tìm hiểu bệnh do vi khuẩn bacillus sp. gây ra trên cá chẽm lates calcarifer (bloch, 1790) nuôi tại khánh hòa

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả xét nghiệm tác nhân gây bệnh trên các mẫu cá chẽm nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa...22 Bảng 3.2: Kết quả phân lập và định lượng vi khuẩn từ thức ăn viên dùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ MỸ DUNG

TÌM HIỂU BỆNH DO VI KHUẨN Bacillus sp GÂY RA TRÊN CÁ CHẼM Lates calcarifer

(Bloch, 1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA

Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn “Tìm hiểu bệnh do vi khuẩn Bacillus sp gây ra trên

cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa” là công trình nghiên

cứu của tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào

Học viên

Võ Thị Mỹ Dung

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang, khoa sau Đại học, Viện Nuôi trồng Thủy đã luôn quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

TS Nguyễn Hữu Dũng, Giám đốc Trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản- trường Đại học Nha Trang, đã định hướng, chỉ dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài hoàn thành chương trình cao học

Th.S Trần Vĩ Hích, phó Giám đốc Trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản, đã luôn cho tôi những lời khuyên quý báu, động viên khích lệ tôi trong thời gian tôi hoàn thành chương trình cao học

Các cô, chú, anh, chị là nhân viên của Trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản

đã tạo một môi trường làm việc thân tình, giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài ở trung tâm

Xin gửi lời cám ơn các anh, chị trong lớp cao học quốc tế Rwanda

CHNT2012-3, lớp cao học nuôi trồng thủy sản CHNT2012-2 và các bạn bè tôi đã luôn động viên

và giúp đỡ tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn

Sau cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình tôi đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình tôi hoàn thành chương trình học cao học

Nha Trang, ngày 25 tháng 6 năm 2014

Học viên

Võ Thị Mỹ Dung

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1.Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm 3

1.2.Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam .4

1.2.1.Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 4

1.2.2.Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam 5

1.3.Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm 6

1.3.1.Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá chẽm trên thế giới .6

1.3.2.Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm ở Việt Nam 8

1.4 Một số đặc điểm của nhóm vi khuẩn Bacillus và tổng quan bệnh do vi khuẩn Bacillus gây ra .9

1.4.1.Đặc điểm của nhóm vi khuẩn Bacillus .9

1.4.2.Bệnh do vi khuẩn Bacillus gây ra trên động vật thủy sản 11

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

2.2.Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 14

2.2.2 Phương pháp thu mẫu 15

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng 15

2.2.3.1 Phương pháp kiểm tra các tác nhân gây bệnh 15

2.2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn trong thức ăn 16

2.2.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn 16

2.2.3.4 Phương pháp xác định độc lực 17

2.2.3.5 Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học 19

2.2.3.6 Phương pháp xác định độ nhạy của vi khuẩn với kháng sinh 19

2.2.4 Xử lý số liệu 20

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1.Kết quả nghiên cứu 21

3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp .21

3.1.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ cá chẽm bệnh .21

3.1.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ thức ăn .23

3.1.2 Đặc điểm và kết quả định danh các chủng vi khuẩn Bacillus sp .24

3.1.3 Kết quả thí nghiệm xác định độc lực 27

3.1.4 Kết quả kiểm tra mô học cá chẽm nhiễm bệnh sau khi cảm nhiễm .31

3.1.5 Kết quả kháng sinh đồ .34

3.2.Thảo luận 34

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 39

4.1.Kết luận 39

4.2.Đề xuất ý kiến 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả xét nghiệm tác nhân gây bệnh trên các mẫu cá chẽm nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa 22 Bảng 3.2: Kết quả phân lập và định lượng vi khuẩn từ thức ăn viên dùng cho cá chẽm 23

Bảng 3.3 : Một số đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn Bacillus

sp phân lập từ cá chẽm bệnh và thức ăn .25

Bảng 3.4: Độ nhạy của chủng vi khuẩn B cereus phân lập từ cá chẽm bệnh ở Khánh

hòa với 12 loại kháng sinh được phép dùng trong nuôi trồng thủy sản .34

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cá chẽm Lates calcarifer……… 3

Hình 1.2 Sản lượng và giá trị cá chẽm nuôi thế giới từ năm 1989 - 2012 5

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 14

Hình 2.2: Quy trình nghiên cứu mô bệnh học .19

Hình 3.1: Dấu hiệu bệnh lý lở loét cơ (a) và xuất huyết gan (b) của cá chẽm bệnh nuôi ở khu vực Khánh Hòa 21

Hình 3.2: Đặc điểm về hình thái của các chủng vi khuẩn Bacillus sp đã phân lập được: khuẩn lạc trên TSA+ 2% NaCl (a) và trên BA + 5% máu cừu (b); tế bào vi khuẩn nhuộm Gram (c) và nhuộm bào tử (b) 24

Hình 3.3: Đặc điểm sinh hóa của chủng CRB170613 trên kit API 20E (a), trên môi trường thủy phân tinh bột (b) và trên môi trường thủy phân casein (c) .26

Hình 3.4: Tỷ lệ chết tích lũy của cá chẽm ở những nồng độ vi khuẩn khác nhau khi dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng chủng vi khuẩn CRB170613 và chủng TAOC3 .27

Hình 3.5: Dấu hiệu bệnh lý của cá chẽm khi gây nhiễm bằng cách tiêm xoang bụng: xuất huyết vây (a); xuất huyết nội quan, tích dịch xoang bụng (b) .28

Hình 3.6: Tỷ lệ chết tích lũy của cá chẽm khi dẫn truyền bằng phương pháp tiêm cơ vi khuẩn CRB170613 và TAOC3 29

Hình 3.7: Dấu hiệu bệnh lý của cá chẽm khi gây nhiễm bằng phương pháp tiêm cơ: vùng cơ trên lưng hoại tử mờ đục, nội quan xuất huyết (a), cá bi hoại tử lở loét tại vùng tiêm (b) .29

Hình 3.8: Tỷ lệ tích lũy cá chẽm biểu hiện hoại tử, lở loét cơ khi dẫn truyền bằng phương pháp tiêm cơ ở những nồng độ vi khuẩn khác nhau chủng vi khuẩn CRB170613 và chủng vi khuẩn TAOC3 30

Hình 3.9 Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn B cereus tiêm vào cơ và tỉ lệ cá chẽm biểu hiện các dấu hiệu tổn thương cơ 30

Hình 3.10: Mô học của thận cá chẽm khỏe (a) và các biến đổi mô bệnh học ở thận cá

chẽm bệnh do B cereus 31

Hình 3.11: Mô học của gan cá chẽm khỏe (a) và các biến đổi mô bệnh học của tổ chức

gan cá chẽm bệnh gây bởi B cereus .32

Hình 3.12: Mô học của lách, não cá chẽm khỏe (a) (c) và các biến đổi mô bệnh học

của lách, não, cơ cá chẽm bệnh gây bởi B cereus 33

LD50 (Lethal Dose 50%) Liều gây chết 50%

ID50 (Infective dose 50%) Liều gây nhiễm 50%

ppm (Part per million) Một phần triệu

rpm (Round per minute) Vòng trên phút

MỞ ĐẦU

Cá chẽm Lates calcarifer, loài cá có tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ nuôi, năng suất

nuôi cao; là một đối tượng nuôi quan trọng ở nhiều nước trên thế giới Ở Việt Nam,

