày

b Xác định tỷ lệ nhiễm nấm trong dạ dày

c Xác định tên của một số loại nấm dạ dày

Nghiên cứu 2 ( trên 89 bệnh nhân)

a.Một số đặc điểm sinh học của các bệnh nhân

b.Nghiên cứu điều kiên nuôi cấy và phân lập các chủng H pylori

c.Xácđịnh HP status (tình trạng nhiễm H pylori ) của các bệnh nhân

d.Nghiên cứu các gen đóng vai trò gây bệnh của 27 chủng H pylori

d1 Khảo sát vùng IR nằm giữa các gen hjp0153 và jhp0152

- Trình tự đầu 3’ gen cagA của một số chủng H pylori

- So sánh đọan 3’ của gen cagA ở mức độ ADN

- So sánh đọan 3’ của gen cagA ở mức độ protein

d3 Khảo sát gen HspA mã hóa cho protein sốc nhiệt của vi khuẩn

d4 Khảo sát các kiểu gen VacA mã hóa cho độc tố protein vacA

- Phân bố kiểu gen vacA s/m

-Trình tự một số đoạn gen vacA m và vacA s

e Nghiên cứu các đột biến trên gen 23S rARN gây kháng kháng sinh

Clarithromycine

g Định tên các loài vi khuẩn non-HP

68

Cặp mồi PCR và mẫu dò MB phát hiện H pylori và C krusei

a Thiết kế mẫu dò MB phát hiện H pylori

- Xác định đoạn ADN đích trên gen HP1125 của H pylori

- Mẫu dò MB cho H pylori

- Xác định độ nhậy lý thuyết Se và đặc thù Sp của phản ứng qPCR

- Thiết kế điều kiện phản ứng qPCR phát hiện H pylori

b Thiết kế mẫu dò MB phát hiện C krusei

- Xác định ADN đích trên vùng ITSI của C krusei

- Mẫu dò MB cho C krusei

- Xác định độ nhậy lý thuyết Se và đặc thù Sp của phản ứng qPCR

-Thiết kế điều kiện phản ứng qPCR phát hiện C krusei

c Đường chuẩn qPCR

91

Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm phát hiện nhiễm vi sinh vật dạ dày

a.Chuẩn bị các dung dịch gốc cho Bộ sinh phẩm

b.Chuẩn bị các dung dịch của Bộ sinh phẩm

c.Thành phần Bộ sinh phẩm

96

d.Hướng dẫn sử dụng Bộ sinh phẩm.

Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trên 250 mẫu bệnh phẩm

a Xác định Cadida krusei trong 125 mẫu bệnh phẩm

b Xác định H pylori trong 125 mẫu bệnh phẩm.

- Biên bản ghi nhớ hợp tác nghiên cứu giữa Việt Nam và Mỹ

- Các bài báo đã đăng

- Các nghiên cứu sinh và cử nhân đại học đã bảo vệ

110

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt

H pylori Helicobacter pylori Vi khuẩn dạ dày

16SrARN 16S ribsomal ARN 16S rARN

ADN Deoxyribonucleic Acid Acid deoxyribonucleic

VacA Vacuolating cytotoxin Antigen Độc tố tạo không bào

EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid Ethylen diamin tetraacetic acid

HP1125 HP1125 membrane protein Protein màng HP1125

IACR International Agency

for Research of Cancer Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế IL-2, IL-8 Interleukin -2, Interleukin - 8 Interleukin- 2, Interleukin- 8

NoHPA Non Helicobacter pylori Agar Non-H pylori agar

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi TAE Tris- Acetic –Acid EDTA Tris- Acetic –Acid EDTA SEM Scanning –Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 Khu hệ vi khuẩn ở trong đường tiêu hóa của người

Hình 2 Bản đồ di truyền của H pylori

Hình 3 Cấu trúc ba chiều của protein vacA (a) gen vacA mã hóa cho vacA 140 kDa Hình 4 Protein HP1125 được xác định nằm trên bề mặt của H pylori bằng phương

pháp miễn dịch đánh đánh dấu vàng

Hình 5 Thể nang tách từ bề mặt của Helicobacter pylori chứa protein CagA (Nguyễn

Thị Hồng Hạnh và cs)

Hình 6 Western đồ trên huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm H pylori

Hình 7 Tính đa hình của H pylori trong các quần thể dân cư địa lý

Hình 8 Hai dạng sinh học của Canadida albican: dạng tế bào sợi (8a) và dạng tế bào

giống nấm men (8b)

Hình 9 Phát hiện các loài nấm gây bệnh bằng kỹ thuật ADN microarray

Hình 10 Phân lập các vi khuẩn non-HP và nấm Candida từ các bệnh nhân bị viêm dạ

dày mãn tính

Hình 11.Hệ thống phân tích Heidelberg xác định chính xác tình trạng giảm tiết HCl

của dạ dày

Hình 12 Mô hình cổ điển của một mẫu dò MB do Fred Kramer và đồng nghiệp thiết

kế 20 năm trước đây (1) Chất phát tín hiệu huỳnh quang Fluorophore (2) Chất làm tắt tín hiệu huỳnh quang quencher

