phân tích vi sinh thực phẩm ướt tính tăng trưởng của clostridium perfrigens trong thịt bò nấu chín dưới nhiệt độ dao động

Khái niệm mới dùng để ước tính sự phát triển của vi khuẩn dưới những điều kiện nhiệt độ khác nhau đã được giả định và đánh giá bằng cách sử dụng Clostridium perfringens để kiểm tra vi k

ƯỚT TÍNH TĂNG TRƯỞNG CỦA CLOSTRIDIUM PERFRIGENS TRONG THỊT BÒ NẤU CHÍN DƯỚI

NHIỆT ĐỘ DAO ĐỘNG

GVHD: Trần Thị Mỹ Lệ Phân tích vi sinh thực phẩm

Khái niệm mới dùng để ước tính sự phát triển của vi khuẩn dưới những điều kiện nhiệt độ khác nhau đã được giả định và đánh giá bằng cách sử dụng Clostridium perfringens để kiểm tra vi khuẩn phương pháp mới này sử dụng dựa trên kiểu Gompertz để tính toán thời gian phát triển tương ứng với những nhiệt độ khác nhau, ước tính số lượng vi khuẩn dưới nhiệt độ khác nhau

Phương pháp mới này đã được kiểm tra trên thịt bò dưới những điều kiện nhiệt độ khác nhau Ước lượng một cách chính xác phương pháp này là 1.0 log10(cfu/g) mặc dù phương pháp này dựa trên C perfringens Có nhiều ứng dụng nguồn bệnh do độ độc thực phẩm tới dự đoán sự phát triển của vi khuẩn dưới những nhiệt độ khác nhau

Clostridium perfringens (trước đây gọi là C welchii) là một vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, vi khuẩn bào tử thuộc chi Clostridium Vi khuẩn này phân bố ở khắp nơi trong môi trường và có thể dễ dàng phân lập từ bụi, thịt sống, gia cầm, và trong đường ruột của người và động vật.

Hình ảnh Clostridium perfrigens

Giới thiệu sơ lược về Clostridium perfrigens

Clostridium perfringens là một tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm nghiêm trọng ở Hoa Kỳ và là một mối quan tâm lớn cho các công nghiệp thực phẩm

Các triệu chứng khi nhiễm clostridium perfrigens: viêm dạ dày ruột, đau bụng cấp tính, tiêu chảy

Các triệu chứng thường xuất hiện 8-16h sau khi ăn các thức ăn bị nhiễm khuẩn và có thể kéo dài từ 24-48h

Bào tử của vi khuẩn này chịu nhiệt cao hơn bào tử của Salmonella và Listeria, chúng có thể sống sót ở nhiệt độ nấu ăn bình thường hoặc nhiệt độ sản xuất các sản phẩm như giăm bông, thịt bò nướng, thịt bò muối

Điều kiện yếm khí tạo ra như là một kết quả của oxy cạn kiệt trong khi nấu có thể cho phép các bào tử sinh vật này trong thịt nấu chín và các sản phẩm gia cầm nảy mầm, phát triển nhanh, và nhân rộng đến một liều lượng cao nguy hiển nếu nhiệt độ sản phẩm không duy trì đúng cách

Clostridium perfringens có thể phát triển ở nhiệt độ từ 6oC đến 52oC và nhân lên nhanh chóng ở 30oC và 47oC

Thịt đỏ và gia cầm dễ bị nhiễm Clostridium perfrigens

Khái niệm thời gian tăng trưởng tương đương (EGT)

1 Đường đẳng nhiệt phát triển của vi khuẩn

Trong việc đánh giá sự an toàn của vi khuẩn các sản phẩm thịt nấu chín, vi sinh vật thường phân quá trình phát triển của vi khuẩn thành 4 giai đoạn: giai đoạn tiềm phát(lag phase), giai đoạn logarit(log phase) hay pha chỉ số (exponential phase), giai đoạn ổn định( stationary phase), giai đoạn suy vong(death phase)

Sau giai đoạn cân bằng là giai đoạn suy vong, tuy nhiên người ta thường bỏ qua giai đoạn này kể từ khi thực phẩm được đánh giá là vi sinh vật vượt quá giới hạn để tiêu thụ sau giai đoạn cố định đặc biệt đối với C

perfringens

Do đó, từ quan điểm an toàn thực phẩm, các vi sinh vật tăng trưởng nói chung được mô tả bởi một hàm xích ma, chẳng hạn như hàm Gompertz (Gibson et al., 1987) và tính theo toán học nó có thể được thể hiện như:

L(t)= A+( B –A) exp{- exp[- μ(t - M)]} (1)

Trong đó:

L(t) là số lượng tác nhân gây bệnh tại thời điểm t, log10 (cfu / g)

A là nồng độ tế bào ban đầu

B là nồng độ tế bào tối đa

M là thời gian mà tại đó tốc độ tăng trưởng là tối đa ( h )

μ là tốc độ tăng tưởng tương đối tại thời điểm M (h-1 )

Mặc dù phương trình Gompertz chỉ là phương trình thực nghiệm nhưng nó được ứng dụng rộng rãi và kiểm tra

dự đoán vi sinh vật

Phương trình Gompertz có thể diễn tả chính xác sự phát triển của vi khuẩn từ pha tiềm phát tới pha

log(McDonald and Sun, 1999) Phương trình này thường được ứng dụng nhiều trong vi sinh vật thực phẩm

2 Giả thuyết của EGT ở nhiệt độ khác nhau

Phương trình Gompertz (phương trình 1) được hình thành dưới điều kiện đẳng nhiệt không thể trực tiếp sử dụng để tính toán sự phát triển của vi khuẩn khi có sự thay đổi của nhiệt độ

Sử dụng phương trình Gompertz ước tính sự phát triển của vi khuẩn dưới điều kiện không đẳng nhiệt thì phải dựa trên giả thuyết EGT hoặc tương ứng với độ tăng thời gian dùng để diễn tả và so sánh sự phát triển vi khuẩn dưới điều kiện nhiệt độ khác nhau

Với giới hạn nhiệt độ thấp nhất và cao nhất, sự phát triển và sự nhân lên của tế bào C perfrigens sau khi sinh ra từ bào tử nằm trong thịt bò có thể xem như là một quá trình đẳng nhiệt hoặc bất đẳng nhiệt bởi vì không thể dừng sự phát triển của vi khuẩn Tế bào vi khuẩn có thể dừng sự phát triển trong điều kiện nhiệt độ môi trường nằm ngoài giới hạn nhiệt độ tối thiểu hoặc tối đa…

Giả thuyết cho rằng mẫu ban đầu nằm tại nhiệt độ T1 tại thời điểm t1 và sau đó tới nhiệt độ T2 cho tại thời điểm khác Sự phát triển của vi khuẩn trong giai đoạn ủ bệnh có thể được tính toán từ phương trình Gompertz ( Phương trình 2):

L1(t)= A+( B –A) exp {- exp [μ1 – (t1 – M1)]} (2)

Sau khi nhiệt độ được thay đổi, tế bào vi khuẩn sẽ tiếp tục phát triển và nhân lên từ điểm kết thúc của thời gian ủ bệnh đầu tiên Nồng độ tế bào ban đầu cho thời gian ủ bệnh thứ hai nên được L1(t)

Để tính toán các vi khuẩn phát triển sau khi nhiệt độ thay đổi, người ta cho rằng sự phát triển ở nhiệt độ T1 cho thời gian ủ bệnh của t1 là tương đương với mức tăng trưởng quá trình ở điều kiện nhiệt độ khác (T2) cho một thời gian ủ bệnh của te, được thể hiện ở phương trình sau:

L1(t)= A+( B –A) exp{- exp [- μ2 - (te – M2)]} (3)

Các vi khuẩn tăng trưởng dưới T2 trong khoảng thời gian ∆t sau khi nhiệt độ thay đổi có thể được xác định từ:

L2(t1+∆t)= A+( B –A) exp{- exp [- μ2 – (t2 + Δt – M2 )] (4)

EGT (te) của 2 điều kiện đẳng nhiệt có thể tính toán từ nhiều giai đoạn (tiềm phát, logarit, ổn định ) của vi sinh vật

Trong phương trình(3), te là EGT(thời gian tăng trưởng tương đương) và là cơ sở cho việc tính toán của vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ dao động điều kiện