Lates calcarifer đã từng được xem là một đối tượng thay thế khi nghề nuôi tôm sú đi

vào giai đoạn suy thoái do dịch bệnh lan tràn và đóng vai trò như một trong những loài

cá “xoá đói giảm nghèo” cải thiện thu nhập cho nhiều hộ nông dân.Với ưu thế sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện nước ta và sản phẩm thịt phi lê đông lạnh có thể xuất khẩu ra thị trường thế giới với giá cao, cá chẽm đã và đang chứng tỏ loài cá này là một đối tượng tiềm năng đem lại lợi ích kinh tế cao Hiện nay đối tượng này đang được phát triển cả về diện tích cũng như các mô hình nuôi ở nhiều vùng trong cả nước

và có mặt trong danh sách một trong những loài cá biển được nuôi chủ yếu ở nước ta Một trong những vật cản thách thức sự phát triển nghề nuôi cá chẽm là dịch bệnh Đồng thời với sự phát triển của nghề nuôi cá chẽm, tần số xuất hiện của bệnh trên cá chẽm ngày càng tăng và những nghiên cứu về bệnh để hạn chế thiệt hại kinh tế cũng được quan tâm hơn Với mục đích giúp người dân đưa ra giải pháp phòng trị và giảm tác hại do bệnh, hoạt động xét nghiệm tác nhân gây bệnh của Trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản (CAAHBS) cũng đã thực hiện kiểm tra trên nhiều mẫu cá chẽm bệnh nuôi ở khu vực Khánh Hòa Trong các mẫu được kiểm tra đó, bên cạnh các tác

nhân vi khuẩn đã được thông báo từ những nghiên trước như Vibrio, Streptococcus; một loài vi khuẩn được xác định là Bacillus sp cũng xuất hiện

Vi khuẩn Bacillus là nhóm vi khuẩn phân bố phổ biến trong tự nhiên Nhiều loài

vi khuẩn có lợi thuộc giống này đã được nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn cuộc sống và sản xuất của con người Một số loài lại là những tác nhân gây bệnh gây những tác hại nghiêm trọng lên sức khỏe con người và động thực vật Ở động vật thủy sản, đã

có một vài thông báo bệnh do nhóm vi khuẩn này gây ra: B cereus gây bệnh hoại tử mang trên cá chép Cyprinus carpio, trên cá Morone saxatilis [18, 36]; B mycoides gây

lở loét trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus [36]; Bacillus sp gây bệnh trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus [31]; tuy nhiên, chưa tìm thấy thông báo nào về bệnh

do vi khuẩn Bacillus sp gây ra trên cá chẽm Vì thế, nghiên cứu khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn Bacillus sp đối với cá chẽm là điều cần thiết

Với lý do trên, được sự cho phép của khoa Sau đại học và viện Nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Nha Trang; được sự định hướng và giúp đỡ của TS Nguyễn Hữu Dũng, tôi đã thực hiện đề tài tốt nghiệp thạc sỹ chuyên ngành Nuôi trồng thủy sản với

tiêu đề “Tìm hiểu bệnh do vi khuẩn Bacillus sp gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa”

Nội dung của đề tài

Phân lập, định danh vi khuẩn Bacillus sp từ cá chẽm bệnh

Xác định khả năng gây nhiễm của chủng vi khuẩn Bacillus sp đã phân lập từ cá chẽm bệnh và đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm khi bị bệnh do vi khuẩn Bacillus sp

gây ra

Xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn

Tìm hiểu khả năng lây nhiễm vi khuẩn Bacillus sp từ thức ăn

Mục tiêu của đề tài

Tìm hiểu khả năng gây bệnh, nguồn lây nhiễm và phương pháp phòng trị bệnh do

vi khuẩn Bacillus sp gây ra trên cá chẽm nuôi

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Cung cấp các tư liệu mới về bệnh do vi khuẩn Bacillus sp

gây ra trên cá chẽm và bổ sung vào danh mục bệnh trên cá biển nuôi ở Việt Nam

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài làm cơ sở cho các đề xuất phòng, trị bệnh

do vi khuẩn Bacillus sp gây ra trên cá chẽm nuôi

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm

Cá chẽm, còn được gọi là cá

vược, có tên khoa học là Lates

calcarifer Tên tiếng anh thông dụng

của loài cá này là Asian seabass,

barramundi hay giant seaperch

Hình 1.1 Cá chẽm Lates calcarifer

Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên Chiều dài thân bằng 2,7 – 3,6 lần

chiều cao Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở

lưng Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến phía dưới sau hốc mắt

Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có 2

vây: vây trước có 7-9 gai cứng và vây sau có 10-11 tia mềm Vây hậu môn có 3 gai

cứng, vây đuôi tròn và có hình quạt Vẩy dạng lược và có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy

đường bên Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc

khi sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trường nước

ngọt Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng và

màu vàng bạc ở mặt bụng

Cá chẽm là loài có khả năng thích ứng rộng với sự thay đổi độ mặn, cá giai đoạn

giống và trưởng thành sống được ở độ mặn từ 0 – 35 ‰ và có thể chịu đựng tốt với sự

thay đổi độ mặn đột ngột Vì vậy, đây là loài rất thích hợp cho phát triển nuôi cả trong

nước ngọt, nước lợ cũng như nuôi biển [46, 56] Cá chẽm có thể thích ứng với nhiệt độ

từ 21 – 39oC, thích hợp nhất 27 – 30oC Nhiệt độ thay đổi đột ngột 2 – 3oC có thể gây

sốc cho cá giống [62]

Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình

Dương và Ấn Độ Dương, từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc,

Đài Loan đến Bắc Úc [56] Tại Việt Nam, cá chẽm có thể được tìm thấy ở vịnh Bắc

bộ, vùng biển Trung và Nam Bộ

Cá chẽm là loài có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60 kg Cá tăng

trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30 g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và chậm lại khi đạt khoảng 4 kg Cá giống cỡ 2 – 2,5 cm sau thời gian ương từ 30 – 45 ngày đạt

cỡ 5 – 11 cm, sau từ 6 đến 24 tháng nuôi thương phẩm cá đạt 0,35 – 3 kg [56] Cá chẽm thuộc loài cá dữ, ăn mồi sống và có tập tính ăn thịt đồng loại Ngoài tự nhiên, thức ăn của cá chẽm gồm cá nhỏ, tôm, cua, mực… Trong điều kiện ương nuôi, cá chẽm sau giai đoạn chuyển đổi thức ăn có thể sử dụng hoàn toàn thức ăn viên [35], tập tính ăn thịt đồng loại cao nhất ở giai đoạn từ 1 – 10 cm [53]