Hình 13 Mẫu dò Beacon phát tín hiệu huỳnh quang khi chuyển từ cấu trúc đóng (1)

sang cấu trúc (2) gắn với đoạn ADN đích

Hình14 Phát hiện các đột biến trên gen rpoB gây kháng rifampin của M tuberculosis

bằng các mẫu dò MB

Hình 15 Phát hiện H pylori bằng Helicotest

Hình 16 Cấu tạo của các mẫu dò MB phát hiện H pylori và C.krusei

Hình 17 Các chủng vi khuẩn non-HP trên đĩa thạch TSA

Hình 18 Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn và nấm phân lập từ các bệnh nhân viêm

chẩy máu dạ dày dưới kính hiển vi Olympia, độ phóng đại x 100

Hình 19 Hình ảnh của một số vi khuẩn non-HP dưới kính hiển vi điện tử SEM

Hình 20 Nhiều loại vi khuẩn non-HP phân lập từ dạ dày người bệnh có họat tinh

Hemolysin

H×nh 21 Phát hiện nấm trong dạ dày bằng phương pháp PCR khuyếch đại vùng ITSII

của nấm từ ADN sinh thiết dạ dày

Hình 22 Phân tích PCR xác nhận vùng IR của 27 chủng H.pylori Việt Nam có kích

thước khoảng 235 cặp bazơ

Hình 23 Cây phả hệ liên kết các chủngH pylori Việt Nam (từ số 83-109) và 66 chủng

nhận từ phía Mỹ

Hình 24 Cây phả hệ liên kết các chủng H pylori Việt Nam (từ số 83-109) và các

chủng trên toàn thế giới

Hình 25 Đầu 3’ của gen cagA trong 27 chủng H pylori có thể khác nhau về kích

thước

Hình 26 Khảo sát gen HspA của 27 chủng H pylori Việt Nam

Hình 27 Đoạn ADN đich (1) trên gen HP1125 của H pylori

Hình 28 Cấu trúc và tính chất quang học của mẫu dò MB đặc thù cho H pylori Hình 29 Đoạn ADN đich (1) trên vùng ITSI của C krusei

Hình 30 Cấu trúc và tính chất quang học của mẫu dò MB đặc thù cho C krusei

Hình 31 Đường chuẩn q PCR

Hình 32 Nấm C krusei được phát hiện và định lượng bằng qPCR với mẫu dò MB

PHẦN II KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIÊM VỤ

LỜI NÓI ĐẦU

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng như ở nhiều nơi trên thế giới, các

bệnh dạ dày liên quan đến Helicobacter pylori (H pylori) đã và đang được điều trị

kết quả nhờ sử dụng phác đồ chống tiết và kháng sinh Tuy nhiên, thật không may,

các chủng H pylori kháng thuốc đã xuất hiện, làm giảm hiệu lực diệt trừ của thuốc

và vì vậy, bệnh nhân không được điều trị triệt để Theo TS Nguyễn Văn Thịnh (Bệnh viện Bưu Điện), Amoxicilline là kháng sinh được sử dụng thường xuyên trong điều

trị diệt H pylori, nhưng vào năm 2010, tỷ lệ các chủng kháng thuốc đã đạt 23.7%,

cao hơn nhiều so với các nước Châu Âu, Mỹ, Tây Á, Hồng Công, Nhật Bản và cao hơn một chút ít so với Hàn Quốc [1a]

Viêm dạ dày do nhiễm H pylori lâu ngày không được điều trị triệt để dẫn tới

giảm tiết acid dạ dày, tạo điều kiện cho các loại vi sinh khuẩn non-HP ưa kiềm có khả năng chuyển hóa Nitrite thành các chất tiền ung thư N-nitroso [3-6] Sự phát triển của nhiều loại nấm trong dạ dày người bệnh thiếu acid dạ dày cũng được ghi nhận trong y

văn thế giới, trong đó có C albicans, C tropical C parapsilosis, C glabrata và C

krusei Nhiễm H pylori tăng nguy cơ ung thư dạ dày gấp 6 lần, trong khi đó ở các

bệnh nhân bị thiếu acid trong dịch vị dạ dày, nguy cơ ung thư dạ dày tăng gấp 4.7 lần nữa, tức là gấp khoảng 30 lần [7-8]

Ở Việt Nam, hiện tượng nhiễm vi sinh vật dạ dày đã được bắt đầu nghiên cứu

rất sớm từ những năm 2000 Nấm Candida được tìm thấy dưới đáy ổ loét dạ dày của

một bệnh Việt nam bởi GS Tạ Long và TS Trịnh Tiến Dũng (Bệnh viện Trung ương Quân đội 108) Cũng vào thời gian đó, PGS-TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh (Viện Công nghệ Sinh học) và cố PGS-TS Nguyễn Kim Giao (Viện Vệ sinh dịch tễ học Trung ương) đã phân lập được một số vi khuẩn kỵ khí từ bệnh phẩm dạ dày một bệnh nhân

bị bệnh viêm dạ dày mãn tính và đã chụp các vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử [1b] Muộn hơn, PGS-TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh và TS Nguyễn Thị Nguyệt tìm thấy 2

loài nấm trong sinh thiết dạ dày, một trong số đó là Candida parapsilosis - loài nấm

gây bệnh đã biết trong y học [1c]

Như thế, sự có mặt của các vi sinh vật gây bệnh khác ngoài H pylori và các vi

sinh vật cư trú thường xuyên trong dạ dày người bệnh Việt Nam là một hiện tượng thực đang tồn tại Trong y văn thế giới, hiện tượng đã được dự đoán nhiều năm về trước bởi GS Zboril V [2] và GS Corea [1] và được gọi là sự phát triển vượt trội của các vi sinh vật dạ dày

Nhiễm vi sinh vật dạ dày hay sự phát triển vượt trội của các vi sinh vật khác tạo các nguy cơ mới đối với sức khỏe của con người, rõ nhất là ung thư dạ dày và nhiễm trùng xâm lấn của nấm dẫn tới nhiễm nấm máu gây tử vong và tàn phế Theo

PGS-TS Trần Văn Thuấn, Phó giám đốc Bệnh viện K, hiện nay ở Việt Nam, các bệnh ung thư, trong đó có ung thư dạ dày có xu hướng tăng Không rõ, có mối liên quan

nào giữa nhiễm H pylori và nhiễm các loại vi khuẩn dạ dày với thực trạng nói trên?