Nguyên liệu và phương pháp

1 Sinh vật thử nghiệm và mẫu ủ

Có 3 mẫu C.perfrigens là NCTC 8238(Hobbs serotype 2), NCTC 8239 (Hobbs serotype 3) và NCTC 10288 (Hobbs serotype 3) ở nhiệt độ (-20 oC) với khối lượng mỗi mẫu là 5.00 gam

2 Nghiên cứu sự phát triển của C.perfrigens

Các mẫu thịt bò đông lạnh được giải đông qua đêm trong tủ lạnh (40C) tiếp theo gia nhiệt ở 750C trong mỗi cốc nước trong 20 phút để kích hoạt các bào tử và để vô hiệu hóa bất kì tế bào thực vật gây ô nhiễm

Sau một thời gian ngắn rửa bằng nước (khoảng 200C trong vòng 1-2 phút) để làm nguội thịt trong túi nhựa, mẫu được ủ ở 300C, 360C, 450C để có đường cong tăng trưởng đẳng nhiệt

Mẫu từ mỗi nhiệt độ ủ được dùng để xác định nồng độ tế bào vi khuẩn Ít nhất ba thí nghiệm độc lập được tiến hành

để tạo ra một đường cong tăng trưởng dẳng nhiệt

Mặc dù thí nghiệm có thể được thực hiện ở bất kì nhiệt độ trong giới hạn của mức tối thiểu và tối đa nhiệt độ

C.perfringens, sinh vật này có thể tăng trưởng ở mức tương đối nhanh ở nhiệt độ lựa chọn trong nghiên cứu này

Mẫu đã được biến đổi giữa 2 quá trình ủ ở 2 phạm vi nhiệt độ (30-45oC hoặc 45-36oC) của vi khuẩn

C.perfrigens trong thịt bò đã nấu chín

3 Xác định nồng độ tế bào C perfringens:

Dùng búa cao su đập miếng thịt thành những miếng nhỏ Sau đó mẫu được cho vào máy MiniMix Stomacher trộn đều trong vòng 12 phút để đảm bảo tạo sự đồng nhất cho mẫu thịt

Sau khi đồng nhất mẫu, lấy một lương nhỏ (0,1-0,5ml) của phần chất lỏng đem pha loãng với 0,1% vô trùng

peptone nước và được cấy trong một đĩa SFP thạch

Sau khi cấy, cho vào mỗi đĩa SFP 10ml dung dịch vừa chuẩn bị

Khi lớp thạch SFP cứng lại, các đĩa sẽ được đặt trong một buồng yếm khí có CO2, N2, H2 (85%:10%:5%) và

ủ ở 370C trong vòng 24-48h Nông độ lạc khuẩn xác định sẽ được tính và ghi lại sau khi ủ

4 Phân tích các đường cong tăng trưởng

Số lượng đĩa C perfringens sẽ được chuyển thành dạng log10 giá trị và phân tích hồi quy phi tuyến tính để số liệu tăng trưởng phù hợp với mô hình Gompertz( phương trình 1)

Do sự đồng nhất của các bào tử trong thịt bò mẫu, dựa vào tất cả các số liệu tăng trưởng thực nghiệm độc lập ở cùng nhiệt độ tăng trưởng cũng tạo ra mô hình Gompertz cho nhiệt độ đó

Ba mô hình Gompertz cho mỗi điều kiện đẳng nhiệt (300C, 370C, 450C, tương ứng) được tạo ra độc lập trong nghiên cứu này

5 Ước tính vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ biến động

Để ước tính sự tăng trưởng của C perfringens trong thịt bò nấu chín ở điều kiện nhiệt độ dao động, các thời gian tăng trưởng tương đương được sử dụng tính toán trong phương trình (3):

L1(t)= A+( B –A) exp{- exp [- μ2 - (te – M2)]} (3)

Sự phát triển sau khi nhiệt độ thay đổi được sử dụng tính toán trong phương trình (4):

L2(t1+∆t)= A+( B –A) exp{- exp [- μ2 – (t2 + Δt – M2 )] (4)

6 Phân tích các lỗi dự đoán

Từ các số liệu tăng trưởng thu được từ thực nghiệm và những sai sót về sự tăng trưởng liên quan đến mô hình đại diện cho một quá trình tăng trưởng, các lỗi tích lũy và phát triển trong dự đoán sự tăng trưởng của