1.2.Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1.Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới

Nghề nuôi cá chẽm thế giới được bắt đầu vào thập kỷ 70 của thế kỷ 20 gắn liền với những nghiên cứu phát triển và hoàn thiện kỹ thuật nuôi loài cá này tại Thái Lan Vào những năm thuộc thập kỷ 80, 90 nghề nuôi cá chẽm đã được mở rộng sang Australia, Đài Loan và một số nước Đông Nam Á như Philipines, Singapore, Việt Nam [56] Hiện nay, loài cá này không chỉ được nuôi ở những quốc gia có phân bố tự nhiên mà còn được di nhập và nuôi thành công ở nhiều quốc gia thuộc những châu lục khác như Mỹ, Anh, Israel

Với ưu thế là loài cá dễ nuôi, sinh trưởng nhanh, chịu được biến động độ mặn và nhiệt độ rộng, cá chẽm được nuôi trong cả môi trường nước mặn, lợ và ngọt ở mức độ thâm canh, bán thâm canh hay quảng canh Hai hình thức được nuôi phổ biến nhất là nuôi trong ao và nuôi trong lồng [26] Hình thức nuôi trong ao đất phổ biến ở các nước Đông Nam Á và Australia Trong khi đó, hình thức nuôi trong lồng là hình thức được nuôi phổ biến tại Thái Lan, Hồng Kông, Malaysia, Singapore và Indonesia; lồng được làm bằng gỗ, kim loại, hay nhựa PVC đặt ở biển hoặc ngay trong ao nuôi Hình thức nuôi cá chẽm trong lồng đem lại lợi nhuận cao hơn so với hình thức nuôi trong ao [56]

Trong khoảng thời gian hơn 4 thập kỷ phát triển, sản lượng và giá trị của cá chẽm nuôi đã đạt được những con số ấn tượng Năm 1963, lần đầu tiên FAO thực hiện việc thống kê về cá chẽm và cho biết sản lượng nuôi đạt 5 tấn tại Thái Lan Sau hơn

20 năm sau, năm 1984, cá chẽm được thống kê cả về mặt sản lượng và giá trị, tổng sản lượng 1.646 tấn đạt giá trị xấp xỉ 4,36 triệu đô la Mỹ (USD), đánh dấu mức độ thương mại của loài cá này Năm 1990, sản lượng cá chẽm thế giới chạm mốc 10.000 tấn Từ năm 1990 cho đến nay, mặc dù có sự biến động tăng giảm theo năm, nhưng xu hướng chung, sản lượng cá chẽm nuôi thế giới đã có sự gia tăng rõ rệt (hình 1.2) Theo thống

kê của FAO, đến năm 2012, tổng sản lượng cá chẽm nuôi thế giới là 75.405,92 tấn, tăng 573,81% so với năm 1990 Cũng theo thống kê của FAO, 5 quốc gia và vùng lãnh thổ có sản lượng cá chẽm nuôi cao nhất thế giới gồm Australia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia và Đài Loan Điều này thể hiện các quốc gia khu vực Châu Á-Thái Bình Dương vẫn đang là những quốc gia phát triển mạnh đối tượng này

Hình 1.2 Sản lượng và giá trị cá chẽm nuôi thế giới từ năm 1989 - 2012

(nguồn: FishStat J-FAO)

1.2.2.Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam

Cá chẽm là một trong 11 loài cá biển được nuôi nhiều nhất ở Việt Nam [26] Giống như những loài cá biển khác, nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam có lịch sử phát triển muộn hơn các loài cá nước ngọt Không có tài liệu nào ghi chép rõ ràng về thời gian cá chẽm được nuôi ở Việt Nam, cho đến hiện nay số liệu thống kê mỗi năm về sản lượng và giá trị cá chẽm xuất khẩu của FAO vẫn chưa có tên Việt Nam Tuy nhiên, trên thực tế, nghề nuôi cá chẽm Việt Nam đã được manh nha từ những năm trước năm

2003 khi loài cá này được một số người dân nuôi ở hình thức quảng canh, nguồn giống không chủ động chủ yếu là bắt ngoài tự nhiên hay nhập từ Thái Lan [3] Cuối năm

2003, trường Đại học Nha Trang đã nghiên cứu hoàn thiện và chuyển giao quy trình

kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo cá chẽm cho một số cơ sở sản xuất trong nước, nhờ

đó giúp chủ động được nguồn cá chẽm giống và tạo nên bước ngoặt cho nghề nuôi cá chẽm Việt Nam Cá chẽm hiện nay được xem là đối tượng xóa đói giảm nghèo và đối tượng nuôi thay thế cho những diện tích ao nuôi tôm không hiệu quả ở một số địa

phương Các vùng nuôi cá chẽm quan trọng ở nước ta là Khánh Hòa, Quảng Ninh, Bến Tre, Kiên Giang, Cà Mau [3, 7]

Hình thức nuôi cá chẽm phổ biến ở nước ta là nuôi trong ao đất, thường ở quy mô gia đình [26] Thức ăn được sử dụng chủ yếu là các loài cá tạp giá trị thấp với hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR) lớn hoặc bằng 4, ngoài ra, một số loại thức ăn công nghiệp dạng viên cũng được dùng với FCR từ 1,5-2,1 [51] Bên cạnh đó, hình thức nuôi lồng trên biển cùng quy trình nuôi cá chất lượng cao cũng được các công ty nuôi cá áp dụng trong những năm gần đây, điển hình như mô hình nuôi lồng tròn đường kính 30m trên biển cho năng suất 100 tấn/ lồng ở Vạn Ninh, Khánh Hòa [5]

1.3.Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm

1.3.1.Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá chẽm trên thế giới

Nhóm bệnh vi khuẩn là một trong những nguyên nhân gây chết nghiêm trọng đối với cá chẽm [9] Bệnh do vi khuẩn trên cá chẽm được gây nên bởi nhiều giống vi khuẩn

như Aeromonas, Flexibacter/ Cytophaga, Vibrio, Pasteurella, Streptococcus [54] Trong

những bệnh đó, một số bệnh xảy ra thường xuyên và gây tác hại nghiêm trọng

Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra (Vibriosis): Vi khuẩn thuộc giống Vibrio luôn

là mối nguy hiểm cho các đối tượng nuôi mặn, lợ [68]; là một trong những tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá được báo cáo nhiều nhất [34] Đối với cá chẽm, vibriosis là nguyên nhân gây chết cấp tính trong vòng 24-48h ở cá chẽm con nuôi lồng trên biển

và luôn là vấn đề dai dẳng cho nghề nuôi cá chẽm Australia [25] Vibriosis cũng từng được thông báo là bệnh nghiêm trọng trên cá chẽm nuôi thương phẩm ở Singapore

[23], Thái Lan [24] và Maylaysia [52] Cá chẽm nhiễm bệnh do vibro thường biểu hiện

màu sắc đen tối, bất thường trong tập tính hoạt động như kém hay bỏ ăn, bơi lờ đờ hay hôn mê, cơ thể xuất huyết hay xuất hiện vùng lở loét kèm xuất huyết [3], xoang bụng tích dịch, đôi khi có hiện tượng xuất huyết ở một số nội quan như gan, thận, lách [52]