Nếu có, chắc chắn cần phải phát hiện chúng để điều trị trúng và triệt để bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào hai mục tiêu:

1 Nghiên cứu tình trạng nhiễm H pylori và các vi sinh vật non-HP trong dạ dày của

các bệnh nhân bị viêm, loét và ung thư dạ dày

2 Chế tạo Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm vi sinh vật dạ dày, sử dụng đầu dò dựa trên công nghệ Beacon

TỔNG QUAN

Khu hệ vi sinh vật dạ dày của người

Sự ra đời của một đứa trẻ sơ sinh đồng nghĩa với sự từ giã môi trường hầu như hoàn toàn vô khuẩn trong bụng mẹ để thâm nhập vào thế giới mới đầy các loại vi sinh

vật hoang dã:chỉ 24 tiếng sau khi sinh, các loại vi khuẩn Enterobacteriaceae,

Enterococcus, Lactobacillus, vi khuẩn gây thối Clostridium và Staphylococcus đã

xuât hiện trong phân của trẻ sơ sinh 3-4 ngày sau, số lượng Enterobacteriaceae,

Enterococcus và các vi khuẩn gây thối giảm dần cùng với sự xuất hiện của Bifidobacterium Một khu hệ vi sinh vật với số lượng lên tới 1011 tế bào trên một gram phân đã được hình thành nhanh chóng trong hệ tiêu hóa của con người

Số lượng vi khuẩn trong khu hệ vi khuẩn ở dạ dày người bình thường có khoảng từ 102 đến 104 tế bào/gram chất dịch và thay đổi khi đi xuống phần dưới của hệ tiêu hóa Dựa vào thời gian lưu trú của các vi sinh vật trong dạ dày, người ta chia chúng thành 2 loại:

(i) loại vi sinh vật cư trú thường xuyên

(ii) loại vi sinh vật sống vãng lai hoặc đi ngang qua dạ dày

Dịch vị dạ dày người khỏe mạnh lúc đói có pH khoảng 4-5 Khi thức ăn đi vào, dịch dạ dày pH 1-2 được tiết để tiêu hóa thức ăn Dưới tác dụng của acid dạ dày, các vi sinh vật đi kèm thức ăn chết gần hết, số sống sót sẽ cùng thức ăn chuyển xuống phần dưới tá tràng và ruột non Ở đây, độ acid của dịch vị được trung hòa nên các loài vi khuẩn mới phát triển tiếp

Khu hệ vi khuẩn dạ dày ở trẻ em và người lớn khá giống nhau, gồm các loài vi

khuẩn ưa axít thuộc các chi Lactobacillus, Streptococcus ở mức khoảng 102 - 103 tế bào/gram dịch dạ dày Tuy nhiên, thành phần của hệ vi sinh vật có thể bị biến đổi do tuổi tác, thói quen ăn uống, các yếu tố miễn dịch, thuốc điều trị [9] Cho đến nay, hệ vi sinh vật dạ dày vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Theo Dore J có khoảng 60 - 80% vi

khuẩn không thể nuôi cấy được Do vậy, ông đã đề nghị khuếch đại gen 16S rRNA của

chúng trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR và tạo dòng các đoạn ADN vào vector, sau đó giải trình tự để định tên của chúng Các vi sinh vật tìm thấy bởi Dore

thuộc ba nhóm chính Bacteroides, Clostridium coccoides và Clostridium leptum [10]

Các nghiên cứu tương tự cũng được tiến hành trong phòng thí nghiệm của GS Blaser, Trường Đại học tổng hợp New York: ông đã tìm thấy 128 loài vi khuẩn dạ dày, chủ

yếu thuộc họ Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, và

Fusobacteria và có khoảng 10% các loài chưa hề được định loại thuộc các họ Caulobacter, Actinobacillus, Corynebacterium, Rothia, Gemella, Leptotrichia, Porphyromonas, Capnocytophaga, TM7, Flexistipes, và Deinococcus [11]

Hệ vi khuẩn dạ dày ở người tiết acid bình thường, người nhiễm H pylori lâu

ngày, người dùng kháng sinh, người bị thiểu năng tiết acid có thành phần rất khác nhau, thay đổi theo tuổi tác của con người Mặt khác, số lượng các loài vi khuẩn vãng lai có thể nhiều hơn các loài cư trú thường xuyên Không rõ, sự thay đổi xẩy ra đến

mức độ nào? Có một điều chắc chắn, số lượng các vi khuẩn sẽ tăng ở những người trẻ

và giảm ở người cao tuổi Hình 1 là biểu đồ giới thiệu khu hệ vi khuẩn trong đường tiêu hóa của người Các vi khuẩn có số lượng nhiều nhất ở manh tràng và trực tràng, ít nhất ở dạ dày

Hình 1 Khu hệ vi khuẩn ở trong đường tiêu hóa của người

Helicobacter pylori

H pylori là vi khuẩn Gram âm không tạo bào tử, có lông roi ở một đầu được cấu

tạo từ một sợi được bao bọc bởi lớp vỏ bên ngoài có tác dụng bảo vệ khỏi axít dạ dày Dưới kính hiển vi, vi khuẩn có hình xoắn cong, đường kính khoảng 0,3 – 1 µm, dài 1,5

