phân tích vi sinh thực phẩm hướng dẫn kĩ thuật elisa

Lịch sử ra đời phương pháp elisaKỹ thuật gắn kết enzyme với kháng nguyên hay kháng thể được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B.. Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển

Lê Thị Thuý

Trần Quốc Toàn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: HƯỚNG DẪN KĨ THUẬT

ELISA

Lịch sử ra đời phương pháp elisa

Kỹ thuật gắn kết enzyme với kháng nguyên hay kháng thể được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B Pierce

Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn kháng nguyên và kháng thể trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các đĩa) nhờ đó mà kháng nguyên hay kháng thể không được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa trôi.

Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Anton Schuurs và Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) dựa trên tất cả những bước phát triển nói trên Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971.

Các khái niệm

Phương pháp ELISA: (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) hay EIA (Enzyme Immuno Assay): là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một

enzyme

Kháng thể: là các phân tử immunoglobulin (có

bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ,

chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus Mỗi kháng thể chỉ

có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất.

Kháng nguyên: là phân tử kích thích đáp ứng miễn

dịch của cơ thể, đặc biệt là sản xuất kháng thể Thông thường kháng nguyên là một protein hay một

polysaccharide , nhưng nó cũng có thể là bất cứ loại

phân tử nào , mang các phân tử hapten nhỏ và gắn với một protein chuyên chở.

Phân loại

Elisa trực tiếp

Elisa gián tiếp

Sandwich elisa

Phản ứng

ức chế/

cạnh tranh

Phân loại

Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất

 Ưu điểm: Đơn giản nhất

 Nhược điểm:

• Độ đặc hiệu bị giới hạn

• Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng.

Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp

ELISA gián tiếp

- Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme).

- Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.

- Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm

Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp

Sandwich ELISA

• Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi

là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies)

3/8/15

Phản ứng ức chế /cạnh tranh

• Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời.

sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh

Kỹ thuật elisa

Giới thiệu

IdEXX sản xuất bộ dụng cụ xét nghiệm chuẩn đoán để phát hiện các bệnh trong động vật nhai lại, ngựa, lợn và gia cầm.

Xét nghiệm miễn dịch enzyme (ELISA) là một trong những nhạy cảm nhất và các công nghệ tái sản xuất có sẵn.Những xét nghiệm là nhanh chóng, đơn giản để thực hiện dễ dàng và

tự động

BỘ DỤNG CỤ ELISA

• Một bộ ELISA là một tập hợp các chất phản ứng được tiêu chuẩn hóa và microwell tấm sản xuất cho một thử nghiệm cụ thể

• IdEXX ELISA bộ dụng cụ có thể chứa một số hoặc tất cả các thành phần sau: Các tấm phủ (tấm rắn/ hoặc dải), pha loãng mẫu, điều khiển, rửa tập trung, liên hợp, bề mặt và ngăn chặn giải pháp

Bộ dụng cụ IDEXX được sản xuất theo từng lô, mỗi lô Đều phải tuân theo tiêu chuẩn, chất lượng nghiêm ngặt Mỗi thành phần hoặc thuốc thử trong rất nhiều bộ được tối ưu hóa để làm việc với các hóa chất khác có trong bộ này, bao gồm: dụng

cụ để đo độ nhạy, độ đặc hiệu và lặp lại

 Vì vậy, điều quan trọng là không để pha

trộn chất phản ứng từ rất nhiều bộ khác nhau

BỘ DỤNG CỤ ELISA BAO GỒM

Tấm (đĩa) tráng

Pha loãng mẫu

Hợp lại (kết hợp, phối trộn)

Chất nền

Rửa Tập trung

Giải pháp ngăn chặn

Thiết bị kỹ thuật ELISA

- Thiết bị để thử nghiệm ELISA được sử dụng phổ biến rộng rãi.

- Dưới đây là một phác thảo ngắn gọn về một số thiết bị có sẵn để thực hiện các thử nghiệm ELISA.

ống hút đơn kênh, ống hút

Hệ thống rưả trôi Máy ELISA đọc tấm

Thiết bị bảo dưỡng và hiệu chuẩn

Việc duy trì và hiệu chuẩn thiết bị cho thí nghiệm của bạn là cực kỳ quan trọng trong việc cho ra kết quả chính xác, đưa vào trong sản xuất Bảo trì và hiệu chuẩn Lịch trình dựa theo.

Thiết bị khi vận hành phải Luôn phải tuân thủ theo hướng dẫn, khuyến nghị của nhà sản xuất

Các giao thức chuẩn

Thiết bị luôn luôn cần phải được hiệu chuẩn theo một thông số thích hợp Vì nếu thiết bị đó không được hiệu chuẩn có thể tạo

ra kết quả sai hoặc không chính xác

Tham khảo các cách bảo trì và hiệu chuẩn Lịch trình và hướng dẫn của nhà sản xuất cho các giao thức chuẩn thích hợp và tần số yêu cầu

Lựa chọn thông số Đo đạc cho pipett

Thực hiện các phương pháp trọng lực

Sử dụng một hệ thống hiệu chỉnh tự động thương mại như máy tính cá nhân PCS® , Sản xuất bởi Artel Trọng lực Pipet Thủ tục hiệu chỉnh, để biết thêm thông tin

Xử lý Thuốc thử

- Một số bộ dụng cụ thử nghiệm khuyên rằng tất cả các chất phản ứng

và các tấm được đưa đến nhiệt độ phòng (18-25 C) trước khi sử dụng.

Dụng cụ thí nghiệm phải được vô trùng, hoặc làm sạch

Nếu tái sử dụng lại thì nên để riêng biệt

CÁC BƯỚC THỰC HIỆN TRONG PHƯƠNG PHÁP ELISA

GIÁN TIẾP

 Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng

 Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào

các giếng khác

 Thêm dung dịch protein không tương tác

(non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu

chuẩn).

 Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết

trước) vào tất cả các giếng của đĩa

 Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody)

 Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư

sẽ được loại bỏ

 Thêm cơ chất

Ứng dụng của phương pháp elisa

- Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như

y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học

Trong thực phẩm

- Phương pháp Elisa có thể phát hiện và

định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh.Phát hiện yếu tố gây dị ứng thực phẩm như sữa, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và trứng

- Phát hiện độc tố trong tảo Phát hiện vi

khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, sán lá gan… trong thực phẩm

Trong y học

• Ứng dụng trong xét nghiệm HIV.

• Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu

vi B và C, bệnh ung thư.

• Ứng dụng để phát hiện bệnh A cantonensis

(bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh

ở phổi chuột gây ra.

• Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở

miền Trung-Tây Nguyên