Hầu hết các loài Vibrio là những tác nhân thứ cấp, sự bùng phát bệnh liên quan đến chất lượng nước kém hay stress do hoạt động chăm sóc [34] Tuy nhiên, V harveyi và

V anguilarum lại được xem là các tác nhân chính gây bệnh ở cá chẽm [45]

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus (Streptococcosis): Bệnh Streptococcosis trên

cá được gây bởi một nhóm gồm 6 loài liên cầu khuẩn Gram dương, trong đó tác nhân

chính gây bệnh trên cá chẽm là Streptococcus iniae Bệnh do S iniae trên cá chẽm

được thông báo từ những năm 80 của thế kỷ 20 Singapore là quốc gia đầu tiên thông

báo bệnh, bệnh được thông báo đồng thời với dịch bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn này

gây ra trên cá dìa (Singanus canaliculatus) [32] Trung Quốc là quốc gia thứ hai thông báo bệnh với tỷ lệ chết từ 16,7- 32,6% [39] Ở Australia, từ năm 1992, S iniae đã

gây bệnh vào mỗi mùa hè với thiệt hại khoảng 8-15% sản lượng cá chẽm nuôi lồng trên biển hàng năm, thậm chí thiệt hại có thể lên 70% khi bệnh bùng phát dữ dội [17]

Vào năm 2003 và 2004, S iniae cũng đã được thông báo gây tác động nghiêm trọng

đến nghề nuôi cá chẽm ở khu vực phía Nam Thái Lan [59] Cá chẽm khi cảm nhiễm

với S iniae thường biểu hiện các dấu hiệu bệnh lý như màu sắc đen tối, mắt cá lồi và

đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương nắp mang, dấu hiệu điển hình như: cá vận động khó khăn, bơi xoắn, không định hướng, xoang bụng tích dịch, xuất huyết các cơ quan nội quan [16, 59] Kiểm tra mô học cho thấy các biến đổi rõ rệt trong gan, thận, lách, tim, mắt và não do phản ứng viêm nghiêm trọng [59] Bệnh có thể xảy ra ở dạng cấp tính hay bán cấp tính trong bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình nuôi

Bệnh “ trướng bụng” (Big belly): Bệnh do loài vi khuẩn Bacillus lưỡng cực, ký

sinh nội bào gây ra Bệnh đã xuất hiện ở một số nước Đông Nam Á như Indonesia, Singapore và Malaysia [64] Đến nay bệnh chỉ được tìm thấy trên cá chẽm Trong sản xuất giống nhân tạo, bệnh thường xảy ra sau khoảng 3 tuần ương khi cá có khối lượng

cơ thể từ 0,3-3 g [64] và gây tỷ lệ chết lên đến 80% Cá nhiễm bệnh thường chuyển màu đen sậm, bụng căng tròn, phần cơ teo tóp, cá bệnh thường tách đàn, mất thăng bằng, bơi lờ đờ trên tầng mặt hay tụ dưới đáy Việc chẩn đoán bệnh thường dựa vào các dấu hiệu của bệnh, sự xuất hiện của những đám trực khuẩn gram âm trong những vùng tổn thương hoại tử ở ruột khi quan sát tiêu bản mô bệnh học hay dựa vào phương pháp mô hóa miễn dịch sử dụng kháng thể đa giá [34]

Bệnh columnaris: bệnh còn được gọi là Flexibacteriosis do vi khuẩn Flexibacterium (Cytophaga hay Flexibacter) gây ra trên môi trường nước ngọt hay Tenacibaculosis do Tenacibaculum maritinum gây ra trên môi trường nước mặn

Những vi khuẩn này có dạng sợi, Gram âm, di động bằng hình thức trượt, gây bệnh lở loét nguy hiểm cho nhiều loài cá nuôi Bệnh được xem là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi [12] Cá nhiễm bệnh thường xuất hiện các vết lở loét trên bề mặt như trên mang, vùng đầu, vùng bụng, trên vây Nhiều nghiên cứu xem

vi khuẩn này là tác nhân cơ hội, sự bùng phát bệnh thường được thông báo sau khi cá gặp phải các yếu tố gây stress Bệnh thường xảy ra trên cá chẽm trong giai đoạn cá từ 1-100 g [64]

1.3.2.Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm ở Việt Nam

Ở Việt Nam, đồng thời với những bước tiến trong nghề nuôi cá chẽm, những nghiên cứu tìm hiểu về bệnh trên đối tượng này cũng được quan tâm và đã có những kết quả nhất định Trong những kết quả đó, đã có nhiều thông báo đề cập về các nghiên cứu tìm hiểu các tác nhân vi khuẩn gây bệnh và những tác hại của bệnh do vi khuẩn gây ra Nhìn chung, hai nhóm bệnh vi khuẩn thường xuyên gây hại cho nghề nuôi cá chẽm Việt Nam là vibriosis và streptococcosis

Đỗ Thị Hòa và CTV (2008) thông báo vibriosis là một trong 10 bệnh đã xuất hiện ở cáctrại nuôi cá biển ở Khánh Hòa, vibriosis thường gây xuất huyết lở loét trên

cá chẽm vào mùa khô [2] Vibriosis gây bởi Vibrio alginolyticus cũng được xác định

là nguyên nhân gây lở loét thân và gây chết 80% cá chẽm nuôi thương phẩm ở vùng biển Vũng Ngán-Nha Trang vào năm 2011 [7]

Bệnh streptococcosis gây bởi S iniae đã được thông báo xảy ra ở một số vùng

nuôi cá chẽm của Khánh Hòa [38] và Vũng Tàu [4] Theo Hich và CTV (2013), streptococcosis có thể gây chết 0,3% đàn cá được nuôi trong ao hay lồng trong một ngày [38]

Nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam cũng như trên thế giới ngày càng phát triển, đồng thời với sự mở rộng diện tích và gia tăng hiệu suất nuôi, những bệnh nhiễm

khuẩn như vibriosis, streptococcosis, columnaris… có tần suất xuất hiện cũng dày

hơn Việc sử dụng kháng sinh để kiểm soát bệnh do vi khuẩn là một phương pháp truyền thống, tuy nhiên bên cạnh hiệu quả chữa trị thì việc sử dụng kháng sinh còn có những bất lợi như có thể để lại dư lượng trong cá, gây khó khăn trong tiêu thụ hay kéo theo những mối nguy hại trực tiếp cho môi trường và cho sức khỏe con người khi hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng gia tăng Trong bối cảnh đó, các biện pháp phòng bệnh được xem là giải pháp “khôn ngoan” để có được một vụ nuôi thành công Vaccine, chế phẩm vi sinh là những công cụ phòng bệnh hữu ích Việc sử dụng vaccine trên cá chẽm còn hạn chế bởi chưa có nhiều sản phẩm vaccine được sản xuất nên sử dụng chế phẩm vi sinh để tăng cường sức khỏe vật nuôi và kiểm soát môi trường là biện pháp được sử dụng phổ biến hiện nay