-10 µm Ngoài ra, đôi khi cũng gặpH pylori ở dạng hình cầu coccoid Vị trí của H

pylori trong bậc thang tiến hóa của sinh giới như sau:

Giới (regnum): Bacteria

Ngành (phylum): Proteobacteria Lớp (classis): Epsilon Proteobacteria

H pylori có khả năng sống kiên định hàng chục năm trong dạ dày của người và có

thể nuôi được trên môi trường đơn giản ở nhiệt độ 370C trong môi trường hiếu khí và

vi hiếu khí Trong dạ dày người, H pylori sống trong lớp màng nhầy niêm mạc dạ dày

Trong điều kiện pH dạ dày khoảng 1-2, vi khuẩn đã thiết lập một loạt các cơ chế thích nghi để sống sót và tương tác chặt chẽ với vật chủ

b Hệ gen của vi khuẩn

Genome của H pylori là một nhiễm sắc thể mạch vòng có kích thước khoảng

1.67 megabazơ Đó là một tập hợp tối thiểu các gen mã hóa cho các protein tham gia

vào quá trình trao đổi chất của vi khuẩn [12] Kích thước genome của H pylori ~ 1/3 kích thước genome của E coli và gần giống với genome của H influenza (hình 2)

Các phân tích trình tự cho thấy, genome của vi khuẩn dạ dày có tỷ lệ (G+C) là 39% [13-14] được chia thành 5 vùng khác nhau, mỗi vùng có một tỷ lệ (G+C) đặc

trưng riêng Tại một số vùng, người ta tìm thấy yếu tố nhảy IS 605 Đảo bệnh lý cag

(cag PAI) - một locus di truyền có nguồn gốc ngoại lai dài khoảng 40 kb được tìm thấy

trong genome của H pylori loại I, trong khi đó các vi khuẩn loại II không mang locus

di truyền này Cag PAI mang khoảng 40 gen, trong đó có 6 gen tương đồng với gen

của vi khuẩn Bordetella pertussis, Rickettsia prowazekii, Brucella suis, Agrobacterium

tumefaciens, Escherichia coli và Legionella pneumophila mã hoá cho các thành phần

của hệ tiết loại IV chuyển các phân tử có cấu trúc phức tạp qua màng vi khuẩn tới vùng ngoại bào hoặc vào trong các tế bào khác

Các chủng H pylori có thể mang các kiểu gen và các kiểu hình khác nhau do

đột biến và dễ tiếp nhận các ADN từ bên ngoài Các nghiên cứu về các đoạn lặp lại ở chủng J99 cho thấy sự tham gia của cơ chế sửa chữa sợi trượt là một trong các nguyên

nhân dẫn đến sự khác biệt về các kiểu gen và kiểu hình của H pylori

Sau khi giải mã toàn bộ trình tự genome của vi khuẩn, các nhà khoa học nhận thấy khoảng 1% genome của chúng mã hoá cho 30 protein màng ngoài đóng vai trò quan trọng trong mối tương tác giữa vi khuẩn và các tế bào biểu mô dạ dày Các

protein màng ngoài có thể sử dụng làm vacin phòng ngừa nhiễm H pylori

c Độc tố protein VacA

VacA là một độc tố protein của H pylori Khi mới được tổng hợp, protein vacA

có phân tử lượng 140 kDa, nhưng sau đó đầu N’ và C’ của protein bị cắt khỏi phân tử tiền vacA dẫn tới hình thành độc tố vacA trưởng thành mang hai vùng p55 và p33

Hình 2 Bản đồ di truyền của H pylori Vòng

tròn lớn ngoài chia các vùng mang mã theo màu sắc, vòng 2: là vùng mang mã từ sợi âm, vòng 3, 4: màu đỏ là IS, rARNs màu xanh, vòng 4, 5: màu xanh là tRNAs, màu đỏ là rARNs và sARNs

với các chức năng khác nhau: vùng p33 ở đầu N’ gây không bào hoá tế bào dạ dày, còn vùng p55 ở đầu C’ gắn vào màng tế bào giúp vacA đi vào bên trong tế bào chủ (hình 3) Độc tố protein VacA làm thay đổi tính thấm màng ty thể, hoạt hoá các protein kinase, ức chế quá trình trình diện kháng nguyên, ức chế hoạt hoá tế bào miễn dịch T

Độc tố vacA chứa 2 vùng biến đổi s và m

-Vùng s: peptide tín hiệu, gồm kiểu allen s1 và s2, trong đó allen s1 tồn tại các kiểu s1a, s1b và s1c

- Vùng m: kiểu allen m1, m2a, m2b

Các chủng H pylori mang kiểu gen vacA khác nhau do tái tổ hợp ngẫu nhiên

giữa các vùng s và vùng m Các bệnh viêm, loét hoặc ung thư dạ dày liên quan tới kiểu

gen vacA Theo Altherton, các chủng vi khuẩn có kiểu hình gen CagA+/VacA s1 có

khả năng gây bệnh cao hơn so với các chủng mang cấu trúc di truyền khác [19-21]

d Protein màng ngoài HP1125

Gen HP1125 mã hóa cho protein màng ngoài HP1125 của H pylori mang tính đa

hình thấp Protein HP1125 có trọng lượng phân tử khoảng 22 kDa nằm ở màng ngoài vi khuẩn (hình 4) và thường được tiết vào bên ngoài tế bào ở dạng thể nang

e Độc tố protein CagA

CagA là một trong các gen nằm trên đảo bệnh lý cagPAI của H pylori Gen cagA

mã hoá cho độc tố protein CagA có khối lượng phân tử dao động từ 120 – 140 kDa,

phụ thuộc vào số đoạn lặp ở vùng biến đổi đầu 3’của gen cagA CagA được vi khuẩn

H pylori tiết ra ở dạng thể nang và thâm nhập vào trong tế bào biểu mô dạ dày (hình