C perfringens ở điều kiện nhiệt dao động

Những sai sót trong việc lập đự đoán tốc độ tăng trưởng của C perfringens có thể được xác định bằng một phương trình phân tích, được thể hiện:

1. Đường cong tăng trưởng đẳng nhiệt

Số lượng bào tử được cấy ban đầu trung bình là 2,03 log10 ( Cfu/g) với sai số là 0.05%

Tất cả các đường cong tăng trưởng đẳng nhiệt để xây dựng mô hình Gompertz với độ chính xác tương đối caoMỗi mô hình Gompertz pha lag (λ ) và tốc độ tăng trưởng ( K) có thể xác định bằng công thức sau

Trong đó : K là tốc độ phát triển,

λ là sự trễ pha

e là cơ số logarit nê pe :

Kết quả và thảo luận

 Sự phát triển của vi khuẩn trong giai đoạn đầu ,trong các thí nghiệm ta có thể quan sát được nồng độ vi sinh vật giảm chậm

 Sự suy giảm số lượng tế bào trong pha lag trên đường cong tăng trưởng có thể gây ra vấn đề tính toán khi hồi quy phi tuyến tính để có được phương trình Gompertz

 Nếu nguyên liệu ban đầu được sử dụng , nồng độ tế bào ban đầu ( A ) thấp thì việc tính toán để ước tính sự tăng trưởng của vi khuẩn theo mô hình bị sai sót

 Vì vậy thực tế trong nghiên cứu này bỏ qua sự suy giảm nguyên liệu ban đầu

• Để kiểm tra giả thuyết EGT dưới các điều kiện đẳng nhiệt khác nhau, một loạt các thí nghiệm đã được tiến hành với sự thay đổi nhiệt

độ ủ bệnh của các vi khuẩn ở các giai đoạn phát triển khác nhau

• Tiến hành thí nghiệm ở 3 nhiệt độ 30oC , 36oC , 45oC

• Hình 3 mô tả sự ảnh hưởng của nhiệt độ trên sự phát triển của C.perfringens trong thịt bò nấu chín Trong tất cả các thí nghiệm này , nhiệt độ ban đầu của các mẫu là 30oC và cuối cùng là 45oC

• Sau đây là kết quả tính toán được theo các phương trình trên.

 Theo kết quả thì nhiệt độ càng cao giá trị M càng nhỏ tức là thời gian mà tốc độ phát triển đạt cực đại càng ngắn làm cho tốc độ tăng K càng lớn

2 Xác nhận các khái niệm về thời gian tăng trưởng tương đương

Để kiểm tra giả thuyết của EGT trong điều kiện đẳng nhiệt khác nhau, một loạt các thí nghiệm được tiến hành với một bước thay đổi trong nhiệt độ ủ bệnh ở các giai đoạn khác nhau của vi khuẩn phát

triển hình 3 mô tả ảnh hưởng của một bước thay đổi trong nhiệt độ ủ trên sự phát triển của C

perfringens trong thịt bò nấu chín Trong tất cả các nghiên cứu này, các mẫu ban đầu được ủ ở 30o C

và sau đó tại 45o C

hình 3 A-C Ước tính sự tăng trưởng của C perfringens khi thay đổi trong nhiệt độ bằng cách sử dụng khái niệm của EGT.

•Các sai sót tuyệt đối ước tính của giả thuyết này là thông thường trong 71 log10 (cfu / g), ngoại trừ một số dữ liệu điểm trong các thí nghiệm nơi nhiệt độ đã được chuyển lúc 2 giờ sau khi thời gian ủ bệnh đầu tiên

hình 4 Các lỗi tuyệt đối dự toán tương ứng với các đường cong tăng trưởng hình 3.