Một số chế phẩm vi sinh có thành phần là các loài vi khuẩn Bacillus kết hợp với một số lợi khuẩn khác Các loài Bacillus có thể được đưa vào cơ thể vật nuôi để cạnh

tranh với tác nhân gây bệnh [30] hay được đưa vào môi trường nuôi nhằm giúp quản

lý chất lượng nước, xử lý chất thải, giảm lượng vật chất hữu cơ và hàm lượng ammonium trong ao nuôi trồng thủy sản [22] Bằng con đường này, các loài vi khuẩn

Bacillus trở thành vi sinh vật đông đúc trong ao nuôi Tuy nhiên, một số loài Bacillus

hiện diện trong môi trường nuôi có chứa độc lực và đã được thông báo là những tác nhân gây bệnh cho động vật thủy sản

1.4 Một số đặc điểm của nhóm vi khuẩn Bacillus và tổng quan bệnh do vi khuẩn Bacillus gây ra

1.4.1.Đặc điểm của nhóm vi khuẩn Bacillus

Bacillus là nhóm những vi khuẩn hình que có khả năng hình thành nội bào tử

trong điều kiện hiếu khí [37] Nhóm vi khuẩn này rất đa dang gồm sự tập hợp của hơn

60 loài [13, 50] , được chia thành 5 hoặc 6 nhóm căn cứ vào đặc điểm kiểu hình và

kiểu gen 16S rDNA [50] Các loài thuộc Bacillus có thể được định danh dựa theo đặc

điểm hình thái bào tử kết hợp các đặc điểm sinh hóa theo phương pháp của Gordon, Haynes và Pang (1973); phương pháp của Claus và Bekeyley (1984) hay định danh bằng các kỹ thuật hiện đại như phân tích 16S rDNA; enzyme electrophoresis, pyrolysis

mas spectrometry [13, 21, 37, 47] Vi khuẩn thuộc Bacillus phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên: đất, nước, không khí [57] Bào tử Bacillus có sức sống cao, có thể tồn

tại nhiều thế kỷ [37] và dễ dàng phát triển thành tế bào sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi

Nhiều loài vi khuẩn thuộc Bacillus có các tác động tích cực và tiêu cực đến nhiều

hoạt động sống của con người Về mặt tích cực, hàng loạt sản phẩm ứng dụng công

nghệ sinh học sử dụng một số loài Bacillus có lợi đã được sản xuất phục vụ cho nhiều

hoạt động của con người như chế phẩm diệt côn trùng; kháng sinh dạng peptide như bacitracin, polymyxin và cirulin [44]; các chế phẩm enzymes cho mục đích tẩy rửa, xử

lý nước thải [50], các chế phẩm vi sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản [27, 30, 67]

Tuy nhiên, bên cạnh các tác động hữu ích, một số loài Bacillus, chủ yếu là các loài thuộc nhóm B cereus, được xem là tác nhân cơ hội hay tác nhân chính gây bệnh ở

người, động vật [50]

Vi khuẩn Bacillus cereus

Vi khuẩn Bacillus cereus còn được gọi là B cereus senu stricto, được phân lập lần đầu tiên từ môi trường không khí tại một trang trại nuôi bò ở Anh [33] B cereus

sensu stricto là thành viên của nhóm B cereus (B cereus sensu lato) Trước đây, vi khuẩn này rất đa dạng bao gồm một số vi khuẩn dưới loài như B cereus var mycoides,

B cereus var thuringiensis, B cereus var anthracis [37] Hiện nay, các vi khuẩn thuộc

B cereus trước đây được tách thành những loài riêng kết hợp với một số loài mới tạo thành nhóm B cereus gồm B cereus sensu stricto, B anthracis, B thuringiensis, B mycoides, B pseudomycoides và B weihenstephanensis [13, 57] B cereus sensu

stricto có độ tương đồng cao về kiểu gen, có thể tương đồng đến 99% gen 16S r DNA, với các loài trong nhóm [57]

Bacillus cereus là vi khuẩn Gram dương, hình que, kích thước 1,0-1,2 µm x

3,0-5,0 µm, có xu hướng hình thành chuỗi dài trên môi trường thạch khi nuôi cấy dài

ngày Vi khuẩn B cereus thuộc loài kị khí tùy nghi, di động và sinh bào tử Tế bào

thường sinh bào tử sau 48 h nuôi cấy trên môi trường thạch [33] Bào tử hình ellip, nằm ở trung tâm hay gần trung tâm tế bào, không gây phình to tế bào [37, 47] Vi khuẩn sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ 10-48oC, tối ưu 28-35oC; sinh trưởng tốt trong các môi trường TSA, TSB, BA Khuẩn lạc có đường kính 3-8 mm, mép không đều, tạo vòng dung huyết β khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu [57] Một số phản

ứng đặc trưng của B cereus gồm các phản ứng catalase và Voges- Proskauer (VP)

dương tính; không lên men đường manitol và arabitose [21, 48]

Bacillus cereus hiện diện phổ biến trong tự nhiên, có thể tìm thấy trong trầm

tích, đất, bụi, thực vật và cả trong những môi trường sản xuất thực phẩm [57] Nhiều

nghiên cứu đã phân lập Bacillus cereus từ các loại thức ăn và nguyên liệu khác nhau

như gạo, sữa, ngũ cốc Theo Blakey và Priest (1980) 56% mẫu các loại đậu và ngũ

cốc có chứa vi khuẩn B cereus từ 1x102 đến 6x104 tế bào/g, vi khuẩn có thể gia tăng lên đến 107 tế bào/g ở quy trình nấu nướng thông thường [15] Ankolekar và CTV

(2009) thông báo 52,8% của các mẫu gạo có chứa bào tử Bacillus với mật độ trung bình là 32,6 CFU/g; 83 chủng trong 94 chủng được định danh là B cereus và 11 chủng được định danh là B thuringiensis [10]

Bacillus cereus được xem là tác nhân gây bệnh cho người Bệnh nhiễm khuẩn

do vi khuẩn B cereus được chia thành 6 dạng: (1) nhiễm khuẩn cục bộ trên da, mắt

sau khi các cơ quan này bị tổn thương hay sau phẫu thuật; (2) nhiễm trùng máu; (3) nhiễm khuẩn hệ thống thần kinh trung ương; (4) nhiễm khuẩn đường hô hấp; (5) nhiễm khuẩn gây viêm màng ngoài tim; (6) nhiễm khuẩn đường tiêu hóa gây ngộ độc

thực phẩm [28] Ở người, các bệnh do vi khuẩn này gây ra thường được tìm thấy trên những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu, trẻ sơ sinh hay người bệnh có những vết thương do mổ, bỏng hay tổn thương do va chạm [28] Tuy nhiên, vi khuẩn này hiện diện trong thực phẩm ở mật độ khoảng từ 102-106 CFU/g được xem là nguyên nhân chủ yếu gây nên các ca ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới [57]