4), ở đó protein gây hàng loạt các phản ứng dẫn tới tăng tiết IL- 8 của tế bào, dẫn đến

viêm nhiễm Các bệnh nhân bị nhiễm H pylori mang gen cagA+ có tần số đột biến gen p53 cao hơn so với bệnh nhân bị nhiễm H pylori mang cagA-

Hình 3 Cấu trúc ba chiều của protein

vacA (a) gen vacA mã hóa cho vacA 140

kDa Toxin thành thục gồm hai vùng p33và p55 Vùng trung gian m1 và m2 của vacA nằm ở p55 (b) p55 có cấu hình β-helix (c) Đọan cuối của β-helix (theo

Kelly A Gangwer et al PNAS October 9,

2007 vol 104 no 41 16293-16298)

g Độc tố protein CagA

CagA là một trong các gen nằm trên đảo bệnh lý cagPAI của H pylori Gen cagA mã hoá cho protein CagA có khối lượng phân tử dao động từ 120 – 140 kDa, phụ

thuộc vào số đoạn lặp ở vùng biến đổi ở đầu 3’của gen Protein CagA được vi khuẩn

H pylori tiết ra ở dạng thể nang thâm nhập vào bên trong tế bào biểu mô dạ dày (hình

5), ở đó protein gây hàng loạt các phản ứng dẫn tới tăng tiết IL- 8 của tế bào Các

bệnh nhân bị nhiễm H pylori mang gen cagA+ có tần số đột biến gen p53 cao hơn so với bệnh nhân bị nhiễm H pylori mang cagA-

Theo các nhà khoa học Nhật Bản, protein CagA sau khi đi vào vào biểu mô dạ

dày gắn với protein SHP-2 (SCR homology 2 domain containing tyrosine phosphatase)

và làm thay đổi biểu hiện và hoạt động của các gen của vi khuẩn Được biết, SHP- 2

đóng vai trò quan trọng trong phát triển ung thư dạ dày ở giai đoạn sớm

g Các phương pháp ph

H pylori là loài vi khuẩn siêu biến nên cho đến nay, các nhà khoa học vẫn còn

nỗ lực để tìm ra các phương pháp tốt hơn phát hiện vi khuẩn và các bệnh liên quan Các phương pháp phát hiện được chia thành hai nhóm:

1 Nhóm xâm phạm: Nhóm phương pháp cần sinh thiết dạ dày để nuôi cấy vi khuẩn

hoặc tách chiết ADN Tuy có độ tin cậy cao, nhưng nhóm xâm phạm gây nhiều khó chịu cho bệnh nhân khi lấy bệnh phẩm Các phương pháp thuộc nhóm bao gồm:

- Nghiệm pháp urease

- Phương pháp mô bệnh học

- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kết hợp lai Southern

- Nhuộm Gram và soi kính hiển vi

- Phương pháp sinh học phân tử như PCR phát hiện một gen đặc thù gây

bệnh của H pylori như cagA, vacA, urease B…

Hình 5 Thể nang tách từ bề mặt của Helicobacter

pylori chứa protein độc tố CagA (Nguyễn Thị Hồng

Hạnh và cs)

Hình 4 Protein HP1125 được xác định nằm trên bề

mặt của H pylori bằng phương pháp miễn dịch đánh

đánh dấu vàng

(Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cs)

0

2 Nhóm không xâm phạm: Xác định H pylori gián tiếp qua tìm kháng thể kháng vi

khuẩn hay xác định các sản phẩm chuyển hoá đặc thù của chúng Các test thử nghiệm

dễ sử dụng, không gây đau đớn cho bệnh nhân nhưng có độ đặc thù và đặc hiệu thấp

Hình 6 Western đồ trên huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm H pylori Các tín hiệu

Western được quét trên ImageMaster VDS-CL) Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cs)

h Xác định nhiễm H pylori ( HPstatus) ở các bệnh nhân

Xác định HPstatus của một bệnh nhân là một vấn đề không đơn giản, vì vi khuẩn (i) khó nuôi cấy và (ii) đa dạng về mặt sinh học (Hình 7) Người ta sử dụng

các phương pháp như (i) nuôi cấy (ii) mô bệnh học (iii) tìm kiếm các kháng thể của

H pylori trong huyết thanh người bệnh (iv) xác định một số chỉ thị sinh học của H pylori bằng các phương pháp sinh học phân tử Phương pháp xác định H pylori bằng

phản ứng Elisa cho kết quả kém nhất

Hình 7 H pylori lưu hành trên thế giới được chia

thành các quần thể hpEurope, hpAsia2, hpNEAfrica, hpAfrica2, hpAfrica1, hspWAfrica, hspSAfrica, hpEAsia, hspAmerind, hspMaori và

hspEAsia (theo Nature 445:915-918)