• Những thí nghiệm này đại diện cho sự thay đổi nhiệt độ trong giai đoạn trễ của thời gian

ủ bệnh đầu tiên Lỗi ước tính lớn hơn (≈1.8 log10 (cfu / g)) đã được quan sát trong vòng 2 giờ đầu tiên của giai đoạn ủ bệnh thứ hai Đối với C perfringens, thay đổi nhiệt độ ủ bệnh trong pha lag có thể gây thêm

3 Phần so sánh với mô hình tuyến tính

- Để dự đoán về hoạt tính sinh học, sử dụng mô hình tuyến tính ba phân đoạn (phương trình (8)) thường được sử dụng để mô tả các

vi khuẩn phát triển đẳng nhiệt Mô hình tuyến tính ba phân đoạn thể hiện sự biến đổi trong các pha : lag, log, và cân bằng của một đường cong tăng trưởng đẳng nhiệt

• Các thông số, K và l, trong các mô hình tuyến tính được lấy từ phương trình Gompertz

• Ước tính sự phát triển của vi khuẩn phải xem xét tình trạng sinh lý của vi khuẩn Khi sử dụng mô hình tuyến tình thì nhiệt độ

có thể thay đổi tại bất kì thời điểm nào trên đường cong sinh trưởng Đối với sự chuyển đổi nhiệt độ trong pha lag , Li và Torres (1993) đã đề xuất một phương pháp để đánh giá việc kết thúc pha lag trong điều kiện nhiệt độ khác nhau

Các giả định cơ bản của Li và phương pháp Torres dựa trên sự phát triển liên tục của các vi khuẩn Họ giả định rằng quá trình tăng trưởng trong pha lag không phụ thuộc vào nhiệt độ Dưới điều kiện đẳng nhiệt, sự ủ bệnh chỉ đóng góp

1 phần nhỏ vào thay đổi của pha lag nếu nhiệt độ ủ bệnh biến đổi trước khi kết thúc pha lag

fλi = ti /λi

Khi tất cả các phân đoạn của pha lag đã trở thành một sự thống nhất, pha lag được hoàn thành

Fλ = ∑ N i=1 fλ1

Theo ông Li và Torres(1993), sự thích ứng của pha lag sẽ bắt đầu với fλ1 = 0 và được hoàn thành khi fλ = 1

Trong đó: ti là thời gian ủ bệnh ở thời điểm T1

Fλ là hệ số hoàn thành pha lag

 Cũng cần phải xem xét sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên ốc độ tăng trưởng trong giai đoạn logatit ( pha log ) Theo (1995) Baranyi ,tốc độ tăng trưởng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, và các vi khuẩn ngay lập tức sẽ thích ứng với nhiệt độ môi trường mới như thay đổi nhiệt độ ủ Nếu các vi khuẩn phát triển đạt đến giai đoạn ổn định ( pha cân bằng ) nồng

độ tế bào sẽ trở nên phụ thuộc vào nhiệt độ

 Dựa trên các giả định của Li và Torres (1993) và Baranyi (1995), ước tính sự phát triển của vi khuẩn theo biến động nhiệt độ bằng cách sử dụng mô hình tuyến tính và so sánh với khái niệm EGT trong hình 5

 Đối với C perfringens trong thịt bò, các mô hình tuyến tính có thể ước tính chính xác những vi khuẩn phát triển trong điều kiện nhiệt độ dao động Tuy nhiên, các mô hình tuyến tính sẽ đánh giá quá cao những quần thể vi khuẩn tại các khu vực chuyển tiếp giữa các giai đoạn logarit ( pha log ) và giai đoạn ổn định ( pha cân bằng )

Sử dụng mô hình tuyến tính để biết được giai đoạn nào thì nồng độ của vi khuẩn ko thay đổi, giai đoạn nào thay đổi, ở giai đoạn 3 thì nồng độ không còn phụ thuộc vào nhiệt độ nữa.

4 So sánh với phương pháp Zwietering

• Zwietering và cộng sự (1994) cũng đã đề xuất một phương pháp để ước tính sự tăng trưởng của vi khuẩn theo sự biến đổi của nhiệt độ bằng cách sử dụng mô hình Gompertz sửa đổi

Các tác giả đưa ra giả thuyết rằng sự thay đổi nhiệt độ sẽ dẫn đến sự gia tăng 25% trong pha lag Nếu sự biến đổi nhiệt

độ xảy ra trong pha lag của thời gian ủ bệnh đầu tiên, thì pha lag phải được hoàn thành khi vi khuẩn này được ủ dưới nhiệt độ ủ thứ hai

• Theo Zwietering và cộng sự (1994), giai đoạn tiềm phát của thời gian ủ bệnh thứ hai (λshift ) có thể được tính từ biểu thức

λshift = (1.25- fλ1 ) λ2 (11)