Bacillus cereus cũng là tác nhân gây bệnh cho động vật Vi khuẩn B cereus

được xếp vào nhóm tác nhân cơ hội không gây nguy hiểm cho sinh vật ở điều kiện bình thường nhưng có khả năng gây bệnh ở những điều kiện thích hợp [21] Vi khuẩn này đã được thông báo gây bệnh trên nhiều loài gồm cả động vật có xương sống như chuột, thỏ, ngựa, mèo, lợn, khỉ và động vật không xương sống như giáp xác, côn trùng [21] Khả năng gây nhiễm trên mỗi loài động vật khác nhau tùy theo vật chủ, độc lực của chủng vi khuẩn và phương thức phơi nhiễm Ở động vật có xương sống, khi nhiễm

bệnh do B cereus gây ra có thể gây viêm hoại tử hình thành các nốt tích dịch trên da

hay lở loét da khi tiêm cơ, tiêm dưới da ở thỏ, chuột [19, 58]; gây mù mắt ở thỏ [20]

hay gây chết ở bò sữa, chuột [19, 43, 60] Ở động vật không xương sống, B cereus

thường gây chết [21]

Bệnh nhiễm khuẩn do B cereus có thể điều trị bằng kháng sinh Hầu hết các

chủng có khả năng kháng với các kháng sinh nhóm β-lactam như penicillin, ampicilin, cephalosporin [63], amoxicillin [21] Ngoài ra, vi khuẩn này cũng được thông báo kháng với những kháng sinh ở các nhóm khác như colistin, polymyxin, kanamycin, tetracycline, bacitracin [66], aztreonam, trimethoprim [21] Vi khuẩn nhạy cảm với doxycycline, erythromycin, gentamycin, vancomycin, mẫn cảm yếu với cephotaxim và nalidixic [21]

1.4.2.Bệnh do vi khuẩn Bacillus gây ra trên động vật thủy sản

Theo Austin, 1999 vi khuẩn Bacillus spp được xem là một trong những tác

nhân mới, gây bệnh cho các loài động vật thủy sản [11] Nhóm tác nhân gây bệnh này

đã được ghi nhận là nguyên nhân gây bệnh cho một số loài cá nước ngọt và nước mặn

ở các quốc gia khác nhau trên thế giới

Oladosu và CTV (1994) [11] thông báo vi khuẩn hình que, Gram (+), có kích

thước 1-4 µm, được nhận định là Bacillus sp., là nguyên nhân bùng nổ bệnh gây chết 10-15% các loài cá Clarias carpis, Clarias gariepinus, Clarias nigrodigitatus,

“Heteroclarias” và Heterobanchus bidorsalis ở các ao vùng phía Đông Nigeria trong

khoảng thời gian từ 1989-1991 Cá bệnh thường ốm yếu, hôn mê, da bị viêm và hoại

tử, hiện tượng chết xảy ra sau vài ngày có dấu hiệu bệnh Giải phẫu bên trong xoang bụng quan sát có hiện tượng tích dịch màu máu nhạt, gan và thận có những đốm hoại

tử, xuất huyết; lách gia tăng kích thước, mềm, dễ vỡ; cơ tim mềm, nhũn; dạ dày xung

huyết Tại vùng da lở loét có sự hiện diện của Aeromonas và Flavobacterium columnare

Baya và CTV (1992) thông báo B cereus là tác nhân được tìm thấy ở cá Morone saxatilis bị hoại tử mang, vi khuẩn này có thể gây chết cho cá Morone saxatilis khỏe khi tiêm 107 tế bào/cá [36] Pynchynski và CTV (1981) cũng đã thông

báo B cereus xuất hiện trên cá chép Cyprinus carpio bị hoại tử mang [18, 36]

Goodwin và CTV (1994) [36] thông báo bệnh do Bacillus mycoides gây ra trên

cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus nuôi thương phẩm ở Alabana, Mỹ vào năm 1992 Cá

nhiễm bệnh có màu sắc đen tối, bỏ ăn Cá chết hay hấp hối biểu hiện vùng da tái nhạt trên lưng, vùng cơ dưới da đục, một số cá có vết loét tại vùng da đã chuyển màu bất thường Kiểm tra mô học cho thấy trong cơ cá bệnh có chứa chuỗi vi khuẩn hình que Gram (+) Khi thử nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm cơ, vi khuẩn đã gây lở loét cho cá khỏe ở nồng độ 1,6 x 104 CFU/cá

Ferguson và CTV (2001) [31] thông báo đã phân lập thành công Bacillus sp ở

cá tra Pangasius hypophthalmus bị bệnh nuôi ở vùng đồng bằng sông Mekong, Việt

Nam Cá nhiễm bệnh biểu hiện các đốm hoại tử màu trắng từ 1-3 mm trên gan, thận, lách Các biểu hiện bệnh lý tương tự xảy ra khi cảm nhiễm 2 x 107 tế bào vi khuẩn này vào xoang bụng cá tra khỏe Ngoài tác nhân vi khuẩn, trùng bào tử sợi myxosporean cũng được tìm thấy trên cá bệnh

Như vậy, vi khuẩn Bacillus là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên một số động vật thủy sản Vi khuẩn thuộc Bacillus gần đây cũng đã xuất hiện trong

một vài mẫu cấy trong hoạt động xét nghiệm tác nhân gây bệnh trên cá chẽm bệnh nuôi ở Khánh Hòa của CAAHBS Tuy nhiên, trong nuôi trồng thủy sản, vi khuẩn

Bacillus được biết đến nhiều hơn với vai trò có ích giúp quản lý môi trường nước ao nuôi Do vậy mà hầu hết các nghiên cứu ở nước ta về Bacillus trong lĩnh vực nuôi

trồng thủy sản là phân lập, sàng lọc vi khuẩn này từ môi trường ao nuôi để sản xuất

các chế phẩm vi sinh Mặt khác, trên cá chẽm, chưa tìm thấy bất cứ thông báo nào về

khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus sp Vì thế nên tìm hiểu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus sp trên cá chẽm là hướng nghiên cứu mới trên nhóm vi khuẩn Bacillus ở nước ta và là điều cần thiết để góp phần xác định vai trò của vi khuẩn này

đối với cá chẽm và môi trường nuôi

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Bacilus sp gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer

Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2013 đến 7/2014

Địa điểm nghiên cứu:

- Thu mẫu bệnh tại các địa điểm nuôi cá chẽm ở Khánh Hòa

- Phân tích mẫu cá bệnh; phân lập vi khuẩn, thí nghiệm cảm nhiễm và kiểm tra

mô bệnh học được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản, trường đại học Nha Trang

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Tìm hiểu bệnh do vi khuẩn Bacillus sp gây ra trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa

Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ cá chẽm

bệnh

Định danh

vi khuẩn

Thí nghiệm cảm nhiễm

Phân lập vi khuẩn

Bacillus sp trên thức ăn

Kiểm tra độ nhạy kháng sinh của vi khuẩn

Kết luận

Định danh

vi khuẩn

Thí nghiệm cảm nhiễm, xác định

mô học

2.2.2 Phương pháp thu mẫu

Mẫu cá phân tích được thu trực tiếp từ các ao, lồng nuôi cá chẽm đang bị bệnh trong địa bàn tỉnh Khánh Hòa Mẫu được vận chuyển sống trong túi có bơm ôxy hay được vận chuyển lạnh trong những túi riêng biệt khi đưa về phòng thí nghiệm

Từ kết quả phân lập vi khuẩn trên cá chẽm bệnh nuôi ở Vạn Ninh; các mẫu thức

ăn ở cơ sở nuôi này được thu, đóng gói trong túi sạch, ký hiệu mẫu và gửi về phòng thí nghiệm để kiểm tra các chỉ tiêu vi khuẩn Các mẫu thức ăn được kiểm tra là những mẫu thức ăn công nghiệp dạng viên đã được sử dụng cho các đàn cá chẽm bệnh còn lưu mẫu tại cơ sở nuôi hay các mẫu từ các lô thức ăn sẽ được sử dụng cho các đàn cá chẽm nuôi

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng

Để thực hiện các nội dung trong luận văn, một số phương pháp nghiên cứu bệnh

ở động vật thủy sản được thực hiện:

- Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá bệnh

- Phương pháp cấy hộp trải xác định vi khuẩn trong thực phẩm

- Phương pháp xác định độc lực

- Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học

- Phương pháp nhuộm Gram trên lát cắt mô

- Phương pháp xác định độ nhạy kháng sinh của vi khuẩn

2.2.3.1 Phương pháp kiểm tra các tác nhân gây bệnh

Quan sát, ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài,

Kiểm tra ký sinh trùng ngoại và nội ký sinh theo phương pháp của Bùi Quang Tề (2006) [6] để xác định sự hiện diện của ký sinh trùng trên cơ thể cá

Kiểm tra virus gây bệnh Viral Nervous Necrosis và Irido virus bằng kit kiểm tra nhanh VNN, GIV của Rega Bio (Đài Loan)

Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá bệnh

Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá xương được trình bày bởi Whitman và MacNair (2004) [65] được dùng để phân lập vi khuẩn

Mẫu bệnh phẩm từ gan, thận, não và cơ cá được cấy trên môi trường TSA (Merck) có bổ sung 2% NaCl, TCBS (Merck) và KF (Merck) + 2% NaCl Các hộp lồng sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28-30oC, quan sát sự xuất hiện vi khuẩn của các đĩa nuôi cấy 2 lần/ngày Các chủng vi khuẩn thu được sau đó được nuôi cấy thuần bằng cách thu khuẩn lạc rời cấy chuyền nhiều lần trên môi trường TSA + 2% NaCl

2.2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn trong thức ăn

Sự hiện diện của vi khuẩn trong mỗi mẫu thức ăn được xác định thông qua phương pháp của Trần Linh Thước (2007) [8]

0,5 g thức ăn ở mỗi mẫu được cân và đưa vào túi nhựa vô khuẩn và nghiền nhỏ bằng dụng cụ thủy tinh đã được vô trùng Mẫu thức ăn đã nghiền nhỏ sau đó được đưa vào ống falcon 15mL vô trùng và bổ sung thêm 0,5 mL nước muối sinh lý tiệt trùng Hỗn hợp được trộn đều bằng máy votex trong 1-5 phút Tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lý tạo ra các huyền dịch có độ pha loãng 10-1 và 10-2 so với huyền dịch gốc Tại mỗi nồng độ, 100 µL huyền dịch thức ăn được cấy trang trên môi trường TSA + 2% NaCl Các đĩa nuôi cấy được ủ ở 28-30oC, lặp lại 2 lần

Quan sát sự hiện diện của vi khuẩn sau 24-48 h nuôi cấy, xác định vi khuẩn tổng

số và vi khuẩn Bacillus tổng số Vi khuẩn thuộc Bacillus được xác định thông qua các

đặc điểm: khuẩn lạc màu trắng đục, bề mặt thô ráp trên mỗi đĩa, kết quả dương tính khi nhuộm Gram và kiểm tra phản ứng catalase, hình thành bào tử trong điều kiện hiếu khí

Các chủng vi khuẩn Bacillus thuần được nuôi tăng sinh, sau đó được lưu giữ

trong môi trường TSB + 2 % NaCl bổ sung 20% Glycerol ở -80oC

2.2.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn

Đặc điểm hình thái, khả năng di động, đặc điểm về nhuộm Gram và khả năng sinh bào tử của chủng vi khuẩn được xác định thông qua quan sát các tiêu bản ép tươi, tiêu bản nhuộm Gram (theo Hucker & Conn, 1923 có cải tiến) [40], tiêu bản nhuộm bào tử (theo Schaeffer and Fulton 1933) [55] Khả năng sinh trưởng ở các nhiệt độ khác nhau và nồng độ muối khác nhau được thực hiện trên môi trường TSB, khả năng sinh trưởng dưới điều kiện yếm khí được thực hiện trên môi trường TSA +2% NaCl Một số đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn được thực hiện trên kit API 20E (bioMerieux®, France) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Phản ứng oxidase được thực

hiện bằng sản phẩm Microbiology Bactident® Oxidase (Merck) Các phản ứng sinh hóa truyền thống khác như catalase, khả năng thủy phân tinh bột được tiến hành theo phương pháp của MacFaddin (1980) [49], khả năng thủy phân casein được tiến hành theo phương pháp của Logan và De Vos (2009) [48]

Định danh vi khuẩn được thực hiện theo khóa phân loại của Gordon (1989) [37] kết hợp so sánh các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn với đặc điểm sinh hóa của

các chủng Bacillus của Bergey [48] và trong các nghiên cứu khác Bên cạnh đó, một

vài chủng vi khuẩn đã được định danh bằng phương pháp sinh hóa cũng được gửi đến phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa để định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA (16S rDNA sequencing)

Phương pháp xác định khả năng sinh bào tử của vi khuẩn

Phương pháp nhuộm bào tử của Schaeffer and Fulton (1933) [55] có cải tiến được sử dụng để xác định khả năng sinh bào tử của vi khuẩn

Quy trình nhuộm như sau:

Bước 1: Vi khuẩn nuôi cấy trên TSA +2% NaCl sau 72 h được dùng để tạo các tiêu bản vi khuẩn phết Các tiêu bản được để khô tự nhiên và cố định trên ngon lửa đèn cồn Bước 2: Nhuộm với dịch malachite green bão hòa (5-7%) trong 15-20 phút Bước 3: Rửa tiêu bản nhuộm dưới vòi nước chảy

Bước 4: Nhuộm với Fucshin trong 30 giây

Bước 5: Rửa tiêu bản, để khô, quan sát dưới kính hiển vi Vi khuẩn bắt màu hồng

đỏ của Fucshin, bào tử bắt màu xanh của malachite green

2.2.3.4 Phương pháp xác định độc lực

Cá thí nghiệm

Cá chẽm dùng trong thí nghiệm (có kích thước 8-11 cm) được sản xuất bằng sinh sản nhân tạo và ương nuôi thành cá giống tại Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản –Trường Đại học Nha Trang Cá khỏe mạnh và đã thích nghi với bể nuôi thí nghiệm từ giai đoạn cá hương cho đến khi bắt đầu sử dụng cho hoạt động nghiên cứu