Nấm Candiđa

Trong những năm gần đây, nhiễm nấm Candida ở các bệnh nhân bị phẫu thuật

hoặc đang được chăm sóc trong các phòng cấp cứu ở bệnh viện đã trở thành mối quan

tâm lớn ở Mỹ và các nước Châu Âu, vì bệnh có tỷ lệ chết đến 50% [15-16] Nâm

Candida đứng hàng thứ bốn trong số các vi sinh vật được phân lập từ máu của các

bệnh nhân [17] Các triệu chứng nhiễm Candiđa dạ dày rất đa dạng, chủ yếu là mệt

mỏi, trào ngược acid dạ dày, lưỡi màu trắng, đau ở vùng thượng vị, thiếu máu, dị ứng Ở các bệnh nhân có hệ thống miễn dịch yếu hoặc sử dụng kháng sinh lâu ngày,

nhiễm Candida có thể dẫn đến nhiễm trùng toàn thân Ngoài ra, các bệnh nhân có thể

bị nhiễm nấm C albican, C tropicalis, C parapsilosis

a Hai dạng sinh học của Candida

Candida có thể tồn tại ở hai dạng (i) nấm men (yeast- like) vô hại với con người

và (ii) tế bào sợi (fungal cell) gây bệnh cho con người Hình 8 là ảnh chụp Candida

albica ở dạng nấm men (8a) và dạng sợi (8b) Khi được nuôi cấy trên môi trường

chuẩn phòng thí nghiệm, C albican có hình tròn và hình bầu dục Khi C albican được

nuôi trên môi trường giống các điều kiện sinh lý của vật chủ, chúng phát triển ở dạng

tế bào sợi có khả năng tấn công mô niêm mạc Trong invivo, các tế bào nấm dạng sợi

ác tính xuyên thủng lớp niêm mạc đường tiêu hóa (dạ dày, ruột non) và đi vào máu, gây nhiễm nấm máu (fungal sepsis)

b Các loài nấm gây bệnh cho người

Nấm men Candida sống trên lớp niêm mạc trong khoang miệng, trong thực quản,

trên da và thường vô hại với con người Nấm men Candida trở nên ác tính, tức là có

khả năng gây bệnh khi cơ chế miễn dịch của con người thay đổi Ví dụ các bệnh nhân trở nên compromised sau điều trị bằng phóng xạ, bằng liệu pháp kháng sinh, các bệnh nhân AIDS/HIV có hệ thống miễm dịch suy thoái ít có khả năng kiểm tra phát triển

của Candida trong cơ thể họ

8a

Hình 8 Hai dạng sinh học của Canadida albican: dạng tế bào sợi (8a) và dạng tế bào

giống nấm men (8b)

Trong số hơn 150 loài nấm Candida, chín loài được xác nhận gây bệnh cho người là nấm C albicans, C krusei, C parapsilosis, C tropicalis, C lusitaniae, C

glabrata(Torulopsis glabrata), C guilliermondii, C pseudotropicalis và C dubliniensis Nấm Candida albicans gây bệnh thường gặp nhất, chiếm từ 44 đến 71%

các trường hợp bị bệnh Hiện nay, xu hướng dịch chuyển sang nhiễm các chủng nấm

candida không phải là albicans, với các chủng thường được phân lập nhất là Candida

glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, and Candida krusei đang xẩy ra

Các dữ liệu từ kho PATH (Prospective Antifungal Therapy Alliace) từ năm 2004 đến

2008 cho thấy tần suất nhiễm máu do các chủng Candida không phải là albicans cao hơn so với C albicans (54,4% so với 45,6%) Sự dịch chuyển dịch từ nhiễm C albican sang nhiễm các chủng non-Candida albican đòi hỏi có các chế độ điều trị khác nhau

với từng loại nấm để tránh sự phát triển vượt trội của một số loài nấm ác tính như

C.glabrata và C krusei vì chúng kháng fluconazole

c Bệnh học

Hiện tại, Candida là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện theo dòng máu thường gặp đứng vào hàng thứ tư Các chủng Candida thường được gặp nhiều tại các

Khoa Hồi sức tích cực, thậm trí vượt trội hơn hẳn các loại nấm gây bệnh khác Nhiễm

trùng xâm lấn do nấm candida (invasive candidiasis) bao gồm nhiễm máu

(candidemia), viêm nội tâm mạc, viêm màng não và các thể khác của tổn thương tạng sâu (Vd:viêm nội nhãn [endophthalmitis], nhiễm trùng candida nội tạng [hepatosplenic candidiasis]) Tỷ lệ tử vong có thể quy cho tình trạng nhiễm trùng candida xâm lấn đã

được báo cáo có thể lên tới 40 đến 50% Nhiễm nấm Candida chỉ giới hạn ở các mô

niêm mạc Đây cũng là bệnh cơ hội thường gặp ở các bệnh nhân có cơ địa suy giảm

miễn dịch, đặc biệt trên 90% đối tượng nhiễm HIV/AIDs Candida spp còn là tác

nhân đứng hàng thứ tư trong nhiễm khuẩn huyết bệnh viện, chiếm 6,6 – 21% Tỉ lệ tử

vong do nhiễm Candida máu là 26 – 75%[ 17a]

Nấm Candida có mặt trong bất kỳ vùng niêm mạc nào của con người Ở dạng nấm men, Candida vô hại đối với cơ thể, ngay cả khi chúng phát triển vượt trội trong

khoang miệng, thực quản, dạ dày Khi con người chịu áp lực của một vài stress như suy thoái hệ thống miễn dịch, dùng nhiều kháng sinh nấm men chuyển thành dạng

nấm gây bệnh Nấm Candida ác tính tấn công vào bên trong niêm mạc dạ dày hoặc

ruột non, tạo các lỗ rò và đi vào máu, gây nhiễm nấm máu Bệnh nhiễm trùng nấm rất nguy hiểm đến tính mạng con người