Chuẩn bị vi khuẩn

Sau khi được phân lập thuần trên môi trường TSA + 2% NaCl, vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường TSB + 2% NaCl đặt trong tủ ấm lắc đảo (180 rpm) ở nhiệt độ 28-30oC trong 24 h Tế bào vi khuẩn được thu hoạch bằng cách ly tâm

1000 x g trong 5 phút, rửa 3 lần trong dung dịch nước muối sinh lý Vi khuẩn sau khi

ly tâm được pha loãng trong nước muối sinh lý tiệt trùng và so sánh độ đục với các ống có độ đục chuẩn (MacFaland) để tạo ra huyền dịch có mật độ vi khuẩn 108 tế bào/ml Tiến hành pha loãng theo cấp số 10 để tạo ra các dịch huyền phù có mật độ vi khuẩn từ 103-107 tế bào/mL Mật độ vi khuẩn sống (CFU/mL) của huyền dịch vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng và cấy trang theo phương pháp của Whitman và MacNair (2004) [65]

Gây nhiễm thực nghiệm để xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Bacillus sp Hai chủng vi khuẩn Bacillus sp.(CRB160713 phân lập từ cá chẽm bệnh và

TAOC3 phân lập từ thức ăn) được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm xoang bụng để xác định liều gây chết 50% (LD50) và thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm cơ xác định liều gây nhiễm 50% ( ID50)

Mỗi thí nghiệm có 6 nghiệm thức gồm 5 nghiệm thức tương ứng với 5 nồng độ vi khuẩn 104, 105, 106, 107, 108 CFU/mL và 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức

có 10 cá thể Vi khuẩn được tiêm với liều lượng 0,2 mL/cá thể, cá đối chứng được

được tiêm 0,2 mL nước muối sinh lý NaCl 0,85 % tiệt trùng

Trước khi cảm nhiễm, ngừng cho cá ăn trong 24 h Cá thí nghiệm được bắt từ bể nuôi bằng vợt và gây mê bằng dung dịch Ethyleneglycol monophenylether 100 ppm Sau khi tiêm vi khuẩn, cá được nuôi riêng trong các bể composite 200 L có chứa nước mặn 25-30 ‰, được sục khí liên tục 24/24h và duy trì nhiệt độ nước ổn định từ 28-

29oC bằng máy điều hòa không khí Trong thời gian thí nghiệm, mỗi ngày cho cá ăn thức ăn viên, lượng thức ăn theo nhu cầu và hoạt động bắt mồi của cá, thay 50% lượng nước trong bể

Quan sát, ghi nhận mọi biểu hiện bất thường của cá thí nghiệm và số lượng cá chết, cá bị lở loét sau khi gây nhiễm cho đến khi thí nghiệm kết thúc

Thí nghiệm kết thúc sau 14 ngày tính từ ngày không phát hiện thêm cá bị lở loét

Cá chết và cá bị lở loét được giải phẫu lấy não và gan, thận và cơ cấy trên môi trường TSA bổ sung 2% NaCl

2.2.3.5 Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học

Tiến hành thu và cố định trong dung dịch đệm Formalin 10% các mẫu gan, thận, não, lách, cơ của 8 cá hấp hối (4 cá từ thí nghiệm tiêm xoang bụng; 4 cá từ thí nghiệm tiêm cơ); 4 cá sống sót sau khi kết thúc thí nghiệm tiêm xoang bụng và 2 cá đối chứng Quy trình tạo các lát cắt mô học tiến hành theo phương pháp nghiên cứu mô học trên cá xương của Tonguthai và CTV (1999) [61]

Để nghiên cứu các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào các tổ chức cá bệnh, các lát cắt được nhuộm bằng Hematoxylin & Eosin

Để quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn trong các tổ chức mô, một số lát cắt được nhuộm theo quy trình nhuộm Gram trên lát cắt mô học của Engbaek và CTV (1979) [29]

Hình 2.2: Quy trình nghiên cứu mô bệnh học

2.2.3.6 Phương pháp xác định độ nhạy của vi khuẩn với kháng sinh

Tính nhạy của vi khuẩn với các loại thuốc kháng sinh được xác định theo phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch trên môi trường MHA (Muller-Hintol Agar) của Whitman và MacNair (2004) [65]

Các đĩa kháng sinh được sử dụng bao gồm gentamicin (10 µg); nalidicid acid (30 µg); cefalexin (30 µg); amoxycillin (25 µg); norfloxacine (5 µg); tetracycline (30 µg);

Tạo các lát cắt 5-7 µm bằng máy Microtone

Thấm parafin

và đúc mẫu

Làm mất nước và mềm mẫu

Nhuộm H&E;

nhuộmGram

doxycycline (30 µg); ciprofloxacin (5 µg); clindamycin (2 µg); streptomycin (10 µg); rifampin (30 µg); erythromycin (15 µg)

2.2.4 Xử lý số liệu

Số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý theo thống kê, sử dụng các phần mềm Microsolft Excel và SPSS Liều gây chết 50 % (LD50) và liều gây nhiễm 50 % (ID50) được xác định bằng probit analysis trên SPSS 15.0

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Kết quả nghiên cứu

3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp

3.1.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ cá chẽm bệnh

Trong thời gian nghiên cứu, 9 mẫu cá chẽm bệnh biểu hiện dấu hiệu bệnh lý rõ ràng ở các địa điểm nuôi thuộc Khánh Hòa đã được thu và kiểm tra (bảng 3.1) Kết quả kiểm tra cho thấy sự xuất hiện của tác nhân vi khuẩn ở tất cả các mẫu kiểm tra, ký

sinh trùng và vi rút xuất hiện tần số thấp Vibrio là nhóm vi khuẩn xuất hiện ở hầu hết

các mẫu kiểm tra Tuy nhiên bên cạnh hai nhóm tác nhân đã được thông báo gây bệnh

trên cá chẽm trong những nghiên cứu trước đây là Vibrio và Streptococcus, kết quả nghiên cứu cũng đã tìm thấy 2 chủng vi khuẩn Bacillus sp khi phân lập trên môi

trường TSA + 2 % NaCl

Các mẫu cá phân lập được vi khuẩn Bacillus sp thường biểu hiện các dấu hiệu

bệnh lý như đen thân, rụng vẩy, hoại tử và xuất huyết nhẹ vùng cơ dưới da, lở loét thân

và xuất huyết nội quan (hình 3.1) Cá nhiễm vi khuẩn Bacillus cũng có thể nhiễm vi khuẩn Vibrio hay cho kết quả dương tính với tác nhân vi rút và ký sinh trùng

Hình 3.1: Dấu hiệu bệnh lý lở loét cơ (a) và xuất huyết gan (b) của cá chẽm bệnh

nuôi ở khu vực Khánh Hòa