Bệnh ở niêm mạc

+Tưa miệng

+ Nhiễm nấm thực quản

+ Viêm âm đạo

- Bệnh ở da và các cơ quan lân cận

+ Viêm da

+ Viêm móng và quanh móng

Bệnh nội tạng

Các bệnh nấm ở trong nội tạng hiếm gặp, chỉ gặp ở những bệnh nhân suy kiệt, có bệnh mãn tính nặng, ung thư, dùng kháng sinh hoặc thuốc ức chế miễn dịch kéo dài, nhất là giai đoạn cuối của bệnh Biểu hiện viêm màng trong tim, viêm màng não, viêm

phổi viêm ruột, gan lách, nhiễm nấm máu…dẫn đến tử vong

d Các loài nấm Candida đã tìm thấy trong dạ dày người bệnh

Nấm Candida được phát hiện trên niêm mạc dạ dày và trong các thành phần

dịch dạ dày ở 54,2% bệnh nhân bị loét dạ dày và 10,3% ở các bệnh nhân bị viêm dạ

dày mãn tính [18] Ngoài Candida albican là loài thường được phân lập nhiều nhất, các nấm C tropicalis, C.parapsilosis, C lusitaniae và C krusei cũng được phát hiện

ngày càng thường xuyên [19] Loét thủng dạ dày (gastric perforation) do hoạt động ác

tính của nấm Candida được biết đến từ lâu Nerman năm 1981 đã thông báo trường hợp của 7 bệnh nhân cao tuổi bị loét dạ dày lành tính mang các sợi nấm Candida dưới

đáy vết loét dạ dày [20] Gần đây nhất, Antonio Cascio và cs đã thông báo về một trường hợp viêm ruột thừa peritonitis thứ cấp do thủng hành tá tràng có căn nguyên là

nấm C krusei [21]

e Các phương pháp phát hiện nấm

Nấm Canđida được phát hiện trong các bệnh phẩm bằng các phương pháp sau:

- Nuôi trên môi trường đặc hiệuCHROMagarCandida(hình 9a)

- Phát hiện nấm trong bệnh phẩm bằng phương pháp sinh học phân tử bằng giám định vùng ITSI và ITSII của nấm

- Các phương pháp miễn dịch học tìm kháng thể của nấm trong huyết thanh người bệnh

Gần đây, các nhà khoa học tại Đại học Tổng hợp Heidelberg (Cộng hoà Liên bang Đức) đã chế tạo thành công chíp ADNmicroarray để phát hiện đồng thời các loài

nấm gây bệnh Qua thử nghiệm MicroChip, đã phát hiện thấy các nấm flavus, A

9a Nấm C.krusei trên môi trường CHROMagar

Candida

Candida albicans → xanh lá cây Candida tropicalis → xanh nước biển ánh kim loại Candida krusei → mầu hồng

2

1

3

fumigatus, C albicans, C dubliniensis, C glabrata, F oxysporum, F solani, R microsporus, S prolificans, và T asahi (hình 9)

Hình 9 Phát hiện các loài nấm gây bệnh bằng kỹ thuật ADN microarray Tín hiệu

dương tính (có nấm trong bệnh phẩm) được chỉ bằng mũi tên

Hiện tượng phát triển vượt trội của các loại vi sinh vật trong dạ dày và các chất Nitroso gây ung thư

a Hiện tượng phát triển vượt trội của các vi sinh vật trong dạ dày

Đời sống của con người liên quan mật thiết với sự xuất hiện hoặc biến mất của

một số loài sinh vật trong hệ tiêu hóa nói chung, trong dạ dày nói riêng Cách đây hơn

50.000, loài người không có H pylori trong hệ tiêu hóa và hiện nay, vi khuẩn dạ dày dần biến mất khỏi cộng đồng dân cư Mỹ và Tây Âu Các nhà khoa học cho rằng, H

pylori dường như chỉ còn là vấn đề của các nước Châu Á [22]

Hệ vi sinh vật dạ dày người (động vật) và các hệ lụy do chúng gây nên đối với

con người phức tạp hơn chúng ta vẫn hình dung Theo GS Zboryl (nhà khoa học người Tiệp), thông thường các loại vi sinh vật kị khí không có trong dạ dày người khỏe mạnh [23] Năm 2001, giáo sư người Nga Bondarenko đã nuôi cấy vi khuẩn ở điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày và đã nhận diện được các loài vi sinh vật thuộc 32 chi như

Helicobacter pylori, nấm Candida, Bacteroides, Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium Năm 2003, Giáo sư công bố thêm các loài Bacillus, Lactobacillus

[24] Khoảng 20% các bệnh nhân nhiễm đồng thời cả H pylori và Candida

albican Các nhà khoa học nhất trí cho rằng, quá trình nhiễm H pylori dẫn đến ung

thư dạ dày xảy ra qua hàng loạt các biến đổi, bắt đầu từ định cư của H pylori trong dạ dày dẫn đến giảm tiết axít, nhiễm vi sinh vật và kết thúc bằng thư dạ dày

b Các hợp chất Nitroso

Các vi khuẩn khử nitrate, nitrite được tìm thấy được trong dạ dày của các bệnh

nhân viêm teo dạ dày loại A hoặc B do H pylori Các chất N-nitroso mà chúng tham

gia tổng hợp đã được chứng minh gây ung thư dạ dày trên chuột [25-29]

N-nitroso là một nhóm 15 chất được hình thành từ phản ứng hóa học của một chất nitroso hóa NOX có nguồn gốc từ muối nitrite hoặc nitơ ôxit (NO) với một chất amine R2NH như trong phương trình:

R2NH + NOX = R2 NNO + HX (1) trong đó, các chất amine có thể là:

1 Cấu trúc của các chất amino

2 Nguồn gốc của các chất nitroso hóa

3 Điều kiện của phản ứng

Phản ứng Liebermann [30] miêu tả quá trình tổng hợp các chất N-nitrosamine như sau: ở điều kiện acid, nitrite tạo nitrous acid (HNO2), chất này bị phân giải thành nitrosonium cation N≡O+ và nước, H2NO2+ = H2O + NO+, sau đó nitrosonium cation tương tác với amine tạo nitrosamine [31]

Các chất nitrosamine có thể được tổng hợp trong dịch dạ dày của con người

Đó là các chất có nguồn gốc nội sinh Như đã biết, các vi khuẩn ở khoang miệng như

Streptococcus mutans và Lactobacillus spp có thể khử nitrate có trong rau, cỏ, thịt,

cá thành các chất nitrite Nitrite sau này lại là tiền chất để tổng hợp nitrosamine Nhiều thực phẩm chứa các amine có thể tương tác với các chất nitrosating để tạo nitrosamine Một số nhà khoa học như Negel lại cho rằng, quá trình nitrate và nitrite hóa trong khoang miệng là bình thường và cần thiết cho hoạt động sinh lý của con người (32-35)

Các nghiên cứu xác định khoảng 25% nitrate đi vào cơ thể được lưu hành trong nước bọt và khoảng 20% trong số đó được chuyển thành nitrite bởi các vi khuẩn trong khoang miệng Trong dạ dày, nitrite (80% có nguồn gốc từ nước bọt và 20% từ thức ăn) bị khử thành các dẫn xuất N-nitroso gây ung thư Ở người khỏe mạnh, pH dạ dày khi đói là ~1 và sau khi ăn là ~3 Hàm lượng Nitrite dao động, đạt khoảng 30 pM sau 1

- 2 giờ ăn Trong điều kiện này, các chất N-nitroso được hình thành từ các axít amin

mạch vòng, urea và peptide Ở người bệnh sau phẫu thuật dạ dày, nhiễm H pylori

mãn tính, thiểu năng aciđ dạ dày hoặc thiếu máu ác tính, các vi khuẩn khử nitrate phát triển vượt mức, làm cho hàm lượng nitrite và các chất N-nitroso tăng đáng kể

Tình hình nghiên cứu nhiễm vi sinh vật dạ dày ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, công tác điều trị các bệnh dạ dày kèm nhiễm H

pylori ở Việt Nam có tiến bộ nhờ sử dụng liệu pháp kháng sinh Tuy vậy ở thời điểm

hiện tại, tỷ lệ chữa khỏi các bệnh thấp, bệnh nhân phải điều trị đi điều trị lại, rất tốn

kém do H pylori đã trở nên kháng thuốc Viêm H pylori lâu ngày sẽ dẫn tới bội

nhiễm vi sinh vật dạ dày

Nấm Canđida dưới đáy ổ loét dạ dày của một bệnh nhân loét dạ dày được tìm

thấy bởi GS Tạ Long và Tiến sỹ Trịnh Tiến Dũng (Quân Y viện Trung ương 108)

những năm cuối thế kỷ 20 TS Nguyễn Thị Nguyệt và cs (Viện Công nghệ Sinh học),

đã xác định 2 loài nấm từ sinh thiết dạ dày người bệnh, một trong số đó là loài gây

bệnh Canđiđa parapsilosis Hình 10a&10b giới thiệu ảnh chụp một chủng vi khuẩn

và nấm Candida phân lập từ sinh thiết dạ dày

a

b

Hình 10 Phân lập các vi khuẩn non-HP và nấm Candida từ các bệnh nhân bị viêm dạ

dày mãn tính

a.Các vi khuẩn non-HP xuất hiện khi phân lập HP

b Chủng nấm BD35 được phân lập từ một bệnh nhân viêm dạ dày mãn tính kèm nhiễm HP (A) Các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch B) Ảnh chụp vi sinh vật dưới TEM (C) Ảnh chụp vi sinh vật dưới TEM của tiêu bản lát cắt siêu

mỏng (D) BDV35 là loài nấm Candida paraplosis (xác định bằng bằng

giám định đoạn ITSII)

Các nguyên nhân dẫn đến nhiễm vi sinh vật của dạ dày

Dạ dày người khỏe mạnh có một hệ vi sinh vật gồm các vi khuẩn cư trú thường

xuyên như H pylori và một số vi sinh vật chịu acid như Lactobacillus và

Streptococuss Trong quá trình sống, hệ vi sinh vật dạ dày thay đổi, đặc biệt ở những

người già hoặc bị nhiễm vi sinh vật khác do những nguyên nhân chính sau đây:

(i) hệ miễn dịch suy yếu đặc biệt ở các các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDs

(iii) sử dụng nhiều kháng sinh hoặc sử dụng nhiều loại thuốc ức chế hệ miễn dịch (iv) bị phẫu thuật dạ dày

(v) bị nhiễm H pylori lâu ngày dẫn đến giảm tiết acid của dạ dày, tạo điều kiện cho

các vi sinh khuẩn khác vãng lai trong dạ dày

350bp